《热带作物学报》2023年第11期

发布时间:2023-12-12 | 杂志分类:其他
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《热带作物学报》2023年第11期

第 11 期 王世尧等:基于表型的蝴蝶兰花色数量分类 2229 1.3 数据处理使用 SQCX 软件获取分光测色仪测定的基于CIE Lab 表色系统的明度值(L*)、红度值(a*)、黄度值(b*)、彩度值(C)、色相角(h)和基于孟塞尔颜色系统的色相值(Hue)、明度值(Value)和彩度值(Chroma);采用 Microsoft Excel 2007软件对统计数据进行整理;利用 Origin 2023软件,使用最远邻近法(欧式距离)对 L*值、a*值和 b*值进行系统聚类分析,分析其不同色系的差异并作图。2 结果与分析2.1 蝴蝶兰花瓣、萼片和唇瓣的花色表型差异分析蝴蝶兰花朵由 3 枚萼片、2 枚侧花瓣和 1 枚高度特化的腹部花瓣——唇瓣构成,具有较高的观赏价值。对供试的 146 份蝴蝶兰种质资源的侧花瓣、萼片和唇瓣的颜色进行测定(存在部分复色材料,分别获得 172 组侧花瓣、萼片数据及 146组唇瓣数据),取其均值分析整体花色表型差异。如表 1 所示,侧花瓣和萼片的颜色参数值均无显著差异,而唇瓣 L*值显著低于花瓣和萼片,其 a*值和 C 值则显著高于二者,表明唇瓣相对于花瓣和萼... [收起]
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《热带作物学报》2023年第11期
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第 11 期 王世尧等:基于表型的蝴蝶兰花色数量分类 2229

1.3 数据处理

使用 SQCX 软件获取分光测色仪测定的基于

CIE Lab 表色系统的明度值(L*

)、红度值(a*

)、

黄度值(b*

)、彩度值(C)、色相角(h)和基于

孟塞尔颜色系统的色相值(Hue)、明度值(Value)

和彩度值(Chroma);采用 Microsoft Excel 2007

软件对统计数据进行整理;利用 Origin 2023软件,

使用最远邻近法(欧式距离)对 L*

值、a*

值和 b*

值进行系统聚类分析,分析其不同色系的差异并

作图。

2 结果与分析

2.1 蝴蝶兰花瓣、萼片和唇瓣的花色表型差异

分析

蝴蝶兰花朵由 3 枚萼片、2 枚侧花瓣和 1 枚

高度特化的腹部花瓣——唇瓣构成,具有较高的

观赏价值。对供试的 146 份蝴蝶兰种质资源的侧

花瓣、萼片和唇瓣的颜色进行测定(存在部分复

色材料,分别获得 172 组侧花瓣、萼片数据及 146

组唇瓣数据),取其均值分析整体花色表型差异。

如表 1 所示,侧花瓣和萼片的颜色参数值均无显

著差异,而唇瓣 L*

值显著低于花瓣和萼片,其 a*

值和 C 值则显著高于二者,表明唇瓣相对于花瓣

和萼片的颜色亮度较暗,但彩度较大,更偏向于

红色。

2.2 基于聚类分析的蝴蝶兰花色分类

因供试种质资源的花瓣和萼片的颜色差异不

表 1 蝴蝶兰花瓣、萼片与唇瓣的花色表型差异

Tab. 1 Flower colour difference of Phalaenopsis of petal,

sepal and labellum

器官 Organ L*

a*

b*

C h

花瓣 58.89 27.75 ‒2.27 27.84 ‒4.68

萼片 59.20 26.98 ‒1.59 27.03 ‒3.37

唇瓣 44.62** 35.23** ‒2.50 35.32** ‒4.06

注:**表示极显著相关(P<0.01)。

Note: ** indicates extremely significant correlation (P<0.01).

大,本研究主要以侧花瓣的色值作为分类依据。

供试蝴蝶兰花色在 CIE Lab 表色系统各参数分布

广泛(表 2),L*

值介于 20.20~93.00 之间;a*

和 b*

值分别分布在‒13.76~74.10,‒35.40~64.07 区

间内。对其 L*

、a*

、b*

值进行系统聚类分析,当

欧式距离为 10 时,可将其分为 8 个类别(图 3);

参考 RHSCC 的命名规则进行命名,可分为 8 个

色系(表 2):紫色系、暗紫色系、浅紫色系、

紫红色系、白色系、黄绿色系、粉色系和灰橙色

系,其中紫红色系和白色系占比较大,但通过分

析聚类样本发现,部分淡黄绿色、淡粉色等彩度

偏低的品种被划在白色系,表明仅通过聚类分析

不能对蝴蝶兰花色有效区分。

2.3 基于 ISCC-NBS色名表示法的蝴蝶兰花色

分类

2.3.1 蝴蝶兰花色分类 基于聚类分析结果,采

用 ISCC-NBS 色名表示法对所测得的 172 个蝴蝶

兰花色表型值重新进行命名及归类,共获得 44 个

颜色名称(表 3)。通过简化饱和度和明度描述,

表 2 蝴蝶兰花色表型数量聚类分析结果

Tab. 2 Results of cluster analysis of flower colour phenotype in Phalaenopsis examples

供试样本 Examples CIELab 表色系统 CIELab coordinate

序号

Code

色系

Colour

group

颜色描述

Colour description 数量

Number

占比

Percentage/%

L*

a*

b*

C h

Ⅰ 紫色 紫偏灰、暗红偏紫 24 13.95 20.20~44.02 29.75~56.50 ‒14.89~8.28 29.86~58.43 ‒16.66~15.55

Ⅱ 暗紫色 暗紫 3 1.74 22.90~28.71 8.86~22.81 ‒0.83~1.84 9.05~22.83 ‒2.08~11.73

Ⅲ 浅紫色 浅紫、浅紫偏红、

淡紫

29 16.86 42.63~68.24 34.31~55.70 ‒32.06~‒17.04 40.76~64.11 ‒34.99~‒20.76

Ⅳ 紫红色 红偏紫、紫偏红 30 17.44 26.54~46.16 53.44~74.10 ‒35.40~‒16.25 58.10~81.02 ‒30.06~‒14.42

Ⅴ 白色 白、白偏绿、白偏黄、

白偏粉

33 19.19 78.52~93.00 ‒13.76~5.03 ‒2.75~38.59 0.27~40.97 ‒2.05~28.12

Ⅵ 黄绿色 浅黄绿、强绿偏黄、

强黄偏绿

15 8.72 59.66~84.89 ‒13.47~7.69 40.94~64.07 40.99~64.45 80.11~103.86

Ⅶ 粉色 浅粉、淡粉 21 12.21 64.36~84.78 10.05~31.39 ‒21.00~‒4.47 12.25~37.71 ‒38.57~‒12.65

Ⅷ 灰橙色 浅黄、橙黄、淡黄、

橙偏棕

17 9.88 48.76~71.83 4.52~30.14 2.87~34.48 22.41~40.13 6.75~78.36

总计 172 20.20~93.00 ‒13.76~74.10 ‒35.40~64.07 0.27~81.02 ‒38.57~103.86

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2230 热带作物学报 第 44 卷

图 3 基于 L*

、a*

、b*

值的 146 个蝴蝶兰花瓣的花色表型聚类分析

Fig. 3 Cluster analysis results of 146 Phalaenopsis petal examples based on L*

, a*

, b* valus

可将供试蝴蝶兰花色划分为 7 大色系:黄色系、

棕色系、红色系、紫罗兰色系、粉色系、紫色系

和白色系。根据划分色系的色相、明度和彩度的

参数范围(表 4),可发现紫罗兰色和紫色系的

明度和彩度相当,红色系中存在品种的明度较低,

表现为暗红色或暗红偏灰,接近于黑色。

2.3.2 蝴蝶兰花色表型分布特点 使用 CIE Lab

表色系统对基于 ISCC-NBS 体系分类下的蝴蝶兰

7 个色系的 L*

、a*

、b*

参数进行分析,各色系的参

数值分布规律较为明显(图 4)。白色系和黄色系

的 L*

值较大且分布集中,红色系的 L*

值最小;粉

色系、紫色系和棕色系的 L*

值重叠,可通过 a*

和 b*

值进行有效区分;白色系和黄色系的 a*

值在

负值范围内有分布,其他色系的 a*

值均在正值范

围;紫罗兰色系和紫色系 b*

值集中分布在负值,

二者在 a*

、b*

值的分布相似,但前者 L*

值明显低

于后者。

供试蝴蝶兰花色在 a*

、b*

色相坐标上,主要

集中在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限,在呈现蓝色的第Ⅲ象

限中无分布(图 5A)。在第Ⅰ象限主要分布棕色、

粉色、红色 3 个色系的品种;黄色系主要分布在

第Ⅱ象限;第Ⅳ象限主要分布紫色、紫罗兰色 2

个色系,红色系亦有分布;白色系集中分布在接

近原点的位置。在 L*

、a*

、b*

值的三维散点图中

花色数据多集中在一条主线附近,呈带状分布(图

5B)。

2.3.3 蝴蝶兰 L*

值与 C 值相关性分析 彩度 C 值

的变化会对明度 L*

值产生影响,根据供试蝴蝶兰

不同色系的 L*

值与 C 值二维坐标的分布,可将其

分为 2 个类群(图 6)。第一类群的 L*

值随 C 值的

增大而变小,包含白色、黄色、棕色、紫罗兰色、

紫色和粉色等 6 个色系(图 7A),对其 L*

值和 C

值进行线性拟合分析,绘制线性回归图,结果表明,

拟合线性方程为 y=-0.71749+93.17836,呈显著负相

关(r=0.689);第二类群仅包含红色系(图 7B),

L*

值和 C 值间无显著相关性(r=0.080)。

第103页

第 11 期 王世尧等:基于表型的蝴蝶兰花色数量分类 2231

表 3 基于 ISCC-NBS 系统对蝴蝶兰的花色命名结果

Tab. 3 Colour naming results of Phalaenopsis based on ISCC-NBS system

色系

Colour group

颜色名称

Colour name

数量

Number

色系

Colour group

颜色名称

Colour name

数量

Number

黄偏粉 2 暗红偏灰 1

淡黄 11 暗橙偏红 1

中黄 1 强蓝紫 9

强黄 1 浅蓝紫 2

暗黄 1 淡蓝紫 2

黄偏绿 11 艳蓝紫 4

黄色

淡绿偏黄 1 中蓝紫 1

棕偏红 2

紫罗兰

极淡蓝紫 1

浅棕 5 粉偏灰紫 1

强棕 1 暗粉 1

棕偏黄 2

粉色

暗粉偏黄 1

淡棕 1 浅紫 9

浅棕偏黄 1 极浅紫 7

棕色

中棕偏红 1 强紫 5

红偏灰紫 2 淡紫 3

极深红偏紫 2 亮紫 5

中红偏紫 2 中紫偏红 19

深红偏紫 3 强紫偏红 2

暗红偏紫 8 浅紫偏红 1

浅红偏灰紫 3 艳紫偏红 8

强红偏紫 5

紫色

深紫偏红 1

红色

暗红 4 白色 白 18

表 4 基于 ISCC-NBS 系统的蝴蝶兰花色分类

Tab. 4 Classification of Phalaenopsis flower colour based on ISCC-NBS system

色系 供试样本 Examples 孟塞尔系统 Munsell system

Colour group 数量 Number 百分比 Percentage/% 色相 Hue 明度 Value 彩度 Chroma

白色 18 10.47 1.7P~4.0GY 8.48~9.01 0.03~0.79

黄色 28 16.28 7.9YR~9.4Y 5.67~8.58 1.26~9.24

棕色 13 7.56 10.0R~10.0YR 4.61~6.89 3.50~7.18

紫罗兰色 19 11.05 0.4P~1.7P 3.10~8.39 2.00~15.73

紫色 60 34.88 6.6P~3.9RP 2.75~8.18 2.00~13.96

粉色 3 1.74 3.0RP~7.5R 4.98~6.62 4.00~5.38

红色 31 18.02 4.1RP~9.2R 1.91~5.70 1.24~13.28

图 4 基于 ISCC-NBS 系统蝴蝶兰各系 L*

、a*

、b*

值箱线图

Fig. 4 Box plot of different colour group of Phalaenopsis according to L*

、a*

、b* based on ISCC-NBS system

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2232 热带作物学报 第 44 卷

图 5 蝴蝶兰花色表型分布图

Fig. 5 Flower colour distribution of Phalaenopsis

图 6 蝴蝶兰 L*

值与 C 值的二维分布图

Fig. 6 Scatterplot according to L*

and

C among Phalaenopsis

3 讨论

蝴蝶兰新品种 DUS 测试指南中[18],利用

RHSCC 以群体目测的方式定义花瓣主色,将蝴蝶

兰分为白色、黄色、绿色、橙色、粉红色、紫红

色和褐色等 7 种类型,该种方式存在一定的主观

性,在实际应用中不能保证定义结果具有良好的

便捷性和精确度。而比色卡与测色仪相结合可保

留视觉的直观性和精密仪器的客观性,可实现对

花色的量化和精确描述。本研究中,基于侧花瓣

的 L*

、a*

、b*

值进行聚类分析方法将蝴蝶兰划分

为 8 个类别,经分析发现并不能将白色与浅粉色、

浅黄色和浅绿色等花色进行有效区分。殷涵泰等[19]

利用测色仪测定 107 份秋石斛品种花瓣和唇瓣的

颜色并进行聚类分析,将其分为白、粉、黄绿、

紫红、浅紫、紫、深紫、复色等 8 个色系,但存

在黄色和绿色资源不能分开的情况;王玉蛟等[20]

在对芍药的花色分类中也出现了此类情况,白色

与黄绿色系中的浅色品种聚为一类,表明仅使用

图 7 蝴蝶兰 L*

值与 C 值相关性分析

Fig. 7 Correlation analysis among L*

and C of Phalaenopsis

第105页

第 11 期 王世尧等:基于表型的蝴蝶兰花色数量分类 2233

聚类分析对颜色较接近的花色进行分类易导致偏

差。ISCC-NBS 色名表示法是基于孟塞尔颜色系

统由美国色彩协会(Inter Society Colour Council,

ISCC)和美国国家标准局(National Bureau of

Standards, NBS)共同确定并颁布了 267 个适用于

非发光物质的标准颜色名称,可从 6 个维度对颜

色进行准确的分类和定义[21]。吴静等[22]基于 466

个紫斑牡丹单株花色的表型值,使用 ISCC-NBS

色名表示法将紫斑牡丹的花色分为 8 大色系,可

有效区分相近的色系,取得了较合理的分类结果。

本研究基于聚类分析结果并利用 ISCC-NBS 色名

表示法将蝴蝶兰花色分为 7 个色系,不同色系与

CIE Lab 系统的 L*

、a*

和 b*

参数具有合理的对应

关系,即可归纳各色系的参数分布范围,实现对

不同蝴蝶兰花色的定量描述,如目测易混淆为同

一色系的紫罗兰色和紫色可通过 L*

值进行有效区

分,实际应用中被定性为粉色的品种如小梅花(P.

Xiaomeihua)、安娜(P. Anna)等被正确划分为紫

色系,表明 ISCC-NBS 色名表示法的色系划分具

备可量化的客观性。但本研究中存在种质资源样

本较少的问题,如划分为粉色系的供试种质仅有

3 种,对应参数范围的准确性仍需进一步完善;

此外,受限于分光测色仪的通光孔孔径的尺寸,

蝴蝶兰的纹路、斑点、斑块等颜色分布类型难以

实现对其量化和精确描述。因此,须加强蝴蝶兰

种质资源的收集力度,同时进一步优化测色方法,

通过聚类分析结合 ISCC-NBS 色名表示法及实际

生产应用进而综合得到更科学、适用且精确的蝴

蝶兰品种分类体系。

花朵呈色主要与其组织结构和组织细胞中的

色素种类、含量密切相关[23]。蝴蝶兰花色多彩,

供试种质在 a*

、b*

参数坐标上除蓝绿色区间外广

泛分布,缺乏纯正的蓝色品种。飞燕草素

(delphinidin)及其衍生物对蓝色花形成至关重

要,F3′5′H 被称为蓝色基因,其时空表达和表达

强度决定了飞燕草素的分布和积累量[24]。蝴蝶兰

中的 F3′5′H 基因与其他植物 F3′5′H 基因同源性仅

为 50%,可能在进化过程中丢失了原有的功能是

导致其无法呈蓝色的潜在原因[25-26]。LIANG 等[27]

将大花飞燕草( Delphinium grandiflorum ) 的

DgF3′5′H 和蝴蝶兰 PeMYB2 在 P. Sogo Yukidian

‘V3’瞬时共表达,产生一种新奇的蓝紫色,其液

泡的 pH 及金属离子(Al3+、Ca2+、Fe3+)与花青

素的摩尔比均与紫色蝴蝶兰存在显著差异。日本

学者将鸭跖草的基因转入蝴蝶兰中,培育出转基

因蓝紫色蝴蝶兰新品种 Blue Gene,但后代繁殖困

难及栽培过程中需添加外源物质才能使其花色稳

定[28-29]。随着多组学和生物信息学技术日渐成熟,

基于蓝色蝴蝶兰呈色机制的复杂性,开展多维度

的交叉融合研究是培育蓝色蝴蝶兰新品种的必由

之路。

蝴蝶兰花色表型的明度和彩度整体呈负相关

关系,可分为两类:第一类群包括白色、黄色、

棕色、紫罗兰色、紫色和粉色 6 个色系,第二类

群仅包含红色系,这可能与决定各色系的多种类

别色素有关。蝴蝶石斛兰中明度 L*

值与总花青苷

含量和总黄酮含量均呈极显著负相关[30]。郭鑫等[31]

