SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

10.26%，本试验代乳料表观消化率数据略高于付宇阳

等[22]

报道的 63~70 日龄羔羊对粗蛋白质的表观消化

率（75.48%）和孙进[23]

的试验结果（75.65%）。试验组

代乳料表观消化率低于对照组羊乳表观消化率的原

因可能是植物蛋白在胃中停留时间较短，胃蛋白酶作

用时间不够，使较多未消化的蛋白质进入肠道造成浪

费。有研究认为，与羊乳相比，大豆蛋白利用率低的

原因是表观消化率低，还与幼畜对大豆蛋白的消化障

碍有关[25]

。傅启高等[26]

通过解剖喂全代乳料的羔羊

发现，其真胃内容物较少，盲肠中内容物较多，而自然

哺乳的羔羊真胃中凝乳块较多，盲肠中内容物较多。

本试验中，对照组饲喂羊乳的羔羊在粗脂肪表观

消化率方面显著高于饲喂代乳料的试验组。动物日

龄、日粮中脂肪酸的存在形式、日脂肪的食入量等都

会对脂肪的吸收产生影响。由于早期断奶羔羊瘤胃

并未发育健全，因此代乳料中粗脂肪主要在十二指肠

和小肠后段被消化吸收。对照组母乳喂养的羔羊粗

脂肪显著高于饲喂代乳料的试验组羔羊，主要在于羊

乳中乳脂率相对于羔羊代乳料中脂肪含量高，而脂肪

能促使胰脏分泌酶原颗粒，引起胆汁分泌，因此，哺乳

羔羊有相对较高的脂肪表观消化率。

羊乳中无纤维成分，哺乳羔羊只能从补饲料中获

得2个纤维含量。2个试验组间羔羊中性洗涤纤维和

酸性洗涤纤维表观消化率方面没有显著差异，但均高

于对照组，原因在于试验组代乳料中适当增加了一些

纤维以促进瘤胃的发育，使其能尽早采食纤维含量较

高的粗饲料，提早反刍，提高瘤胃发酵效率。

4 结论

早期断奶有利于提高羔羊屠宰性能，促进消化器

官和内脏器官的发育，说明对羔羊实施 30 日龄早期

断奶是可行的。试验所配制代乳料能够代替母乳应

用于羔羊早期断奶，代乳料 A 饲喂效果更好，可在生

产实践中推广。

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（编辑：张 雷，747334055@qq.com）

73

反 刍 动 物 2023年第44卷第21期 总第690期

γ-氨基丁酸对肉羊生长指标、血清生化、

抗氧化和免疫指标的影响

■ 崔海燕1，2

（1.驻马店幼儿师范高等专科学校，河南驻马店 463000；2.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453000）

摘 要：为了研究不同剂量γ-氨基丁酸（GABA）对肉羊的作用，试验选择120只月龄相近的杜寒

杂交绵羊，随机分为 4个组，即：对照组、试验 1组（60 mg/kg GABA）、试验 2组（100 mg/kg GABA）、试

验3组（140 mg/kg GABA），预试期3 d，正试期30 d，对肉羊生长性能、血清生化、抗氧化及免疫指标进

行了测定。结果表明：①试验2组和试验3组的平均日增重显著高于对照组（P<0.05),试验2、3组的采

食量显著高于对照组（P<0.05)，试验2组和试验3组的料重比显著低于对照组（P<0.05)。 ②与对照组

相比，试验2、3组肉羊血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）含量显著提高（P<0.05），谷草转氨酶（AST）、谷

丙转氨酶（ALT）活性以及尿素氮（BUN）含量显著降低（P<0.05）。③试验1、2、3组血清中总抗氧化能

力（T-AOC）显著提高（P<0.05），试验2、3组超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）

活性显著提高（P<0.05），试验1、2、3组血清中丙二醛（MDA）含量显著降低（P<0.05）；④试验2、3组血

清免疫球蛋白 A（IgA）、免疫球蛋白 G （IgG）、白细胞介素-2（IL-2）含量显著升高（P<0.05）。 综合结

果：日粮中添加100、140 mg/kg GABA能够改善肉羊生长性能、血清生化、抗氧化及免疫指标，考虑经

济成本，推荐添加量为100 mg/kg。

关键词：γ-氨基丁酸；肉羊；生长性能；抗氧化指标；免疫指标

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.21.012

中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）21-0074-04

Effects of γ-Aminobutyric Acid on Growth Performance, Serum Biochemical Indicators,

Antioxidant Indicators and Immune Indicators of Mutton Sheep

CUI Haiyan1,2

(1. Zhumadian Preschool Education College, Henan Zhumadian 463000, China;

2. Henan Normal University College of Life Sciences, Henan Xinxiang 453000, China)

Abstract：This experiment was conducted to study the effects of different doses of γ-aminobutyric acid

(GABA) on mutton sheep. The experimental animals were 120 similar month old Du Han hybrid sheep,

randomly divided into 4 groups: control group and experimental group 1 (60 mg/kg GABA), test group 2

(100 mg/kg GABA), test group 3 (140 mg/kg GABA), pre feeding period of 3 days, experimental period

of 30 days. The growth performance, serum biochemical, antioxidant and immune indexes, were detected

in this experiment. The results showed that: ① the average daily weight gain of group 2 and group 3 was

significantly higher than that of control group (P<0.05), and the feed intake of group 2 and group 3 was

significantly higher than that of control group (P<0.05). The feed weight ratio of group 2 and group 3 was

significantly lower than that of control group (P<0.05). ② Compared with control group, the serum total

protein (TP) and albumin (ALB) contents of the group 2 and group 3 were significantly increased (P<

0.05), while the activities of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and urea

nitrogen (BUN) content were significantly reduced (P<0.05). ③The total antioxidant capacity (T-AOC) in

the serum of groups 1, 2, and 3 were significantly increased (P<0.05), while the activities of superoxide

dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in groups 2 and 3 were significantly increased (P<

0.05). The contents of malondialdehyde (MDA) in

the serum of groups 1, 2, and 3 were significantly

reduced (P<0.05). ④ The levels of serum immuno⁃

globulin A (IgA), immunoglobulin G (IgG), and in⁃

作者简介：崔海燕，硕士，讲师，研究方向为生理学。

收稿日期：2023-09-26

74

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

terleukin-2 (IL-2) in group 2 and 3 significantly increased (P<0.05). Comprehensive research results:

Adding 100 mg/kg and 140 mg/kg GABA to diet can improve the growth performance, serum biochemi⁃

cal, antioxidant, and immune indicators of mutton sheep. Considering economic costs, the recommended

dosage is 100 mg/kg.

Key words：γ -aminobutyric acid; mutton sheep; growth performance; antioxidant indicators; immune

indicators

γ-氨基丁酸，别名 4－氨基丁酸（γ-aminobutyric

acid，简称GABA），化学式是C₄H₉NO₂，在脊椎动物、植

物和微生物中广泛存在[1]

。GABA作为一种抑制性神

经递质，有着非常多的生理效应，主要作用于中枢神

经系统，能够改善肝脏功能、肾脏功能，调节食欲等多

种生理活性，GABA 很早就应用在医药和保健食品

中[2]

。GABA 对动物有很好的抗热应激效果，还能提

高动物的生长速度，它是一种新型饲料添加剂[3]

，

GABA 在畜禽上已经广泛应用。除此之外，GABA 能

增加采食量、改善牲畜的生长性能，还能降低料重比。

在热应激过程中，通过 GABA 的加入，可以显著地减

少热应激仔鸡的呼吸频率，显著提高肉鸡的日增重，

改善料重比[4]

。但 GABA 对肉羊的作用研究相对较

少。羔羊在断奶后的应激较为严重，本试验旨在研究

断奶后过渡阶段肉羊基础日粮中添加不同剂量的

GABA，通过对生长数据指标、血清生化、抗氧化、免

疫指标测定，为GABA的使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 添加剂

GABA购买自山东某企业。

1.2 试验设计

试验地点在河南驻马店某养殖场，选择相同月龄

的杜寒杂交绵羊120只，随机分为4组，每组共30只，每

组分成6栏，每栏5只羊。对照组不添加GABA，试验1组

添加60 mg/kg GABA，试验2组添加100 mg/kg GABA，

试验3组添加140 mg/kg GABA。基础日粮原料组成及

营养水平见表1。预试期3 d，正试期30 d。试验期内按

养殖场要求进行日常管理，早、晚各饲喂一次。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 生长数据检测

分别在开始和结束时间段，对试验羊进行称重，

称重前空腹处理，记录每天的吃料量，通过以上数据

计算平均日增重、平均日采食量、料重比。

平均日增重（g）=(末重-初重)/试验天数

平均日采食量（kg）=(投料量-剩料量)/试验天数

料重比=平均日采食量/平均日增重

1.3.2 血清生化指标检测

试验最后一天，采集血液 10.0 mL 并分离血清。

使用上海液质检测技术有限公司的试剂盒检测总蛋

白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）含量以及谷草

转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活性。血清试剂盒

购买自上海液质检测技术有限公司。

表1 试验日粮配方及营养水平（风干基础）

项目

原料组成(%)

玉米秸秆

玉米

豆粕

麦麸

磷酸氢钙

食盐

预混料

合计

营养水平

消化能(MJ/kg)

粗蛋白(%)

钙(%)

磷(%)

含量

44.00

24.00

18.00

11.00

1.00

1.00

1.00

100.00

9.41

12.81

0.87

0.58

注：1. 预混料向每千克日粮提供：VD3 1 200 IU、VA 5 000 IU、VE

20 IU、铁 30 mg、锰 30 mg、锌 30 mg、铜 10 mg、钴 0.1 mg、碘

0.5 mg、硒0.3 mg；

2. 营养水平中除消化能为计算值，其余均为实测值。

1.3.3 抗氧化指标检测

使用上海液质检测技术有限公司的试剂盒检测

总抗氧化能力，使用 Fe3+

还原法检测 T-AOC 能力、使

用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、

使用比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活

性、使用铂酸铰法检测过氧化氢酶（CAT）活性、使用

硫代巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）含量。

1.3.4 免疫指标检测

使用上海液质检测技术有限公司的试剂盒检测

血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球

蛋白M（IgM）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α

（TNF-α）含量。

1.4 数据处理和分析

采用 SAS 9.3 进行单因素方差分析，使用 Dun⁃

can’s 法进行多重比较。以“平均值±标准差”标识数

75

反 刍 动 物 2023年第44卷第21期 总第690期

据。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 GABA对肉羊生长指标的影响

由表2可知，与对照组相比，试验2、3组的平均日

增重、平均日采食量显著升高，料重比显著降低

（P<0.05)。

表2 GABA对肉羊生长性能的影响

组别

对照组

试验1组

试验2组

试验3组

初重（kg）

20.29±0.24

20.32±0.19

20.29±0.23

20.42±0.21

末重（kg）

29.02±0.40b

29.41±0.35b

30.84±0.33a

31.03±0.37a

平均日增重（g）

291.00±4.76b

303.00±5.38b

351.67±6.01a

353.67±5.92a

平均日采食量（kg）

1.23±0.13b

1.27±0.12b

1.39±0.10a

1.41±0.14a

料重比

4.24±0.15a

4.20±0.14a

3.95±0.17b

3.98±0.13b

注：同列数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05），下表同。

2.2 GABA对肉羊血清生化指标的影响

由表3可知，与对照组相比，试验2、3组肉羊血清

TP、ALB 指标显著提高（P<0.05），AST、ALT 活性以及

BUN含量显著降低（P<0.05）。

表3 GABA对肉羊血清生化指标的影响

组别

对照组

试验1组

试验2组

试验3组

TP(g/L)

42.56±1.75b

44.38±1.32b

49.12±1.01a

50.21±1.28a

ALB(g/L)

14.21±0.92b

14.01±1.08b

19.87±1.51a

18.99±1.23a

AST(U/L)

38.13±1.72a

36.23±1.83a

32.45±1.14b

33.12±1.27b

ALT(U/L)

30.45±1.11a

28.24±1.08a

24.53±1.54b

24.51±1.12b

BUN(mmol/L)

9.87±0.49a

8.83±0.74a

6.91±0.44b

6.44±0.83b

2.3 GABA对肉羊血清抗氧化指标的影响

由表4可知，与对照组相比，试验1、2、3组血清TAOC显著提高（P<0.05），MDA含量显著降低（P<0.05）。

试验2、3组SOD、GSH-Px活性显著提高（P<0.05）。

表4 GABA对肉羊血清抗氧化指标的影响

组别

对照组

试验1组

试验2组

试验3组

T-AOC(U/mL)

0.51±0.02b

0.72±0.03a

0.80±0.03a

0.79±0.04a

SOD(U/mL)

60.15±2.94b

62.44±2.58b

69.74±3.12a

70.23±2.98a

GSH-Px(U/mL)

84.36±3.57b

85.63±3.98b

91.44±4.14a

91.76±3.86a

MDA(nmol/mL)

4.54±0.31a

3.48±0.26b

3.37±0.22b

3.29±0.23b

表5 GABA对肉羊血清免疫指标的影响

组别

对照组

试验1组

试验2组

试验3组

IgA(g/L)

1.55±0.16b

1.61±0.17b

1.87±0.15a

1.86±0.14a

IgG(g/L)

8.31±0.24b

8.42±0.23b

9.94±0.28a

9.79±0.21a

IgM(g/L)

1.15±0.12

1.14±0.11

1.19±0.14

1.21±0.13

IL-2(ng/L)

120.21±2.34b

123.47±2.41b

131.89±2.61a

132.81±2.78a

TNF-α(ng/L)

72.79±1.41

72.95±1.69

73.27±1.64

73.24±1.71

2.4 GABA对肉羊血清免疫指标的影响（见表5）

由表5可知，与对照组相比，试验2、3组血清IgA、

IgG、IL-2 含量显著升高（P<0.05）；Ig(M)和 TNF-α 试

验组和对照组无显著差异（P>0.05）。

3 讨论

3.1 GABA对肉羊生长性能的影响

动物的采食量是影响生长的关键因素，受到中枢

系统的调节。中枢神经系统会受到体液因素的影响，

例如胃肠道功能、自身代谢的变化和其他因素会对中

枢系统产生影响从而影响采食量[5]

。GABA也可以引

起神经肽 Y 在血液中的浓度，可使采食中枢兴奋，提

高动物采食意愿[6-7]

。GABA 对葡萄糖磷酸化酯酶活

性有积极影响，提高脑细胞兴奋度，增加乙酰胆碱的

含量，从而有效提高动物采食量[8]

。GABA 能够提升

动物体内褪黑素及5-羟基色胺的分泌量，显著提升动

物体内促甲状腺激素水平 ，从而有效的解决各种应

激问题。GABA 能降低机体 CCK 分泌，提高 NPY 分

泌，抑制 α-MSH 分泌，从而提高 CAMP 的浓度，加快

动物生长速度[9]

。

3.2 GABA对肉羊血清生化指标的影响

血清中 TP、ALB 和尿酸或尿素的含量是衡量机

体营养情况的重要指标[10]

。机体肝脏出现问题时，

AST及ALT指标会明显提高，所以肝脏健康的动物血

清中的 AST 及 ALT 指标在合理范围内会保持较低的

76

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

水平。未出现病变或损伤，肝脏解毒等功能越强[11]

。

血清中 BUN 的含量越低代表蛋白质合成效率越高。

本试验结果显示，添加 100、140 mg/kg GABA 的试验

2、3 组肉羊血清 TP 和 ALB 含量显著提高（P<0.05），

ALT、AST活性和BUN含量显著降低。

3.3 GABA对肉羊血清抗氧化指标的影响

根据动物代谢规律，动物机体氧化反应终产物是

丙二醛（MDA），含量的高低直接反映了氧化反应强

度，MDA含量越高，说明动物机体细胞的损伤程度越

大[12]

。动物机体抗氧化过程中，SOD、GSH-Px发挥了

主要作用，而 T-AOC 体现抗氧化酶促系统对动物机

体损伤的抵抗能力，T-AOC、SOD、GSH-Px活性越高，

说明抗氧化能力越强[13]

。GABA能够改善机体的氧化

与还原的动态平衡，提高反刍动物消除自由基的能

力，从而改善抗氧化功能。本研究中，肉羊日粮中添

加 100、140 mg/kg GABA 能够显著提升 T-AOC、SOD、

GSH-Px 活性， MDA含量则会显著下降。

3.4 GABA对肉羊血清免疫指标的影响

IgG 可以激活补体和中和多种毒素，在免疫应答

中起重要的作用[14-15]

。IgA 抗体可以中和感染因子，

在身体的黏膜表面发挥作用，由淋巴结中浆细胞和脾

脏合成，这三种抗体含量反映了体液免疫的强度[16]

。

IL-2 主要由活化 T 细胞产生，具有多源性和多向性，

来自于趋化因子家族，对机体的免疫应答和抗病毒感

染等有重要作用[17]

。TNF-α 主要是来自单核巨噬细

胞，是重要的生物活性细胞因子。GABA 是一种非常

重要的神经递质，对免疫系统有调节作用，它是通过

与免疫细胞上相应受体结合起作用[18]

，从而对机体免

疫系统产生影响。本研究对肉羊血清中各种免疫指

标进行了检测，结果表明添加了 GABA 的试验 2、3组

IgA、IgG、IL-2含量显著升高，说明 GABA 在调节肉羊

体液免疫与细胞免疫方面均具有明显的积极作用。

4 结论

在本试验条件下，肉羊日粮中添加100、140 mg/kg

的GABA能够提升断奶后过渡阶段肉羊的生长指标，

改善血清中相关生化指标、抗氧化指标，提升肉羊的

免疫水平。考虑生长性能指标及生产成本因素，

GABA在肉羊中的经济添加量为100 mg/kg。

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（编辑：张 雷，747334055@qq.com）

77

反 刍 动 物 2023年第44卷第21期 总第690期

暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃发酵

和微生物区系的影响

■ 杨得玉 黄文植 薛 斌 张晓卫 崔占鸿* 冯宇哲

（青海大学畜牧兽医科学院，农业农村部青藏高原放牧牦牛藏羊动物营养与饲草料重点实验室，

青海省牦牛工程技术研究中心，青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海西宁 810016）

摘 要：为探究暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃发酵和微生物区系的影响，试验选取体重

接近的2.5岁雄性牦牛12头，随机分为2组，每组6个重复，对照组纯放牧，盐砖组则采用放牧+补饲矿

物质盐砖的饲养方式。结果表明：盐砖组牦牛瘤胃乙酸、丁酸、异戊酸、戊酸、总挥发性脂肪酸以及氨

态氮的产量显著高于对照组（P<0.05），试验第 30 天对照组和盐砖组的瘤胃液 pH 差异不显著（P>

0.05），试验第 60天、90天盐砖组的瘤胃液 pH显著低于对照组（P<0.05）。补饲矿物质盐砖能显著降

低牦牛瘤胃甲烷杆菌、克里斯滕森菌科、克里斯滕森菌 R-7等菌的相对丰度（P<0.05），显著提高了变

形菌门、放线菌纲、红细菌科、纤维素单胞菌科等菌的相对丰度（P<0.05）。综上所述，暖季补饲矿物

质盐砖能改变牦牦牛瘤胃微生物群落的活性，促进瘤胃发酵，提高牦牛生产性能。

关键词：暖季；矿物质盐砖；放牧牦牛；瘤胃发酵；微生物区系

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.21.013

中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）21-0078-10

Effects of Mineral Salt Brick Supplemention in Warm Season on Rumen Fermention and

Microbial Community of Grazing Yaks

YANG Deyu HUANG Wenzhi XUE Bin ZHANG Xiaowei CUI Zhanhong*

FENG Yuzhe

(Qinghai Academy of Animal Husbandry and Veterinary Sciences in Qinghai University, Ministry of

Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Animal Nutrition and Forage-Feed of Grazing Yak

and Tibetan Sheep in Qinghai-Tibetan Plateau, Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition

and Feed Science of Qinghai Province, Yak Engineering Technology Research Center of Oinghai

Province, Qinghai Xining 810016, China)

Abstract： In order to explore the effects of supplementation of mineral salt bricks in warm season on ru⁃

men fermentation and microflora community of grazing yaks, a total of twelve 2.5-year-old male yaks with

similar body weight were selected and randomly divided into two treatment groups with six replicates in

each group. The control group was pure grazing, and the salt brick group was fed with grazing + supple⁃

mentary feeding of mineral salt bricks. The results show that: the yields of acetic acid, butyric acid, isova⁃

leric acid, valeric acid, total volatile fatty acids and ammonia nitrogen in the rumen of yaks in the salt

brick group were significantly higher than those in the control group (P<0.05), but there was no significant

difference in pH between the control group and the salt brick group on the 30th day of the experiment (P>

0.05). On the 60th and 90th day of the experiment,

the pH of the salt brick group was significantly

lower than that of the control group (P<0.05).

Supplementation of mineral salt bricks could sig⁃

nificantly reduce the relative abundance of Metha⁃

nobrevibacter, Christenellaceae, Christensenellaceae

R-7 and other bacteria in the rumen of yaks (P<

0.05). It significantly increased the relative abun⁃

作者简介：杨得玉，硕士，助理实验师，研究方向为牦牛营

养与饲料。

*通讯作者：崔占鸿，博士，副研究员。

收稿日期：2023-09-13

基金项目：青海省中央引导地方科技发展资金——高寒地

区放牧牦牛适度补饲关键技术应用与示范项目[2023ZY017]

78

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

dance of Proteobacteria, Actinobacteria, Rhodobacteraceae, Cellulomonadaceae (P<0.05). In summary，

supplementation of mineral salt bricks in the warm season can change the activity of rumen microbial

community in yaks, promote rumen fermentation, improve the production performance of yak.

Key words：worn season; mineral salt brick; grazing yak; rumen fermentation; microbial community

作为青海、西藏等高海拔地区的象征，1 400多万头

牦牛为当地牧民提供了基本的生存资源[1]

。其构成了

高原畜牧业的主要支柱，不仅作为当地牧民赖以生存

的物质基础，也是藏区特色优势产业的发展重点[2-3]

。

牦牛主要以放牧为主，依靠天然牧草获取所需的各种

营养物质。但是由于高寒牧区牧草生长期短而枯草

期较长，牧草养分不平衡，导致牦牛生长缓慢[4-5]

。牦

牛在暖季具有补偿生长能力[6]

，研究表明，在暖季进行

补饲可以提高牦牛体况，更好地发挥其生长潜力，达

到短期育肥的目的。传统放牧生产模式虽然有诸多

优点，但高寒草甸天然牧草营养呈季节性变化，甚至

每个月都有差异，致使这一模式低效。

补饲是目前提高牦牛养殖效益的一种有效措施。

由于高寒草甸的特殊性，对于牦牛冷季补饲的探究已

经较为深入。针对青年牦牛和母牦牛，主要补充干

草、精料、青贮、舔砖等[7-11]

，关于牦牛犊牛也有报

道[12-13]

，结果均表明冷季进行补饲能延缓掉膘。虽然

在牦牛暖季补饲方面已有一些报道，主要对生长期牦

牛进行补饲，探究其生长性能，但对牦牛暖季的营养

补饲探究其机理的研究仍较少。矿物质的补饲有多

种形式，常见的形式是预混料添加剂，制成全价饲料

进行补饲，也有通过不同添加形式进行补饲[14]

，如瘤

胃缓释弹丸用以预防微量元素的缺乏[15]

。常用的是

制成舔砖进行补饲。舔砖的种类各异，一般根据成分

来命名，如盐砖、糖蜜砖、尿素营养舔砖。已有研究证

实，补饲矿物质对牦牛瘤胃发酵有促进作用[16]

。因

此，本试验通过对放牧牦牛进行暖季补饲矿物质盐

砖，从微观上探究瘤胃发酵和瘤胃微生物区系的变

化，以期充分发挥放牧牦牛的生长潜力，提高生产性

能，为高寒草甸牦牛的矿物质营养研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

试验时间为2020年7月16日—2020年10月31日。

试验地点为青海省海晏县达日玉秀乡高寒草甸区，草

地类型为高寒草甸草地，草地优势种有高山嵩草、垂

穗披碱草和草地早熟禾，伴生种有大花蒿、多裂委陵

菜、翠雀花、黄帚橐吾、紫花针茅和芨芨草等。

选取体重接近的 2.5岁健康公牦牛 12头，随机分

为2组，每组6头。对照组牦牛全天放牧，盐砖组牦牛

放牧并补饲矿物质盐砖，自由舔食。围栏内放置饮水

槽，并保证饮水干净充足，两组牦牛自由饮水。预试

期15 d，正试期90 d。本试验天然牧草的营养含量和

矿物质含量见表 1 和表 2，矿物质盐砖的主要矿物质

成分见表3。

表1 天然牧草常规营养成分含量（干物质基础，%）

项目

粗蛋白(CP)

粗脂肪(EE)

中性洗涤纤维(NDF)

酸性洗涤纤维(ADF)

粗灰分(Ash)

30 d

7.78±0.16a

2.28±1.77a

56.99±0.45b

30.56±0.97b

6.53±0.04

60 d

6.74±0.01b

2.29±0.05a

60.88±0.72a

34.73±1.35a

6.41±0.14

90 d

5.20±0.01c

1.82±0.12b

59.75±1.78a

34.77±1.15a

6.46±0.23

注：同行数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有

相同小写字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）；表2~表5同。

表2 天然牧草矿物质含量（干物质基础, mg/kg)

项目

钙(Ca)

磷(P)

镁(Mg)

钠(Na)

钾(K)

锰(Mn)

铁(Fe)

铜(Cu)

锌(Zn)

钴(Co)

30 d

8 860.34±636.24b

960.00±5.00

787.52±8.56b

650.30±29.05b

25 460.27±1 036.30a

33.22±1.35a

146.90±1.53b

6.34±0.39a

19.00±0.60b

0.86±0.06

60 d

4 700.49±184.23c

780.00±8.00

927.99±21.41a

943.92±20.44a

15 402.62±582.92b

13.93±4.96b

206.19±22.30a

4.08±0.52b

22.63±1.15a

1.20±0.75

90 d

13 305.12±1 142.07a

730.00±35.00

484.25±116.33c

630.89±68.21b

3 615.16±393.56c

8.02±0.44c

188.49±24.51a

2.47±0.35c

15.85±2.84c

0.31±0.78

79

反 刍 动 物 2023年第44卷第21期 总第690期

表3 矿物质盐砖的主要矿物质成分

项目

钙（Ca，%）

磷（P，%）

钠（Na，%）

镁（Mg，mg/kg）

铜（Cu，mg/kg）

铁（Fe，mg/kg）

锌（Zn，mg/kg）

锰（Mn，mg/kg）

碘（I，mg/kg）

硒（Se，mg/kg）

钴（Co，mg/kg）

含量

0.63

0.51

33.97

200.00

150.00

1 200.00

1 000.00

500.00

45.00

15.00

20.00

1.2 样品采集

牧草采集：试验前根据牦牛的采食路线圈定采样

区域，采用对角线法采集多个 0.25 m×0.25 m 大小样

方的牧草，混匀并在 65 ℃烘干，并粉碎过筛保存，用

于牧草养分分析。

瘤胃液采集：采样前禁食8 h，使用胃管式瘤胃液

采样器采集每头试验牛的瘤胃液样品。先将试验牛

保定，避免乱动。然后将干净的胃管式瘤胃液采样器

从口腔插入，到达瘤胃后用150 mL大型注射器抽取瘤

胃液，舍弃前两管，采集完毕后，缓慢将采样器抽出。

随后立即将注射器中瘤胃液移入15 mL冻存管中，测

定pH，其余放入液氮，用于氨态氮（NH3-N）、挥发性脂

肪酸（VFA）浓度的测定和16S rRNA测序分析。

1.3 指标测定

1.3.1 牧草常规营养成分含量测定

粗灰分（Crude ash，Ash）：GB/T 6438—2007《饲料

中粗灰分的检测》；粗蛋白（Crude protein，CP）：GB/T

6432—2018《饲料中粗蛋白质的测定 凯氏定氮法》；

粗脂肪（Ether extract，EE）：GB/T 6433—2006《饲料中粗

脂肪的测定》；中性（酸性）洗涤纤维（Neutral detergent

fiber，NDF/Acid detergent fiber，ADF）：GB/T 20806—

2006《饲料中中性洗涤纤维（NDF）的测定》。

1.3.2 牧草和矿物质盐砖矿物质元素测定

磷（Phosphorus，P）：GB/T 6437—2018《饲料中总

磷 的 测 定 分 光 光 度 法》；主 要 矿 物 质 元 素 ：GB/T

13885—2017《饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含

量的测定 原子吸收光谱法》，使用仪器为普析 TAS990原子吸收分光光度计。

1.3.3 牦牛盐砖采食量测定

将盐砖组各头牦牛采食的盐砖固定好，确保每头

牛每天舔食同一块盐砖，采食前记录每块盐砖的重

量，在试验进行30、60 d和90 d时对盐砖称重，并计算

试验期间盐砖的采食量。

1.3.4 生长性能的测定

试验期开始前对所有牦牛进行空腹称重，记录初

始重，在试验进行 30、60、90 d时空腹称重并记录，并

计算试验期间的日增重。

1.3.5 瘤胃发酵指标测定

NH3-N含量：采用冯宗慈等[17]

改进的比色法测定。

VFA 浓度：使用徐晓峰[18]

的测定方法，使用仪器

为岛津GC 2014气相色谱仪。

16S rRNA 测序：委托北京诺禾致源科技股份有

限公司测序分析。

1.4 数据统计分析

试验数据采用 Excel 2016 软件初步处理后，用

SPSS 统计软件中 ANOVA 进行单因素方差分析，用

Duncan’s法进行多重比较和显著性分析，数据结果用

“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛生长性能的影响

由表 4可知，盐砖组牦牛矿物质盐砖的平均日采

食量为16 g左右。

表4 矿物质盐砖采食量（g）

项目

盐砖平均日采食量

30 d

16.00±4.74

60 d

15.19±8.00

90 d

16.10±5.93

由表 5 可知，试验第 30 天对照组、盐砖组放牧牦

牛体重无显著差异（P>0.05）；试验第 60、90 天盐砖组

牦牛平均体重显著高于对照组（P<0.05）；放牧牦牛平

均日增重盐砖组显著高于对照组（P<0.05）。

表5 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛生长性能的影响

组别

对照组

盐砖组

初始重(kg)

137.75±5.19

136.75±5.44

30天体重(kg)

149.55±11.43

152.20±5.38

60天体重(kg)

156.55±9.05b

170.25±5.62a

90天体重(kg)

158.50±11.21b

176.20±7.85a

平均日增重(g)

244.12±121.65b

464.12±86.25a

注：同列数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同小写字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）。

2.2 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃发酵的影响

由表 6 可知，随着牧草营养成分的变化，对照组

的 pH 呈升高趋势，而盐砖组瘤胃液的 pH 呈先下降

后上升的趋势，试验第 30天两组瘤胃液的 pH差异不

80

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

显著（P>0.05），试验第 60、90 天盐砖组瘤胃液的 pH

（分别为 7.41、7.54）显著低于对照组（7.59、7.70）（P<

0.05）。随着牧草营养成分的变化，牦牛瘤胃发酵后

的 NH3-N 呈降低的趋势，盐砖组的 NH3-N 含量显著

高于对照组（P<0.05）。试验第 30天盐砖组牦牛瘤胃

发酵后的丁酸、戊酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸含量

显著高于对照组（P<0.05），乙酸、丙酸、乙丙比、异丁

酸两组间差异不显著（P>0.05）；试验第 60 天盐砖组

牦牛瘤胃发酵后的乙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、总挥发

性脂肪酸含量显著高于对照组（P<0.05），丙酸、异丁

酸、乙丙比两组间差异不显著（P>0.05）；试验第 90天

盐砖组乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸含

量显著高于对照组（P<0.05），异丁酸、乙丙比两组间

差异不显著（P>0.05）。试验 30、60、90天盐砖组牦牛

瘤胃发酵后乙酸含量比对照组分别提高了 15.06%、

20.23%、36.05%；丙 酸 含 量 分 别 提 高 了 10.69%、

13.02%、29.90%，丁 酸 含 量 分 别 提 高 了 63.16%、

48.91%、46.21%，异 丁 酸 含 量 分 别 提 高 了 27.27%、

4.44%、3.70%，总挥发性脂肪酸含量提高了 19.24%、

55.07%、32.91%。

表6 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃发酵的影响

项目

pH

氨态氮(mg/dL)

乙酸(mmol/L)

丙酸(mmol/L)

异丁酸(mmol/L)

丁酸(mmol/L)

异戊酸(mmol/L)

戊酸(mmol/L)

总挥发性脂肪酸(mmol/L)

乙丙比

组别

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

第30天

7.54±0.14

7.67±0.09

7.00±0.18a

8.73±0.22b

34.47±3.46

39.66±4.69

9.54±0.73

10.56±1.00

0.77±0.08

0.98±0.37

5.13±0.20a

8.37±0.20b

0.86±0.10a

1.03±0.05b

3.90±0.36a

4.60±0.43b

54.67±4.00a

65.19±4.30b

3.62±0.36

3.80±0.74

第60天

7.59±0.06a

7.41±0.05b

6.56±0.30a

8.26±0.24b

37.22±1.15a

44.75±3.37b

10.75±1.45

12.15±1.36

0.90±0.09

0.94±0.15

6.40±0.10a

9.53±1.28b

0.79±0.08a

1.10±0.08b

4.15±0.48a

4.91±0.16b

60.21±2.79a

73.37±5.19b

3.51±0.44

3.70±0.25

第90天

7.70±0.08a

7.54±0.10b

3.83±0.23a

5.55±0.18b

28.82±3.21a

39.21±5.35b

7.55±0.86a

9.81±1.38b

0.54±0.06

0.56±0.03

3.83±0.70a

5.60±0.21b

0.53±0.02a

1.05±0.10b

3.98±0.40

3.91±0.27

45.24±4.59a

60.13±5.27b

3.84±0.45

4.06±3.95

注：同项中同列数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同小写字母或无字母表示差异不显著（P>

0.05）；表7~表8同。

2.3 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃微生物区

系的影响

对所有样本的有效序列，以 97% 的一致性进行

OUTs聚类，再将OUTs的序列进行物种注释。稀释曲

线见图1，由图1可知，当测序深度达到53 500测序片

段数时，对照组和盐砖组的稀释曲线趋于平缓，说明

测序所得数据量已经覆盖样本中的绝大多数细菌

物种。

2.3.1 基于OUTs的韦恩图分析

基于 OUTs 韦恩图图 2 可以看出，试验第 30 天对

照组、盐砖组 OTUs 数分别为 4 289 个、3 929 个，两组

共享 3 439 个，对照组特有 OTUs 859 个，盐砖组特有

OTUs 490 个；试验第 60 天对照组、盐砖组 OTUs 数分

别为3 978个、3 900个，两组共享3 392个，对照组特有

OTUs 586个，盐砖组特有 OTUs 508 个；试验第 90 天

对照组、盐砖组 OTUs 数分别为 3 656 个、5 116 个，

两组共享 3 203 个，对照组特有OTUs 453个，盐砖组

特有OTUs 1 913个。

2.3.2 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃微生物

群落α多样性的影响

81

反 刍 动 物 2023年第44卷第21期 总第690期

注：图中A1、B1、C1分别代表对照组试验第30、60、90天，A2、B2、C2分别代表盐砖组试验第30、60、90天OTUs，下图同。

图2 韦恩图

Ace、Chao1 指数代表菌群丰富度，其值越大，表

明物种总数越多，Shannon、Simpson 指数代表菌群多

样性，指数越大表明物种多样性越高，各物种分配越

均匀[19]

。由表 7可知，补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤

胃菌群丰富度估计值（Ace、Chao1 指数）试验第 30、

60 天盐砖组的物种总数与对照组差异不显著（P>

0.05），试验第90天盐砖组显著高于对照组（P<0.05）；

Shannon 指数除试验第 60 天对照组显著高于盐砖组

（P<0.05），其他时间段两组没有显著差异（P>0.05）；

Simpon指数组间没有显著差异（P>0.05）。

序列号

图1 暖季放牧牦牛瘤胃细菌稀释曲线

观察物种数量

0 10 000 20 000 30 000 60 000

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

500

0

40 000 50 000

A11

A12

A13

A14

A15

A21

A22

A23

A24

A25

B11

B12

B13

B14

B15

B21

B22

B23

B24

B25

C11

C12

C13

C14

C15

C21

C22

C23

C24

C25

表7 数据预处理结果

项目

Ace指数

Chao1指数

Shannon指数

Simpson指数

组别

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

对照组

盐砖组

30 d

2 753.45±606.35

2 837.93±233.92

2 733.92±602.85

2 821.32±237.59

9.09±0.66

9.00±0.11

0.993±0.004

0.992±0.002

60 d

2 831.35±128.87

2 726.18±166.30

2 813.89±138.27

2 704.09±160.51

9.19±0.25a

8.90±0.17b

0.993±0.004

0.992±0.003

90 d

2 741.76±54.32b

3 186.76±61.96a

2 719.78±54.47b

3 121.33±49.47a

8.95±0.13

8.74±0.33

0.992±0.003

0.989±0.006

82

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

2.3.3 放牧牦牛瘤胃细菌β多样性分析

由图 3可知，基于属水平上的 PCoA分析，试验第

30、60、90天盐砖组和对照组样品的间距较小，说明同

组样品间菌落结构差异较小，结果显示PCoA1占总变

异的35.57%，PCoA2差异占总变异的14.86%。 PCoA2(14.86 %)