对 190 个紫斑牡丹品种为材料分析 L*

与 C 值,进

行相关性分析发现亦分为 2 个类群,紫红色和黑

红色系明度和彩度呈正相关,与本研究中红色系

蝴蝶兰的表征趋近。大部分植物的萼片为绿色,

而兰科植物中萼片和花瓣特化的唇瓣均有丰富的

颜色[32]。李崇辉等[30]对 24 份蝴蝶石斛兰种质的

花色表型进行测定,发现唇瓣颜色比花瓣和萼片

暗,但色彩更浓郁,与蝴蝶兰的花色特征相同。

在未来的蝴蝶兰花色育种工作中,须进一步明确

外源基因导入对蝴蝶兰色素合成途径和呈色的作

用,亦可结合花型育种培育“三唇瓣”品种[33];

此外,还可通过引入蝴蝶兰近缘属特殊的花色种

质资源与其进行远缘杂交,以期创制出新奇特异

的蝴蝶兰花色新种质,如蝴蝶兰与万代兰属

(Vanda)中的蓝色或火焰兰属(Renanthera)的

亮橙色种质资源进行属间杂交,获得的杂种群体

均可充分遗传双亲的特点[34-35]。

4 结论

通过对 146 份蝴蝶兰种质资源花色表型值进

行测定,发现蝴蝶兰花色较为丰富,缺乏蓝色系;

花瓣和萼片颜色整体差异不大,唇瓣相较二者颜

色更暗,彩度较大。基于侧花瓣的 L*

、a*

、b*

进行聚类分析的分类结果不能完全表征蝴蝶兰花

色的分布特点;利用 ISCC-NBS 色名表示法可将

供试种质资源分为黄色系、棕色系、红色系、紫

罗兰色系、粉色系、紫色系和白色系共 7 个色系,

对于蝴蝶兰花色表型分类更为准确,整理出不同

色系花色参数范围;整体上蝴蝶兰花色明度和彩

度呈负相关,可分为红色系和其余色系 2 个类群。

本研究初步建立基于表型的蝴蝶兰花色数量分类

第106页

2234 热带作物学报 第 44 卷

体系,为蝴蝶兰新品种和花色选育提供理论基础。

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第108页

热带作物学报 2023, 44(11): 22362243

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2023-06-28;修回日期 2023-07-25

基金项目 上海市科学技术委员会项目(No. 19390743600);国家自然科学基金项目(No. 32271740);上海市绿化和市容管

理局 2023 年科学技术项目(No. G232408)。

作者简介 邵 丽(1989—),女,学士,工程师,研究方向:兰科植物快速繁育。*通信作者(Corresponding author):黄卫

昌(HUANG Weichang),E-mail:huangweichang@csnbgsh.cn。

兰科蒙自兰快速繁殖和试管开花的研究

邵 丽1

,曾歆花1

,黄卫昌1,2*

1. 上海辰山植物园/华东野生濒危资源植物保育中心,上海 201602;2. 福建农林大学艺术园林学院,福建福州 350002

摘 要:以蒙自兰种子作为试验材料,研究不同浓度配比的生长调节剂对蒙自兰的无菌播种、快速繁殖和试管开花的

影响。结果表明:人工授粉后 105 d 的蒙自兰种子活力强,萌发率高,1/2MS+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA 培养基较

适合种子萌发;丛芽增殖适宜用含 2.0 mL/L 6-BA 的培养基,不添加 NAA;生根壮苗用 1/2MS+1.0 mL/L NAA+30 g/L

土豆匀浆最佳;在 1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L PP333 培养基上蒙自兰开花率最高。研究结果为蒙自兰的物种

保护、可持续利用以及野外种群的恢复和重建提供重要材料和技术支持。

关键词:蒙自兰;无菌播种;快速繁殖;试管开花

中图分类号:S682.31 文献标识码:A

Rapid Multiplication and in vitro Flowering of Mengzia foliosa (King

& Pantl.) W.C. Huang, Z.J. Liu & C. Hu (Orchidaceae)

SHAO Li1

, ZENG Xinhua1

, HUANG Weichang1,2*

1. Shanghai Chenshan Botanical Garden / Eastern China Conservation Centre for Wild Endangered Plant Resources, Shanghai

201602, China; 2. College of Landscape Architecture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

Abstract: In this study, the effects of different concentration and ratio of growth regulators on seed germination, rapid

propagation and in vitro flowering of Mengzia foliosa were studied. The results showed that the seeds had strong activity

and high germination rate at 105 days after artificial self-pollination, and 1/2MS+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA medium was more suitable for seed germination. Meanwhile, 2.0 mL/L 6-BA without NAA was more suitable for cluster

bud proliferation; and 1/2MS+1.0 mL/L NAA+30 g/L potato homogenate medium was the best for rooting and hardening-off. In addition, 1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L PP333 medium had the highest flowering rate. Our results

not only contribute to the conservation and sustainable use of the species, but also provide important materials and

technical support for wild population restoration and reconstruction.

Keywords: Mengzia foliosa; aseptic sowing; rapid propagation; in vitro flowering

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.012

蒙自兰[Mengzia foliosa (King & Pantl.) W.C.

Huang, Z.J. Liu & C. Hu],是兰科蒙自兰属多年生

草本植物,主要分布于中国云南南部、泰国的山

坡林下。基于前期形态学和分子系统学的分析结

果,华白及[Bletilla sinensis (Rolfe) Schltr.]区别于

兰科龙嘴兰族的白及属和其他属植物。因此,以华

白及作为模式种,建立兰科新属——蒙自兰属[1]。

当前,由于生境破坏和人为干扰,蒙自兰野外居

群和植株数量极少,目前已被列为国家保护的濒

危植物[2]。此外,蒙自兰在引种栽培和繁育过程

中也存在生长缓慢、开花少和结实困难等问题,

这极不利于蒙自兰野外种群的恢复和重建。兰科

植物种子数量巨大,一个果荚内含有成千上万粒

种子,通过无菌播种技术能快速繁殖大量种苗;

第109页

第 11 期 邵 丽等:兰科蒙自兰快速繁殖和试管开花的研究 2237

此外,通过试管开花技术能打破天气、季节和地

域的限制,可提高植物开花率和结实率,从而满

足植物资源保护和可持续开发利用所需的植物材

料。目前,国内外对兰科植物组培快繁和试管开

花的研究有较多报道,如春兰[3]、建兰[4]、寒兰[5]、

铁皮石斛[6]、梳唇石斛[7]、春石斛[8]、虎舌兰[9]、

报春石斛[10]和扇形文心兰[11]等。而濒危兰科植物

蒙自兰由于稀缺的野外材料,其无菌播种繁殖、

药效和试管开花等相关研究均处于空白状态。为

加快该物种的保护和开发利用,亟需开展蒙自兰

的快速繁育和试管开花研究。

本研究通过研究不同浓度 6-BA、NAA、营养

物质对蒙自兰生长的影响,以及 6-BA、NAA、

TDZ、2,4-D、PP333 对试管开花的影响,筛选出最

佳培养基配方,建立一套高效的快繁技术体系。

不但可以为该物种的种群回归和恢复等保育生物

学研究提供帮助,还能为其开花调控机理研究和

缩短育种周期提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料取自云南人工授粉的蒙自兰未开裂

果荚。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒灭菌 将蒙自兰蒴果在流水下冲

洗 0.5 h,然后用吸水纸将种荚表面水分吸干后转

入无菌操作台。参照王丽等[12]的方法,用 75%酒

精浸泡 30 s,然后用含少许吐温 20 的 0.1%升汞

溶液震荡消毒 10~15 min,无菌水冲洗 5 遍,滤纸

吸干表面水分后待用。

1.2.2 种子萌发 (1)不同成熟度种子的萌发。

播种不同成熟程度的蒴果,成熟度为从自交到播

种的天数分别为 85、95、105、115 d。剖开消毒

过的蒴果,将种子均匀接种于含 0.5 mg/L NAA、

30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 琼脂、0.2 g/L 活性炭,pH

为 5.8 的 1/2MS 培养基上。共 4 组处理 A1~A4,

每个处理接种 10 瓶,每瓶约 100 粒种子,分别记

录萌发时间和统计种子萌发数,并计算萌发率。萌

发率=萌发种子数量/接入种子总数×100%。

(2)不同培养基对种子萌发的影响。基本培

养基以MS和1/2MS为对照,添加不同浓度的 NAA

和 6-BA,采用 L16(43

)正交表设计(表 1)。设置

16 组样本 B1~B16,每组接种 5 瓶,每瓶 100 粒种

子,待种子萌发后统计萌发种子数,计算萌发率。

表 1 播种正交试验表

Tab. 1 Orthogonal test table of sowing

水平 Level 培养基 Mmedium NAA/(mg·L–1) 6-BA/(mg·L–1)

1 MS 0 0

2 1/2MS 0.2 0.5

3 0.6 1.0

4 1.0 1.5

1.2.3 丛芽增殖 将萌发后长小叶的蒙自兰小苗

接种至不同培养基,基础培养基为 1/2MS,添加

不同浓度 NAA 和 6-BA,NAA 的浓度梯度设置为

0、0.2、0.5 mg/L,6-BA 的浓度梯度设置为 0.5、

1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L,不添加任何激素的作为

对照组(CK)。15 个处理 C1~C15,每组处理 10

个重复 150 芽,60 d 后统计增殖率。

1.2.4 生根壮苗 将增殖后约同等大小的蒙自兰

小苗接种至不同的生根壮苗培养基。基础培养基

是 1/2MS,添加不同浓度生长素和营养物匀浆,

设置 L16(43

)正交试验表(表 2)。不添加任何生长

调节剂和营养物的培养基作为对照组(CK),16

个处理 D1~D16,每组 10 个重复共 100 苗,60 d

后测量生根数量、根长和苗高[13]。

表 2 生根壮苗正交试验表

Tab. 2 Orthogonal test table of rooting and strenghening

水平

Level

NAA

/(mg·L–1)

营养物

Nutrient

营养物浓度

Nutrient concentration/(g·L–1)

1 0 香蕉 10

2 0.2 椰子水 30

3 0.5 土豆 50

4 1.0 100

1.2.5 试管开花 将丛芽增殖后约同等大小的蒙

自兰幼苗接种至不同的催花培养基。以 1/2MS 为

基础培养基,添加不同浓度的细胞分裂素 6-BA

(1.0、2.0 mg/L)、TDZ(0.1、0.5 mg/L)和生长

素 NAA(0.2、0.5 mg/L)、2,4-D(0.2、0.5 mg/L),

两两配比,另添加多效唑 PP333 1.0 mg/L,以不添

加 PP333 的处理作为对照组(CK),16 个处理 E1~

E16,每组 5 个重复共 25 苗,90 d 后统计开放花朵

数,计算开花率和正常花率。开花率=开放花朵数

/接种外植体数×100%;正常花率=正常花朵数/开放

花朵数×100%。

1.2.6 培养条件 通过预试验发现蒙自兰从萌发

到幼苗生长各阶段在 1/2MS 培养基上均生长良

好,因此设置丛芽增殖、生根壮苗、试管开花试

第110页

2238 热带作物学报 第 44 卷

验的基本培养基均为 1/2MS。各培养基中均加入

0.2 g/L 活性炭、6.5 g/L 琼脂、30 g/L 蔗糖,催花

培养基中另外添加 30 g/L 香蕉匀浆,pH 均调为

5.8。培养室温度控制在(25±1)℃,光照时长为

12 h/d,光照强度为 2000 lx。

1.3 数据处理

使用正交设计助手Ⅱv3.1 软件设置正交试验

表,运用 SPSS16.0 软件进行数据处理。采用单因

素方差分析比较不同种子成熟度对种子萌发率的

影响;采用多因素方差分析比较不同培养基对种

子萌发率,以及不同激素浓度配比对丛芽增殖率、

根长、苗高、根数量、花芽分化率和正常开花率

的影响。采用 Tukey HSD 方法比较不同实验组的

显著性差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度对蒙自兰种子萌发的影响

蒙自兰种子的成熟度对其萌发率有显著影响

(表 3)。授粉后 85~105 d 的种子呈白色,萌发所

需时间均在 30 d 左右,随着种子成熟时间的延长

其萌发率递增,A3 与 A1、A2 间呈显著差异。105 d

的种子萌发率最高为 87.00%,显著高于 115 d 的

种子萌发率,且萌发出原球茎后叶片分化快。授

粉 115 d 的种子颜色略深,萌发时间最短,但萌

发率明显降低,且萌发后的原球茎叶分化率低。

表 3 不同成熟度种子的萌发率

Tab. 3 Germination rate of different maturity seeds

处理

Treatment

授粉后天数

Days after pollination

萌发所需天数

Days required for

germination

萌发率

Germination

rate/%

A1 85 29 58.00±3.40b

A2 95 30 63.00±6.05b

A3 105 31 87.00±1.14a

A4 115 13 14.00±3.85c

注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate

significant difference (P<0.05).

2.2 不同培养基对蒙自兰种子萌发的影响

成熟度为 105 d 的蒙自兰种子播种于不同培

养基上,供试的 16 组培养基均能萌发,但各组萌

发率有显著差异(表 4)。B15 处理的培养基

(1/2MS+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA)的萌发

率最高,为 97.00%。在 16 组处理中,当 NAA 浓

度相同时,萌发率随 6-BA 浓度的升高而增加;

而当 6-BA 浓度相同时,较低 NAA 浓度的萌发率

较高,其中 B9 和 B15 的萌发率接近,且 B9 的萌发

率仅次于 B15;当 NAA 浓度为 1.0 mg/L 时,MS

培养基的萌发率较低,B4 和 B8 的萌发率分别为

5.00%和 9.40%;当 6-BA 浓度为 1.5 mg/L 时,

1/2MS 培养基的萌发率有所降低。从表 5 中可知,

基础培养基、NAA、6-BA 对蒙自兰种子萌发的影

响均存在显著性差异(P<0.05),对比三因素的 F

值发现,影响种子萌发率的大小顺序为基础培养

基>NAA>6-BA。

表 4 不同培养基对蒙自兰种子萌发的影响

Tab. 4 Effects of different medium on seed germination

of M. foliosa

处理

Treatment

基础培养基

Basic medium

NAA

/(mg·L–1)

6-BA

/(mg·L–1)

萌发率

Germination rate/%

B1 MS 0 1.5 87.20±3.60ab

B2 MS 0.2 1.0 41.20±8.05de

B3 MS 0.6 0.5 15.20±6.70fg

B4 MS 1.0 0 5.00±3.16g

B5 MS 0 0.5 77.80±5.38abc

B6 MS 0.2 0 35.60±6.53ef

B7 MS 0.6 1.5 65.00±4.46bcd

B8 MS 1.0 1.0 9.40±4.77g

B9 1/2MS 0 1.0 96.40±0.60a

B10 1/2MS 0.2 1.5 93.40±1.86a

B11 1/2MS 0.6 0 5.20±3.25g

B12 1/2MS 1.0 0.5 57.40±5.59cde

B13 1/2MS 0 0 89.40±4.99a

B14 1/2MS 0.2 0.5 62.40±4.86cd

B15 1/2MS 0.6 1.0 97.00±2.00a

B16 1/2MS 1.0 1.5 79.40±4.61abc

注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate

significant difference (P<0.05).

表 5 种子萌发主体间效应检验

Tab. 5 Testing of inter subject effects of seed germination

Source

平方和

Sum of squares

自由度

df

均方

Mean square

F P

基础培养基 18 635.513 1 18 635.513 31.640 0.000

NAA 28 840.438 3 9 613.479 16.322 0.000

6-BA 4132.813 1 4 132.813 7.017 0.010

误差 43 584.425 74 588.979

2.3 不同激素浓度对蒙自兰丛芽增殖的影响

蒙自兰种子播种后约 30 d 萌发形成原球茎。

将其转接至增殖分化培养基中发现原球茎会分化

第111页

第 11 期 邵 丽等:兰科蒙自兰快速繁殖和试管开花的研究 2239

成苗,但增殖形成的愈伤组织并未分化且逐渐发

黄死亡。因此在原球茎分化出叶片后再进行丛芽

增殖处理。将 1/2MS 作为基本培养基,观察 NAA

和 6-BA 对丛芽增殖的影响(表 6)。结果显示,

各处理的蒙自兰丛芽均具有不同程度的增殖,未

添加 NAA 和 6-BA 的 CK 组的增殖率显著低于添

加激素处理组;C2 和 C4 显著高于其他处理,2 组

处理均未添加 NAA;C4 处理的增殖率最大,为

47.33%,其 6-BA 添加浓度为 2.0 mg/L;添加激素

处理组中,C5 的增殖率最低为 18.01%,其 6-BA

添加浓度为 2.5 mg/L,C4和 C5处理均未添加 NAA。

主体效应分析显示(表 7),不同浓度的 NAA 对丛

芽增殖的影响差异不显著(P>0.05),而不同浓度

的 6-BA 对丛芽增殖的影响差异显著(P<0.05)。

2.4 不同浓度 NAA 及营养物对蒙自兰生根壮

苗的影响

将蒙自兰丛芽接种到不同培养基上,观察

NAA 和不同营养物质对蒙自兰生根壮苗的影响。

结果表明,D15 培养基 1/2MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L

土豆匀浆处理的蒙自兰生长状况最佳,苗高、根

长和根的数量均显著高于其他处理(表 8)。由表

9 可知,各因素间呈显著性差异(P<0.05)。营养

物对蒙自兰根长和根数量的影响大于 NAA,30 g/L

土豆匀浆处理的生根效果最佳,其次是浓度 10 g/L,

土豆匀浆超过 30 g/L 反而抑制生根;30、50 ml/L

表 6 不同激素浓度对蒙自兰丛芽增殖的影响

Tab. 6 Effects of different hormone concentration on

cluster buds proliferation of M. foliosa

处理

Treatment

NAA

/(mg·L–1)

6-BA

/(mg·L–1)

增殖率

Proliferation rate/%

C1 0 0.5 21.34±3.41ab

C2 0 1.0 43.98±7.70a

C3 0 1.5 18.68±7.50ab

C4 0 2.0 47.33±11.90a

C5 0 2.5 18.01±5.71ab

C6 0.2 0.5 19.99±4.87ab

C7 0.2 1.0 38.67±7.81ab

C8 0.2 1.5 30.66±11.12ab

C9 0.2 2.0 26.02±5.83ab

C10 0.2 2.5 36.00±4.99ab

C11 0.5 0.5 37.34±5.72ab

C12 0.5 1.0 20.00±4.44ab

C13 0.5 1.5 20.01±5.26ab

C14 0.5 2.0 32.01±9.48ab

C15 0.5 2.5 37.99±8.78ab

CK 6.00±1.84b

注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate

significant difference (P<0.05).

表 7 从芽增殖主体间效应检验

Tab. 7 Testing of inter subject effects of cluster

buds proliferation

Source

平方和

Sum of squares

自由度

df

均方

Mean square

F P

NAA 15.920 2 7.960 0.014 0.986

6-BA 7927.236 5 1585.447 2.854 0.017

误差 84 426.832 152 555.440

表 8 不同浓度 NAA 及营养物对蒙自兰幼苗生长的影响

Tab. 8 Effects of different concentration of NAA and nutrients on seedling growth of M. foliosa

处理

Treatment

NAA

/(mg·L–1)

营养物

Nutrient

营养物浓度

Nutrient concentration/(g·L–1)

根长

Root length/cm

苗高

Plant height/cm

根数量

Number of roots

D1 0 香蕉 10 2.96±0.90de 4.83±1.33b

5.85±2.66bc

D2 0 椰子水 30 3.34±1.05cd 4.80±1.63bc 6.45±2.35b

D3 0 土豆 50 1.64±0.67i

3.09±1.61gh 3.21±1.43g

D4 0 香蕉 100 3.94±1.13ab 4.43±1.56bcd 5.10±2.04cd

D5 0.2 香蕉 30 3.02±1.27cde 3.26±1.53fgh 3.91±1.57efg

D6 0.2 椰子水 10 2.60±1.01efg 2.24±0.63ij 3.49±1.36fg

D7 0.2 土豆 100 2.36±0.83fgh 4.24±2.07bcde 4.71±2.05de

D8 0.2 香蕉 50 2.57±1.20efg 4.17±1.73bcde 3.68±1.39fg

D9 0.5 香蕉 50 2.50±0.85efgh 4.26±1.53bcde 3.82±1.39efg

D10 0.5 椰子水 100 2.89±0.99def 2.97±1.09hi 3.73±1.41efg

D11 0.5 土豆 10 4.04±0.85ab 3.98±1.77cdef 4.93±2.20cd

D12 0.5 香蕉 30 2.18±1.14ghi 3.88±1.45defg 4.24±1.27def

D13 1.0 香蕉 100 2.86±1.23def 2.83±1.07hi 3.69±1.80fg

D14 1.0 椰子水 50 3.53±1.16bc 6.81±1.03a

5.00±1.46cd

D15 1.0 土豆 30 4.34±0.97a

6.91±2.21a

9.90±3.04a

D16 1.0 香蕉 10 2.01±0.82hi 3.44±1.43efgh 3.04±1.25g

CK 0.88±0.07j

1.67±0.10j

1.71±0.10h

注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

第112页

2240 热带作物学报 第 44 卷

表 9 生根壮苗主体间效应检验

Tab. 9 Testing of inter subject effects of rooting

and strenghening

指标

Index

Source

平方和

Sum of

squares

自由度

df

均方

Mean

square

F P

NAA 49.439 3 16.480 16.516 0.000

营养物 319.573 4 79.893 80.071 0.000

根长

误差 1340.015 1343 0.998

NAA 425.283 3 141.761 63.212 0.000

营养物 542.129 4 135.532 60.435 0.000

苗高

误差 3011.834 1343 2.243

NAA 491.185 3 163.728 49.255 0.000

营养物 1266.742 4 316.685 95.269 0.000

根数量

误差 4464.272 1343 3.324

椰子水和 100 g/L 香蕉匀浆也有利于生根,但效

果比土豆匀浆差。NAA 对苗高的影响大于营养

物,1.0 mg/L 的 NAA 有利于幼苗茎叶生长,D14、

D15 处理组的苗高显著高于其他处理。

2.5 不同激素浓度对蒙自兰试管开花的影响

在蒙自兰生根壮苗试验中发现,添加 30 g/L

香蕉匀浆的培养基上幼苗有部分开花现象,故在

试管开花试验培养基中以添加 30 g/L 香蕉匀浆来

促进其开花,CK 组不添加。将生长健壮、苗高基

本一致的蒙自兰幼苗接种到不同培养基上,观察

不同激素对幼苗花芽分化和开花的影响。从表 10

可知,在添加 PP333 的条件下,E2 处理的花芽分

化率和正常开花率均显著高于其他处理,是最优

催花培养基。观察花芽分化情况发现(图 1),E1、

E2、E3 培养基的花梗均较长且大多植株开 2~4 朵

花(图 1A),而其他培养基处理的开花株均为 1

梗 1 朵(图 1B);与 E1 对比发现,未添加 PP333

的 CK 培养基幼苗无花芽分化;当添加相同浓度

的 6-BA 时,除 E6 未开花,NAA 与 6-BA 组合处

理的花芽分化率显著优于 2,4-D 与 6-BA 组合处

理,且花朵畸形率也较低;含 2,4-D 的培养基处

理中,除 E16 外,花芽分化率均显著低于其他处

理,且花朵畸形率较高;TDZ 对蒙自兰花芽分化

也有促进作用,0.5 mg/L TDZ 处理的作用效果明

显高于 0.1 mg/L TDZ,但其花朵畸形率高于含

6-BA 的培养基处理,可见添加 TDZ 会增加蒙自

兰花朵畸形率,而 2,4-D 对蒙自兰花芽分化有一

定的抑制作用。添加 0.5 mg/L TDZ 和 0.5 mg/L

NAA 的 E12 处理培养基上幼苗的开花状态为花梗

短且花瓣卷曲(图 1C);添加 0.1 mg/L TDZ 和

0.5 mg/L 2,4-D 的 E14 处理培养基上幼苗的开花状

态为花梗短且花朵呈闭合状态直至凋谢(图 1D)。

表 10 不同激素浓度对蒙自兰试管开花的影响

Tab. 10 Effects of different hormone concentration on in vitro flowering of M. foliosa

处理

Treatment

6-BA

/(mg·L-1)

TDZ

/(mg·L-1)

NAA

/(mg·L-1)

2,4-D

/(mg·L-1)

PP333

/(mg·L-1)

花芽分化率

Flower bud differentiation rate/%

正常开花率

Normal flowering rate/%

E1 1.0 0.2 1.0 20.00±8.94cde 60.00±24.49ab

E2 1.0 0.5 1.0 132.00±4.90a

84.29±6.97a

E3 2.0 0.2 1.0 40.00±10.95bcd 70.00±20.00ab

E4 2.0 0.5 1.0 32.00±10.20bcde 63.33±18.56ab

E5 1.0 0.2 1.0 8.00±4.90de 0c

E6 1.0 0.5 1.0 0e

0c

E7 2.0 0.2 1.0 8.00±4.90de 20.00±20.00bc

E8 2.0 0.5 1.0 4.00±4.00de 20.00±20.00bc

E9 0.1 0.2 1.0 4.00±4.00de 20.00±20.00bc

E10 0.1 0.5 1.0 4.00±4.00de 20.00±20.00bc

E11 0.5 0.2 1.0 64.00±4.00b

80.00±8.16a

E12 0.5 0.5 1.0 12.00±4.90de 20.00±20.00bc

E13 0.1 0.2 1.0 0e

0c

E14 0.1 0.5 1.0 8.00±8.00de 20.00±20.00bc

E15 0.5 0.2 1.0 8.00±4.90de 40.00±24.50abc

E16 0.5 0.5 1.0 52.00±17.44bc 52.00±22.45abc

CK 1.0 0.2 0e

0c

注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

第113页

第 11 期 邵 丽等:兰科蒙自兰快速繁殖和试管开花的研究 2241

A:一梗多花;B:正常开花;C~D:花朵畸形;E:105 d 种子;F:115 d 种子。

A: A stalk with several flowers; B: Normal flower; C-D: Flowers malformation; E: Seeds of 105 days; F: Seeds of 115 days.

图 1 蒙自兰种子及试管开花状态

Fig. 1 Seeds and in vitro flowering of M. foliosa

3 讨论

蒙自兰在野生状态和人工栽培条件下生长缓

慢,利用无菌种子培养可有效解决分株繁殖系数

低、繁殖周期长的问题。本研究表明,在 1/2MS

培养基上,蒙自兰从种子萌发到壮苗的各阶段均

能较好生长,生长调节剂对生长各阶段起到的促

进或抑制作用各有差异。

种子成熟度对种子萌发有着重要影响[14]。通

过解剖镜观察种子发现,蒙自兰 105 d 的种子胚

圆润饱满(图 1E),而 115 d 的种子胚缩小、种皮

变厚(图 1F)。用 TTC 溶液对种子进行染色发现,

85、95、105 d 的种子很快被染色,而 115 d 的种

子只有少数种子被染色,且染色所需时间较长。

因此,115 d 的种子萌发率低可能与种子活性低、

胚龄长或种皮变厚有关。蒋雅婷等[15]研究发现,

无距虾脊兰种子胚龄为 120 d 时萌发率最高,随

后逐渐降低,到 210 d 时,萌发率降为 0。蒙自兰

野外植株数量少,组培苗养护难度高且开花难,

目前能得到的果荚数量有限,因此尚未观察到其

果荚自然开裂的时间和状态。种子在 115 d 以后

的萌发率是否会降到 0 以及果荚自然开裂的时间

后续还需进一步试验加以验证。1/2MS 培养基的

种子萌发率均较高,说明低盐分培养基有利于蒙

自兰种子萌发,这与漆子钰[3]对春兰种子的萌发

研究结果一致。NAA 和 6-BA 的不同浓度组合也

影响种子萌发,1/2MS+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L

6-BA 的培养基萌发率最高为 97.00%,而 105 d

的种子在 1/2MS+0.5 mg/l NAA 培养基中的萌发

率为 87.00%,在 NAA 浓度接近的情况下,其萌

发率相对较低的原因可能是未添加 6-BA。可见,

培养基配方对蒙自兰种子萌发起着关键作用。

蒙自兰种子萌发后原球茎会快速进入叶分化

阶段,在分化之前可以通过添加生长调节剂对原

球茎进行增殖处理,但增殖出的愈伤组织未能分

化成苗,可能增殖出的愈伤为非胚性愈伤组织。

而对已分化出叶片的幼苗进行丛芽增殖发现均为

有效增殖,且丛芽健壮,未发现徒长、弱化或玻

璃化现象。在植物组织培养中,细胞分裂素可刺

激细胞分裂,促进芽分化和生长[3]。不同品种兰

科植物所需的生长调节剂种类、组合和浓度也不

第114页

2242 热带作物学报 第 44 卷

同。蒙自兰丛芽增殖试验结果表明,2.0 mg/L 6-BA

对丛芽增殖效果最佳,这与滇金石斛[13]、血叶兰[16]

丛芽增殖所需的分裂素一致,但浓度不同,且滇

金石斛还需添加 NAA,血叶兰还需添加 NAA 和

TDZ。而杜鹃兰丛生芽增殖需要 2.0 mg/L TDZ 和

0.2 mg/L IAA[17],与蒙自兰不同。生长素 NAA 能

促进试管苗生长、生根和壮苗。除生长调节剂外,

一些天然营养物质,如椰青、香蕉、土豆、苹果、

酵母浸出物等,对某些植物器官组织有一定的促

进生长作用。椰青、香蕉和土豆被广泛应用于兰

科植物的组织培养。1.0 mg/L NAA 和 30 g/L 土豆

为蒙自兰幼苗生根壮苗的最优组合,这与三褶虾

脊兰[18]幼苗生长所需的添加物和生长调节剂种类

一致,三褶虾脊兰需要 100 g/L 土豆泥和 0.1 mg/L

NAA。

蒙自兰试管开花试验发现,生长调节剂和营

养物质对幼苗开花均有一定促进作用。部分开花

株植株矮小,且球茎大、叶片宽,可能是 PP333

抑制植株茎的生长,刺激其提前开花的原因。这

与李杰等[19]在霍山石斛花芽诱导试验中 TDZ 与

PP333 组合处理的畸形花比率高的结果一致。蒙自

兰幼苗在 90 d 内陆续开花,这与梳唇石斛[7]试管

开花状态一致,但梳唇石斛开花可持续半年以上。

蒙自兰单朵花期在 7~10 d 左右,90 d 后花芽分化

结束,这可能与培养基中营养成分的消耗有关。

本研究结果显示,蒙自兰试管开花的最佳培养基

为 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L

PP333+30 g/L 香蕉。6-BA 与 NAA 组合处理的诱

导效果最佳,这与梳唇石斛[7]的开花诱导结果一

致。霍山石斛[19]在花芽诱导培养基中也添加了香

蕉匀浆物。但蒙自兰开花时间不统一,个别植株

从播种到开花仅需 145 d。兰科植物开花受多种因

素的影响,除培养基成分外,还受环境因子的调

控,如温度、光照强度、光照时长等[20]。本研究

取得蒙自兰试管开花的初步结果,但如何提高试

管开花率和花朵品质,以及诱导开花的机理仍有

待进一步探索。

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热带作物学报 2023, 44(11): 22442255

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-10-21;修回日期 2022-11-09

基金项目 海南省自然科学基金项目(No. 320RC731);中央级公益性科研院所基本科研业务费项目(No. 1630022020023)。

作者简介 杨晶晶(2001—),女,本科生,研究方向:植物分子生物学。*通信作者(Corresponding author):肖小虎(XIAO

Xiaohu),E-mail:xiaofeihu_011588@126.com。

巴西橡胶树 ACA/ECA 基因家族鉴定及分析

杨晶晶1,2,方永军1

,张鸿韬1,3,龙翔宇1

,秦云霞1

,阳江华1

,肖小虎1*

1. 农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/中国热带农业学院橡胶研究所,海南海口 571101;2. 云南农业大

学热带作物学院,云南普洱 665099;3. 海南大学热带作物学院,海南海口 570228

摘 要:Ca2+是植物细胞的第二信使,Ca2+-ATPase(ACA/ECA)作为 Ca2+运输的重要蛋白,在保证细胞内钙离子的平

衡和植物非生物胁迫方面发挥着至关重要的作用。为了研究巴西橡胶树中 Ca2+-ATPase(ACA/ECA)的生物学功能,

以模式植物拟南芥的 ACA/ECA 蛋白序列为探针,从橡胶树基因组中鉴定得到 45 个 ACA/ECA 基因家族成员,其中 ACA

成员 38 个,ECA 成员 7 个。利用 Expasy、Plant-mPLoc 等工具对 45 个成员的理化性质、基因结构、染色体定位、系

统进化和表达进行全面分析。理化性质分析表明:各成员编码蛋白的氨基酸数目为 86~1142 个,氨基酸分子量在 10

048.04~125 412.75 Da 之间,蛋白产物多定位于细胞质膜,有少量成员定位于内质网、叶绿体、液泡和细胞核。在进化

方面,ACA/ECA 家族成员明显聚于 ACA 和 ECA 两个分枝,2 个分支中橡胶树始终与木薯紧靠,表明在系统进化过程

中橡胶树与木薯存在较近的亲缘关系。染色体定位结果显示:ACA/ECA 家族的 45 个成员不均匀地分布在橡胶树的 14

条染色体和 1 个 contig 上,其中 2 号和 9 号染色体上成员分布最多,为 11 个。表达分析显示:部分成员在不同组织中

的表达存在显著差异,HbACA31 在叶片中表达丰度最高,HbACA36 在胶乳中表达丰度最高,并且 HbACA36 经乙烯利

刺激处理后在胶乳中的表达明显上调。另外,本研究还分析了割胶对 ACA/ECA 家族成员基因表达的影响,发现

HbACA36 在 PR107 和热研 8-79 两个橡胶树品种割胶过程中均处于较高的表达水平,并且在高产品种热研 8-79 开割过

程中明显上调表达,推测 HbACA36 参与橡胶树产胶排胶调控,并在其中起重要作用。本研究结果首次揭示了橡胶树

ACA/ECA 家族成员的理化性质和表达模式,为进一步研究 ACA/ECA 基因在巴西橡胶树中的生物学功能,特别是橡胶

树产胶调控方面的功能奠定基础。

关键词:巴西橡胶树;Ca2+-ATPase(ACA/ECA);基因家族;生物学功能;表达分析

中图分类号:S794.1 文献标识码:A

Identification and Analysis of ACA/ECA Gene Family in Hevea brasiliensis

YANG Jingjing1,2, FANG Yongjun1

, ZHANG Hongtao1,3, LONG Xiangyu1

, QIN Yunxia1

, YANG Jianghua1

,

XIAO Xiaohu1*

1. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Rubber Research

Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China; 2. College of Tropical Crops, Yunnan

University, Pu’er, Yunnan 665099, China; 3. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

Abstract: Ca2+ is a second messenger in plant cells, and Ca2+-ATPase (ACA/ECA), as an important protein in Ca2+

transport, plays a crucial role in ensuring the balance of intracellular calcium ions and abiotic stress in plants. To investigate the biological function of Ca2+-ATPase (ACA/ECA) in Hevea brasiliensis, 45 ACA/ECA gene family members

were identified from the rubber tree genome using the ACA/ECA protein sequence of the model plant Arabidopsis as a

probe, including 38 ACA members and 7 ECA members. Expasy and Plant-mPLoc were used to comprehensively analyze the physicochemical properties, gene structure, chromosomal localization, phylogeny, and expression patterns of

第117页

第 11 期 杨晶晶等:巴西橡胶树 ACA/ECA 基因家族鉴定及分析 2245

the 45 members. Physicochemical properties analysis showed that the number of amino acids encoded by each member

was 86‒1142, the molecular weight of amino acids ranged from 10 048.04 to 125 412.75 Da, and the protein products

were mostly localized on the cytoplasmic membrane, with a few members localized on the endoplasmic reticulum,

chloroplast, vacuole, and nucleus. In evolutionary, members of the ACA/ECA family were clearly clustered into ACA

and ECA two branches, and rubber tree members were always in close proximity to cassava in both branches, indicating

that there was a close relative between rubber tree and cassava during phylogeny. Chromosomal localization revealed

that the 45 members of the ACA/ECA family were unevenly distributed across 14 chromosomes and one contig in rubber tree, in which, chromosomes 2 and 9 had the largest member distribution of 11 members. Expression analysis

showed that there were obvious differences in the expression of some members in different groups, HbACA31 was expressed the most in leaves, HbACA36 was expressed the most in latex, and the expression of HbACA36 was obviously

up-regulated in latex after treatment with ethenol. In addition, we also analyzed the influence of tapping on ACA/ECA

gene expression, and found that HbACA36 was at a high expression level during tapping of the two rubber tree varieties,

PR107 and Reyan 8-79, and significantly up-regulated during tapping of high-yield variety Reyan 8-79 ,which speculated that HbACA36 was involved in the regulation of rubber biosynthesis and played an important role. The results

presented in this study reveal the physicochemical properties and expression patterns of ACA/CA family members for

the first time in rubber tree, and would provide a foundation for further investigation of the biological functions of

ACA/ECA genes in H. brasiliensis, especially in the regulation of the rubber production.