-0.2 0 0.2

0.20

0.15

0.10

0.05

0

-0.05

-0.10

-0.15

-0.20

-0.25

B2

A2

A1

C1

B1

C2

PCoA1(35.57 %)

图3 放牧牦牛瘤胃细菌的主坐标分析（PCoA）

2.3.4 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃细菌门

水平组成的影响

由图4可知，含量前十的门分别为拟杆菌门（Bac⁃

teroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteo⁃

bacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、未鉴定菌门

（unidentified_Bacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、纤

细菌门（Gracilibacteria）、螺线体门（Spirochaetota）、互

养菌门（Synergistota）、广古菌门（Euryarchaeota）。试

验第 30、60、90 天对照组和盐砖组以拟杆菌门（分别

为 51.59%、55.95%、57.58% 和 54.40%、59.34%、

52.25%）、厚壁菌门（分别为 31.10%、30.24%、25.53%

和 30.56%、26.81%、24.52%）、变 形 菌 门（分 别 为

0.91%、1.01%、1.64% 和 1.46%、1.28%、4.64%）、疣微

菌门（分别为 3.14%、2.18%、4.05% 和 2.46%、2.06%、

3.93%）、未鉴定菌门（分别为 2.97%、1.43%、1.73%和

1.88%、1.43%、3.54%）、放 线 菌 门（分 别 为 2.40%、

2.11%、1.47% 和 1.84%、1.85%、2.13%）相对丰度较高

（相对丰度≥1%）。值得注意的是，变形菌门在盐砖组

的含量高于对照组。

2.3.5 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃细菌属

水平的影响

由图 5 可知含量前十的属分别为普雷沃氏菌属

（Prevotella）、理研菌属 RC9（Rikenellaceae_RC9_gut_

group）、普 雷 沃 氏 菌 UCG-001（Prevotellaceae_UCG001)、奎 因 氏 菌 属（Quinella）、克 里 斯 滕 森 菌 R-7

（Christensenellaceae_R-7_group）、普 雷 沃 氏 菌 UCG003（Prevotellaceae_UCG-003）、拟 杆 菌 属（Bacteroi⁃

des）、Candidatus Saccharimonas、Qscillospira、杆 菌 属

（Bacillus）。数据表明，试验第 30、60、90 天对照组和

盐砖组以普雷沃氏菌属（分别为 17.41%、11.11%、

13.87% 和 14.03%、13.20%、11.45%）、理研菌属 RC9

（分 别 为 7.29%、9.44%、12.45% 和 7.72%、10.99%、

11.88%）、普 雷 沃 氏 菌 UCG: 001（分 别 为 2.44%、

5.90%、2.87% 和 2.71%、3.83%、3.53%）、奎因氏菌属

（ 分 别 为 2.47%、3.04%、1.41% 和 2.75%、1.90%、

1.87%）、克里斯滕森菌 R-7（分别为 4.09%、4.02%、

3.77% 和 3.77%、1.90%、1.87%）、普雷沃氏菌 UCG003（分别为 1.71%、3.01%、2.75% 和 2.21%、3.29%、

2.53%）、拟杆菌属（分别为 0.77%、1.65%、2.19% 和

1.48%、1.04%、1.71%）相对丰度较高（相对丰度≥1%）。相对丰度(%)

A1 A2 B1 B2 C2

100

80

60

40

20

0 C1

Others

Euryarchaeota

Synergistota

Spirochaetota

Gracilibacteria

Actinobacteriota

unidentified_Bacteria

Verrucomicrobiota

Proteobacteria

Firmicutes

Bacterioidota

样品名称

图4 放牧牦牛瘤胃细菌门水平相对丰度

相对丰度(%)

A1 A2 B1 B2 C2

100

80

60

40

20

0 C1

Others

Bacillus

Oscillospira

Candidatus_Saccharimonas

Bacteroides

Prevotellaceae_UCG-003

Christensenellaceae_R-7_group

Quinella

Prevotellaceae_UCG-001

Rikenellaceae_RC9_gut_group

Prevotella

样品名称

图5 放牧牦牛瘤胃细菌属水平相对丰度

83

反 刍 动 物 2023年第44卷第21期 总第690期

2.3.6 T检验

由图6可以看出，试验60 d对照组和盐砖组主要

的差异菌门是广古菌门，试验第 90 天对照和盐砖组

主要的差异菌门是变形菌门，通过对比，试验第 60天

盐砖组的广古菌门丰度显著高于对照组（P<0.05），试

验第 90 天盐砖组的变形菌门丰度显著高于对照组

（P<0.05）。

由图7可以看出，试验第60天对照组和盐砖组主

要的差异菌属是普雷沃氏菌 UCG-005和甲烷短杆菌

属，试验第 90 天对照组和盐砖组主要的差异菌属有

克里斯滕森菌R-7、Candidatus Saccharimonas、欧陆森

氏菌属、Saccharofermentans 和解琥珀酸菌属，通过对

比，试验第 60 天对照组的普雷沃氏菌 UCG-005 丰度

显著高于盐砖组（P<0.05），盐砖组的甲烷短杆菌属显

著高于对照组（P<0.05）；试验第90天对照组的克里斯

滕森菌 R-7、Candidatus Saccharimonas、欧陆森氏菌

属、Saccharofermentans和解琥珀酸菌属丰度显著高于

盐砖组（P<0.05）。

图7 T检验两组间物种差异分析图（属水平）

0 0.025 0.050

0.007**

P

值

95%置信区间

Christensenellaceae_R-7_group

分组平均数 组间差异

0 0.01 0.02 0.03

C1

C2

Candidatus_Saccharimonas

Olsenella

Saccharofermentans

Succiniclasticum

0.025*

0.024*

0.045*

0.021*

0 0.050 0.010 0.015

0.043*

P

值

95%置信区间

Methanobrevibacter

分组平均数 组间差异

-0.02 -0.01 0 0.01

B1

B2

UCG-005 0.006*

2.3.7 细菌群落结构线性判别（LEfSe）分析

图 8 中，LDA 分支大于阈值（阈值为 3）的显著差

异物种，即组间具有统计学差异的生物标识，筛选出

两组之间显著差异物种，再以图 9展示出各层次水平

图6 T检验两组间物种差异分析（门水平）

0 0.050 0.010 0.015

0.043* P

值

95%置信区间

Euryarchaeota

分组平均数 组间差异

-0.020 -0.015 -0.010 -0.005 0

B1

B2

0 0.02 0.04 0.06

0.045* P

值

95%置信区间

Proteobacteria

分组平均数 组间差异

-0.075 -0.005 -0.025 0

C1

C2

84

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

中存在组间差异的微生物群落或物种结构，最终可

知，试验第30天盐砖组与对照组相比共有8种差异显

著的菌，其中拟杆菌科（Bacteroidaceae）、拟杆菌属、肠

杆菌门（Enterobacterales）、肠杆菌科（Enterobacteria⁃

ceae）、副 乳 杆 菌 目（Lactobacillales）、terium_enrich⁃

ment_culture_clone-HN117 等菌属的丰度较对照组显

著增加（P<0.05）；试验第60天对照组与盐砖组相比共

有 7 种差异显著的菌，其中布劳特氏菌属（Blautia）、

真杆菌属（Eubacterium_coprostanoligenes_group）、韦荣

球菌科（Veillonellaceae）、RF39、芽孢杆菌纲（Bacilli）、

细菌（Bacteria）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的丰度

显著高于盐砖组（P<0.05），盐砖组与对照组相比共有

6种差异显著的菌，其中Archaea、广古菌门、甲烷杆菌

科（Methanobacteriaceae）、甲烷杆菌纲（Methanobacte⁃

ria）、甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷杆菌属

（Methanobrevibacter）的丰度较对照组显著增加（P<

0.05）；试验第 90天对照组与盐砖组相比共有 19种异

显著的菌，其中 Saccharimonadia、Saccharimonadales、

Saccharimonadaceae、Candidatus_Saccharimonas、副 杆

菌 科（Parabacteroides_merdae）、欧 陆 森 氏 菌 属（Ol⁃

senella）、Atopobiaceae、科氏杆菌（Coribacteriia）、红蝽

菌 目（Coriobacteriales）、甲 烷 杆 菌 属 、古 生 菌（Ar⁃

chaea）、广古菌门、甲烷杆菌纲、甲烷杆菌目、甲烷杆

菌科、克里斯滕森菌目（Christensenellales）、克里斯滕

森菌科（Christenellaceae）、克里斯滕森菌 R-7、拟杆菌

（Bacteroidales_BS11_gut_group）等菌丰度较 SG 组显

著增加（P<0.05），盐砖组与对照组相比共有12种差异

显著的菌，其中变形菌门、变形菌纲（Gammaproteobac⁃

teria）、芽孢杆菌纲、放线菌门、酸微菌纲（Acidimicro⁃

biia）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、微球菌目

（Micrococcales）、微球菌科（Micrococcaceae）、细菌、红

细 菌 目（Rhodobacterales）、红 细 菌 科（Rhodobactera⁃

ceae）、纤维素单胞菌科（Cellulomonadaceae）等菌丰度

显著高于对照组（P<0.05）。

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

p_Proteobacteria

c_Gammaproteobacteria

c_Bacilli

c_Actinobacteria

c_Acidimicrobiia

c_Alphaproteobacteria

o_Micrococcales

k_Bacteria

o_Rhodobacterales

f_Rhodobacteraceae

f_Cellulomonadaceae

f_Micrococcaceae

o_Saccharimonadales

c_Saccharimonadia

f_Saccharimonadaceae

g_Candidatus_Saccharimonas

s_Parabacteroides_merdae

g_Olsenella

f_Atopobiaceae

c_Coriobacteriia

o_Coriobacteriales

g_Methanobrevibacter

k_Archaea

p_Euryarchaeota

f_Methanobacteriaceae

c_Methanobacteria

o_Methanobacteriales

g_Christensenellaceae_R_7_group

f_Christensenellaceae

o_Christensenellales

f_Bacteroidales_BS11_gut_group

C1 C2

LDA分数(lg)

图8 差异物种的LDA值分布柱状图

a: f_Methanobacteriaceae

b: o_Methanobacteriales

c: c_Methanobacteria

d: f_Cellulomonadaceae

e: f_Micrococcaceae

f: o_Micrococcales

g: c_Actinobacteria

h: f _Atopobiaceae

i: o_Coriobacteriales

j: c_Coriobacteriia

k: f_Bacteroidales_BS11_gut_group

l: c_Bacilli

m: f_Christensenellaceae

n: o_Christensenellales

o: f_Rhodobacteraceae

p: o_Rhodobacterales

q: c_Alphaproteobacteria

r: c_Gammaproteobacteria

s: c_ Acidimicrobiia

t: f_Saccharimonadaceae

u: o_Saccharimonadales

v: C_Saccharimonadia

C1

C2

图9 进化分支图

85

反 刍 动 物 2023年第44卷第21期 总第690期

3 讨论

3.1 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛生长性能和瘤

胃发酵的影响

对于放牧牦牛而言，牧草矿物元素的季节性缺乏

将直接影响牦牛的生长。补充矿物质盐砖则会平衡

牧草导致的矿物质缺乏，而体重能直接反映牦牛生长

及育肥效果。研究发现，补充矿物质能促进牦牛的生

长发育[20]

，暖季补饲矿物元素能显著提高牦牛犊

牛[21]

、生长期牦牛[22]

和母牛[23]

的生长性能。本试验的

结果与上述研究一致。这正说明在暖季补饲矿物质

能够促进放牧牦牛的生长。

瘤胃液pH是评价反刍动物瘤胃内环境与机体健

康最为直观的指标。反刍动物瘤胃液pH的正常范围

为 6.0~7.5[24-25]

。本试验中各月份放牧组牦牛瘤胃液

pH 高于 7.5，研究表明低能量水平饲粮瘤胃液 pH 要

高于高能量饲粮瘤胃 pH[26]

，本研究牦牛主要采食天

然牧草，其能量水平低于精料日粮，这可能是导致瘤

胃液pH高的原因。

本试验测得试验第 30、60 天瘤胃液中 NH3-N 浓

度范围是6~8 mg/dL，试验第90天瘤胃中NH3-N浓度

范围为 3.8~5.5 mg/dL，与郭天龙等[27]

测出的结果相

符。补饲矿物质盐砖的牦牛组 NH3-N 含量显著高于

未补饲组，补饲盐砖组牦牛对牧草CP、EE的消化率提

高，提升了氮利用率，从而也显著提高了NH3-N含量。

此外，矿物质添加提高了放牧牦牛瘤胃 NH3-N 含量，

但其机理还需进一步研究。

VFA 是反刍动物主要能量来源[28]

，研究发现，对

公牛[29]

、奶牛[30] 、山羊[31]

补充矿物质，能提高乙酸、总

挥发性脂肪酸的含量，这与本研究结果一致。本研究

中，8、9、10月补饲矿物质盐砖牦牛组瘤胃乙酸含量比

未补饲组分别提高了 15.06%、20.23%、36.05%；丙酸

含量分别提高了 10.69%、13.02%、29.9%，丁酸含量分

别提高了 63.16%、48.91%、46.21%，异丁酸含量分别

提高了 27.27%、4.44%、3.70%，总挥发性脂肪酸含量

提高了 19.24%、55.07%、32.91%。暖季放牧牦牛补充

矿物质盐砖明显提高了VFA的含量。

3.2 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃微生物区

系的影响

16S rRNA高通量测序技术利用其在不同菌种中

序列的多样性来鉴定菌种的类别[32]

。本研究通过检

测暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃微生物菌群

的变化，来评价补饲矿物质盐砖对放牧牦牛微生物菌

群是否有积极影响。本试验两试验组第 30、60、90天

的优势菌群均为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门，与前

人研究结果相似[33-36]

。盐砖组试验第30、60天拟杆菌

门丰度与对照组相比有所增加，但差异不显著；两组

间厚壁菌门丰度差异不显著。研究发现，拟杆菌门主

要作用是对非纤维物质的降解，而厚壁菌门主要作用

是对纤维物质的降解[37]

。盐砖组、对照组的优势菌属

均为普雷沃氏菌属，两组间差异不显著。根据 T 检

验，在门水平下，试验第 60天盐砖组的广古菌门丰度

显著高于对照组。广古菌门主要作用是产生甲烷，有

研究表明，瘤胃中产气量越高，表明饲料在瘤胃内的

发酵程度越高[38]

。试验第 90天盐砖组的变形菌门丰

度显著高于对照组。根据LEfSe分析，试验第90天对

照组牦牛瘤胃中甲烷杆菌纲、甲烷杆菌目、甲烷杆菌

科的相对丰度显著高于盐砖组。瘤胃产甲烷杆菌在

生长过程中会产生甲烷，甲烷的产生不仅造成了动物

饲料能量的浪费，也增加了温室气体排放。有研究表

明，克里斯滕森菌科、克里斯滕森菌 R-7与血清中的

甘油三酯成反比关系[39]

。

综合以上结果表明，补饲矿物质盐砖能降低瘤胃

甲烷杆菌、克里斯滕森菌科、克里斯滕森菌 R-7 等菌

的相对丰度，提高了变形菌门、放线菌门、红细菌科、

纤维素单胞菌科等菌的相对丰度。

4 结论

暖季补饲矿物质盐砖降低了放牧牦牛瘤胃液

pH，显著升高了其瘤胃 NH3-N 的浓度及瘤胃 VFA 的

含量，提高了能量的利用，促进了瘤胃发酵。

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（编辑：张 雷，747334055@qq.com）

87

试 验 研 究 2023年第44卷第21期 总第690期

荚膜甲基球菌蛋白遗传毒性研究和被动皮肤过敏试验

■ 高嫣珺1，2 聂 雅1，2 陈秀云3 张思微1，2 刘 瑜1，2 卜仕金1，2*

（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；

3.扬州大学医学院，江苏扬州 225009）

摘 要：荚膜甲基球菌蛋白（Methylococcus capsulatus bacteria meal，MBM）拟开发为新饲料原料。

本研究旨在通过遗传毒性研究和被动过敏试验评价其毒理学安全性，为其未来的应用奠定基础。本

研究包括四个试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验采用平板掺入法，每皿剂量在 0.625~

10.000 mg范围内，采用TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535五种菌株进行回复突变试验；小鼠骨髓

细胞微核试验和精子畸形试验均设2 500、5 000、10 000 mg/kg三个MBM剂量组，微核试验采用30 h

两次给药法，精子畸形试验连续染毒 5 d，分别在既定的时间采样制片；大鼠被动皮肤过敏试验设

250、500、1 000 mg/kg 三个 MBM 剂量组，制备抗血清后背部皮内注射致敏，24 h和/或 48 h后进行抗

原激发，考察蓝色反应斑直径。所有试验均根据要求设置阴性、阳性对照组。结果表明：在有或无代

谢活化系统结果（S9）时，MBM的鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验结果均为阴性；小鼠骨髓细胞

微核和精子畸形试验结果均为阴性；大鼠皮肤被动过敏试验结果为阴性。说明在设置的试验系统和

剂量下MBM未显示遗传毒性和潜在的致敏性。

关键词：荚膜甲基球菌蛋白；鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验；骨髓细胞微核试验；精子畸形试验；

被动皮肤过敏试验

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.21.014

中图分类号：S816.4 文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2023）21-0088-06 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Genetic Toxicity Study and Passive Cutaneous Anaphylaxis Test of Methylococcus Capsulatus

Bacteria Meal

GAO Yanjun1,2

NIE Ya1,2

CHEN Xiuyun3

ZHANG Siwei1,2

LIU Yu1,2

BU Shijin1,2*

(1. College of Veterinary Medicine Yangzhou University, Jiangsu Yangzhou 225009, China; 2. Jiangsu

Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses,

Jiangsu Yangzhou 225009, China; 3. Medical College of Yangzhou University, Jiangsu Yangzhou

225009, China)

Abstract：Methylococcus capsulatus bacteria meal (MBM) is intended to be developed as a new feed ingre⁃

dient. This study was aimed to evluate toxicological safety of MBM through genotoxicity study and pas⁃

sive cutaneous anaphylaxis test, which laying the foundation for its future applications. The Ames test

was performed by the plate doping method with doses ranging from 0.625 to 10 mg per dish, reverse mu⁃

tation test was carried out in five strains of TA97, TA98, TA100, TA102 and TA1535. The mice micro⁃

nucleus test and the sperm malformation test both performed at 2 500, 5 000, 10 000 mg/kg. The micro⁃

nucleus test was conducted using a 30 h double

administration method, and the sperm abnormality

test was continuously exposed to the MBM for

5 days. Two tests were respectively sampled and

produced smear at a predetermined time. The rat

passive cutaneous anaphylaxis test was performed

at 250, 500, 1 000 mg/kg. The antiserum was pre⁃

作者简介：高嫣珺，硕士，研究方向为兽医药理与毒理学。

*通讯作者：卜仕金，教授，博士生导师。

收稿日期：2023-08-03

基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目；现代农

业产业技术体系专项[CARS-41]

88

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

pared and then sensitization by Intradermal injection on the back. Antigenic challenge was performed 24 h

and/or 48 h later. Finally the blue reaction spots were examined. Negative and positive control groups

were set up for all tests. The results showed that the with or without metabolic activation system (S9), the

Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames test) result was negative; the mice bone marrow

cell micronucleus and sperm abnormality test results were both negative; and the rat passive cutaneous

anaphylaxis test result was negative. The study suggests that MBM showed no genotoxicity and potential

allergy under the set test system and dose.