Keywords: Hevea brasiliensis; Ca2+-ATPase (ACA/ECA); gene family; biological functiun; expression analysis

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.013

钙离子(Ca2+)作为植物细胞的第二信使几

乎参与了植物生长发育的各个方面,包括对生物

和非生物胁迫的反应[1]。植物细胞内 Ca2+信号的

传递主要是通过改变细胞内外钙离子浓度实现

的,而 Ca2+浓度的变化则主要由膜上的跨膜转运

蛋白进行控制[2]。植物细胞的 Ca2+转运主要由钙

离子通道、钙离子反向转运蛋白和钙离子泵[3],

Ca2+-ATPase 属于 P-型 ATP 酶离子超家族的 P2

分支,根据其蛋白质氨基酸序列和生化特征方面

的差异分为 2 个亚家族(P2A 和 P2B),也分别

称为内质网型 Ca2+-ATPase ( ER-type calcium

ATPase, ECA, P2A)和自抑制的质膜(PM)型

Ca2+-ATPase(autoinhibited calcium ATPase, ACA,

P2B)[4]。在植物细胞中,定位于质膜和内质网中

的 P 型 Ca2+-ATP 酶被认为在调节细胞质 Ca2+浓度

方面起重要作用[5],同时 P 型 Ca2+-ATP 酶在植物

生长发育的各个方面都是不可或缺的,包括花粉

管生长、细胞程序性死亡、根部尖端生长,以及

生物和非生物胁迫应答(如低温、高温、盐胁迫、

干旱和渗透胁迫等)、共生等方面[3]。目前已经在

拟南芥[6]、水稻[7]、白菜[8]、茄科植物[9]、苜蓿[10]

等植物中鉴定得到 ACA/ECA基因家族多个成员,

并对其在植物中的功能进行了研究。研究表明,

在拟南芥中,ACA8 基因功能的缺失能显著提高拟

南芥对零下低温的抗冻性[11];在低钙环境下,

ECA1 表达受到干扰的转基因株系耐受低 Ca2+

(0.2 mmol/L)或高 Mn2+(0.5 mmol/L)胁迫的

能力降低[12]。水稻 ACA/ECA 家族由 15 个成员组

成,其中有 3 个属于内质网膜型钙离子泵,12 个

属于自抑制型钙离子泵,盐、干旱和 ABA 胁迫可

以显著激活 OsACA6 的表达,但热胁迫激活作用

相对较弱[13]。ACA/ECA 家族在大白菜不同组织

中表达模式不同,5 个成员编码蛋白定位于细胞

膜上,其中 Bra002762、Bra035649、Bra031701

与低温和盐胁迫响应有关,而 Bra003276 和

Bra024117 与自交不亲和性相关[5],大白菜缺少

ECA 基因会导致新叶生长缓慢,叶片枯萎黄化[14]。

在茄科植物中,低温和盐胁迫处理后,SLyECA1

基因表达丰度较高,且处理前后表达趋势变化明

显,说明 SLyACA1 基因可能是提高植株抗性的关

键基因[9]。野生大豆 Ca2+ATPase 基因 GsACA1 在

苜蓿中超量表达,能够显著提高转基因苜蓿的耐

盐碱性[10]。以上研究表明,ACA/ECA 基因家族

成员在多种植物中均发挥了重要作用。

巴西橡胶树是大戟科橡胶树属乔木,其产生

的胶乳是天然橡胶生成的主要原料。天然橡胶

(natural rubber)是一种以聚异戊二烯为主要成

分的天然高分子化合物,与合成橡胶相比天然橡

胶性能更加优良,在很多方面具有不可替代性,

可用于生产飞机轮胎、手套等数万种橡胶制品,在

军事、医疗、运输等行业起着非常重要的作用[15],

中国是目前为止世界上最大的天然橡胶消费国,

第118页

2246 热带作物学报 第 44 卷

年消费量占全世界总消费量的 40%以上,但自给

率不足为 15%[16]。理论预测,以及生产上出现的

高产橡胶树单株都显示出巴西橡胶树还具有巨大

的产胶潜能[17-18]。目前已知的 2500 余种产胶植物

中橡胶树表现出优异的产胶能力,推测与橡胶树

中高丰度表达的橡胶延伸因子/小橡胶粒子蛋白

(REF/SRPP)基因家族发生扩增有关[19]。已有研

究表明,REF/SRPP 基因[20]、HbNN2 基因[21]、蔗

糖转运蛋白 HbSUT3[22]对橡胶树产胶具有重要作

用。生产上,割胶和乙烯刺激都能显著提高胶乳

产量,表明激素和伤害信号的传递与橡胶生物合

成关系密切。钙离子是植物细胞内重要的信号传

递因子,在植物应对生物和非生物胁迫方面具有

重要功能,而目前关于钙离子泵 ACA/ECA 家族

在橡胶树中的研究却未见报道。本研究以已发表

植物 ACA/ECA 蛋白序列为探针从橡胶树转录组

和基因组中鉴定出橡胶树 ACA/ECA 家族的全体

成员,并从理化性质、系统进化和表达模式等方

面进行了全面系统的分析。研究结果将为进一步

研究 ACA/ECA 基因在橡胶树乳管钙离子信号的

传递,以及橡胶树生长发育和逆境胁迫应答等方

面的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料均来自于海南省儋州市中国热带农

业科学院试验基地。用于表达分析的不同组织材

料(叶片、树皮、胶乳、种子、雄花、雌花等 6

种组织)均来自于正常开割 2 年的热研 7-33-97

橡胶树。由于生产上开割树多为嫁接苗,根部并

非热研 7-33-97 品种,因而本研究选用热研

7-33-97 组培苗的根作为根材料。为了分析乙烯刺

激对基因表达的影响,对正常开割 2 年的热研

7-33-97 橡胶树(未涂抹过乙烯利,割胶频率为 3 d

1 刀)进行乙烯利刺激试验,提前 0、3、12、24 h

将 1.5%的乙烯利涂抹在橡胶树割面,然后在同

一时间点采集胶乳样品。为了进一步研究割胶对

ACA/ECA 基因表达的影响,选取相邻 2 个林段,

PR107 品系和热研 8-79 的未开割橡胶树,同时

进行 3 d 1 刀割胶,分别在第 1、3、5、7、9 刀

采集胶乳样品。利用试剂盒提取以上样品的

RNA,送往北京百迈克公司进行二代 illumina 转

录组测序。

1.2 方法

1.2.1 橡胶树 ACA/ECA 家族成员鉴定及理化性

质分析 根据文献[6]的方法,从 NCBI(https://

www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中下载模式植物拟

南芥的 ACA/ECA 蛋白序列,以拟南芥蛋白序列

作为探针,通过本地服务器进行 blastp 比对(参

数 e 值为 1e-4),得到候选橡胶树 ACA/ECA 家

族成员。利用在线软件 CD-Search(https://www.

ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi ) 对

候选 ACA/ECA 家族成员所包含的结构域进行进

一步鉴定分析,得到橡胶树 ACA/ ECA 家族成员。

利用在线软件 Expasy ( https://web.expasy.org/

protparam/)和 Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.

edu.cn/bioinf/plant-multi/)对橡胶树 ACA/ECA 基

因家族成员的氨基酸分子量、蛋白长度、理论等

电点以及亚细胞定位进行分析。

1.2.2 构建系统进化树以及基因结构图 在

NCBI 网站通过 blastp 比对检索并下载水稻、杨树

和木薯的 ACA/ECA 蛋白序列,使用多序列比对

软件在线 mafft ( https://mafft.cbrc.jp/alignment/

software/)对拟南芥、水稻、杨树、橡胶树和木

薯 5 种植物的蛋白序列进行比对,使用 MEGA

6.0[23]软件采用邻接法构建系统进化树,参数

bootstrap 设置为 1000,利用在线软件 Figtree

(http:// tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)对进化

树进行调整;利用基因组序列和基因组注释 GFF3

文件对橡胶树 ACA/ECA 基因家族进行基因结构

分析,通过 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)[24]

在线软件结合系统进化树绘制出橡胶树 ACA/ECA

基因结构图。

1.2.3 橡胶树 ACA/ECA 家族成员染色体定位分

析 利用 Tbtools[25]软件,根据橡胶树 GFF3 文

件相关信息绘制出橡胶树 ACA/ECA 基因家族的

染色体定位图;利用 MCscanX 软件对橡胶树基

因组进行共线性分析,绘制染色体之间的共线性

连线[26]。

1.2.4 橡胶树 ACA/ECA 家族成员表达模式分析

利用本实验室转录组数据,对 ACA/ECA 家族成

员在不同组织中、乙烯利处理不同时间点以及割

胶处理条件下的表达进行分析[27]。将测序得到的

转录组数据上传到本地服务器,利用 RSEM[28]软

件包进行表达分析得到每个基因的 FPKM 值,利

用 Tbtools 软件中的 HeatMap 小程序绘制热图。

第119页

第 11 期 杨晶晶等:巴西橡胶树 ACA/ECA 基因家族鉴定及分析 2247

2 结果与分析

2.1 橡胶树 ACA/ECA 家族成员鉴定及理化性

质分析

利用已发表模式植物拟南芥的 ACA/ECA 蛋白

序列[6],通过 BLAST 比对筛选橡胶树 ACA/ ECA

基因家族候选成员,并利用在线软件 CD-Search 对

候选成员的蛋白结构域进行进一步鉴定,最终鉴定

得到 45 个 ACA/ECA 基因家族成员,其中包含 38

个 ACA 和 7 个 ECA 亚家族成员,分别命名为

HbACA1~HbACA38 和 HbECA1~HbECA7。橡胶树

ACA/ECA 基因编码的蛋白分子量在 10 048.04 Da

(HbACA26)~125 412.75 Da(HbACA36)之间,

理论等电点在 5.18(HbACA18)~9.21(HbACA26)

之间,45 个成员中 30 个成员等电点均小于 7,说明

大多属于酸性蛋白。亚细胞定位结果显示,橡胶树

ACA/ECA 基因家族成员大多定位于细胞膜(表 1)。

表 1 橡胶树 ACA/ECA 基因家族成员信息

Tab. 1 ACA/ECA gene family members of H. brasiliensis

基因名称

Gene name

基因 ID

Gene ID

染色体

Chromosome

位置

Localization

基因大小

Gene

length/bp

蛋白长度

Protein

length/aa

氨基酸分子量

Molecular

weight/Da

等电点

Isoelectric

point

亚细胞定位

Subcellular

localization

HbACA1 EVM0016302.1 LG07 120 75 368~12 087 029 11 662 818 89 587.47 5.72 叶绿体、液泡

HbACA2 EVM0012621.1 LG03 48 737 744~48 743 632 5889 1032 113 138.54 8.78 叶绿体、内质网、液泡

HbACA3 EVM0000857.2 LG12 6 216 555~62 23 381 6827 1020 111 182.75 8.82 叶绿体、内质网、液泡

HbACA4 EVM0011980.1 LG06 78 963 020~78 970 776 7757 1015 112 073.73 6.92 叶绿体、内质网、液泡

HbACA5 EVM0039732.1 LG16 87 565 443~87 571 971 6529 1015 118 852.42 6.49 叶绿体、内质网、液泡

HbACA6 EVM0010645.1 LG16 87 574 251~87 591 324 17 074 943 108 545.60 6.43 叶绿体、内质网

HbACA7 EVM0003754.1 LG07 102 697 785~102 701 228 3444 1027 118 823.48 6.37 细胞膜

HbACA8 EVM0006762.1 LG02 3 117 085~3 120 040 2956 728 117 316.59 6.75 细胞膜

HbACA9 EVM0005296.1 LG02 3 265 205~3 267 018 1814 558 23 582.69 9.14 细胞膜

HbACA10 EVM0026077.1 LG02 3 125 359~3 127 310 1952 625 115 834.52 5.94 细胞膜

HbACA11 EVM0031132.1 LG02 3 233 955~3 236 682 2728 883 110 578.33 5.83 细胞膜

HbACA12 EVM0024428.1 LG02 3 243 686~3 246 736 3051 1016 111 393.79 8.36 细胞膜

HbACA13 EVM0015252.1 LG02 3 262 343~3 263 065 723 178 111 989.14 7.98 细胞膜

HbACA14 EVM0024534.1 LG09 66 096 509~66 100 083 3575 750 110 309.03 5.92 细胞膜

HbACA15 EVM0029641.1 LG09 66 317 572~66 321 445 3874 720 103 884.94 5.74 细胞膜

HbACA16 EVM0017927.1 LG08 4 391 059~4 394 100 3042 1013 121 009.41 5.34 细胞膜

HbACA17 EVM0032610.1 LG11 12 512 452~12 513 504 1053 209 113 546.69 8.23 细胞膜

HbACA18 EVM0030427.1 LG09 66 076 346~66 079 704 3359 733 116 818.40 5.18 细胞膜

HbACA19 EVM0003826.1 LG09 66 279 877~66 304 362 24 486 1142 80 664.67 7.21 细胞膜

HbACA20 EVM0027429.1 LG09 66 104 652~66 105 203 552 183 68 724.97 6.08 细胞膜

HbACA21 EVM0015004.1 LG09 66 325 873~66 326 422 550 137 97 047.61 8.07 叶绿体、细胞核

HbACA22 EVM0014853.1 LG09 66 353 279~66 353 827 549 182 112 055.29 8.31 细胞膜、细胞核

HbACA23 EVM0033987.1 LG09 66 354 136~66 354 761 626 151 20 006.51 5.45 细胞膜

HbACA24 EVM0021882.1 LG09 66 116 797~66 120 161 3365 465 61 593.16 6.18 细胞膜

HbACA25 EVM0003506.1 LG08 4 375 525~4 379 761 4237 1004 118 968.46 6.44 细胞膜

HbACA26 EVM0010956.1 LG05 96 367 224~96 370 397 3174 1057 10 048.04 9.21 细胞膜

HbACA27 EVM0037889.1 LG16 10 542 615~10 545 666 3052 1006 104 419.52 6.83 细胞膜

HbACA28 EVM0032692.1 LG16 10 696 931~10 700 001 3071 1011 116 861.51 8.48 细胞膜

HbACA29 EVM0016389.1 LG09 62 325 967~62 328 900 2934 977 117 740.50 5.24 细胞膜

HbACA30 EVM0028891.1 LG09 62 389 407~62 392 328 2922 973 107 702.42 5.35 细胞膜

HbACA31 EVM0000930.1 LG08 38 103 650~38 144 781 41 132 1082 107 266.05 5.40 细胞膜

HbACA32 EVM0008651.1 LG02 8 008 368~8 075 531 67 164 1058 80 305.37 8.37 细胞膜

HbACA33 EVM0021769.1 LG02 7 964 947~8 005 806 40 860 956 82 737.19 6.63 细胞膜

第120页

2248 热带作物学报 第 44 卷

续表 1 橡胶树 ACA/ECA 基因家族成员信息

Tab. 1 ACA/ECA gene family members of H. brasiliensis (comtinued)