Key words：Methylococcus capsulatus bacteria meal; Ames test; bone marrow cell micronucleus test;

sperm abnormality test; passive cutaneous anaphylaxis test

豆粕是当前主流的饲料蛋白质原料，2022年饲料

中豆粕用量为 6 580 t，占比为 14.5%[1]

。我国大豆高

度依赖进口，2022 年进口量达 9 108 万吨，大部分用

于生产饲用豆粕，但自然灾害等因素使其进口有很大

的不确定性[2]

。为了应对外部的不确定性，农业农村

部于 2023 年 4 月 12 日印发了《饲用豆粕减量替代三

年行动方案》的通知，充分挖掘微生物菌体蛋白，实现

2025年新批准1~2种微生物菌体蛋白上市，以减少豆

粕依赖，是行动的目标之一[3]

。荚膜甲基球菌蛋白

（Methylococcus capsulatus bacteria meal，MBM）来源于

天然存在的非转基因微生物的培养物，粗蛋白含量高

达65%，主要由甲烷氧化菌荚膜甲基球菌在发酵过程

中使用甲烷、氧气、氨氮和矿物质迅速增殖产生，其生

产不占用耕地、不使用动植物性原料且仅耗费极少的

水资源，相比于传统的动植物蛋白具有显著的优

势[4-6]

。研究表明，MBM 不仅可代替鱼粉成为大西洋

鲑鱼、虹鳟、罗非鱼等水产动物饲用蛋白质来源，在畜

禽（断奶仔猪、育肥猪）养殖业同样具有广阔的应用前

景[7-10]

。为了将MBM开发为新饲料原料，本研究进行

了包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验、小鼠

骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验在内的 MBM

遗传毒性研究和大鼠被动皮肤过敏试验，提供 MBM

开发为新饲料原料所需的毒理学安全性评价资料[11]

，

为MBM在我国养殖业作为替代蛋白饲料原料应用奠

定基础。

1 材料与方法

1.1 受试物

MBM，粗 蛋 白 含 量 ≥65%，褐 色 粉 末 。 批 号 为

FNJ012-20210308，由恺迪苏（重庆）有限公司南京中

试基地提供。用于 Ames 试验的不同浓度 MBM 水溶

液使用无菌水溶解；用于小鼠骨髓细胞微核和精子畸

形试验的不同浓度的 MBM 混悬液使用 0.5% 羧甲基

纤维素钠配制；用于被动皮肤过敏试验的 MBM 生理

盐水溶液使用生理盐水溶解。不同浓度的MBM溶液

均采用2倍递次稀释法配制。

1.2 主要试剂

环磷酰胺购自Halle公司；Giemsa染液购自Solor⁃

bio公司；叠氮钠、敌克松、2-氨基芴、2-氨基蒽和1,8-

二羟蒽醌购自Sigma公司；羧甲基纤维素钠、磷酸氢钠

铵、枸椽酸、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯

化镁、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、二甲基亚砜、D生物素、L-组氨酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、氧化型辅

酶Ⅱ、琼脂粉、牛肉膏、胰胨等购自国药集团化学试剂

有限公司。所有试剂均为分析纯。

代谢活化系统（S9）在试验前由多氯联苯在雄性

成年Wistar大鼠诱导制备，活力经诊断性诱变剂鉴定

符合试验要求。

1.3 主要仪器

D98-9052B-2 隔水式电热恒温培养箱购自上海

一恒科学仪器有限公司；CX2 光学显微镜购自 Olym⁃

pus 公司；Centrifuge 5415R 高速冷冻离心机、微量移

液器购自 Eppendorf公司；BCD-251WDGW 购自 Haier

公司。

1.4 试验动物与菌株

试验动物：清洁级ICR小鼠100只，体重25~35 g，

其中 75 只为雄性，25 只为雌性；清洁级 Wistar 大鼠

250 只，体重 150~180 g，雌雄各半。试验动物均购自

扬州大学比较医学中心，动物生产许可证号为 SCXK

（苏）2022-0009，使用许可证号为 SYXK（苏）2022-

0044。

89

试 验 研 究 2023年第44卷第21期 总第690期

试验菌株：Ames 试验使用的标准测试菌株为组

氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102

和 TA1535，购自 Moltox公司，经生物学特性鉴定合格

后用于试验。

1.5 试验方法

1.5.1 Ames试验

参 考《兽 药 Ames 试 验 指 导 原 则》[12]

和《GB

15193.4—2014细菌回复突变试验》[13]

进行试验设计，

根据点试法进行的预试验结果，设高（10 mg/皿）、中

高（5 mg/皿）、中（2.5 mg/皿）、中低（1.25 mg/皿）、低

（0.625 mg/皿）共 5 个 MBM 剂量组，另设阴性对照组

（无菌水）及阳性对照组，每个剂量组包括有 S9（+S9）

和无 S9（-S9）两个系列，采用平板渗入法，测试 MBM

对 TA97、TA98、TA100、TA102 和 TA1535 的致突变作

用，每个MBM剂量组或对照组每种菌株分别设3个平

行皿，于 37 ℃培养 48 h 后计数每皿的回变菌落数。

如果MBM剂量组回变菌落数的增加超过阴性对照组

2倍以上，且满足以下两种情况之一：①有剂量-反应

关系；②某一测试点有可重复的阳性结果，则可判定

为阳性结果。

1.5.2 小鼠骨髓细胞微核试验

参考《兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则》[12]

和 GB 15193.5—2014《哺乳动物红细胞微核试验》[14]

进行试验设计，设高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）

和低（2 500 mg/kg）3个MBM剂量组，另设阳性对照组

（环磷酰胺40 mg/kg）和阴性对照组（0.5%羧甲基纤维

素钠），每组 10 只小鼠，雌雄各半。采用 30 h 两次染

毒法，即两次染毒间隔24 h，第2次染毒后6 h采集骨

髓样品制片。MBM剂量组和阴性对照组经口灌胃染

毒，阳性对照组腹腔注射，高、中、低MBM剂量组染毒

药液分别为 0.5、0.25、0.125 g/mL 浓度的 MBM 混悬

液，除阳性对照组外各组均灌胃20 mL/kg。每组采样

10 只小鼠，使用胸骨段骨髓，吉姆萨染色，每只小鼠

制片2张。阅片时每张涂片计数嗜多染红细胞（PCE）

1 000个，观察并计数其中含有微核的PCE细胞（一个

PCE 中含多个微核按一个计），同时计数同一视野下

的成熟红细胞（RBC）。计算 PCE/RBC 比值和微核率

（‰），按照公式计算微核率。

嗜多染红细胞微核率（‰）=含微核的嗜多染红细

胞/检查嗜多染红细胞总数×1 000

PCE/RBC应在小鼠的参考值（0.6~1.2）范围内，阴

性对照组微核率应小于5‰，如MBM剂量组微核率与

阴性对照组存在统计学差异，并且呈现剂量-反应关

系，则可判定MBM微核试验结果阳性。

1.5.3 小鼠精子畸形试验

参考《兽药小鼠精子畸形试验指导原则》[13]

和 GB

15193.7—2003《小鼠精子畸形试验》[15]

进行试验设计，设

高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）和低（2 500 mg/kg）

3个MBM剂量组和阳性（环磷酰胺40 mg/kg）、阴性对

照组（0.5% 羧甲基纤维素钠），每组 10 只雄性小鼠。

MBM剂量组和对照组连续经口灌胃染毒 5 d，高、中、

低MBM剂量组染毒药液分别为0.5、0.25、0.125 g/mL浓

度的 MBM 混悬液，阳性对照组为浓度为 2 mg/mL 的

环磷酰胺溶液（溶剂为生理盐水），各组灌胃体积均为

20 mL/kg。首次染毒后第35天安乐死动物，每组采样

10只小鼠，取双侧附睾制片，2% 伊红染色，每只小鼠

制片2张，每只小鼠计数共1 000个精子中的畸形数，

并分类计数（分为无钩、香蕉形、无定性、双头、胖头、

尾折叠和双尾），根据公式计算精子畸形率（%）。

精子畸形率（%）=畸形精子数（/ 正常精子数+畸

形精子数）×100

阴性对照组精子畸形率在质控范围（0.8%~3.4%）

内，且阳性与阴性对照精子畸形率差异极显著（P<

0.01），则表明该试验系统可靠。MBM剂量组小鼠的精

子畸形率为阴性的2倍或2倍以上，或有统计学差异，

且存在剂量-反应关系，则可判断试验结果为阳性。

1.5.4 被动皮肤过敏试验

参考《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术

指导原则》[16]

进行试验设计，按体重设高（1 000 mg/kg）、

中（500 mg/kg）、低（250 mg/kg）3个MBM剂量组，另设

阳性对照组（牛血清白蛋白 15 mg/kg）和阴性对照组

（生理盐水）。10只大鼠，雌雄各半，随机均分为5组，对

应各组剂量皮下注射，隔日一次，共3次，MBM剂量组和

对照组均注射3 mL/kg，MBM和牛血清白蛋白溶剂均为

生理盐水。末次致敏后第14天采血，2 000 r/min离心

10 min 分离抗血清，使用生理盐水将各组抗血清为

1∶2、1∶8、1∶32三个浓度。将240只大鼠分为5组，

中、低 MBM 剂量组各 30 只，其余组各 60 只，雌雄各

半，在动物背部预先脱毛 3 cm×4 cm 的区域，皮内注

射各对应组不同浓度的抗血清0.1 mL进行被动致敏，

中、低MBM剂量组被动致敏24 h，其余组不同抗血清

浓度分别致敏24 h和48 h，每组每个浓度不同时间均

90

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

致敏 10 只大鼠。到达致敏时间后，皮下注射与致敏

剂量相同的激发抗原进行激发，同时静脉注射 1.0%

伊文思兰染料 1.0 mL。30 min 后安乐死各组大鼠，

剪取背部皮肤，测量皮肤内层的斑点大小，不规则斑

点的直径为长径与短径之和的一半，直径大于 5 mm

者判定为阳性，计算各组的阳性百分率（%）。

1.6 数据分析

试验结果均采用“平均值±标准差”表示，使用

SPSS 26.0软件进行统计学分析，组间统计学显著性比

较采用X2

检验，显著性水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与分析

2.1 Ames试验

Ames 试验结果见表 1，MBM 每皿剂量为 0.625~

10.000 mg，有或无 S9 时，5 种鼠伤寒沙门氏菌试验株

的每皿平均回变菌落数均在阴性对照的两倍以内，未

见剂量-反应关系，两次试验结果均一致。表明MBM

对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性，MBM 的 Ames试验结

果为阴性。

表1 MBM鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果（n=3）

组别

高剂量组

中高剂量组

中剂量组

中低剂量组

低剂量组

阴性对照组

阳性对照组

有(+)/无(-)

代谢活化

系统(S9)

-S9

+S9

-S9

+S9

-S9

+S9

-S9

+S9

-S9

+S9

-S9

+S9

-S9

+S9

TA97

第一次

150±11

140±25

137±27

147±13

146±13

148±24

156±18

137±19

142±31

138±30

145±13

135±14

2 587±102

1 853±47

第二次

145±21

134±10

143±39

132±29

136±36

131±28

135±21

136±7

143±14

147±19

142±14

134±14

2 583±76

1 797±96

TA98

第一次

37±6

34±5

35±7

35±9

40±3

42±1

36±6

40±1

42±5

35±2

37±3

36±10

1 104±84

6 100±100

第二次

40±7

35±6

36±6

38±6

41±6

37±6

40±4

34±7

41±7

34±6

36±8

38±8

1 123±25

6 046±64

TA100

第一次

153±13

149±33

150±17

146±19

151±23

159±7

149±26

163±13

149±28

141±20

151±15

148±19

2 610±101

2 970±61

第二次

151±10

145±13

150±20

163±11

164±18

155±20

149±8

141±13

165±19

158±16

151±12

159±11

2 667±153

3 020±20

TA102

第一次

262±18

274±22

263±32

263±16

274±23

266±15

283±18

263±24

286±10

283±23

284±7

279±17

828±10

725±40

第二次

274±14

273±6

276±28

287±14

279±26

278±23

277±31

282±16

277±29

265±13

271±28

276±26

850±50

750±30

TA1535

第一次

24±2

27±6

21±7

23±8

21±2

21±6

21±7

24±6

22±10

23±5

23±9

26±5

319±3

353±27

第二次

24±6

27±6

25±6

25±4

25±4

24±8

24±4

24±7

25±1

23±3

24±6

22±4

323±6

343±43

注：+S9 阳性对照，TA97、TA98 和 TA100 为 2-氨基芴 10 μg/皿，TA102 为 1,8-二羟蒽醌 50 μg/皿，TA1535 为 2-氨基蒽

5 μg/皿；-S9阳性对照，TA97、TA98和TA102为敌克松50 μg/皿，TA100和TA1535为叠氮钠1.5 μg/皿。

2.2 小鼠骨髓细胞微核试验

由表 2可知，MBM 剂量组和阴、阳性对照组 PCE/

RBC均在参考范围内，雌、雄小鼠MBM剂量组PCE微

核率与阴性对照组比较无显著差异（P≥0.05），且阳

性对照组与 MBM 剂量组、阴性对照组比较差异极显

著（P<0.01），同一 MBM剂量组内雌、雄小鼠微核率显

著的性别差异（P≥0.05）。结果表明，MBM 在 2 500~

10 000 mg/kg 剂量范围内小鼠骨髓细胞微核试验结

果为阴性。

2.3 小鼠精子畸形试验

由表 3可知，阴性对照组精子畸形率在质控范围

内，MBM剂量组精子畸形率未达阴性对照组的2倍且

与阴性对照组比较无显著差异（P≥0.05），而阳性对照

组与 MBM 剂量组和阴性对照组比较差异均极显著

（P<0.01）。以上结果表明本试验系统可靠，MBM在 2

500~10 000 mg/kg 剂量范围内小鼠精子畸形试验结

果为阴性。

2.4 被动皮肤过敏试验

由表 4 可知，三个 MBM 剂量组和阴性对照组在

1∶2、1∶8、1∶32抗血清浓度，激发24 h和48 h，所有

大鼠皮肤内侧的蓝色反应斑直径均≤5 mm，阳性对照

组大鼠皮肤内侧的蓝色反应斑直径均>5 mm。MBM

剂量组与阴性对照组比较无显著统计学差异（P≥

0.05），与阳性对照组比较差异极显著（P<0.01）。以上

结果表明 MBM 在 250~1 000 mg/kg 剂量范围内对大

鼠的被动皮肤过敏试验结果为阴性。

91

试 验 研 究 2023年第44卷第21期 总第690期

表3 MBM小鼠精子畸形试验结果（n=10）

组别

高剂量组

中剂量组

低剂量组

阴性对照组

阳性对照组

检查数

(个)

10×103

10×103

10×103

10×103

10×103

精子畸形类别

无钩

61

62

63

60

145

香蕉形

18

16

17

19

88

无定形

111

108

115

109

239

胖头

7

8

7

7

19

尾折叠

7

6

7

7

17

双头形

5

6

4

5

15

双尾形

6

6

5

6

25

总畸形数

(个)

215

212

218

213

548

平均畸形数

(个)

21.50±2.72ns,**

21.20±2.04ns,**

21.80±3.05ns,**

21.30±3.13

54.80±6.34

精子畸形率

(%)

2.14±0.27

2.11±0.19

2.17±0.31

2.12±0.31

5.45±0.63

表4 MBM被动皮肤过敏试验结果（n=10）

组别

阴性对照组

高剂量组

中剂量组

低剂量组

阳性对照组

时间(h)

24

48

24

48

24

24

24

48

抗血清

1∶32

1∶8

1∶2

1∶32

1∶8

1∶2

1∶32

1∶8

1∶2

1∶32

1∶8

1∶2

1∶32

1∶8

1∶2

1∶32

1∶8

1∶2

1∶32

1∶8

1∶2

1∶32

1∶8

1∶2

平均蓝斑直径(mm)

1.40±0.47

1.38±0.45

1.34±0.49

1.35±0.44

1.35±0.39

1.53±0.38

1.31±0.42

1.32±0.44

1.41±0.46

1.34±0.50

1.28±0.31

1.40±0.48

1.36±0.45

1.38±0.43

1.44±0.44

1.36±0.51

1.36±0.39

1.36±0.48

6.07±0.99

5.68±0.67

6.18±1.19

5.83±0.65

5.77±0.60

5.67±0.58

蓝斑直径(只)

≤5 mm

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

0

0

0

0

0

0

>5 mm

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

10

10

10

10

10

10

阳性百分率(%)

0

0

0ns,**

0ns,**

0ns,**

0ns,**

100

100

表2 MBM小鼠骨髓细胞微核试验结果（n=5）

组别

高剂量组

中剂量组

低剂量组

阴性对照组

阳性对照组

性别

♀

♂

♀

♂

♀

♂

♀

♂

♀

♂

PCE/RBC值

1.02±0.02

1.06±0.05

1.03±0.02

1.11±0.04

1.04±0.06

1.06±0.04

1.05±0.04

1.06±0.03

1.02±0.03

1.01±0.01

PCE微核率（‰）

2.19±0.57ns,**

2.48±0.98ns,**

2.09±0.56ns,**

1.98±0.61ns,**

2.19±0.82ns,**

2.47±0.49ns,**

2.19±0.83

2.28±0.67

13.34±2.13

12.22±1.69

注：ns，各MBM剂量组与同性别阴性对照组比较P≥0.05；**，各MBM剂量组与同性别阳性对照组比较P<0.01；下表同。

92

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

3 讨论

MBM 作为一种非动植物源性的新型可持续功

能 性 蛋 白 原 料 在 国 外 沿 用 已 久 ，商 品 名 为 Feed⁃

KindⓇ ，但其首次进入我国市场，尚未批准使用[17]

。

《新饲料和新饲料添加剂管理办法》[11]

中规定，新饲

料原料的申请资料必须包括毒理学安全评价资料，

因此对 MBM 进行全面的毒理学安全性评价对其今

后在我国畜禽养殖业的应用具有重大的推动作用。

前期已完成的大、小鼠急性经口毒性试验和 90 d 亚

慢性毒性试验结果显示，MBM 在大、小鼠的 LD50均≥

10 g/kg，无作用剂量至少达到 3 100 mg/kg。本研究

所涉及的试验根据前期急性和亚慢性毒性研究结果

和相关指导原则要求设置剂量组，保证受试物得到

充分暴露。本研究参照《兽药研究技术指导原则》[12]

和食品安全国家标准[13-15]

，进行 MBM 的 Ames 试验、

小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验研究其

遗传毒性，其中 Ames 试验根据要求设置在最高剂量

下设 4 个剂量组，共设 5 个 MBM 剂量组；微核试验和

精子畸形试验根据要求均设 3 个 MBM 剂量组。同

时，参照人用药的相关指导原则[16]

进行大鼠皮肤

被动过敏试验，设 3 个 MBM 剂量组，在各剂量组设

1∶2、1∶8、1∶32 共 3 个抗血清浓度。在 Ames 试验

中，每皿剂量在 0.625~10 mg 范围内，在加和不加 S9

时 ，各 MBM 剂 量 组 TA97、TA98、TA100、TA102、

TA1535 回变菌落数均与阴性对照接近，远低于阳性

的判断标准，表明 MBM 对鼠伤寒沙门氏菌无致突变

作用。骨髓细胞微核试验通过测量微核率来评价受

试物对染色体的损伤，本试验剂量下，MBM 对小鼠

骨髓细胞的微核率与阴性对照组无统计学差异且未

达两倍，三个 MBM 剂量组微核率接近，未呈现明显

的剂量-反应关系；同时，小鼠精子畸形试验 MBM 剂

量组各类精子畸形数和总精子畸形率均符合阴性结

果的标准。大鼠被动过敏试验中，三个 MBM 剂量组

在不同抗血清浓度和激发时间下，所有动物蓝斑直

径均≤5 mm，均未出现过敏反应。

4 结论

在本试验条件和剂量下，MBM 未显示遗传毒性

和潜在的致敏作用，MBM 作为新饲料原料使用具有

较高的安全性。

参考文献

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牧兽医报, 2023-04-09(001).