基因名称

Gene name

基因 ID

Gene ID

染色体

Chromosome

位置

Localization

基因大小

Gene

length/bp

蛋白长度

Protein

length/aa

氨基酸分子量

Molecular

weight/Da

等电点

Isoelectric

point

亚细胞定位

Subcellular

localization

HbACA34 EVM0034728.1 LG02 7 829 269~7 854 528 25 260 1082 20 379.37 8.93 细胞膜

HbACA35 EVM0001605.1 LG02 7 963 616~7 964 455 840 86 50 604.66 5.47 细胞核

HbACA36 EVM0027126.1 LG01 5 339 293~5 359 637 20 345 1070 125 412.75 6.14 细胞膜

HbACA37 EVM0017585.1 LG14 36 438 395~36 464 099 25 705 990 79 361.44 6.55 细胞膜

HbACA38 EVM0033009.1 LG14 36 607 045~36 633 937 26 893 1080 15 362.58 8.93 细胞膜

HbECA1 EVM0006681.1 LG12 6 495 924~6 517 245 21 322 1001 20 166.08 5.95 细胞膜

HbECA2 EVM0032367.1 LG10 74 562 648~74 567 522 4875 1050 16 172.53 8.73 内质网

HbECA3 EVM0035728.1 LG05 101 795 694~101 800 096 4403 1057 116 356.77 7.76 内质网

HbECA4 EVM0037175.1 LG03 3 585 354~3 589 740 4387 760 84 489.55 5.53 内质网

HbECA5 EVM0033174.1 LG02 19 860 280~19 864 338 4059 1070 111 941.08 5.94 内质网

HbECA6 EVM0001506.1 LG13 4 899 156~4 905 549 6394 1059 109 762.53 5.78 内质网

HbECA7 EVM0042041.1 Contig01284 39 845~46 637 6793 954 104 494.54 5.27 内质网

2.2 系统进化树的构建及基因结构分析

为了比较拟南芥(Arabidopsis thaliana, At)、

木薯(Manihot esculenta, Me)、杨树(Populus

trichocarpa, Pt)、水稻(Oryza sativa, Os)4 种植

物和橡胶树(Hevea brasiliensis, Hb)ACA/ECA

蛋白在进化上的相互关系,利用 mafft 软件对 5

种植物蛋白序列进行多序列比对,并用 MEGA 6.0

软件构建系统进化树,然后用 Figtree 软件对进化

树进行修饰。从进化树可以看出(图 1),ACA/ECA

基因家族成员分别聚于 ACA 和 ECA 两个不同分

支,橡胶树与木薯的 ACA/ECA 成员聚在一起,

这与系统进化上木薯与橡胶树的亲缘关系较近是

一致的;其中 HbACA13、HbACA12、HbACA11、

HbACA10、HbACA9、HbACA8 和 HbACA35 聚

集在同一个小分支,并且这 7 个成员均位于 LGO2

号染色体上,推测这 7 个成员是通过串联复制进

化而来。

利用基因组 GFF3 注释文件对橡胶树

ACA/ECA 基因家族成员进行基因结构分析,并通

过 GSDS 软件结合进化树绘制内含子-外显子结

构图(图 2)。在橡胶树 45 个 ACA/ECA 基因家

族成员中,35 个成员含有内含子,包括 26 个 ACA

和 7 个 ECA 成员,橡胶树 ACA/ECA 家族成员内

含子数量在 0~33 之间,存在明显差异。同一分支

上的成员在内含子数目和位置方面相对一致,除

HbACA12、HbACA24、HbACA20、HbACA22、

ACA25、HbACA15 和 HbACA16 等 12 个成员无

内含子外,其他成员均存在 1~33 个内含子;部分

成员出现了较大数目的内含子,如 HbACA31、

HbACA34、HbACA38 和 HbECA1 的内含子数目

在 30~33 之间。

2.3 橡胶树 ACA/ECA 基因家族成员染色体定

位分析

从 45 个 ACA/ECA 基因家族染色体定位图可

看出(图 3),45 个成员分布在 14 条染色体上,

LG02 和 LG09 号染色体上分布有最多的成员,均

为 11 个,LG16 染色体上有 4 个成员,LG08 染色

体分布有 3 个成员,LG07、LG03、LG12、LG05、

LG14 染色体上均有 2 个成员,LG06、LG01、

LG10、LG13、LG11 染色体上分布最少,均为 1

个成员,另外,contig 上也有 1 个成员。进一步

分析发现,LG02 和 LG09 号染色体上的成员大部

分成簇分布,LG08、LG12、LG14 和 LG16 四条

染色体上有成员成对分布,这些成员可能是通过

串联重复复制而来,表明这些 ACA/ECA 家族成

员蛋白序列具有较高的相似性,可能具有类似的

生物学功能。蓝色线连接表明成员之间具有共线

性,在进化过程中通过染色体加倍或大片段复制

形成。

2.4 橡胶树 ACA/ECA 基因家族表达分析

利用本实验室转录组数据对 45 个橡胶树

ACA/ECA 基因家族成员在不同组织(胶乳、树皮、

叶片、种子、根、雌花和雄花)、乙烯利和割胶

处理下的胶乳的表达情况进行分析并绘制热图。

从橡胶树 ACA/ECA 基因家族成员在不同组织中

的表达可以看出(图 4),HbACA1、HbACA3、

第121页

第 11 期 杨晶晶等:巴西橡胶树 ACA/ECA 基因家族鉴定及分析 2249

图 1 橡胶树和其他 4 种植物的 ACA/ECA 蛋白系统进化树

Fig. 1 ACA/ECA protein phylogenetic tree of H. brasiliensis and other four plants

HbACA36、HbECA1、HbECA6 和 HbECA7 功能较

为保守,在各组织中均有表达;HbACA2 在胶乳

中特异高表达,而在其他组织中低表达或不表达,

表现出组织特异性。另外,除 HbACA2 外,

HbACA36、HbACA38 和 HbECA7 四个成员在胶乳

中的表达丰度也比较高,其中 HbACA36 在胶乳表

达丰度最高;在叶片中,HbECA6、HbECA7、

HbACA1、HbACA31 和 HbACA36 表达丰度相对较

高,其中 HbACA31 表达丰度最高;在树皮中,

HbECA6 、 HbECA7 、 HbACA1 、 HbACA31 、

HbACA36、HbACA26 和 HbACA3 表达丰度较高。

HbECA7 在叶片、树皮和根等多种组织中都有相

对较高的表达,说明该成员可能在橡胶树钙离子

运输方面具有重要功能。

乙烯利刺激是橡胶生产中常用的一种增产手

段,为了进一步研究橡胶树 ACA/ECA 基因在乙

烯利刺激后胶乳中的表达,本课题组在乙烯利处

理后的 4 个不同时间点(0、3、12、24 h)对

ACA/ECA 基因家族成员在胶乳中的表达进行了

分析(图 5)。经乙烯利处理后 HbACA2、HbACA36、

HbACA38、HbECA7 四个成员表达呈上升趋势,

其中 HbACA36 在乙烯利处理 24 h 后呈现高丰度

表达,并且在处理前后相对于其他成员都处于较

高表达水平,这和之前不同组织表达分析的结果

第122页

2250 热带作物学报 第 44 卷

绿色代表 UTR 区,黄色代表外显子,外显子之间的连线代表内含子。

Green represents UTR region, yellow represents exons, and the lines between exons were introns.

图 2 橡胶树 ACA/ECA 家族基因结构图

Fig. 2 Gene structure of ACA/ECA family in H. brasiliensis

图 3 橡胶树 ACA/ECA 家族成员在染色体上的定位和共线性

Fig. 3 Localization and collinearity of ACA/ECA family members on chromosomes of H. brasiliensis

第123页

第 11 期 杨晶晶等:巴西橡胶树 ACA/ECA 基因家族鉴定及分析 2251

图 4 橡胶树 ACA/ECA 基因家族成员在 7 种组织中的表达分析

Fig. 4 Expression analysis of ACA/ECA family members in seven tissues of H. brasiliensis

一致。 HbACA3 在乙烯利处理后上调表达,

HbECA5 在胶乳中低表达或不表达但经乙烯利刺

激 24 h 后上调表达。结合染色体定位图来看,

HbACA36 和 HbACA38 有较高同源性,但在表达

上却存在差异,HbACA36 表达丰度更高,并且乙

烯利刺激后表达变化也更明显,推测 HbACA36

在乳管钙离子运输方面起主要作用。研究结果表

明,部分成员乙烯利刺激后在胶乳中的表达呈明

显的上升趋势,推测这些成员可能在乳管胶乳再

生方面发挥重要作用。

在橡胶生产中发现,割胶能够促进橡胶树产

胶。为了进一步分析割胶对橡胶树 ACA/ECA 基

因家族成员表达的影响,选用 2 种不同产量水平

的未开割橡胶树品种进行割胶试验,包括相对低

产的 PR107 和高产品种热研 8-79;同时对 2 个品

种的已开割橡胶树进行割胶试验,通过转录组测

序对基因的表达进行分析。由图 6 可以看出,在

割胶过程中 ACA/ECA 基因家族成员在 PR107 和

热研 8-79 中的表达趋势整体一致,如 HbECA6、

HbECA7、HbACA1、HbACA2、HbACA3、HbACA36、

HbACA37 和 HbACA38 在 2 个品种的割胶过程中

均有表达。其中 HbACA36 在 PR107 和热研 8-79

割胶过程中均处于较高的表达水平,这与前面不

同组织以及乙烯利处理的试验结果一致。但是

HbACA36 在热研 8-79 割胶过程的表达表现出明

显的上升趋势(第 1、3、5、7、9 刀的 FPKM 值

分别为 206.19、221.96、281.45、353.36、355.59),

而 HbACA36 在 PR107 中的表达则表现出先下降

后上升再下降的表达趋势(第 1、3、5、7、9 刀

的 FPKM值分别为 212.89、160.28、209.92、205.15、

第124页

2252 热带作物学报 第 44 卷

图 5 橡胶树 ACA/ECA 基因家族成员在乙烯处理后胶乳中的表达分析

Fig. 5 Expression analysis of ACA/ECA genes in rubber latex after ethylene treatmen

159.48),HbACA36 在热研 8-79 中的整体表达水

平高于 PR107,这可能与热研 8-79 的高产具有一

定的相关性。此外,HbACA18 和 HbACA19 经割

胶处理后仅在热研 8-79 中表达,再次说明橡胶树

ACA/ECA 基因家族成员在 2 个品种中的表达存

在一定差异。

3 讨论

Ca2+-ATPase(ACA/ECA)在植物逆境胁迫应

答和生长发育等方面起重要作用[28],目前,在拟

南芥[6]、大白菜[8]、茄科植物[9]等多种植物中鉴定

得到 ACA/ECA 家族成员,并对部分家族成员的

功能进行了系统分析,而关于 ACA/ECA 基因在

橡胶树中的功能的研究还未见报道。天然橡胶是

重要的战略物质,在工业和国防等方面发挥着重

要作用,橡胶树作为生产天然橡胶的唯一来源,

其种植和生产一直备受关注[29],随着经济的发展,

天然橡胶的消耗也不断增长,出现供不应求[30],

因而提高橡胶产量显得尤为重要,钙离子信号在

乙烯刺激和割胶过程中的传递对增加胶乳产量促

第125页

第 11 期 杨晶晶等:巴西橡胶树 ACA/ECA 基因家族鉴定及分析 2253

图 6 橡胶树 ACA/ECA 家族成员在 PR107 和热研 8-79 两种品系不同割胶刀数表达分析

Fig. 6 Expression analysis of H. brasiliensis ACA/ECA family members under different tapping

number in PR107 and Reyan 8-79 strains

使乳管胶乳再生至关重要,因此探明 ACA/ECA

基因家族在橡胶树中的功能有重要研究意义。本

研究鉴定得到橡胶树中 45 个 ACA/ECA 基因家族

成员,包括 38 个 ACA 成员,7 个 ECA 成员,其

中 ACA 成员明显多于 ECA 成员,这与其他植物

的研究结果一致。从系统进化树来看有 2 个明显

分支,在 2 个分支中橡胶树与木薯 ACA/ECA 聚

在一起,这与橡胶树和木薯在系统进化上有较近

的亲缘关系是一致的。从染色体定位图看,有成

员成对或者成簇存在,其中 2 号和 9 号染色体上

的部分成员聚在一起,结合进化树可以看出,相

对于杨树和木薯等其他植物,橡胶树 ACA/ECA

成员在部分分支上出现了扩张,并且扩张主要由

串联复制产生的。在表达方面,部分 ACA/ECA

成员在不同组织中的表达表现出组织特异性,如:

HbACA2 在胶乳中表达丰度较高,HbACA12 在种

子中表达丰度较高,而在其他组织中表达丰度很

低或不表达;在胶乳中,HbACA2、HbACA36、

HbACA38 和 HbECA7 四个成员表达丰度相对较

高,其中 HbACA36 在胶乳中表达丰度最高,并且

第126页

2254 热带作物学报 第 44 卷

明显高于其他 3 个成员,推测 HbACA36 在乳管钙

离子转运方面具有重要作用。乙烯利刺激和割胶

是橡胶树生产中最主要的 2 种增产手段,乙烯利

处理后,HbACA36 在胶乳中表达呈现明显的上升

趋势,在高产品种热研 8-79 割胶过程中 HbACA36

的表达也表现出明显的上升趋势,表明 HbACA36

在橡胶树乳管中可能具有重要功能并且和橡胶树

的产量具有一定的相关性。综上表明,HbACA36

在橡胶树乳管的信号传递方面起重要作用,进而

影响橡胶树乳管中的橡胶生物合成。本研究相关

结果为进一步研究 ACA/ECA 基因的生物学功能,

及其在乙烯刺激橡胶树增产过程中的重要作用奠

定了基础。

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热带作物学报 2023, 44(11): 22562264

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-09-30;修回日期 2022-11-04

基金项目 国家现代农业产业技术体系岗位项目“广西芒果创新团队栽培与病虫害防治”(No. nycytxgxcxtd-2021-06-2);科技先

锋队‘强农富农’‘六个一’专项行动(No. 202204);广西创新驱动发展专项(桂科 AA22068098-2)。

作者简介 黄 星(1996—),女,硕士研究生,研究方向:果树遗传育种与生物技术。*通信作者(Corresponding author):何

新华(HE Xinhua),E-mail:honest66222@163.com;罗 聪(LUO Cong),E-mail:22003luocong@163.com。

芒果 MiNAC7 基因的表达模式及在开花和非生物逆境胁迫

应答中的功能分析

黄 星,徐欢欢,黎开奖,何新华*

,夏黎明,陆婷婷,梁容真,罗 聪*

广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西农业环境与农产品安全重点实验室,广西南宁

530004

摘 要:NAC 转录因子是植物中一个大的基因家族,在调控植物生长发育、信号传导、逆境胁迫响应等方面起重要作

用。前期研究中,从芒果成花基因酵母文库筛选中分离获得 1 个 NAC 基因,命名为 MiNAC7,本研究对该基因的生物

信息学、表达模式和基因功能进行分析。生物信息学分析表明:MiNAC7 基因位于 10 号染色体上,有 4 个内含子,5

个外显子;MiNAC7 基因编码区长度为 1137 bp,编码 379 个氨基酸,理论等电点为 4.88,蛋白质分子量为 93.41 kDa,

氨基酸序列中含有 1 个 NAM 保守结构域。系统进化树分析表明,芒果 MiNAC7 与阿月浑子 PvNAC26 亲缘关系最接近,

同源性最高,氨基酸序列相似性为 69.64%。启动子序列分析显示,MiNAC7 基因的启动子区域包含光响应元件、赤霉

素响应元件以及生长素响应元件等。表达分析显示,MiNAC7 基因在童期组织的茎与芽中表达水平较高,在叶中表达

很低,在成年期组织的茎中表达水平较高,在花和叶中表达很低。同时发现 MiNAC7 基因在营养生长期的叶片中表达

水平较高,在成花转变期和花发育期的叶片中表达水平很低。超量表达的 MiNAC7 基因诱导转基因拟南芥出现晚花表

型,在超量表达 MiNAC7 基因的拟南芥中显著降低了促花基因 AtFT 和 AtAP1 的表达水平,而 AtFLC 晚花基因的表达

水平显著提高。逆境胁迫处理显示,超量表达 MiNAC7 基因的拟南芥提高了对干旱和盐的抗性,提高了对 GA3 的抗性,

但对 ABA 更敏感。本研究表明,芒果 MiNAC7 基因不仅影响成花也参与对非生物胁迫的应答,为深入研究 MiNAC7

基因参与调控芒果开花和逆境胁迫应答的基因调控网络奠定基础。

关键词:芒果;MiNAC7;生物信息学分析;表达模式;功能研究

中图分类号:S667.7 文献标识码:A

Expression and Function Analysis of a MiNAC7 Gene in Response to

Flowering and Abiotic Stress in Mango

HUANG Xing, XU Huanhuan, LI Kaijiang, HE Xinhua*

, XIA Liming, LU Tingting, LIANG Rongzhen,

LUO Cong*

College of Agriculture, Guangxi University / State Key Laboratory for Protection and Utilization of Subtropical Agricultural Biological Resources / Guangxi Key Laboratory for Agro-Environment and Agro-Product Safety, Nanning, Guangxi 530004, China

Abstract: NAC transcription factors are a large gene family in plants which play important roles in regulating plant

growth and development, signal transduction, stress response, etc. In the previous study, the NAC gene, named MiNAC7,

was isolated by the yeast two-hybrid system. In this study, the bioinformatics, expression patterns and gene functions of

genes were studied. Bioinformatics analysis showed that the MiNAC7 gene was located on chromosome 10, with 4 introns and 5 exons. The length of the coding region of the MiNAC7 gene was 1137 bp, encoding 379 amino acids, the

theoretical isoelectric point was 4.88, the molecular weight of the protein was 93.41 kDa, and the amino acid sequence

第129页

第 11 期 黄 星等:芒果 MiNAC7 基因的表达模式及在开花和非生物逆境胁迫应答中的功能分析 2257

contained a conserved NAM domain. Phylogenetic tree analysis showed that mango MiNAC7 and pistachio PvNAC26

had the closest genetic relationship and the highest homology, and the amino acid sequence similarity was 69.64%.

Promoter sequence analysis showed that the promoter region of the MiNAC7 gene contained light response elements,

gibberellin response elements and auxin response elements. Expression analysis showed that the expression level of the

MiNAC7 gene was high in the stems and buds of juvenile tissues, low in flowers, high in the stems of adult tissues, and

low in flowers and leaves. At the same time, it was found that the MiNAC7 gene maintained a high expression level in

the leaves at the vegetative growth stage and a low expression level in the leaves at the flowering transformation stage

and flower development stage. Overexpression of the MiNAC7 gene led to a late-flowering phenotype in transgenic

Arabidopsis. The overexpression of the MiNAC7 gene in Arabidopsis significantly reduced the expression level of the

floral-promoting genes AtFT and AtAP1, while the expression level of the late-flowering gene AtFLC was significantly

increased. Stress treatment showed that Arabidopsis with excessive expression of the MiNAC7 gene improved its resistance to drought and salt and improved its resistance to GA3 but was more sensitive to ABA. This study shows that the

mango MiNAC7 gene not only affects flowering but also participates in the response to abiotic stress, which would lay a

foundation for further research on the gene regulatory network of the MiNAC7 gene involved in regulating mango flowering and stress response.

Keywords: mango; MiNAC7; bioinformatics analysis; expression pattern; functional research

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.014

NAC(NAM、ATAF1/2 和 CUC2)基因家族

是最大的植物特有转录因子家族之一,基因成员

数量庞大[1]。随着全基因组测序技术日趋完善,

目前已发现绝大部分物种均存在 100 个以上的

NAC 基因数量[2]。NAC 基因在影响植物生长[3]、

调控植株成花[4]、果实成熟[5-6]、叶片衰老[7]和应

对非生物胁迫[8-10]等生理过程中发挥了重要作用。

NAC 基因家族参与多种激素调控途径和非生

物胁迫应答过程。NAC 基因参与调节 ABA 信号

传导途径,如:拟南芥 AtNAC016 可以结合 ABA

依赖性胁迫信号通路中的关键转录因子脱落酸响

应元件结合蛋白 1 基因(AREB1)的启动子,通

过抑制AREB1的转录来促进对干旱胁迫的反应[11];

过表达水稻 ONAC022 对外源 ABA 的敏感性增

强,与 ABA 有关的调控基因表达上调,即水稻

ONAC022 通过调节 ABA 信号传导途径来提高抗

旱和耐盐胁迫能力[12];陆地棉 GhirNAC2 直接与

GhNCED3a/3c 的启动子结合,通过调节 GhNCED3a/3c 表达来调节 ABA 生物合成和气孔关闭,增

强了转基因植物的抗旱性[13]。NAC 基因参与调节

GA信号传导途径,如甘蔗ScNAC23直接与DELLA

蛋白 ScGAI 相互作用调节 GA 信号传导途径来促

进甘蔗开花和叶片衰老[14]。NAC 基因还参与调节

生长素和细胞分裂素等途径,如水稻 OsNAC2 基

因可以直接结合 IAA 和细胞分裂素(cytokinin,

CK)相关基因的启动子来调节根发育过程中的细

胞分裂[15]。另外,甘蔗 OsNAC14 可以直接与 DNA

修复系统中同源重组的关键成分OsRAD51A1启动

子之间相互作用,招募参与 DNA 损伤修复和防御

反应的因子来提高耐旱性[8];梭梭 HaNAC1 直接

与 AtNAC32 蛋白相互作用来增强抗旱性[16]。

芒果(Mangifera indica L.)是重要的热带水

果,适时开花有利于芒果生产[17]。前期研究中,

课题组从芒果成花基因 LEAFY 的酵母文库筛选

获得 1 个 NAC7 基因,而 NAC 转录因子参与了植

物的逆境胁迫应答[18]。目前尚不清楚芒果 MiNAC7

基因是否参与了芒果的成花与逆境胁迫应答。因

此,本研究对 MiNAC7 的生物信息学、表达模式

和基因功能进行分析,明确 MiNAC7 基因在芒果

开花和非生物胁迫中的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用芒果品种为四季蜜芒(Mangifera

indica L. cv. SiJiMi),该芒果品种生长于广西大学

农学院标本园中。用于时间表达分析的样本主要

为成年期的叶片,采集时间为 2021 年 9 月至 2022

年 5 月,每月 1 日下午 5 点采集 1 次。时间表达

主要分为 5 个生长阶段,即营养生长期、成花诱

导期、花芽分化期、花序伸长和开花期、果实发

育初期。用于组织表达分析的样本主要为童期的

叶、茎、芽,采集时间为 2022 年 2 月 15 日;成

年期的叶、茎、花以及幼胚和成熟胚,采集时间

为 2021 年 11 月 16 日。所有样品采集后立即用液

氮冷冻并保存在−80 ℃冰箱中。本研究中使用的

拟南芥为哥伦比亚型拟南芥。

第130页

2258 热带作物学报 第 44 卷

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 利用 TBtools 软件和

cDNA 以及 DNA 文件绘制 MiNAC7 的 DNA 序列结

构图[19];通过 NCBI/blastp 数据库对芒果 MiNAC7

编码的氨基酸序列进行同源查找并预测其保守结

构域,利用 DNAMAN 软件对不同物种的 NAC 蛋

白进行氨基酸序列比对;利用 MEGA 7.0 软件构

建 NAC 蛋白的系统发育树[20];利用 NewPlace 数

据库对 MiNAC7 基因前 2000 bp 的启动子区进行

分析并通过 TBtools 软件绘制顺式元件的分布。

1.2.2 MiNAC7的表达分析 芒果样品 RNA采用

美基公司的难提植物总 RNA 小提试剂盒提取,拟

南芥样品 RNA 采用植物 RNA 小量提取试剂盒提

取。利用 M-MLV 逆转录酶按照说明书将 RNA 逆

转录为 cDNA,用于后续实验。利用在线软件 Primer

3.0 Plus 设计特异引物(MiNAC7u: 5ʹ-CTGCAG

ACATAAACGGTGGA-3ʹ, MiNAC7d: 5ʹ-TGGGTTGACAAGATCCAACA-3ʹ),以芒果 MiActin1 为内参

基因[21](qMiACTu: 5ʹ-CCGAGACATGAAGGAGAAGC-3ʹ, qMiACTd: 5ʹ-GTGGTCTCATGGATACCAGCA-3ʹ)。采用 TaKaRa公司的SYBR Green和SYBR

Premix Ex Taq II 试剂,使用 Applied Biosystems 7500

实时定量 PCR 仪对 MiNAC7 基因的表达进行 RTqPCR 检测,使用 2–ΔΔCT方法对荧光定量的结果进

行分析[22]。

1.2.3 拟南芥的转化 将 MiNAC7 的完整 cDNA

序列(CDS)插入到 pBI121 载体中,将阳性重组

质粒 pBI121-MiNAC7 按照说明书的方法导入农

杆菌 EHA105 中,随后用花序侵染法对野生型拟南

芥进行转化[23]。收获侵染后的种子,将其播种于含

有 50 mg/L 卡纳的 1/2MS 培养基中进行阳性苗筛

选,利用余海霞等[24]改良的 CTAB 法提取阳性拟南

芥的 DNA,用 MiNAC7 的特异引物对阳性转基因

拟南芥进行 PCR 检测与验证。对序列检测正确的阳

性拟南芥进行培育繁殖,直至获得纯合株系。

1.2.4 转基因拟南芥的表型分析 将拟南芥置于

长日照(16 h 光照/8 h 黑暗)和 21 ℃的条件下培

养,以野生型拟南芥(WT)和转空载拟南芥

(pBI1121)为对照,观察转基因拟南芥的表型,

统计植株第一朵花开放的时间。以 T3 代纯合转基

因拟南芥的 cDNA 为模板,拟南芥基因 AtACTIN2

为内参基因(AtActin2u: 5ʹ-TCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3ʹ, AtActin2d: 5ʹ-CCGTACAGATCCTTCCTGATATCC-3ʹ),通过半定量法[25]

检测芒果 MiNAC7 基因在转基因拟南芥中的表达

水平。通过 qRT-PCR 法检测开花相关基因在转基

因拟南芥中的表达水平(AtFTu: 5ʹ-CTTGGCAGGCAAACAGTGTATGCAC-3ʹ, AtFTd: 5ʹ-GCCACTCTCCCTCTGACAATTGTAGA-3ʹ; AtAP1u: 5ʹCACCAAATCCAGCATCCTTAC-3ʹ, AtAP1d: 5ʹGTTCGAGATCATTCCTCCTCA-3ʹ; AtFLCu: 5ʹACTTGTGGATAGCAAGCTTGTGG-3ʹ, AtFLCd:

5ʹ-CATGAGTTCGGTCTTCTTGGCTC-3ʹ)。

1.2.5 转基因拟南芥的非生物逆境胁迫处理 将

T4 代转基因拟南芥幼苗置于长日照培养箱经过 3 d

培养后转入逆境培养基中,竖直放置并继续培养 5 d

后,拍照并记录野生型和转基因拟南芥的根长表型

和鲜重。逆境胁迫处理所用的试剂及浓度设计如

下:盐胁迫使用浓度为 0、100、125 mmol/L 氯化

钠(NaCl);干旱胁迫使用的甘露醇(mannitol)浓

度为 0、300、400 mmol/L;ABA 浓度为 0、5 μmol/L,

GA3 浓度为 0、5、10 μmol/L。

1.3 数据处理

本研究所有数据(如表达分析、表型分析和

非生物胁迫逆境分析数据等)均使用 Excel 软件进

行统计处理,采用 IBM SPSS 25.0 软件进行单因素

方差分析和 Duncan 多重范围检验,利用 GraphPad

Prism 9 绘制条形图,P<0.05 表示差异显著,有统

计学意义。

2 结果与分析

2.1 MiNAC7 生物信息学分析

MiNAC7 基因 DNA 全长为 3631 bp,编码区长

度为 1137 bp,编码 379 个氨基酸,等电点为 4.88,

蛋白质分子量为 93.41 kDa。MiNAC7 有 4 个内含

子,5 个外显子(图 1A)。利用 MEGA 7.0 软件构

建了 NAC 蛋白的系统进化树(图 1B),芒果

MiNAC7 与阿月浑子 PvNAC26 最接近,同源性

最高,氨基酸相似性为 69.64%,且 MiNAC7 与

PvNAC26、CcNAC29、CcNAC100、CsNAC29、

LcNAC39 同源性较高。故对这 6 个物种的 NAC

氨基酸序列进行比对,其保守结构域如图 1C 所

示,6 种蛋白的 N 端表现出高度的相似性,氨基

酸序列中含有 1 个 NAM 保守结构域,是 NAC 基

因家族的典型结构域,C 端表示出明显的差异。

对 MiNAC7 基因的起始密码子前 2000 bp 的启动子

区域进行顺式元件分析(图 1D),MiNAC7 基因启

动子主要包含 6 种不同类型的顺式调控元件,即

第131页

第 11 期 黄 星等:芒果 MiNAC7 基因的表达模式及在开花和非生物逆境胁迫应答中的功能分析 2259

A:MiNAC7 的 DNA 序列结构,方块表示外显子,横线表示内含子;B:MiNAC7 的系统进化树;

C:MiNAC7 的氨基酸序列比对;D:MiNAC7 的启动子顺式作用元件可视化图。

A: Gene structure analysis of MiNAC7, squares represent exons and horizontal lines represent introns; B: Phylogenetic analysis of MiNAC7;

C: Sequences analysis of MiNAC7; D: Cis-elements within MiNAC7 gene promoters analysis of MiNAC7.

图 1 MiNAC7 基因生物信息学分析

Fig. 1 Bioinformatics analysis of MiNAC7 gene

光响应元件(light response element)、ICE 转录因

子结合位点、MYB 转录因子结合位点、赤霉素响

应元件(gibberellin response)、茉莉酸响应元件

(jasmonic acid response element)以及生长素响

应元件(auxin response element)等。

2.2 MiNAC7 基因的表达模式分析

为探究 MiNAC7 基因在四季蜜芒不同组织的

表达特性,采集童期和成年期的不同组织进行表

达模式分析。如图 2A 所示,MiNAC7 基因在各

个组织中均表达,但表达存在差异,MiNAC7 在

童期组织的茎中表达最高,其次是在芽中,在叶

中表达很低,在成年期的茎中表达水平较高,在

花和叶中表达很低;表明 MiNAC7 基因在茎中优

势表达。为了探究 MiNAC7 基因在四季蜜芒中不

同生长发育时期的表达特性,利用 qRT-PCR 对

不同时期的表达模式进行分析。如图 2B 所示,

MiNAC7 基因在不同时期的叶片中均存在不同程

度的表达,其中在营养生长期的叶片中维持较高

的表达水平,在成花转变期和花发育期的叶片中

表达水平很低,说明 MiNAC7 基因与植物生长发

第132页

2260 热带作物学报 第 44 卷

A:MiNAC7 基因在不同组织中的表达;B:MiNAC7 基因在不同时期的表达。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

A: Relative expression of MiNAC7 in different tissues; B: Relative expression of MiNAC7 at different stages.

Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

图 2 MiNAC7 基因的表达模式分析

Fig. 2 Expression analysis of MiNAC7 gene in mango

育有关。

2.3 MiNAC7 转基因拟南芥对开花的影响

将构建好的载体采用花序侵染法转化野生型

拟南芥植株后,筛选阳性株系并繁育至 T3 代纯合

植株。通过半定量 PCR 技术检测 MiNAC7 在转基

因拟南芥中的表达情况,结果如图 3A1 所示,

MiNAC7 在这 3 个转基因株系(OE-2、OE-3、OE-6)

中均可以正常表达,而在野生型(WT)和转

pBI121 空载拟南芥中不表达。以野生型拟南芥

(WT)和转空载 pBI121 拟南芥为对照,观察

MiNAC7 转基因拟南芥的开花时间。结果如图 3A

所示,MiNAC7 转基因拟南芥显著延迟开花,开

花时间比对照植株晚约 4 d(图 3B)。转基因拟

南芥开花内源基因表达水平检测显示,MiNAC7

转基因拟南芥中促花基因 AtFT 和 AtAP1 的表达

水平被显著下调,而抑制成花基因 AtFLC 的表达

水平被显著上调(图 3C)。

2.4 MiNAC7 转基因拟南芥对逆境胁迫应答的

影响

为了解 MiNAC7 在非生物逆境胁迫中的功

能,对野生型拟南芥和 3 个超量表达株系进行盐

胁迫处理(0、100、125 mmol/L NaCl)、干旱胁

迫处理(0、300、400 mmol/L 甘露醇)和激素处

理(0、5 μmol/L ABA,0、5、10 μmol/L GA3),

结果见图 4。在对照组中,野生型与 MiNAC7 转

基因拟南芥在根长和鲜重上差异不显著,实验组

的野生型与 MiNAC7 转基因拟南芥在根长和鲜重

上差异显著。盐胁迫处理使拟南芥根长生长受到

抑制,但 MiNAC7 转基因拟南芥的根长受到的抑

制显著小于野生型拟南芥。干旱胁迫抑制了拟南

芥根长生长,鲜重重量降低,但 MiNAC7 转基因

拟南芥的根长受到的抑制比野生型拟南芥轻,鲜

重比野生型拟南芥重。GA3 激素处理使拟南芥根

长和鲜重均受到不同程度的影响,5 μmol/L GA3

激素处理促进了 MiNAC7 转基因拟南芥的根长生

长,鲜重升高,但对野生型拟南芥的根长生长无

显著差异;10 μmol/L GA3 激素处理与 5 μmol/L

GA3 激素处理相比,野生型拟南芥和 MiNAC7 转

基因拟南芥的根长生长均被抑制。在 5 μmol/L

ABA 激素处理下拟南芥表型差异明显,植株弱

小,MiNAC7 转基因拟南芥的根长比野生型拟南

芥的短。综上所述,过表达 MiNAC7 基因增强了

转基因拟南芥对 ABA 的敏感性、抗 GA3 以及抗

旱和耐盐碱能力。

3 讨论

NAC 基因家族广泛存在于大量物种中,在植

物激素信号传导,成花发育、果实成熟、叶片衰

老等植物生长发育过程以及高盐、干旱、低温或

高温等非生物胁迫中起重要作用[26]。通过酵母双

杂交文库筛选,挖掘获得了 1个 NAC类转录因子,

命名为 MiNAC7,NCBI 同源性比较分析显示,

第133页

第 11 期 黄 星等:芒果 MiNAC7 基因的表达模式及在开花和非生物逆境胁迫应答中的功能分析 2261

A:过表达 MiNAC7 转基因拟南芥推迟开花图,A1:MiNAC7 基因在野生型拟南芥、转 pBI121 空载拟南芥和 3 个超量表达 MiNAC7

拟南芥株系中的半定量表达水平; B:过表达 MiNAC7 转基因拟南芥表型开花时间分析,不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05);

C:MiNAC7 转基因拟南芥中 3 个开花相关基因的表达模式,*表示处理间差异显著(P<0.05)。

A: Overexpression of MiNAC7 in Arabidopsis delays flowering, A1: Semi-quantitative expression analysis of MiNAC7 in wide type,

pBI121-expressing and MiNAC7 overexpression transgenic lines; B: Phenotypic data of overexpressed MiNAC7 gene in Arabidopsis, Different lowercase letters indicate significant difference among treatments (P<0.05); C: Expression analysis of the transgenic Arabidopsis with

flowering time-related genes, * indicates significant difference among treatments (P<0.05).

图 3 超量表达 MiNAC7 拟南芥推迟开花的表型分析

Fig. 3 Overexpression of MiNAC7 in Arabidopsis delays flowering

A:不同逆境胁迫下过表达 MiNAC7 转基因拟南芥生长情况;B~E:不同逆境胁迫下过表达 MiNAC7 转基因拟南芥根长数据图;F~G:

不同逆境胁迫下过表达 MiNAC7 转基因拟南芥鲜重数据图;*表示处理间差异显著(P<0.05)。

A: Growth of Arabidopsis seedlings on MS plates with different stress; B-E: Root length data of overexpressed MiNAC7 transgenic

Arabidopsis under different stress; F-G: Weight data of overexpressed MiNAC7 transgenic Arabidopsis under different stress; *

indicates significant difference among treatments (P<0.05).