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2011年）[M]. 北京：化学工业出版社, 2012.

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准出版社, 2014.

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标准　哺乳动物红细胞微核试验: GB 15193.5—2014[S]. 北京:

中国标准出版社, 2014.

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2003[S]. 北京: 中国标准出版社, 2004.

[16] 国家食品药品监督管理总局. 药物刺激性、过敏性和溶血性研

究 技 术 指 导 原 则 [Z/OL]. 2014-05-13. http://www.sda. gov. cn/

WS01/CL1616/101018.html.

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(Methylococcus capsulatus, Bath) bacteria meal as an alternative

protein source for Japanese yellowtail, Seriola quinqueradiata[J].

Aquaculture, 2020, 529: 735700.

（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

93

试 验 研 究 2023年第44卷第21期 总第690期

发 酵 桔 皮 对 酿 酒 酵 母 生 长 性 能 的 影 响 研 究

■ 马吉喆1 吴雨来2 张林梅2 叶倩颖2 陆筑凤2 李加友2* 徐 涛1

(1.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江杭州 310018；2.嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001)

摘 要：研究旨在通过添加新型生长刺激剂促进酵母生长，提升酵母的生长效率。通过向酵母

培养基中添加发酵桔皮，探究发酵桔皮对酵母生长的影响，利用单因素试验、正交试验、响应面分析

等方法对添加发酵桔皮的酵母培养基进行优化。结果表明：添加发酵桔皮后的优化培养基为：葡萄

糖100.756 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸膏11.906 g/L、发酵桔皮（干物质含量）1.906 g/L、无水硫酸镁2 g/L、

尿素2 g/L、磷酸二氢钾5 g/L。培养基优化后酵母生物量达到最大，比未添加发酵桔皮的培养基提高

了1.3倍。发酵桔皮可以作为酵母生长刺激剂提高酵母活菌浓度，缩短酵母进入对数生长期的时间，

从而促进酵母饲料工业降本增效。

关键词：桔皮；发酵；酵母；生长刺激剂；酵母饲料

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.21.015

中图分类号：S816.6 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）21-0094-07

Study on Effect of Fermented Orange Peel on Yeast Growth Performance

MA Jizhe1

WU Yulai2

ZHANG Linmei2

YE Qianying2

LU Zhufeng2

LI Jiayou2*

XU Tao1

(1. College of Life Science and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, Zhejiang Hangzhou 310018,

China; 2. School of Biological and Chemical Engineering, Jiaxing University, Zhejiang Jiaxing

314001, China)

Abstract：The research aims to promote yeast growth and improve yeast growth efficiency by adding new

growth stimulants. By adding fermented orange peel to explore the effect of fermented orange peel on

yeast growth in yeast medium. Next, single-factor experiments, orthogonal experiments, response surface

analysis and other methods were used to optimize the yeast medium with fermented orange peel. The re⁃

sults showed that the optimized medium after adding fermented orange peel was: C6H12O6 100.756 g/L,

peptone 9 g/L, yeast extract 11.906 g/L, fermented orange peel (dry matter content) 1.906 g/L, MgSO4 2 g/L,

urea 2 g/L, KH2SO4 5 g/L. After medium optimization, yeast biomass was maximized, which was 1.3 times

higher than medium without fermented orange peel. Fermented orange peel can be used as yeast growth

stimulants to increase yeast live bacteria concentration, shorten the time for yeast to enter the logarithmic

growth period, thereby reducing costs and increasing efficiency for yeast feed industry.

Key words：orange peel; ferment; yeast; growth stimulants; yeast feed

随着生物工程技术、畜牧业和饲料工业的发展以

及中国居民对高蛋白类食品需求量的增加[1]

，酵母类

产品的开发利用已成为饲料工业的重中之重。中国

饲料工业协会明确指出：我国的高蛋白饲料在配方结

构、产品创新中更加趋向于酵母培养物类的饲料添加

剂[2-3]

。酵母饲料是利用酵母的新陈代谢，通过微生

物发酵技术制成含有活菌、适口性良好、安全、无污

染、无残留的酵母培养物[4-5]

。研究报道酵母饲料[6-7]

不仅具有原料来源广泛、生产速度快、蛋白质含量高

的优点，而且可以调节动物肠道微生物菌群结构、提

高饲料利用率、增强动物机体免疫力[8-12]

，在畜牧养殖

业生产中具有广阔的应用前景。但酵母存在的培养

产量低、效率差等问题，使得酵母铬、酵母葡聚糖、生

作者简介：马吉喆，硕士，研究方向为发酵技术。

*通讯作者：李加友，教授。

收稿日期：2023-08-11

基金项目：浙江省自然科学基金公益项目[LGN22C20000

9]；嘉兴市科技计划项目[2021AD10010]

94

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

物多肽等相关酵母饲料成本过高[13-15]

。研究表明，提

高酵母的生长性能主要采用添加辅助因子[16]

和培养

基优化改良[17]

等方法。其中，通过添加海藻糖等辅助

因子可以增强酵母免疫力，使酵母具有高生物活性，

但价格昂贵不便于投入到工业生产应用中。因此有

必要进一步研究酵母菌在发酵过程中营养成分之间

的相互作用，通过添加发酵桔皮和酵母培养基优化相

结合，观测酵母的生长趋势变化，从而在酵母饲料工

业中做到降本增效、改善生产工艺、提高产品的市场

竞争力。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

桔皮，宁波市象山华宇罐头厂；葡枝根霉（Rhizo⁃

pus stolonifer）1118，嘉兴学院发酵食品开发与分析检

测实验室保藏菌种；酿酒酵母（Saccharomyces cerevi⁃

siae），安琪酵母股份有限公司；葡萄糖（食品级），浙江

一诺生物科技有限公司；酵母浸膏，上海阿拉丁生化

科技股份有限公司；尿素（纯度≥99.5%）、无水硫酸镁

（纯度≥99.5%）、磷酸二氢钾（纯度99%）、蛋白胨，上海

阿拉丁生化科技股份有限公司。

初始发酵培养基（g/L）：葡萄糖100、酵母浸膏10、

尿素2、无水硫酸镁2 、磷酸二氢钾5。

1.2 仪器与设备

ZHWY-200B 型全温摇床，上海智城分析仪器制

造有限公司产品；CT14RD11台式离心机，上海天美生

化仪器设备有限公司产品；FR124CN 型分析天平，奥

豪斯仪器有限公司产品；紫外分光光度计，上海美谱

达仪器有限公司产品。

2 试验方法

2.1 发酵桔皮的制备

称取适量干燥桔皮，研磨过筛（10目筛网）置于发

酵桶中，加入桔皮粉干重 1.5 倍质量的水，混合均匀，

用直径1 cm打孔器从匍枝根霉1118的PDA固体培养

基上取 2 个菌苔，加入培养基中，使菌种与桔皮粉充

分接触。于 28 ℃恒温培养 15 d。对发酵物进行过滤

除渣，制成浸膏状水溶性发酵桔皮（干物质含量

21%），4 ℃下冷藏保存，备用。

2.2 酵母培养

菌种活化：将1 g酿酒酵母活性干酵母加入100 mL

葡萄糖含量为 2% 的培养基中，38 ℃、220 r/min 摇床

振荡培养30 min，对菌种进行活化，制得种子菌液。

酿酒酵母发酵培养：取 1 mL 种子菌液接种至

100 mL发酵培养基中，28 ℃恒温培养。

2.3 酵母浓度测定

2.3.1 标准曲线绘制

取酵母发酵培养基中1 mL的样液于显微镜下计

数，将样液分别梯度稀释 10、20、30、40、50倍，并测定

OD600，绘制OD600与对应酵母活菌数的标准曲线。

2.3.2 检测方法

参照参考文献[18]，采用吸光光度法对发酵液的

生物量进行测定。并将发酵液进行梯度稀释至1/20，

利用分光光度计于 600 nm 处测定吸光度，结果记为

OD600，并以此读数作为培养基中的酵母浓度。

2.4 培养基优化试验

2.4.1 单因素试验

以酿酒酵母初始发酵培养基为基础，分别考察发

酵桔皮、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等不同添加量对酿酒

酵母生长的影响，每次处理只改变初始发酵培养基的

一个因子。按 1%（W/V）接入活化酿酒酵母，28 ℃下

恒温培养24 h检测OD600，确定各单因素的最佳水平。

2.4.2 正交试验

在单因素试验的基础上，以发酵桔皮（A）、葡萄

糖（B）、蛋白胨（C）及酵母浸膏（D）为考察对象，采用

L8(2)

7

正交试验设计，对酿酒酵母发酵培养基进一步

优化。各因素与水平见表1。

表1 正交试验因素水平（g/L）

水平

1

2

A

1.8

2.2

B

90

110

AB

1

2

C

7

9

AC

1

2

BC

1

2

D

11

13

2.4.3 Box-Benhnken响应面分析

在正交试验基础上，采用 Box-Benhnken 设计结

合响应面分析对发酵桔皮（E）、葡萄糖（F）、酵母浸膏

（G）等三个主要影响因子进行优化。各因素 BoxBenhnken设计方法与水平见表2。

表2 响应面分析各因素与水平(g/L）

水平

-1

0

1

E

1.5

2

2.5

F

90

100

110

G

11

12

13

2.4.4 桔皮发酵物成分检测

用常规方法检测桔皮发酵物中橙皮苷[19]

、黄酮[20]

等药效成分含量以及多糖[21]

、蛋白质[22]

、脂肪[23]

等营

养成分。

95

试 验 研 究 2023年第44卷第21期 总第690期

2.5 数据处理

每组试验进行 5 次平行测定，借助 Minitab 16、

Design-Expert 13.0 和 Origin 2021 对数据进行统计分

析。P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著，0.05≤

P<0.10表示具有差异显著趋势。

3 结果与分析

3.1 培养基组分对吸光度指标的影响

见表 3，对发酵样液中酵母活菌进行镜检并按梯

度进行稀释。记录活菌数与OD600的对应变化绘制标

准曲线，见图 1，得到标准曲线方程：y=1.201 27x0.129 62，其中R2

为99.157。表明采用OD600作为酵母

生物量的测定中，培养基组分对吸光度没有影响。

表3 活菌记录结果

项目

吸光度

菌数（×107

个/mL）

10倍稀释

0.970

1.053

20倍稀释

0.566

0.526

30倍稀释

0.419

0.351

40倍稀释

0.334

0.263

50倍稀释

0.251

0.211

酵母活菌数(×107

个/mL)

0.2 0.3 0.4 0.5 1.0

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

斜率：1.201 3±0.055 33

截距：-0.129 62±0.031 41

R2

=0.991 57

0.6 0.7 0.8 0.9

吸光度

图1 酵母活菌数对应OD600标准曲线

3.2 单因素试验结果及分析

3.2.1 发酵桔皮浓度对酿酒酵母生长的影响

通过在发酵过程中添加相关的辅助因子能够促

进酵母生长、增强代谢、弥补酵母营养缺失的物质[24]

。

在实验室对桔皮进行发酵处理后得到其水溶性浸膏

状物质，并将其作为生长刺激剂添加到原始培养基

中，研究不同浓度的发酵桔皮对酵母生长代谢的影

响，结果如图 2所示。结果表明不同浓度的发酵桔皮

可以不同程度提高培养体系中的酿酒酵母活菌数量，

当发酵桔皮初提物浓度为 2 g/L 时效果最好，酵母活

菌检测值从0.302提高到0.561，说明发酵桔皮对酵母

的生长代谢具有良好的刺激作用。

3.2.2 葡萄糖浓度对酿酒酵母生长的影响

葡萄糖是微生物生长的主要营养物质，初始浓度

对生长和代谢都有重要影响[25]

。在发酵桔皮浓度为

2 g/L 的条件下，研究不同浓度的葡萄糖对酵母生长

的影响，结果见图 3。当葡萄糖浓度为 100 g/L 时，酵

母浓度提高到 0.572；继续添加葡萄糖至 160 g/L时酵

母浓度下降明显。说明葡萄糖浓度过高对酵母对生

长具有抑制作用。

酿酒酵母OD600

0 1 2 3

0.60

0.55

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

0.302

4 5

0.495

0.561 0.503

0.466

0.448

发酵桔皮浓度（g/L）

图2 发酵桔皮添加浓度对酵母生长的影响

酿酒酵母OD600

80 100 120

0.58

0.56

0.54

0.52

0.50

0.48

0.46

0.44

0.42

0.502

140 160

0.572

0.555

0.493

0.436

葡萄糖浓度（g/L）

图3 葡萄糖浓度对酿酒酵母生长的影响

3.2.3 酵母浸膏浓度对酿酒酵母生长的影响

酵母浸膏富含丰富的营养物质，是酿酒酵母培养

基的常用组分。通过改变原始培养基中酵母浸膏的

添加量，考察酵母浸膏对酿酒酵母生长的影响，结果

见图 4。当酵母浸膏添加量为 12 g/L 时，酵母浓度最

高可达0.609；酵母浸膏继续增加菌体浓度稍有下降。

3.2.4 蛋白胨浓度对酿酒酵母生长的影响

不同微生物对氮源的需求不尽相同，蛋白胨是酵

母生长的常用氮源[26]