图 4 超量表达 MiNAC7 拟南芥植株对逆境胁迫的抗性分析

Fig. 4 Phenotypic analysis of roots of wild-type and MiNAC7-overexpressing Arabidopsis under abiotic stress

第134页

2262 热带作物学报 第 44 卷

MiNAC7 与多个被命名为不同名字的 NAC 基因具

有同源性,其中与阿方索芒果 MiNAC7 的核苷酸和

氨基酸同源性分别为 98.16%和 96.04%。进化树分

析显示芒果 MiNAC7 与阿月浑子 PvNAC26 最接

近,同源性最高,氨基酸相似性为 69.64%。启动

子顺式元件分析表明,芒果 MiNAC7 基因可能受

到光照、激素以及逆境胁迫的调控。

不同物种 NAC 家族基因表现出不同的表达模

式。蜡梅 CpNAC68 在成熟叶和花上特异表达[27],

小麦 TtNAC2A 在叶和根中特异表达[28]。黄瓜 NAC

基因家族中有 11 个基因的优势表达部位是茎[29],

菊花菜 NAC 基因家族中有 3个成员在茎的生长发

育过程中起重要的调控作用[30]。在本研究中,芒

果 MiNAC7 基因在童期组织中的表达水平相对于

成年期更高,在童期茎的表达量最高,与北沙柳

SpsNAC005 的研究结果相似[31]。芒果时空组织分

析结果显示,MiNAC7 基因在营养生长期表达量

较高,但在成花转变和花发育期表达水平较低,

说明 MiNAC7 与芒果成花有关。

在植物开花时间的调控中不同的 NAC基因具

有不同的功能。甘蔗 ScNAC23 的过表达促使转基

因拟南芥提前开花[14],黄麻 CcNAC1 可以让植物

的花期提前[32],OsNAC7 亚家族 CHR00069684 基

因使转基因烟草提前开花[30]。本研究中,MiNAC7

过表达的转基因拟南芥延迟开花,并下调开花促

进基因 AtFT 和 AtAP1 的表达,上调成花抑制基

因 AtFLC 的表达,说明 MiNAC7 通过调控成花相

关基因的表达进而影响转基因植株成花。芒果

MiNAC1 基因不影响转基因拟南芥的开花时间[33],

说明不同类型的 NAC 基因在调控植物成花过程

中的功能存在差异。

植物 NAC 转录因子在多种非生物胁迫应答

中起重要作用,在 NaCl、甘露醇或 ABA 胁迫条

件下,刚毛柽柳 ThNAC13 转基因植物的根长和鲜

重与野生型植物相比均显著增加[34]。在 ABA 胁

迫条件下,南荻 MlNAC10[35]、欧李 ChNAC1[36]

转基因植物都增加了对 ABA 的敏感性。在本研究

中,100、125 mmol/L 浓度的盐胁迫处理和 300、

400 mmol/L 的干旱胁迫的转基因拟南芥根长均比

野生型拟南芥根长较长,鲜重比野生型拟南芥重。

5、10 μmol/L GA3 激素处理促进了 MiNAC7 转基

因拟南芥的根长生长,在 5 μmol/L ABA 激素处理

下转基因拟南芥根长较短,说明 MiNAC7 也参与了

植物的逆境胁迫应答过程。这与芒果 MiNAC1 基因

在逆境胁迫方面的研究结果相似[33]。

综上所述,芒果 MiNAC7 基因不仅参与调控

植株开花,同时响应非生物逆境胁迫应答。

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热带作物学报 2023, 44(11): 22652272

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-10-10;修回日期 2022-11-16

基金项目 国家现代农业产业技术体系项目(No. CARS-11);海南省院士创新平台科研专项(No. SQ2021PT0035)。

作者简介 伍宝朵(1984—),女,硕士,助理研究员,研究方向:胡椒种质资源与遗传育种。*通信作者(Corresponding author):

闫 林(YAN Lin),E-mail:yanlin2575@163.com。

流式细胞术估测胡椒属植物基因组大小方法的建立及应用

伍宝朵1,3,4,胡丽松1,3,4,冯楗雄2

,范 睿1,3,4,郭 芬2

,吉训志1,3,4,郝朝运1,3,4,

闫 林1,4*

1. 中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁 571533;2. 云南农业大学热带作物学院,云南普洱 665000; 3. 海南

省 Sim Soonliang 院士工作站,海南万宁 571533;4. 农业农村部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室,海南万宁 571533

摘 要:为建立胡椒属资源基因组大小流式细胞术测定方法,本研究筛选了 6 种细胞核提取液和 3 种不同部位叶片,

以已知基因组大小的黄瓜为标样,运用流式细胞术对胡椒属资源基因组大小进行了测定。结果表明:改良细胞核提取

液和倒一叶是适合胡椒流式细胞术的提取液和取样部位;栽培胡椒品种古晋、Aman 和 EMAS 胡椒的基因组大小为

667.94~719.32 Mb,而热引 1 号、柬埔寨小叶种、班尼约尔 1 号和 73F5 的基因组大小为 759.69~785.38 Mb,因此不同

栽培品种之间基因组大小存在差异;推算基因组大于 900 Mb 的石楠藤和山蒟的染色体条数应该是大于 52 且为 13 的倍

数,基因组大小在 600~800 Mb 范围内种质的染色体数可能是 52 条。杂交种不但具有与栽培胡椒和黄花胡椒相近的表

型,其基因组大小也几乎等于栽培胡椒和黄花胡椒的平均值,推测杂交种可能是栽培胡椒和黄花胡椒的杂交后代。本

研究可为胡椒属资源基因组大小测定提供方法,也将为胡椒属种质资源评价及远源杂交等研究提供技术基础。

关键词:胡椒属;流式细胞术;细胞核提取液;基因组大小

中图分类号:S573.9 文献标识码:A

Establishment and Application of a Method for Genome Size Estimation

of Piper L. Using Flow Cytometry

WU Baoduo1,3,4, HU Lisong1,3,4, FENG Jianxiong2

, FAN Rui1,3,4, GUO Fen2

, JI Xunzhi1,3,4, HAO Chaoyun1,3,4,

YAN Lin1,4*

1. Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wanning, Hainan 571533, China;

2. College of Tropical Crop Science, Yunnan Agricultural University, Pu’er, Yunnan 665000, China; 3. Hainan Sim Soonliang Academician Workstation, Wanning, Hainan 571533, China; 4. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spiced Beverage

Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wanning, Hainan 571533, China

Abstract: Six nuclear extracts and three leaves of different development stage were screened to establish the flow cytometry (FCM) method for determining the genomic size of Piper L. and Cucumis sativus L. was used as the DNA reference standard. Result showed that the modified nuclear extract and inverted leaf were suitable for the flow cytometry

of Piper L. The genome size of cultivated varieties, including Kuching, Aman and EMAS, ranged from 667.94 to 719.32

Mb, and Reyin1, microphylla variety from Cambodia, Panniyur-1 and 73F5 ranged from 759.69 to 785.38 Mb. Therefore, the genome size was significantly different among cultivated varieties. Furthermore, it is speculated that the

chromosome numbers of P. wallichii and P. hancei, with genome size larger than 900 Mb, should be larger than 52 with

a multiple of 13, and the number of chromosomes of germplasm, with genome size ranged from 600 to 800 Mb, may be

52. The hybrid not only had similar phenotypes to cultivated varieties and P. flaviflorum, but also had an average genome size of cultivated varieties and P. flaviflorum. Therefore, it is speculated that the hybrid may be the hybrid offspring of cultivated varieties and P. flaviflorum. This study would provide a method for the determination of the genome

size of Piper L. germplasm, and provide a technical basis for the study of Piper L. germplasm evaluation and distant

第138页

2266 热带作物学报 第 44 卷

hybridization.

Keywords: Piper L.; flow cytometry; modified nuclear extract; genomic size

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.015

基因组大小是指某种生物中单倍体细胞核或

配子体中的 DNA 含量,是物种特有的,称为 C

值(C-value),常用重量皮克(10‒12

g)或核苷酸

碱基对数量(base pair)来表示。基因组大小与物

种的进化有较强的相关性,同时与生物学性状也

有一定的关系[1]。基因组大小测定的方法有多种,

如 Feulgen 染色法、化学分析法及流式细胞术等。

Feulgen 染色法结果相对准确,但是操作过程繁

琐;化学分析法易受细胞周期影响,致使测定结

果存在偏差[2];而新技术流式细胞术(flow cytometry, FCM)具有瞬间准确分析大量细胞的特

点,是一种测定基因组大小快速且有效的方法[3]。

流式细胞术在人和动物的临床和基础研究中被广

泛应用,植物体内由于含有大量的多糖、多酚等

次生代谢物质,严重影响了 PI 染料的荧光染色强

度,降低了测定基因组大小的准确性[4]。因此明

确适合测定物种流式细胞术的测定方法对该物种

基因组大小研究至关重要。近年来,流式细胞术

在植物中被广泛应用。杨转英等[5]采用流式细胞

术测定不同菠萝蜜株系基因组大小,发现不同菠

萝蜜株系之间基因组大小存在显著差异,且湿苞

株系大于干苞株系。柳觐等[6]利用改良 OTTO 细

胞核提取液检测出澳洲坚果基因组大小为 1.872

758×109

bp,该研究发现运用流式细胞术进行澳

洲坚果基因组 C 值测定准确可靠。

胡椒属植物是胡椒科(Piperaceae)重要的泛热

带组成成分,是基部被子植物中最大的属之一[7]。

约有 1000 多个种,主要分布于南亚、南美洲、中

美洲等热带和亚热带地区。胡椒属内有许多具有

经济价值和开发潜力的资源,例如胡椒(P. nigrum)、卡瓦胡椒(P. methysticum)和石楠藤(P.

wallichii)等被用来入药[8],在亚洲东南部,人们

常将蒌叶(P. betle)和槟榔果连同石灰一起咀嚼

帮助消化。胡椒野生近缘种众多,部分资源具有

优良性状,例如黄花胡椒(P. flaviflorum)具有较

强的抗瘟病性[9]。大叶蒟(P. laetispicum)具有较

长的花穗,石楠藤具有较强的抗寒性等[10]。胡椒

是人们喜爱的调味品,素有“香料之王”的美誉。

原产于印度,胡椒自 1947 年引入中国,目前种植

面积达 3 万 hm2

,年总产量超过 3 万 t,位居世界

第 5 位。我国胡椒栽培品种以热引 1 号(P. nigrum

cv. Reyin1)为主,存在栽培品种单一和抗逆性弱的

问题,严重限制了我国胡椒产业的良性发展[11-12]。

因此亟待开展胡椒资源挖掘和创新利用工作。胡

椒是四倍体植物,染色体数为 2n=4x=52[13]。JOSE

等[14]报道胡椒属不同资源具有不同染色体数,且胡

椒属植物具有较小的染色体长度(0.56~2.41 μm),

而染色体倍性分析需要较强的实验技术,利用流

式细胞术可快速测定胡椒属资源基因组大小,为

染色体倍性估测和分析提供基础。

本研究以 4 份不同来源地胡椒属种质为材

料,通过筛选 6 种细胞核提取液和不同部位叶片,

明确适合胡椒属基因组大小的流式细胞术测定方

法。利用筛选出的适合胡椒流式细胞术测定的方

法,以黄瓜为标样,测定 22 份胡椒属资源的基因

组大小。本研究可为胡椒属资源基因组大小测定

提供方法,也将为胡椒属资源变异、种质资源评

价及远源杂交等研究提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为胡椒属种质,胡椒属种质叶片取

材于中国热带农业科学院香料饮料研究所的农业

农村部万宁胡椒种质资源圃。分别取 4 份来源地

不同的胡椒属种质嫩叶用于细胞核提取液筛选

(表 1);取 4 份种质的下位叶、中位叶、倒一叶

用于叶片部位筛选;22 份胡椒属资源用于测定基

因组大小。以黄瓜(Cucumis sativus L.)为标样[15],

将黄瓜种子播种于 15 cm×20 cm 培养盆中,并在

人工气候室培育,待长出真叶后取嫩叶用于试验。

表 1 供试材料

Tab. 1 Test materials

材料名称

Materials name

种名

Genus name

来源地

Origin place

植株形态

Plant morphology

热引 1 号胡椒 P. nigrum cv. Reyin1 中国海南 木质藤本

黄花胡椒 P. flaviflorum 中国云南 木质藤本

墨西哥胡椒 P. auritum 墨西哥 直立灌木

卡瓦胡椒 P. methysticum 南美洲 直立灌木

第139页

第 11 期 伍宝朵等:流式细胞术估测胡椒属植物基因组大小方法的建立及应用 2267

1.2 方法

1.2.1 细胞核提取液及 DNA 荧光染料的配制

选取 4 种已报道的细胞核提取液(Otto 提取液[5]、

Tris提取液[16]、LB01提取液[4]和 WPB 提取液[17])、

1 种改良提取液[18]和 1 种 PI 试剂盒(广州吉源生

物科技有限公司),细胞核提取液具体配方见表 2。

提取液配制完成后过滤、灭菌,并置于 4 ℃冰箱

内保存。荧光探针是碘化丙啶(PI),PI 工作液中

碘化丙啶的浓度为 1 mg/mL。

1.2.2 细胞核悬浮液的制备和染色 剪取约

20~40 mg 胡椒叶片放入 60 mm 培养皿中,加入

预冷的细胞核提取液 500 μL,让提取液充分浸没

叶片,用厚度为 0.08 mm 锋利的双面刀片迅速切

成碎片,倾斜放置 5 min,再用 400~600 目滤膜

过滤至流式细胞仪专用上样管中,在滤液中加入

2 mL 细胞核提取液或缓冲液、6 μL RNaseA(终

浓度为 40 μg/mL)和 20 μL PI 染液,避光静置

30 min。

表 2 细胞核解离液及提取液成分

Tab. 2 Nuclear buffer and its components

提取液 Buffer 组分 Component

Otto 提取液 Otto Ⅰ: 100 mmol/L citric acid, 0.5% Tween 20, 20 mmol/L β-mercaptoethanol, pH 2.3

Otto Ⅱ: 400 mmol/L Na2HPO4·12H2O, 20 mmol/L β-mercaptoethanol, pH 8.9

Tris 提取液 200 mmo/L Tris, 4 mmol/L MgCl2, 0.5% (V/V) Tritonx-100 pH 7.5

LB01 提取液 15 mmol/L Tris, 2 mmol/L Na2EDTA, 0.5 mmol/L spermine·4HCl, 80 mmol/L KCl, 20 mmol/L NaCl, 15 mmol/L

β-mercaptoethanol, 0.1% (V/V) Triton X-100, pH 7.5

WPB 提取液 200 mmol/L Tris-HCl, 4 mmol/L MgCl2·6H2O, 2 mmol/L Na2EDTA, 86 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Na2O5S2, 1%

PVP-10, 1%(V/V) Triton X-100, pH 7.0

改良提取液 1.0% (V/V) Tritonx-100, 140 mmol/L PVP, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0), 50 mmol/L NaHSO3, pH 7.5

1.2.3 流式细胞术检测 将制备好的细胞核悬浮

液采用德国 Partec 公司 CyFlow® Cube6 流式细胞

仪检测。流式细胞仪的氩离子激光发射器的激发

光波长为 488 nm ,检测通道为 FL2 通 道

590/50[488] ,利用流式细胞仪随机自带软件

CyFlow Cube 15-CFG 收集至少 5000 个细胞,变

异系数(coefficient of variation, CV)控制在 6%

以内;每个样本重复测定 5 次。

1.3 数据处理

利用 FlowJo-V10 软件分析数据,以标样基因

组大小和出峰位置为对照,依据测定样品出峰位

置计算出其基因组大小(基因组 C 值),计算公式

为:待测样本基因组大小=参考样本基因组大小

(待测样本荧光均值/参考样本荧光均值);使用

SPSS 16.0 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 细胞核提取液的筛选

比较 6 种细胞核提取液流式细胞术测定结果

可知(图 1),以 Otto 提取液为细胞核提取液时,

只有墨西哥胡椒能检测出信号峰,热引 1 号胡椒、

黄花胡椒和卡瓦胡椒 3 份种质不能检测出信号

峰。以 Tris 提取液为细胞核提取液时,热引 1 号

胡椒和墨西哥胡椒能检测出信号峰,但是信号峰

碎片较多,CV 值均大于 6,黄花胡椒和卡瓦胡椒

不能检测出信号峰。以 LB01 提取液为细胞核提

取液时,热引 1 号胡椒、墨西哥胡椒和卡瓦胡椒

均能检测出信号峰,其中热引 1 号胡椒和卡瓦胡

椒的信号峰都是碎片较多,CV 值大于 6,墨西哥

胡椒信号峰碎片相对少一些,黄花胡椒不能检测

出信号峰。以 WPB 提取液为细胞核提取液时,

热引 1 号胡椒和墨西哥胡椒均能检测出信号峰,

但是检测出的信号峰都是碎片较多,CV值大于6,

黄花胡椒和卡瓦胡椒不能检测出信号峰。以 PI 试

剂盒为细胞核提取液时,墨西哥胡椒和卡瓦胡椒

能检测出信号峰,但是卡瓦胡椒信号峰碎片稍多,

热引 1 号胡椒和黄花胡椒不能检测出信号峰。以

改良提取液为细胞核提取液时,4 份种质均能检测

出完整信号峰,CV 值小于 6。可见,改良提取液

是适合胡椒属种质流式细胞术的细胞核提取液。

2.2 叶片取样部位的筛选

为选择适合胡椒属种质资源流式细胞检测的

最佳部位叶片,利用筛选出的改良提取液分别对

黄花胡椒、热引 1 号胡椒、卡瓦胡椒和墨西哥胡

椒的下位叶(superior leaf)、中上位叶(inferior

leaf)和倒一叶(inverted one leaf)进行流式细胞

术检测(图 2),结果表明 4 份胡椒种质使用下位

叶和上位叶检测时,少数不能形成完整的信号峰,

第140页

2268 热带作物学报 第 44 卷

图 1 6 种细胞核提取液筛选 4 份胡椒种质流式图

Fig. 1 Flow cytometry results analyzed by six nuclear extract buffer for four Piper L. germplasm

第141页

第 11 期 伍宝朵等:流式细胞术估测胡椒属植物基因组大小方法的建立及应用 2269

图 2 改良提取液检测 4 份胡椒种质不同部位叶片流式结果

Fig. 2 Flow cytometry result of four Piper L. germplasm different sites of leaf samples screened with modified buffer

多数形成了完整的信号峰,但是与倒一叶相比,

下位叶和上位叶形成的信号峰碎片较多,细胞核

收集偏少。可见,倒一叶是适宜胡椒属流式细胞

术的叶片采样部位。

2.3 胡椒属资源 C 值测定

通过比较待测胡椒资源样品与黄瓜样品峰值

的倍数关系(图 3),计算出胡椒资源的基因组大

小(表 3)。以热引 1 号胡椒为例,其荧光强度是

6596 ,标样黄瓜的荧光强度为 3184 ,

ARUMUGANATHAN 等[15]报道利用流式细胞术

测定的黄瓜基因组大小为 367 Mb,依据基因组大

小计算公式,计算出热引 1 号胡椒基因组大小为

759.69 Mb,HU 等[19]通过全基因组测序估测的热

引 1 号胡椒基因组大小为 761.2 Mb,二者误差较

小,说明该方法准确可靠。利用同样的方法,估

测了 22 份胡椒资源基因组大小,检测的胡椒种质

基因组大于 900 Mb 的种质有石楠藤、卡瓦胡椒

和山蒟;基因组在 600~800 Mb 的种质有热引 1

号、柬埔寨小叶种、班尼约尔 1 号、古晋、Aman

胡椒、EMAS 胡椒、73F5、杂交种、复毛胡椒、

华山蒟、蒌叶和筚菝;基因组小于 600 Mb 的种

图 3 标样黄瓜的流式细胞术测定结果

Fig. 3 Flow cytometry determination result of

Cucumis sativus L.