。蛋白胨添加量对酿酒酵母生

长的影响见图 5，结果表明：在蛋白胨添加量为 8 g/L

96

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

时，酵母浓度达到最高值0.638。但是，在考察的蛋白

胨浓度范围内（7~11 g/L），酵母浓度的最大差异仅为

3%，变化并不显著。酿酒酵母OD600

8 9 10

0.62

0.60

0.58

0.56

0.557

11 14

0.585

0.609

0.601

0.584

12 13

酵母浸膏浓度（g/L）

图4 酵母浸膏浓度对酿酒酵母生长的影响

酿酒酵母OD600

7 8 9

0.68

0.67

0.66

0.65

0.64

0.63

0.62

0.61

0.60

0.625

10 11

0.638 0.631

0.623 0.621

蛋白胨浓度（g/L）

图5 蛋白胨浓度对酵母生长的影响

3.3 正交试验结果及分析

在单因素试验的基础之上，根据各单因素的最佳

添加量，并结合不同因素之间的交互影响，采用7因素

2水平进行正交试验，结果见表4。根据极差（R）大小

比较不同因素对酿酒酵母生长的影响：发酵桔皮（A）>

葡萄糖（B）>葡萄糖与发酵桔皮的交互作用AB>酵母浸

膏（D）>蛋白胨（C）；另一方面，葡萄糖和发酵桔皮具有

交互作用，可能是发酵桔皮有利于促进葡萄糖的代谢，

具体机理有待深入研究。从表 4可以看出，培养基各

因子的最优组合为A2B2C2D1。但蛋白胨浓度的影响

水平只有0.02，相对较小，因此进行单因素最佳水平的

响应面分析试验时不作为主要考虑因素。理论最优培

养基为（g/L）：葡萄糖110、蛋白胨9、酵母浸膏11、发酵

桔皮2.2、无水硫酸镁2、尿素2、磷酸二氢钾5。

3.4 Box-Benhnken响应面结果及分析

3.4.1 Box-Benhnken响应面优化试验及结果分析

设 OD600 读数（Z）为响应值，采用 Box-Benhnken

响应面优化设计原理，考察发酵桔皮（E）、葡萄糖（F）、

酵 母 浸 膏（G）三 个 因 素 对 OD600 读 数（Z）的 影 响 。

OD600读数响应面试验设计及结果见表5。由表5可以

看出，不同添加量的E、F、G对OD600读数（Z）的影响各

不相同。

表4 正交试验结果

编号

1

2

3

4

5

6

7

8

K1

K2

R

因素

A

1

1

1

1

2

2

2

2

0.643

0.673

0.030

B

1

1

2

2

1

1

2

2

0.647

0.669

0.022

AB

1

1

2

2

2

2

1

1

0.663

0.654

0.009

C

1

2

1

2

1

2

1

2

0.657

0.659

0.002

AC

1

2

1

2

2

1

2

1

BC

1

2

2

1

1

2

2

1

D

1

2

2

1

1

2

2

1

0.661

0.655

0.006

OD600

0.636

0.638

0.657

0.642

0.662

0.653

0.673

0.704

注：K1代表“1”水平下试验数据平均值；K2代表“2”水平下试验数

据平均值。

表5 Box-Benhnken响应面优化试验及结果分析

编号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

E

-1

1

-1

1

-1

1

-1

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

F

-1

-1

1

1

0

0

0

0

-1

1

-1

1

0

0

0

0

0

G

0

0

0

0

-1

-1

1

1

-1

-1

1

1

0

0

0

0

0

Z

0.627

0.624

0.653

0.611

0.661

0.619

0.636

0.627

0.627

0.642

0.619

0.627

0.711

0.703

0.703

0.709

0.711

3.4.2 OD600读数响应面优化试验回归模型及方差分析

将 OD600读数（Z）响应面结果进行二次响应面回

归分析，结果见表6。

97

试 验 研 究 2023年第44卷第21期 总第690期

表6 各因素影响的主效应分析

组分

模型

E-发酵桔皮浓度

F-葡萄糖浓度

G-酵母膏浓度

EF

EG

FG

E²

F²

G²

残差

失拟项

纯误差

总计

决定系数R2

可调节系数R2

预测系数R2

准确性

平方和

0.022 9

0.001 2

0.000 2

0.000 2

0.000 4

0.000 3

0.000 0

0.005 4

0.007 7

0.054 0

0.000 1

0.000 1

0.000 1

0.023 0

0.996 1

0.991 2

0.980 4

35.126 1

自由度

9

1

1

1

1

1

1

1

1

1

7

3

4

16

方差

0.002 5

0.001 2

0.000 2

0.000 2

0.000 4

0.000 3

0.000 0

0.005 4

0.007 7

0.054 0

0.000 1

7.16×10-6

0

F值

200.5

90.91

12.78

15.78

30.01

21.49

0.966 7

426.46

609.40

426.46

0.426 6

P值

<0.000 1

<0.000 1

0.009 0

0.005 4

0.000 9

0.002 4

0.358 2

<0.000 1

<0.000 1

<0.000 1

0.745 0

显著性

显著

不显著

由表 6 可以看出，目标函数 R 的响应面模型 P 值

远小于 0.01，表示模型的显著性极好，所得多项回归

方程可以准确反映各因素对响应值的影响。模型中

的自变量一次项变量E、F、G和二次项EF、EG、E2

、F2

、

G2

的 P值都小于 0.05，说明 E、F、G是重要的模型项且

具有显著作用。其中预测系数 R2

与决定系数 R2

差值

为0.015 7表明该模型的预测结果与实际结果的合理

一致性，准确性>4，表示该单因素响应面模型信号充

足，可以用于模型预测设计。其决定系数R2

为0.996 1，

表明99.61%以上的响应值均可由该模型解释。因此

可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行

分析。

通过Design-Expert 13软件进行二次响应面回归分析，得到多元二次响应面回归模型：

Z=0.707 4−0.012 0E+0.004 5F−0.005 0G−0.009 7EF+0.008 3EG−0.001 7FG−0.035 8E2−0.042 8F2

−

0.035 8G2

式中：Z——OD600读数；

E——发酵桔皮浓度（g/L）；

F——葡萄糖浓度（g/L）；

G——酵母浸膏浓度（g/L）。

3.4.3 三维响应面分析

根据二次多项回归方程绘制出响应面，发酵桔皮

浓度与葡萄糖浓度的响应曲面如图 6，发酵桔皮浓度

与酵母浸膏浓度的响应曲面如图 7，葡萄糖浓度与酵

母浸膏浓度的响应曲面如图8。

根据发酵桔皮浓度、葡萄糖浓度与酵母浸膏浓度

两两之间的响应曲面表明，在发酵桔皮浓度E坐标轴

上，OD600读数变化最快，而在酵母浸膏浓度 G 的坐标

轴方向，OD600读数变化较慢，说明发酵桔皮浓度的影

响水平较大。其中图 6的响应面扭曲最大，说明发酵

桔皮浓度与葡萄糖浓度之间是具有明显交互作用；

图 7的响应面扭曲程度也是显著的，说明发酵桔皮浓

度与酵母浸膏浓度之间是具有交互作用。其中EF的

P 值小于 0.05，证实正交试验中发酵桔皮浓度和葡萄

糖浓度之间的交互影响作用，说明发酵桔皮的添加对

OD600读数的影响并不是简单的线性关系，其中二次

项 EF、EG的 P值小于一次项 E、F的 P值，且 P值均小

于0.05；说明该发酵桔皮对培养基中主要成分的交互

影响作用大于其自身，表明发酵桔皮的添加可以刺激

酿酒酵母的生长与代谢。

3.5 酵母发酵培养基优化结果

3.5.1 优化前后酵母数量的对比

通过Design-Expert 13软件优化结果见图9，在此

预测条件下酵母浓度为 0.709，具有 97.9% 的可信度。

98

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

通过对酿酒酵母进行培养后酵母浓度为 0.695，达到

了响应面分析预测值的 98.3%；相对于不添加发酵桔

皮的优化培养基，酵母浓度提高了 37.4%；与不添加

发酵桔皮的初始培养基相比，酵母浓度提高了 130%

（见图10）。

105

0.7

Z 1.5

0.72

0.68

0.66

0.64

0.62

0.6

1.7 1.9 2.1 2.3 2.5 90

100 95

110

E(g/L) F(g/L)

图6 E与F响应面3D建模

12.5

0.7

Z 1.5

0.72

0.68

0.66

0.64

0.62

0.6

1.7 1.9 2.1 2.3 2.5 11

12 11.5

13

E(g/L) G(g/L)

图7 E与G响应面3D建模

12.5

0.7

Z

90

0.72

0.68

0.66

0.64

0.62

0.6

95 100 105 110 11

12 11.5

13

F(g/L) G(g/L)

图8 F与G响应面3D建模

3.5.2 酵母生长曲线绘制

通过 Design-Expert 13 软件优化结果，表明酵母

发酵最佳培养基为葡萄糖 100.756 g/L、蛋白胨 8 g/L、

酵母浸膏11.906 g/L、发酵桔皮浓度1.906 g/L、无水硫

酸镁 2 g/L、尿素 2 g/L、磷酸二氢钾 5 g/L。基于响应

面分析得到的最优培养基培养酿酒酵母，以添加发酵

桔皮的培养基为试验组，不添加发酵桔皮的培养基为

对照组，绘制出酿酒酵母生长曲线，如图 11所示。发

现发酵桔皮添加能够在各个时间段明显提高酵母活

菌数量，并且缩短酵母进入对数生长期的时间。

3.6 桔皮发酵物成分检测结果

发酵桔皮与未发酵桔皮中营养成分比较见表 7。

通过对桔皮进行发酵处理后，发酵桔皮中的脂肪含量

下降 51.99%，总黄酮含量、橙皮苷含量、多糖、蛋白质

含量得到了明显的提高，使得发酵桔皮中含有更多可

供酵母吸收和利用的相关物质。

图9 响应面模型优化结果

4 讨论

黄酮是一类具有促生长、免疫调节、抗菌的天然

植物化合物，其来源广泛并且应用前景广阔。通过对

发酵桔皮和未发酵桔皮的成分进行测定，发现经过发

99

试 验 研 究 2023年第44卷第21期 总第690期

酵后桔皮中相关营养物质的含量大幅度提高，其中发

酵桔皮中的总黄酮含量是未发酵桔皮的3.24倍，橙皮

苷的含量为之前的 1.86 倍，蛋白质含量为之前的

4.71 倍。说明通过对桔皮进行发酵处理后，不但桔皮

中有效的中药成分总黄酮含量得到了提高，而且降低

了其中的脂肪含量，提高了多糖以及蛋白质等可供酵

母菌生长的小分子营养物质的含量。其中橙皮苷是

由橙皮素和芸香糖构成的一种重要的二氢黄酮类物

质，具有较高的抗氧化功能。使得酵母细胞的衰老速

度下降，更具有生物活力，使得酵母的生长速度提高。

左瑞华等[27]

研究发现蕨菜黄酮可以提高肉鸡的平均

日增重量。杨汝才等[28]

在饲料中添加辣木黄酮显著

降低了雏鸭血清中丙二醛（MDA）含量。王咏梅等[29]

在饲料中添加桑叶黄酮使得虾的抗氧化性能得到提

高。因此，桔皮经过发酵后可以凭借其自身无污染、

高蛋白、高抗氧化的特性作为酵母的生长刺激因子用

于酵母高蛋白饲料的生产中。

表7 发酵桔皮与未发酵桔皮营养成分

成分

未发酵桔皮

发酵桔皮

总黄酮

(mg/g)

5.92

19.21

橙皮苷

(%)

2.25

4.18

多糖

(%)

8.99

12.03

蛋白质

(%)

3.91

18.40

脂肪

(%)

10.56

5.07

5 结论

在单因素试验基础上，经过正交试验选出关键影

响因子，结合响应面优化分析获得了酿酒酵母培养基

的相关数学模型，推测出最佳培养条件为：葡萄糖

100.756 g/L、蛋白胨 8 g/L、酵母浸膏 11.906 g/L、发酵

桔皮浓度 1.906 g/L、无水硫酸镁 2 g/L、尿素 2 g/L、磷

酸二氢钾 5 g/L。在此条件下酵母浓度为 0.695，是初

始发酵培养基的1.3倍。与不添加发酵桔皮的检测结

果对比，发酵桔皮可以提高酿酒酵母增殖速率，促进

酿酒酵母生长，加快酵母进入对数生长期，是一种高

效的生长刺激剂。本试验丰富了酵母的繁殖环境，提

高了酵母的发酵能力，为酵母饲料工业生产高蛋白饲

料、提高相关酵母培养物产量以及降低生产成本提供

一种新的途径。

参考文献

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酵母活菌检测值(OD600)

原始发酵培养基

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

0.302

0.541

0.452

0.642

正交优化培养基 响应面优化培养基

0.506

不加发酵桔皮 0.695

加发酵桔皮

发酵培养基种类

图10 优化前后酿酒酵母活菌对比

酵母活菌OD600

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

26

0.531

0.715

实验组

对照组

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

酵母培养时间（h）

图11 酿酒酵母生长曲线

100

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法

测定配合饲料中阿奇霉素含量

■ 朱万燕1 徐文远1* 张鸿伟2 伦才智1 鲍春晓1 徐 豪1 徐久飞1 王正国1

（1.临沂海关综合技术服务中心，山东临沂 276034；2.青岛海关技术中心，山东青岛 266000）

摘 要：试验旨在建立配合饲料中阿奇霉素含量的超高效液相色谱-串联质谱检测法。样品经水

和乙腈提取，以氯化钠为盐析剂，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和氨丙基硅胶键合相吸附剂萃取

净化，采用0.1%甲酸水溶液（内含5 mmol/L乙酸铵）-乙腈为流动相，在电喷雾离子源正离子多反应监

测模式下进行测定，基质外标法定量。结果表明：阿奇霉素在1.0~50.0 μg/L范围内线性关系良好，相关

系数大于0.999，方法定量限为2.0 μg/kg，在2.0、4.0、8.0 μg/kg加标水平下（n=6）回收率为75%~90%，相

对标准偏差不高于8.7%。说明该法简单、快速、准确，适用于饲料中阿奇霉素的测定。

关键词：阿奇霉素；QuEChERS；配合饲料；超高效液相色谱-串联质谱法；检测

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.21.016

中图分类号：S816.17 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）21-0101-06

Determination of Azithromycin in Compound Feed by QuEchERS Purification Coupled with

Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHU Wanyan1

XU Wenyuan1*

ZHANG Hongwei2

LUN Caizhi1

BAO Chunxiao1

XU Hao1

XU Jiufei1

WANG Zhengguo1

(1.Comprehensive Technology Center of Linyi Customs, Shandong Linyi 276034, China;

2. Technology Center of Qingdao Customs, Shandong Qingdao 266000, China)

Abstract：An analytical method was established

for the determination of azithromycin in compound

feed by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The

samples were extracted by H2O and acetonitrile,

作者简介：朱万燕，硕士，研究方向为商品分析检测。

*通讯作者：徐文远，高级工程师。

收稿日期：2023-08-25

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（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

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101

饲 料 检 测 2023年第44卷第21期 总第690期

and NaCl was used as salting-out agent in this experiment. Extraction liquid was purified by dispersivesolid phase extraction with PSA and -NH2 sorben, and finally detected by UPLC-MS/MS in multiple re⁃

action monitoring mode (MRM) via positive electrospray ionization (ESI), using 0.1% formic acid contain⁃

ing 5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase,matrix standard curve quantification.The results showed

that the correlation coefficient of the standard calibration curves for azithromycin in the concentration

range of 0~50.0 μg/L was above 0.999. The limit of quantification was 2.0 μg/kg. The blank samples

were spiked at three levels (2.0、4.0、8.0 μg/kg), and the average recoveries were between 75%~90% (n=

6), and the relative standard deviations were no more than 8.7%. It indicated that the method is simple,

rapid and accurate; it is suitable for the determination of azithromycin in compound feed.

Key words：azithromycin; QuEChERS; compound feed; ultra performance liquid chromatography-tandem

mass spectrometry (UPLC-MS/MS); determination

随着人民生活水平的提高，动物源性产品的数量

已不再是人民首要关注的问题，其质量安全成为人民

关注的重点。饲料质量安全是影响动物源性产品质

量安全的重要因素之一。阿奇霉素作为新一代大环

内酯类广谱抗生素，对于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性

菌以及厌氧菌都具有较好的抗菌效果，受到养殖业的

青睐，被越来越多地作为饲料添加剂应用在动物身

上。养殖业不合理使用阿奇霉素，一方面可诱发耐药

菌株，通过食物链迁移到人体，产生耐药性[1]

；另一方

面，人食用含有阿奇霉素残留的动物食品后，会在体

内蓄积，损害胃肠、肝胆、血液、神经系统。有关调查

表明，因阿奇霉素的滥用已产生耐药菌株。因此，建

立饲料中阿奇霉素的检测方法对于监控饲料质量安

全、进而保证食品安全具有重要意义。

兽药残留检测的方法主要有酶联免疫法[2]

、气相色

谱质谱法[3]

、高效液相色谱法[4]

、液相色谱-质谱联用

法[5-7]

。液相色谱-质谱联用法因具有定性准确、灵敏度

高等优点，成为目前积极推广应用的检测方法。目前，

报道较多的是关于阿奇霉素在动物性食品中的残留检

测研究[8-10]

，饲料中阿奇霉素的残留检测鲜有报道[11]

。

QuEChERS技术因具有简单、快速、环保、成本低等特

点，已越来越多地被应用在兽药残留前处理中[12-14]

。本

试验以饲料为检测基质，以QuEChERS方法进行前处

理，建立了饲料中阿奇霉素的超高效液相色谱串联质谱

（ultra performance liquid chromatography-tandem mass

spectrometry,UPLC-MS/MS）检测方法，方法准确、简单、

快速、省时省力，可以为饲料中阿奇霉素的安全监督提

供技术支持，从而有效控制动物源性产品污染。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290-6470 型超高效液相色谱串联质谱

仪，购自美国Agilent公司；CR22GⅢ高速冷冻离心机，

购自日本 HITACHI 公司；ULTRA-TURRAX T25 型均

质器，购自德国 IKA公司；GENIUS 3基本型涡旋混匀

器，购自德国 IKA公司；HS260型多用调速振荡器，购

自德国 IKA 公司；Caliper TurboVap LV 氮吹仪，购自

美国公司。

阿 奇 霉 素 标 准 品（CAS 号 83905-01-5，纯 度

94.4%），BePure 标准物质；乙腈（色谱纯），购自美国

MREDA公司；甲醇（色谱纯），购自美国LabServ公司；

甲酸（色谱纯），购自天津市光复精细化工研究所；氯

化钠（分析纯），购自天津博迪化工股份有限公司；中

性氧化铝、十八烷基硅胶键合相（C18）、乙二胺-N-丙

基硅烷（PSA）、阴离子交换混合机理的水可浸润型聚

合物（PAX）、石墨化炭黑（GCB）、氨丙基硅胶键合相、

阳离子交换混合机理的水可浸润型聚合物（PCX），均

购自天津 Bonna-Agela 公司；试验用水为美国 Milli⁃

pore纯水系统制得的超纯水。

1.2 标准溶液配制

标准储备液的配制：准确称取经纯度折算后的

阿奇霉素标准物质 50 mg，置于 50 mL 烧杯中，用甲

醇溶解并定量转移至 50 mL 容量瓶中，既得浓度为

1 000 μg/mL的标准储备溶液。

标准中间液的配制：准确量取适量体积的阿奇霉

素标准储备溶液，用甲醇稀释成 50 μg/mL 的标准中

间液。

1.3 样品前处理

提取：称取 2.0 g样品，精确至 0.01 g，置于 50 mL

离心管中，加入 8 mL 水，涡旋 1 min，静置 30 min，将

样品充分浸润分散，再加入 3 g 氯化钠和 8 mL 乙腈，

102

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

振荡提取 30 min，10 000 r/min 离心 5 min，取 6 mL 上

清液待净化。

净 化 ：将 6 mL 上 清 液 加 入 含 有 200 mg 乙 二

胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）和 100 mg 氨基吸附剂

的 15 mL 离心管中，涡旋 1 min，10 000 r/min 离心

5 min，再取 5 mL上清液于另一离心管中，氮吹至干，

用 1 mL 乙腈-0.1% 甲酸水溶液（体积比 25∶75），复

溶，过0.22 μm滤膜，上UPLC-MS/MS测定。

1.4 仪器工作条件

超高效液相色谱条件：Eclipse Plus C18 色谱柱

（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相 A 为 0.1% 甲酸水

溶液（内含 5 mmol/L 乙酸铵），B 为乙腈，梯度洗脱程

序：0~2.5 min，10%~95% B；2.5~3.5 min，95% B；3.50~

3.51 min，10%~95% B；3.51~8.00 min，10% B；流速：

0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：AJS 电喷雾离子源，正离子模式/多反

应离子监测模式（MRM）；干燥气温度（Gas Temp）：

300 ℃；干燥气流速（Gas Flow）：10 L/min；雾化气压

力（Nebulizer）：138 kPa；鞘气温度（Sheath Gas Temp）：

300 ℃；鞘气流速（Sheath Gas Flow）：12 L/min；毛细

管电压（Capillary）：2 500 V；喷嘴电压（nozzle voltage）：

0 V；Delta EMV（+）：400 V；阿奇霉素的母离子、子离

子 、保 留 时 间 、毛 细 管 出 口 电 压 、碰 撞 能 等 参 数

见表 1。

表1 阿奇霉素的质谱参数

项目

阿奇霉素

母离子(m/z)

750.0

子离子(m/z)

158.3*

591.8

传输电压(V)

130

40

33

碰撞能(eV) 驻留时间(ms)

150

150

注：“*”表示定量离子。

×106 mAu

100 150 200 250 1 000

1.1

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950

质荷比(m/z)

图1 阿奇霉素的母离子扫描图

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

查阅相关文献，阿奇霉素多采用正离子模式监测，

试验以1.0 μg/mL阿奇霉素标准溶液为研究对象，在不

接色谱柱的情况下直接进质谱仪优化参数。具体在正

离子全扫描模式下，确定目标化合物的母离子，同时优

化毛细管出口电压，结果表明，阿奇霉素的质谱响应不

是很高，只优化毛细管电压达不到理想效果，本试验在

厂家推荐的起始离子源参数基础上，对离子源参数进行

了进一步优化。试验发现，喷嘴电压由500 V降到0 V

即去掉喷嘴电压后，目标化合物的响应提高了一倍；目

标化合物的响应随着雾化器压力的升高反而降低，雾化

器压力由241 kPa调至138 kPa时，目标化合物响应提

高了50%；此外，在不影响化合物响应的基础上，为了尽

量延长鞘气加热组件的使用寿命，将鞘气温度由400 ℃

降至300 ℃。阿奇霉素的质谱扫描图见图1和图2。

2.2 色谱条件的选择

比较了Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），

Waters cortees UPLC C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），

XBridge peptide BEH C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），

HT C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）四种色谱柱，阿奇

霉素在 Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）色

谱柱上的峰型、响应最好，且可实现阿奇霉素与样品

基质的基线分离。

103

饲 料 检 测 2023年第44卷第21期 总第690期

经参考文献，试验比较了乙腈-0.1% 甲酸溶液、乙

腈-0.2% 甲酸溶液、乙腈-0.4% 甲酸溶液、乙腈-0.1%

甲酸溶液（内含5 mmol/L乙酸铵）四种流动相体系，结

果显示：随着甲酸溶液浓度的增加，阿奇霉素的响应没

有明显变化；当甲酸溶液中加入5 mmol/L的乙酸铵时，

阿奇霉素的响应明显提高，且峰型有所改善，最终选择

乙腈-0.1%甲酸溶液（内含5 mmol/L乙酸铵）作为本研

究的流动相。阿奇霉素的MRM色谱图见图3。

图3 阿奇霉素（5 μg/L）的MRM谱图

×103 mAu

1.5 2 2.5 3 6

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

3.5 4 4.5 5 5.5

计数与采集时间(min)

（a）定量离子

×103 mAu

1.5 2 2.5 3 6

5

4

3

2

1

0

3.5 4 4.5 5 5.5

计数与采集时间(min)

（b）定性离子

2.3 提取溶剂的优化

试验发现，当直接用乙腈提取配合饲料中的阿奇

霉素时，回收率仅为 30% 左右，且用空白样品基质提

取溶液配制标准溶液时基质效应严重；而当先加入

水，之后再用乙腈提取时，回收率明显提高，达到80%

以上。这可能是由于所用的饲料是干制样品，加入水

后一方面可以使样品充分分散，有利于阿奇霉素的提

取，另一方面样品中的部分极性干扰物质被提取到水

中析出，降低了阿奇霉素的基质效应。试验进一步对

水和乙腈的用量进行了优化，比较了4 mL水+4 mL乙

腈、4 mL 水+6 mL 乙腈、4 mL 水+8 mL 乙腈、4 mL

水+10 mL乙腈、6 mL水+6 mL乙腈、6 mL水+8 mL乙

腈、6 mL 水+10 mL 乙腈、8 mL 水+8 mL 乙腈、8 mL

水+10 mL 乙腈、10 mL 水+10 mL 乙腈对阿奇霉素提

取效率的影响，结果见图4。从图中可以看出，当水和

乙腈的用量达到 8 mL 时，阿奇霉素的回收率在 80%

以上，之后随着水和乙腈用量的增加，回收率没有明

显变化，综合考虑回收率及成本、环保等因素，最终选

择8 mL水+8 mL乙腈为本试验的提取溶剂。

2.4 净化条件的优化

净化条件关系到整个试验的效果，在不影响回收

率的情况下尽量去除提取液中的杂质是试验的目标，

试验过程中分三个步骤对净化条件进行了优化：①吸

附剂种类的初筛；②吸附剂去除杂质效果的比较；③

吸附剂用量的优化。

吸附剂种类的初筛。首先考察了各种吸附剂对目

标化合物的吸附性，具体方法如下：在浓度为20 μg/L

的标准溶液中，分别加入中性氧化铝、C18、PSA、

PAX、GCB、NH2、PCX，经充分振荡并离心后，取上清

液过滤膜上机测定，比较标准溶液浓度前后有无变

化。结果显示，经 C18、PAX、GCB、PCX 吸附后，标准

溶液浓度明显降低，表明这四种吸附剂对阿奇霉素有

×104 mAu

100 150 550

1.1

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

200 250 300 350 400 450 500 600 650 700 750 800

质荷比(m/z)

图2 阿奇霉素的子离子扫描图

104

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

图4 提取溶剂不同体积对回收率的影响

回收率（%）

4 mL水+4 mL乙腈

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

4 mL水+6 mL乙腈

4 mL水+8 mL乙腈

4 mL水+10 mL乙腈

6 mL水+6 mL乙腈

6 mL水+8 mL乙腈

6 mL水+10 mL乙腈

8 mL水+8 mL乙腈

8 mL水+10 mL乙腈

10 mL水+10 mL乙腈

很强的吸附作用；而经中性氧化铝、氨基、PSA 吸附

后，标准溶液浓度基本没有变化，表明这三种吸附剂

对阿奇霉素的吸附作用小。因此，初步选定中性氧化

铝、氨基、PSA对提取液进行净化。

吸附剂去除杂质效果的比较。试验比较了中性

氧化铝、氨基、PSA 及两两组合对提取液的净化效果

及对阿奇霉素回收率的影响。结果表明，这几种吸附

剂无论是单独使用还是两两组合使用，其回收率相差

不大，但 PSA 和氨基组合使用时，其基质效应是最小

的，原因可能是，PSA 主要去除提取液中的脂类和糖

类物质，氨基对提取液中的弱酸性物质吸附性强，两

者组合使用净化效果更好。

吸附剂用量的优化。比较了 50~400 mg PSA 与

50~400 mg氨基按不同比例组合时的净化效果。结果

表明，200 mg PSA 与 100 mg 氨基组合时提取液颜色

最浅、净化效果最好，基质效应最小。

3 方法学考察

3.1 基质效应

参考相关文献[15]

，试验通过比较空白基质匹配标

准溶液中待测物质的峰面积（A1）与溶剂标准溶液中

待测物质的峰面积（A2）的大小来评估方法的基质效

应：当两者的比值(A1/A2)等于 1 时，表明没有基质影

响；当两者比值小于 1时，表明有基质抑制效应；当两

者比值大于 1 时，表明有基质增强效应。具体方法：

取空白饲料样品，按1.3步骤进行处理，最后用浓度分

别为 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的标准溶液复

溶，制得基质匹配标准溶液，同时配制相同浓度的溶

剂标准溶液，比较两种标准溶液中待测物质的峰面积，

结果见表2。从表2可以看到比值均大于1，表明该法

测定饲料样品中的阿奇霉素存在基质增强效应，而且

低浓度时的基质效应要强于高浓度时。为抵消基质效

应的影响，本试验用基质匹配的标准溶液进行定量。

表2 阿奇霉素的基质效应

浓度(μg/L)

1.0

2.0

5.0

10.0

20.0

50.0

基质标准峰面积(A1，mAu×min)

582

1 214

3 285

6 495

11 545

27 802

溶剂标准峰面积(A2，mAu×min)

374

720

2 021

4 095

9 158

21 951

A1/A2

1.56

1.69

1.62

1.58

1.26

1.27

3.2 线性关系和检出限

取空白配合饲料样品，按1.3步骤进行处理，待氮

吹干后，用1 mL系列浓度的标准溶液复溶，配制成浓

度在 1~50 μg/L 范围内的基质标准曲线溶液，进超高

效液相色谱-串联质谱仪进行测定；以阿奇霉素的浓

度为横坐标，以其定量离子峰面积为纵坐标，绘制标

准曲线。用上述同样的方法，配制浓度逐步降低的基

质标准溶液，直到获得目标化合物的信噪比等于 10

的浓度，确定为该化合物的定量限（LOQ）。阿奇霉素

的线性关系及定量限见表 3。结果表明，阿奇霉素在

1~50 μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数（r

2

）

为0.999 1，定量限为2.0 μg/kg

3.3 回收率和精密度

用经测定不含有阿奇霉素的配合饲料作为空白

105

饲 料 检 测 2023年第44卷第21期 总第690期

样品，添加 3 个质量浓度水平（分别为 LOQ、2LOQ、

4LOQ），按照 1.3步骤进行处理，每个水平做 6个平行

样，计算其加标回收率和相对标准偏差，结果见表 4。

从表 4 可以看出，阿奇霉素的平均加标回收率在

75%~90%之间，相对标准偏差在4.3%~8.7%之间。

4 样品检测

表4 复合饲料中阿奇霉素的加标回收率和相对标准偏差

项目

阿奇霉素

添加量(μg/kg)

2.0

4.0

8.0

测定值(μg/kg)

1.6，1.5，1.7，1.4，1.5，1.4

3.3，3.6，3.1，3.5，2.9，3.6

7.3，7.6，7.0，6.8，7.5，7.0

平均值(μg/kg)

1.5

3.3

7.2

回收率（%）

75.0

82.5

90.0

相对标准偏（%）

7.1

8.7

4.3

从市场上随机购买30份配合饲料（6份产蛋鸡配

合饲料、6份肉鸡配合饲料、6份鸭配合饲料、6份猪配

合饲料和 6 份牛羊配合饲料），应用本试验建立的方

法进行测定，其中有 1份产蛋鸡配合饲料检出阿奇霉

素，含量为 5.2 μg/kg，其余样品均未检出。为了验证

该方法，应用龚兰等[11]

建立的“固相萃取净化/高效液

相色谱一串联质谱测定饲料中 7 种大环内酯类药物

含量”的方法对上述阳性样品进行了检测，检出结果

为5.5 μg/kg。

5 结论

试验采用改良的QuEChERS法对样品进行处理，

并结合超高效液相色谱-串联质谱仪，建立了配合饲

料中阿奇霉素残留量的检测方法。试验过程中系统

优化了色谱条件、质谱条件、提取溶剂以及净化条件

等；除此之外，为验证方法的适用性，还具体考察了方

法的基质效应、线性关系、回收率和精密度。结果表

明，所建立的方法操作简单，省时省力，提取回收率

高，重复性好，满足兽药残留分析的要求，可以为饲料

质量安全监督及饲料安全检测标准体系的完善提供

技术支持。

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同时测定蜂蜜中 60 种兽药残留[J]. 分析试验室, 2013, 32(4):

82-88.

[14] 魏玉霞, 王芳, 左郡, 等. QuEChERS-超高效液相色谱-串联质

谱法同时测定淡水鱼和淡水虾中的11种喹诺酮类兽药残留量

[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(7): 2906-2912.

[15] 丁奇, 王建凤, 冯月超, 等 . 高效液相色谱-串联质谱法测定鱼

肠道内容物中 32 种抗生素残留[J]. 食品安全质量检测学报,

2022, 13(4): 1141-1149.

（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

表3 阿奇霉的线性范围、线性方程、相关系数和定量限

项目

阿奇霉素

线性范围(μg/L)

1~50

线性方程

Y=555.8X+161.6

相关系数(r

2

)

0.999 1

定量限(μg/kg)

2.0

106

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

不同种类树叶饲料对林麝日粮养分

表观消化率和氮平衡的影响

■ 蒋桂梅1 王建明1 吴 杰1 陈 凤1 郑程莉1 王 欢1 司华哲2*

（1.四川养麝研究所，四川都江堰 611830；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118）

摘 要：试验旨在研究不同种类树叶饲料对林麝营养物质表观消化率和氮平衡的影响。选取12头

年龄相同、体况良好的雄性林麝[体重（8.0±0.5） kg]，随机分为 6组。试验采用 6×6拉丁方设计，整个

试验期为84 d，共分为6期，每期14 d（预试期11 d，正试期3 d），按照树叶饲料种类分为青皮藤组、桑

树叶组、三角枫叶组、榆树叶组、苦楝树叶组及以上树叶等比混合的混合叶组，共 6 组。结果表明：

①桑树叶组基础饲粮和树叶采食量与其他组差异不显著（P>0.05）；桑树叶组日粮采食总量显著低于

混合树叶组（P<0.05），但与其他组差异不显著（P>0.05）。②日粮粗蛋白（CP）、粗灰分（Ash）、钙（Ca）、

碳水化合物（CHO）、总能（GE）、中性洗涤纤维（NDF）表观消化率以桑树叶组较高（P<0.05）。③桑树

叶组沉积氮和氮利用率较高（P<0.05）。由此可见，林麝以桑树叶为粗饲料时日粮表观消化率和氮利

用率较高。

关键词：林麝；树叶；采食量；表观消化率；氮平衡

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.21.017

中图分类号：S816.11 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）21-0107-06

Effects of Different Leaves on Nutrient Apparent Digestibility and Nitrogen Balance in

Forest Musk Deer

JIANG Guimei1

WANG Jianming1

WU Jie1

CHEN Feng1

ZHENG Chengli1

WANG Huan1

SI Huazhe2*

(1. Sichuan Institute of Musk Deer Breeding, Sichuan Dujiangyan 611830, China; 2. College of Animal

Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China)

Abstract：This experiment was conducted to investigate the effects of different leaves on feed intake, nutri⁃

ent apparent digestibility and nitrogen balance in forest musk deer. Twelve male forest musk deers (Moschus

Berezovskii) of similar age and good health were used in a 6×6 Latin square design with 2 replicates per

group. The ration consists of base material and the leaves. Green rattan, mulberry leaves, triangular maple

leaves, elm leaves, Melia azedarach leaves and mixture of the above five leaves in equal proportion were

used in each group. The results showed as follows: ① the intake of base material and leaves in mulberry

leaves group had no significant difference from those in other groups (P>0.05). The intake of total ration in

mulberry leaves group was significantly lower than that in mixed group (P<0.05), but had no significant dif⁃

ference with the rest groups (P>0.05). ②The apparent digestibility of dry crude protein (CP), crude ash, cal⁃

cium, carbohydrate (CHO), total energy (GE) and neutral detergent fiber (NDF) in mulberry leaves group

were significantly higher than those in other groups

(P<0.05). ③ The retention nitrogen and nitrogen

utilization in mulberry leaves group were higher

than those in other groups (P<0.05). It is concluded

that the apparent digestibility and nitrogen utiliza⁃

tion of ration are higher in mulberry leaves group.

Key words：forest musk deer; leaf; intake; appar⁃

ent digestibility; nitrogen balance

作者简介：蒋桂梅，硕士，助理研究员，研究方向为反刍动

物营养。

*通讯作者：司华哲，博士，讲师。

收稿日期：2023-09-04

基金项目：四川省重点研发项目[2019YFS0186]；四川省

科研院所科技成果转化项目[2023JDZH0029]

107

特 种 养 殖 2023年第44卷第21期 总第690期

我国有丰富的树木资源，其中多数树木的叶子、

嫩枝及果实都可用作畜禽的饲料原料，树叶资源的饲

料化利用可在一定程度上缓解饲料与粮食供求之间

的矛盾，利用当地优势树木种类资源，开发非常规饲

料资源、提高资源的利用率是保证畜牧业可持续健康

发展的重要途径。树叶具有较高的营养价值，例如新

鲜的榆树叶（Ulmus pumila L.）中粗蛋白含量为 7.5%,

无氮浸出物含量为14%，此外还含有丰富的矿物质和

胡萝卜素[1]

。樊金玲[2]

发现榆树叶中含有大量的类胡

萝卜素，其主要组分为叶黄素和β-胡萝卜素。杨树叶

富含多种必需氨基酸，部分氨基酸含量高于谷类作

物[3]

。部分地区的刺槐、紫穗槐和桑叶（Folium mori）

的蛋白质含量可达20%以上，可作为畜禽优质的蛋白

质和维生素来源[4]

。其中，桑叶营养全面、成本低、产

量大[5-6]

，在牛、羊、兔等草食动物中已被证明有较好

的应用效果。据文献记载，桑叶有提高动物采食量及

生长性能、改善瘤胃内环境、促进瘤胃内微生物纤维

分解酶产生、增强消化率的作用[7-9]

。在饲粮中添加

鲜桑叶可提高母兔繁殖性能和血清瘦素水平，降低血

脂含量[10]

。饲粮配合8%的饲料桑叶可以显著提高育

肥湖羊平均日增重、胴体脂肪含量、瘤胃背囊肌层厚

度和背囊的乳头长度，有利于瘤胃发育，显著提高湖

羊血清中谷胱甘肽过氧化物酶活力，提高总抗氧化能

力[11]

。桑叶调制成的桑叶青贮饲料，可作为反刍动物

高质量饲料来源或生物活性药物，可改善瘤胃微生物

群落，提高羔羊的抗氧化能力和免疫调节能力[12]

。林

麝（Moschus berezovskii）属偶蹄目麝科，主要栖于针阔

混交林，也适于在针叶林和郁闭度较差的阔叶林生境

生活。杨营等[13]

针对围栏养殖林麝采食植物种类的

调查发现，其可采食植物的种类多达 64种，这些植物

隶属于 31 科，除野草和种植饲草外，还采食青皮藤

[Jasminum elongatum (Bergius) Willd]、桑树叶、三角枫

叶（Acer buergerianum Miq）、榆树叶、苦楝树叶（Melia

azedaeach L.）等树叶类饲料。然而，这些树叶类饲料

对林麝日粮消化率的影响研究鲜见报道。野生林麝

食性较广，圈养林麝由于受到饲养地域、树种分布、

树种数量、树叶产量、采摘条件等因素影响，所食树

叶种类非常有限，通常以榆树叶、桑树叶、青皮藤等

为主，辅以其他杂树叶[14]

。试验旨在研究几种常用

树叶类饲料对林麝营养物质表观消化率和氮平衡的

影响，为不同种类树叶饲料在林麝生产中的科学应

用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计

试验在四川养麝研究所都江堰养麝场选取 12头

体重（8.0±0.5） kg、年龄相同、体况良好的雄性林麝，

随机分为6组，每组2只。试验采用6×6拉丁方设计，

根据树叶饲料种类分为青皮藤组、桑树叶组、三角枫

叶组、榆树叶组、苦楝树叶组及以上树叶等比混合的

混合叶组等六组。整个试验期 84 d，共分为 6 期，每

期14 d，其中预试期11 d、正试期3 d。

1.2 试验日粮及饲养管理

试验日粮由基础饲粮和树叶组成。基础饲粮由

多汁料（南瓜和莴笋，鲜重）与精补料（风干基础）按

5∶1 的重量比例配成，日喂量 600 g，树叶日喂量

80 g，各树叶类饲料的营养水平见表 1。基础饲粮组

成及营养水平见表 2。试验麝每日 08：00 和 16：00 饲

喂两次，自由饮水。

表1 试验用树叶营养水平（风干基础）

项目

粗蛋白(CP，%)

粗脂肪(EE，%)

粗灰分(Ash，%)

钙(Ca，%)

有机物(OM，%)

碳水化合物(CHO，%)

总能(GE，MJ/kg)

酸性洗涤纤维(ADF，%)

中性洗涤纤维(NDF，%)

粗纤维(CF，%)

青皮藤

13.26

2.23

6.97

2.06

85.44

69.95

10.3

24.6

28.6

11.0

桑树叶

17.74

3.55

12.99

2.9

79.43

58.15

10.24

18.1

18.6

10.1

三角枫叶

17.54

2.07

7.75

1.95

84.62

65.01

10.4

15.8

19.8

10.0

榆树叶

17.66

1.02

11.09

2.3

80.9

62.22

9.75

22.9

24.7

9.5

苦楝树叶

13.29

0.45

6.13

1.59

86.93

73.19

10.01

11.90

17.6

9.9

混合叶

16.05

1.27

9.38

2.03

83.33

66.01

9.98

15.2

21.2

11.3

注：营养成分中有机物和碳水化合物为计算值，其余均为实测值。

108

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

表2 试验基础饲粮组成和营养水平(风干基础，%)

原料组成

玉米

豆粕

麸皮

鱼粉

氯化钠

酵母

小苏打

其他

多汁料

合计

含量(%)

42.38

15.14

12.11

1.51

0.45

1.90

1.13

0.88

24.49

100.00

营养水平

粗蛋白(%)

粗脂肪(%)

粗纤维(%)

粗灰分(%)

总能(MJ/kg)

15.84

2.16

5.45

6.01

10.64

注：表中营养水平为实测值。

树叶：在 5 月下旬至 6 月下旬采集各品种鲜嫩树

叶，除去硬枝、杂物，及时摊晒晾干制成风干料，装入

塑料袋密封，放置于阴凉干燥处保存备用。

1.3 样品采集

1.3.1 饲料样品和粪样样品的采集

试验正试期每天采集饲料样本和全部粪样，饲料

样品在65 ℃烘干24~48 h至恒重；粪便样品按收集鲜

重的 25% 加入 10% 酒石酸溶液进行固氮，先在 80 ℃

下杀菌 2 h，然后在 65℃烘干 24~48 h 至恒重，烘干后

的饲料和粪便样品用于干物质测定。粉碎过 40目筛

后进行粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维

等指标的测定。

1.3.2 尿样的采集与分析

试验期每天（24 h）收集全部尿样，取20%的尿样

加入装有二甲苯的广口瓶中，试验期结束后混匀尿

样，冷藏保存备测。

1.4 指标的测定及方法

1.4.1 采食量的测定

正试期每天记录每只动物的饲料投喂量和剩料

量，用于计算干物质采食量（DMI）。

1.4.2 消化指标测定

营养物质表观消化率采用2N盐酸不溶灰分法测

定，计算公式如下：

营养物质表观消化率（%）=100-100×[饲粮中盐酸

不溶灰分含量（%）/粪样中盐酸不溶灰分含量（%）]×[粪

样中营养物质含量（%）/饲粮中营养物质含量（%）]

饲料及粪样的干物质（DM）含量采用GB/T 6435—

2014方法测定，粗蛋白含量参照 GB/T 6432—2018采

用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量参照GB/T 6433—2006

采用索氏抽提法测定，粗纤维含量参照 GB/T 6434—

2006采用过滤法测定，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维

参照 GB/T 20806—2006 采用范氏（Van Soest）纤维分

析法测定，总能采用 ZDHW-3 全自动量热仪测定，钙

含量采用 GB/T 6436—2018 进行测定，粗灰分的含量

采用 GB/T 6438—2007 饲料中粗灰分的方法测定。

计算可利用氮、沉积氮、氮利用率。

可利用氮（g/d）=食入氮-粪氮

沉积氮（g/d）=食入氮-（粪氮+尿氮）

氮利用率（%）=沉积氮/食入氮

1.5 数据处理及统计分析

试 验 数 据 用 Microsoft Excel 2013 整 理 后 采 用

SPSS 22.0中单因素方差分析（one-way ANOVA）进行

均值的差异分析，采用 Duncan’s法进行多重比较，以

P<0.05作为差异显著性判断标准。试验结果以“平均

数±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 不同种类树叶对林麝采食量的影响

由表 3可见，以不同种类树叶作为林麝粗饲料来

源时，三角枫叶组基础饲粮采食量显著高于青皮藤组

（P<0.05），但与其他组无显著差异（P>0.05）；混合叶

组树叶采食量显著高于榆树叶组和苦楝树叶组（P<

0.05），但与其他组无显著差异（P>0.05）；混合叶组饲

粮采食总量显著高于青皮藤组、桑树叶组、榆树叶组

和苦楝树叶组（P<0.05），但与三角枫叶组差异不显著

（P>0.05）。表明饲喂混合树叶更能提高林麝采食量。

表3 林麝以不同树叶为粗饲料时的采食量（风干基础，g/d，n=12）

项目

基础饲粮

树叶

总和

青皮藤组

124.42±8.87b

63.61±5.39ab

188.03±8.55b

桑树叶组

131.94±5.65ab

61.97±6.94ab

193.40±7.45b

三角枫叶组

149.06±3.36a

59.42±7.57ab

208.47±9.03ab

榆树叶组

140.10±6.12ab

49.39±5.09b

191.24±8.87b

苦楝树叶组

144.14±5.40a

48.67±7.25b

192.26±6.49b

混合叶组

145.62±3.40a

78.89±8.67a

224.50±11.00a

P值

0.04

0.04

0.03

注：同行数据肩标无字母或含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不含有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下表同。

2.2 不同种类树叶对林麝日粮营养物质表观消化率

的影响

由表 4可见，以不同种类树叶作为林麝粗饲料来

源时，桑树叶组日粮 CP 表观消化率显著高于其他处

109

特 种 养 殖 2023年第44卷第21期 总第690期

理组（P<0.05）；三角枫叶组 EE 表观消化率显著高于

混合叶组（P<0.05），但与其他处理组差异不显著（P>

0.05）；各处理组间 Ash的表观消化率无显著差异（P>

0.05）；桑树叶组日粮 Ca、OM、CHO、GE、ADF、NDF 表

观消化率显著高于榆树叶组和混合叶组（P<0.05），但

与其他处理组差异不显著（P>0.05）；榆树叶组日粮

CF 表观消化率显著低于其他处理组（P<0.05）。表明

本试验条件下，以桑树叶为林麝粗饲料时，日粮 CP、

Ca、OM、CHO、GE、NDF表观消化率更高，更利于林麝

消化。

表4 不同树叶对林麝日粮表观消化率的影响（%，n=12）

项目

CP

EE

Ash

Ca

OM

CHO

GE

ADF

NDF

CF

青皮藤组

69.10±1.56b

58.78±4.19ab

42.76±1.60

38.24±4.00ab

79.69±1.02ab

82.52±0.95abc

77.89±1.04ab

52.28±3.19a

66.31±2.14ab

64.12±1.64a

桑树叶组

76.98±1.13a

54.04±3.50ab

48.40±2.69

44.42±4.72a

82.28±0.74a

84.66±0.60a

80.15±0.86a

57.19±3.06a

72.68±1.53a

65.15±1.68a

三角枫叶组

71.28±1.32b

63.67±3.19a

47.44±2.28

41.26±1.51ab

80.72±0.63ab

83.47±0.51abc

79.11±0.73ab

60.55±1.76a

71.13±2.08a

66.44±0.69a

榆树叶组

70.31±1.83b

55.31±5.29ab

41.36±3.34

33.34±4.14b

78.27±1.32b

80.81±1.18c

76.54±1.41b

44.05±4.17b

63.87±2.08b

57.88±2.39b

苦楝树叶组

71.10±2.46b

61.65±5.89ab

49.24±3.58

42.23±3.97ab

81.09±1.32ab

83.63±1.08ab

79.65±1.47ab

55.36±3.71a

69.31±3.23ab

63.43±2.39a

混合叶组

68.89±1.03b

48.91±4.54b

41.32±3.09

31.31±2.18b

78.39±0.64b

81.34±0.58bc

76.36±0.71b

42.59±3.04b

62.40±2.58b

63.39±1.16a

P值

0.011

0.230

0.168

0.091

0.039

0.022

0.070

0.001

0.016

0.026

2.3 不同种类树叶对林麝日粮氮平衡的影响

由表 5可见，以不同种类树叶作为林麝粗饲料来

源时，混合叶组食入氮显著高于青皮藤组和苦楝树叶

组（P<0.05）；桑叶组组粪氮显著低于混合叶组（P<

0.05），但与其他组差异不显著（P>0.05）；尿氮各组间

差异不显著（P>0.05）；桑树叶组、三角枫叶组和混合

叶组可利用氮和沉积氮显著高于青皮藤组和苦楝树

叶组（P<0.05），但与榆树叶组差异不显著（P>0.05）；

桑树叶组和三角枫叶组沉积氮显著高于青皮藤组（P<

0.05），但与其他组差异不显著（P>0.05）；各组间氮利

用率差异不显著（P>0.05），但桑树叶组较其他组有升

高趋势。表明本试验条件下，以桑树叶作为林麝粗饲

料来源时，日粮氮利用率更高，更有利于氮的吸收

利用。

表5 不同树叶对林麝日粮氮平衡的影响(n=12)

项目

食入氮(g/d)

粪氮(g/d)

尿氮(g/d)

可利用氮(g/d)

沉积氮(g/d)

氮利用率(%)

青皮藤组

4.47±0.22b

1.39±0.11bc

1.95±0.17

3.08±0.15b

1.13±0.10b

25.67±2.36

桑树叶组

5.00±0.20ab

1.16±0.07c

2.13±0.15

3.85±0.16a

1.72±0.22a

33.42±3.84

三角枫叶组

5.43±0.24a

1.59±0.11ab

2.14±0.16

3.84±0.17a

1.69±0.18a

31.87±2.88

榆树叶组

4.94±0.20ab

1.49±0.13abc

2.18±0.20

3.45±0.11ab

1.26±0.68ab

25.67±3.91

苦楝树叶组

4.45±0.15b

1.30±0.13bc

1.84±0.19

3.14±0.12b

1.31±0.14ab

29.25±3.27

混合叶组(n=12)

5.58±0.26a

1.75±0.12a

2.22±0.16

3.83±0.16a

1.61±0.21ab

28.36±3.06

P值

0.001

0.010

0.617

0.000

0.065

0.430

3 讨论

苦楝树叶是楝科落叶乔木苦楝树的叶子，含有毒

成分苦楝素和苦楝萜酮内酯，畜禽喜吃，但食量过大

会引起中毒[15]

。本研究中，饲喂苦楝树叶组和榆树叶

组林麝树叶的采食量显著低于混合叶组，这可能是苦

楝树叶中的苦味物质苦楝素和苦楝萜酮内酯影响采

食后的生理感受，使得林麝不喜多采食此种树叶，该

结果有待进一步研究。王道坤[16]

研究发现榆树叶含

粗蛋白 22.4%，粗脂肪 2.5%。王永奇等[17]

报道，兴山

榆树叶的粗蛋白为 13.4%。本试验使用的榆树叶粗

蛋白为 17.66%。粗蛋白含量的不同可能与榆树叶产

地、品种及收获时期不同有关。动物对植物的采食受

到植物营养价值特性的影响[18]

。有研究发现，树叶叶

片中 CP、NDF 及 ADF 含量是影响黇鹿对叶片采食的

重要因素，即黇鹿对叶片的采食量与 NDF 和 ADF 含

量呈负相关，与 CP 含量呈正相关[19]

。本试验中所用

榆树叶和青皮藤粗蛋白含量不高，而 ADF 和 NDF 含

量较高（分别为 22.9% 和 24.7%），林麝对这两种树叶

的采食量较低，这与黇鹿对树叶的采食选择相似。

Liu 等[20-21]

研究发现，使用桑叶替代生长羔羊氨化稻

草日粮中的菜籽粕，可促进干物质采食量的提高，且

桑叶作为粗饲料可改善绵羊瘤胃微生态环境，并改善

110

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第21期 总第690期

瘤胃营养物质平衡。在本研究中，桑树叶组基础饲粮

和树叶的干物质采食量与其他各组无显著差异，总干

物质采食量显著低于混合叶组，这可能是由于林麝特

殊的采食习性造成的。野生林麝食性较广，所食植物

种类可达 100 多种，而圈养林麝所食植物种类有限。

混合树叶综合了几种树叶在适口性和营养成分方面

的特点、较好地平衡了林麝对适口性和营养的需求，

故在多种树叶混合饲喂时，较好地满足了林麝的采食

习性和适口性，采食量提高。本试验中林麝混合叶组

的总干物质采食量最高，较符合林麝采食多样性的生

理特点[22]

。此外，动物采食量与日粮蛋白质水平有

关。王循刚等[23]

研究发现藏系绵羊羯羊平均日采食

量随日粮蛋白质水平提高而增加。倪晓君等[24]

对云

南半细毛羊的研究发现，蛋白质水平从8.38%提高到

10.42%，采食量显著增加，但10.42%及以上各水平组

间差异不显著。孙光明等[25]

发现饲喂粗蛋白水平为

9.91% 和 13.89% 日粮的育肥期牦牛平均日采食量差

异不显著。贾志海等[26]

研究发现，山羊16%蛋白质水

平日粮的干物质采食量显著高于 9% 蛋白质水平日

粮。试验结果的不同可能是由于使用的动物和日粮

蛋白质水平不同。本研究中，由于树叶种类不同，各

组 日 粮 蛋 白 质 水 平 有 一 定 差 异 ，相 差 最 高 约 为

1.56%，其中日粮蛋白质水平居中的混合叶组采食量

最高，树叶种类、营养成分、适口性和日粮蛋白质水平

影响林麝采食量的权重比还有待进一步研究。

新鲜桑叶含粗蛋白 4%，其蛋白质的氨基酸组成

大体与脱脂大豆粉一致[27]

，经霜后桑叶氨基酸含量高

于其他季节[28]

。桑叶干物质中含粗蛋白 15%~30%，

粗脂肪 4%~10%，粗纤维 8%~12%，无氮浸出物 30%~

35%，粗灰分8%~12%，钙1%~3%，磷0.3%~0.6%[29-30]

，

桑叶粗蛋白含量高而粗纤维含量低，林麝较喜食。桑

叶富含维持机体免疫系统、抗氧化系统、脂肪和碳水

化合物周转代谢系统正常或应激活动所需的维生素，

且矿物质元素含量丰富、易被消化吸收[31]

。用桑叶饲

喂牛羊可提高牛羊对粗蛋白的吸收，Tewatia等[32]

用桑

树嫩枝饲喂水牛犊，提高了日粮消化率和日增重，瘤

胃氨基酸含量明显增加。凌浩等[33]

用青贮桑叶替代

青贮玉米饲喂奶山羊的研究发现，粗蛋白和酸性洗涤

纤维表观消化率显著提高。Sun 等[34]

研究发现，饲喂

桑叶绵羊的干物质、有机物、酸性洗涤纤维表观消化

率比饲喂羊草高，且24%桑叶组粗蛋白和粗脂肪表观

消化率高。桑叶中的黄酮类物质能提高饲料中干物

质、中性纤维、酸性纤维及氮的表观消化率，同时能显

著降低产甲烷菌的数量，增加琥珀酸纤维杆菌的数

量，调节肠道菌群，减少空气的污染[35-36]

。本研究所

用风干桑树叶含粗蛋白17.74%，粗纤维10.10%，林麝

采食后日粮粗蛋白表观消化率显著高于其他处理组，

且日粮Ca、OM、CHO、GE和NDF表观消化率显著高于

榆树叶组和混合叶组，且均较其他组有提高趋势；日

粮 ADF 和 CF 表观消化率仅次于三角枫组，较其他组

有提高趋势。本研究结果与前述研究结果一致，说明

以桑树叶作为粗饲料的来源更有利于林麝消化吸收。

严冰等[37]

研究了桑叶作为湖羊补充饲料促进生

长的效果。苏海涯等[38]

研究表明，桑叶蛋白质含量

高，适口性好，可使奶牛瘤胃中可降解蛋白增加，提高

产奶量。用桑叶饲喂牛羊可提高牛羊对粗蛋白的吸

收，Tewatia 等[32]

用桑树嫩枝饲喂水牛犊，瘤胃氨基酸

含量明显增加。Huyen 等[39]

研究发现，杂交肉牛每天

摄入200、400、600 g桑叶颗粒可线性提高瘤胃中总挥

发性脂肪酸、乙酸、丁酸含量以及乙酸/丙酸，改善氮

平衡，并提高营养物质的消化率。本研究中桑树叶组

可利用氮和沉积氮显著高于青皮藤组和苦楝树叶组，

与三角枫组和混合叶组差异不显著，桑树叶组氮利用

率显著高于其他处理组，提高了蛋白质的吸收率，这

与粗蛋白表观消化率提高结果一致。桑树叶粗蛋白

含量高，易于被林麝消化吸收，可利用氮含量高，饲喂

林麝后日粮营养成分的表观消化率提高，营养成分的

有效利用改善了氮平衡，提高了氮沉积和氮利用率，

是林麝较理想的树叶类饲料。

4 结论

林麝以混合树叶为粗饲料时日平均总采食量最

高，以桑树叶为主要粗饲料时日粮CP、Ca、OM、CHO、

GE、NDF 表观消化率和氮利用率较其他 5 组高。综

合考虑采食量、日粮表观消化率和氮平衡指标，未来

可以考虑改变桑树叶加工调制方法或采用以桑树叶

为主的多种树叶混合饲喂以提高林麝的采食量和消

化利用率，从而满足林麝采食多样性、适口性和对营

养的需求，提高林麝的生长、生产性能。

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（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

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