第142页

2270 热带作物学报 第 44 卷

表 3 不同胡椒资源细胞核 DNA 相对含量

Tab. 3 Relative nuclear DNA content in different Piper L. germplasm

种质名称 荧光强度 Fluorescence intensity

Germplasm name

种名

Species name 胡椒 Piper 黄瓜 C. sativus

比值

Ratio

基因组大小

Genome size/Mb

热引 1 号 Piper nigrum 6596.0 3184 2.07 759.69

柬埔寨小叶种 Piper nigrum 7048.2 3407 2.07 759.69

班尼约尔 1 号 Piper nigrum 6771.6 3219 2.10 770.70

古晋 Piper nigrum 6747.0 3491 1.93 708.31

Aman 胡椒 Piper nigrum 6081.2 3348 1.82 667.94

EMAS 胡椒 Piper nigrum 6943.4 3548 1.96 719.32

73F5 Piper nigrum 6688.0 3124 2.14 785.38

杂交种 未知 5166.4 3124 1.65 605.55

海南蒟 Piper hainanense 5772.0 3592 1.62 594.54

蒌叶 Piper betle 7479.0 3539 2.11 774.37

徦蒟 Piper samentosum 5569.2 3716 1.50 550.50

大叶蒟 Piper laetispicum 5111.0 3472 1.47 539.49

石楠藤 Piper wallichii 9847.0 3116 3.16 1159.72

复毛胡椒 Piper bonii 5852.8 3316 1.77 649.59

尖峰岭胡椒 Piper jianfenglingense 5235.8 3371 1.55 568.85

荜菝 Piper longum 6766.8 3316 2.04 748.68

黄花胡椒 Piper flaviflorum 4140.6 3219 1.29 473.43

卡瓦胡椒 Piper methysticum 8026.0 3184 2.52 924.84

墨西哥胡椒 Piper auritum 4208.0 3124 1.35 495.45

斜叶蒟 Piper senporeiense 5225.8 3539 1.48 543.16

华山蒟 Piper cathayanum 6378.4 3361 1.90 679.30

山蒟 Piper hancei 9254.6 3510 2.64 968.88

质有海南蒟、假蒟、大叶蒟、尖峰岭胡椒、斜叶

蒟、黄花胡椒和墨西哥胡椒。综上可见,胡椒属

不同种质间基因组大小差异较大。

3 讨论

植物体内含有大量的多糖、多酚等次生代谢

物质,严重影响了 PI 染料的荧光染色强度,降低

了测定基因组大小的准确性。胡椒属植物是遍布

于热带地区的重要作物,胡椒叶片具有较厚的蜡

质层,叶片硬度较高,细胞中具有较复杂的次生

代谢物质,研究表明胡椒叶中 DPPH 清除能力、

多酚含量及氧自由基清除能力均高于胡椒果实,

可能含有高抗氧化因子[20]。本研究尝试采用已报

道植物流式细胞术测定细胞核提取液(Otto、Tris、

LB01、WPB 提取液和 PI 试剂盒)测试胡椒属植

物,均不能得到满意效果,因此,明确适合胡椒

属植物流式细胞术的细胞核提取液及测定方法对

胡椒属植物基因组大小研究至关重要。

本研究发现,与 Otto、Tris、LB01、WPB 提

取液和 PI 试剂盒相比较,以改良提取液为细胞核

提取液检测胡椒属植物时,噪音峰能够与信号峰

较好分离,碎片相对较少,CV 值也符合流式细胞

术分析要求,是适合胡椒属植物基因组大小测定

的细胞核提取液。本研究选用的 6 种提取液配方

差异较大,以改良提取液检测胡椒属植物效果最

好,LB01 提取液效果次之。比较改良提取液和

LB01 提取液配方发现,二者共有的成分有

Tritonx-100、Cl和 Tris,改良提取液特有的成分

是 NaHSO3 , 而 LB01 提取液特有的成分是

spermine·4HCl。分析另外 3 种已知配方提取液发

现,Tritonx-100、Cl和 Tris 这 3 种成分在 Tris 和

WPB 提取液中也同时存在。说明 NaHSO3 和

spermine·4HCl 可能适用于作为胡椒属植物流式

细胞术检测的提取液配方,尤其是 NaHSO3 更适

合,当然,它们需与其他成分相互作用才能更好

地发挥作用。本研究只测试了改良提取液在胡椒

属植物中的应用,还适用于哪些植物需要进一步

试验证明。

第143页

第 11 期 伍宝朵等:流式细胞术估测胡椒属植物基因组大小方法的建立及应用 2271

分析不同种质信号峰检测结果发现,不同种

质检测出信号峰的难易程度差异较大。如:热引

1 号胡椒在 2 种提取液中能检测出完整信号峰,3

种提取液中能检测的信号峰不能与噪音峰分离;

黄花胡椒除在改良提取液中能检测出完整信号

峰,其他的均不能;而墨西哥胡椒在 4 种提取液

中均能检测出完整信号峰,另外 2 种的信号峰不

能与噪音峰分离。说明利用流式细胞术检测胡椒

属内不同种资源时也具有特异性,这可能与不同

种资细胞内次生代谢物质不同有关。

本研究选用的栽培种胡椒有 7份。古晋、Aman

和 EMAS 胡椒都是马来西亚育成品种,其中

EMAS 胡椒是由 Balancotta(印度品种)和古晋杂

交并回交选育而成,Aman 胡椒是由从哥斯达黎加

引种的品种 CATIE Row1-1 的无性系选育而来[21]。

经测试发现,古晋、Aman 和 EMAS 胡椒的基因

组大小分别为 708.31、667.94、719.32 Mb;热引

1 号是由从印度尼西亚引种的品种南榜的无性系

经长期选育而来,班尼约尔 1 号是从印度引进的

品种,73F5 是热引 1 号和班尼约尔 1 号的杂交后

代,柬埔寨小叶种是从柬埔寨引进的小叶种胡椒

品种。热引 1 号、柬埔寨小叶种、班尼约尔 1 号

和 73F5 的基因组大小分别为 759.69、759.69、

770.70、785.38 Mb。综上可见,本研究中测定的 7

份栽培种胡椒的基因组大小存在差异。JOSE 等[14]

报道栽培种班尼约尔 1 号、Cheriakaniakadan 和

Karimunda 的总染色体长度分别为 67.04、51.48、

56.66 μm,因此不同栽培种之间基因组大小也会

存在差异。本研究中,来源于马来西亚的品种与

来源于印度尼西亚、印度、柬埔寨的品种基因组

大小也具有差异。

JOSE 等[14]认为胡椒属资源的染色体基数是

n=13(P. cubeba 除外),研究发现,栽培胡椒、蒌

叶、荜菝和卡瓦胡椒的染色体数分别为 2n= 4x=52、

2n=2x=52、2n=2x=52 和 2n=10x=130[14, 22-23]。本研

究测定卡瓦胡椒基因组大小大于 900 Mb,明显大

于另外 3 种染色体数为 52 的种质,此外,石楠藤

和山蒟的基因组也大于 900 Mb,依据前面结论推

测石楠藤和山蒟的染色体条数应该是大于 52 且

为 13 的倍数[14]。本研究中 7 份栽培胡椒染色体

数都是 52,基因组大小范围为 667.94~785.38 Mb,

SAMUEL 等[22]研究中报道,3 份染色体数为 52

的种质(P. nigrum、P. ornatum 和 P. porphyrophyllum)染色体长度为 52.32~72.18 μm,其中 P.

nigrum 的染色体长度最长,推断基因组大小在

600~800 Mb 范围内的种质染色体数可能也是 52

条。杂交种是一个未知种,从表型和进化上来看,

该种具有与栽培胡椒和黄花胡椒相近的表型,本

研究发现,其基因组大小几乎等于栽培胡椒和黄

花胡椒的平均值,因此推测杂交种可能是栽培胡

椒和黄花胡椒的杂交后代。

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第145页

热带作物学报 2023, 44(11): 22732280

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-09-19;修回日期 2022-11-17

基金项目 江西省教育厅科学技术研究项目(No. GJJ218111, No. GJJ213308);江西省抚州市青年科技领军人才项目(No.

2020ED66)。

作者简介 许建丰(1982—),女,硕士,讲师,研究方向:药用植物生物技术。*通信作者(Corresponding author):饶泽昌

(RAO Zechang),E-mail:rzc2005010@163.com。

基于转录组测序的斑地锦内参基因筛选及验证

许建丰1

,桂明明2

,张永康1

,尧子钊1

,黄胜和2

,饶泽昌1*

1. 南昌大学抚州医学院,江西抚州 344000;2. 江西中医药高等专科学校医学基础部,江西抚州 344000

摘 要:斑地锦(Euphorbia maculata)是一种常用中药材,其中黄酮类化合物槲皮素是其主要药效成分之一。目前斑

地锦槲皮素生物合成基因研究鲜见报道,而实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)是基因研究的常用方法之一,但具有合适

的内参基因是 RT-qPCR 相对定量的前提条件。为了获得适合的斑地锦内参基因,本研究基于转录组测序结果,筛选出

斑地锦 EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7 以及课题组前期得

到的 EmUBQ 共 10 个基因作为侯选内参基因。通过 RT-qPCR 检测 10 个候选内参基因在斑地锦营养生长期和生殖生长

期的根、茎、叶及果中的表达情况,利用 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 软件分析候选基因的表达稳定性,通过

几何平均值法对不同软件所得结果进行整合并明确综合排名,即 EmGDI1>EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>

EmTRI1>EmSYP22> EmRSZ21=EmRPL7。以 EmGDI1 为内参基因,对槲皮素生物合成过程中的一个关键酶基因 EmC4H

进行表达分析,EmC4H 在不同生长期不同组织内的表达差异与转录组测序结果趋势基本一致。本研究开发的内参基因

EmGDI1 可作为斑地锦不同生长期基因组织特异性表达研究中适合的内参基因。

关键词:斑地锦;内参基因;转录组测序;实时荧光定量 PCR

中图分类号:S567.219 文献标识码:A

Selection and Verification of the Reference Genes of Euphorbia maculata Based on Transcriptome Sequencing

XU Jianfeng1

, GUI Mingming2

, ZHANG Yongkang1

, YAO Zizhao1

, HUANG Shenghe2

, RAO Zechang1*

1. Fuzhou Medical College, Nanchang University, Fuzhou, Jiangxi 344000, China; 2. Department of Basic Medicine, Jiangxi College

of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Jiangxi 344000, China

Abstract: The flavonoid quercetin is one of the main active ingredients in Chinese medicinal herb, Euphorbia maculata.

At present, there are few reports on quercetin biosynthesis gene, and real-time quantitative PCR (RT-qPCR) is one of the

common methods in gene research. But it is a prerequisite for relative quantitative RT-qPCR to have suitable reference

genes. In order to obtain a suitable reference gene, this experiment was based on the results of transcriptome sequencing,

EmSE, EmUBC, EmGDI1, EmLSM12, EmGBP, EmSYP22, EmTRI1, EmRSZ21, EmRPL7 and EmUBQ obtained by our

research group in the early stage were selected as candidate reference genes. RT-qPCR was used to detect the expression

of the candidate reference genes in roots, stems, leaves and fruits of E. maculata during vegetative and reproduction

stages. The expression stability of the candidate genes was analyzed using geNorm, NormFinder and BestKeeper software. The results of different software were integrated and ranked by the geometric mean method. The ranking was in

the order EmGDI1>EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>EmTRI1>EmSYP22>EmRSZ21=EmRPL7. EmC4H,

a key enzyme gene in quercetin biosynthesis, was analyzed using EmGDI1 as the reference gene. The difference of

EmC4H expression in different tissues at different stages was consistent with the trend of transcriptome sequencing. The

reference gene EmGDI1 developed in this study could be used as a suitable reference gene for tissue-specific expression

studies of different stages of E. maculata.

第146页

2274 热带作物学报 第 44 卷

Keywords: Euphorbia maculata; reference gene; transcriptome sequencing; RT-qPCR

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.016

斑地锦(Euphorbia maculata L.)是一年生大

戟科(Euphorbiaceae)大戟属(Euphorbia L.)草

本植物,分布于江西、新疆、河南和浙江等地区[1],

具有清热解毒功效,主治痢疾、泄泻、尿血、便

血、疮疖痈肿、湿热黄疸等[2]。斑地锦主要含有

黄酮类、萜类、酚酸类和生物碱类等成分,目前

已开发有肠炎宁片、三七止血片、泻痢宁片等中成

药,其主要药效成分之一为黄酮类物质槲皮素[3],

研究槲皮素等药用植物有效成分生物合成途径基

因及其调控已成为热点之一[4]。

实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)是分子生物

学中研究基因表达的重要工具之一,具有定量准

确、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,常

用于基因表达定量分析[5]。然而,合适的内参基

因是获得可信相对定量结果的前提[6]。研究表明,

不经筛选评价而以一种基因作为任何条件下的内

参基因可能会大大降低结果的精确度[7-8]。基因芯

片及转录组测序技术等已被用于筛选传统的或新

的内参基因,以利于 RT-qPCR 的开展[9]。转录组

测序是对某一物种的 mRNA 进行高通量测序,反

映特定条件或特定时间点的基因表达情况,通过

分析转录组测序结果可以初步筛选出候选内参基

因[10]。目前评价内参基因表达稳定性的软件较

多,其中应用较广泛的有 geNorm、NormFinder

和 BestKeeper[11-12]。为筛选适用于斑地锦不同生

长期不同组织 RT-qPCR 检测的内参基因,本研究

以前期筛选出的内参基因 EmUBQ[13]和通过转录

组测序数据初步筛选出的 9 个表达相对稳定的基

因 EmRSZ21、EmSE、EmTRI1、EmGDI1、EmSYP22、

EmLSM12、EmGBP、EmRPL7、EmUBC 为候选内

参基因进行 RT-qPCR,分析其在营养生长期和生

殖生长期的根、茎、叶、果中的表达模式,利用

geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 等软件综合

分析其表达稳定性排名,并用 EmC4H(槲皮素生

物合成过程中的关键酶基因之一)进行验证,为

斑地锦不同生长期基因组织特异性表达研究提供

可靠的内参基因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试材料采自江西中医药高等

专科学校实验田,经其药学系中药教研室鉴定为

斑地锦。分别采集营养生长期(未开花且地上部

分有 2 个及以上分枝)植株的根、茎、叶和生殖

生长期(结 3 个及以上的果)植株的根、茎、叶、

果,7 种样品皆为来源于 3 株以上植株的混合样,

样品采集后立即置于-80 ℃冰箱备用。

1.1.2 主要试剂与仪器 RNA 提取试剂盒(Spin

Column Plant Total RNA Purification Kit)购自生

工生物工程(上海)股份有限公司;反转录试剂

盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA

Eraser)、荧光定量 PCR 试剂(PrimeScriptTM RT

Master Mix)、Pfu 酶(TransStart FastPfu DNA

Polymerase)、Taq 酶等购自宝生物工程(大连)

有限公司。普通 PCR 仪(T100TM Thermal Cycler)、

荧光定量 PCR 仪(CFX96 Real-Time)等购自美

国 Bio-Rad 公司。超微量分光光度计(NanoDrop

One)购自美国 Thermo Scientific 公司。引物合成、

测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总 RNA 的提取和 cDNA 的合成 参照试

剂盒说明书,提取斑地锦不同生长期根、茎、叶、

果总 RNA,通过超微量分光光度计测定 RNA 浓

度,并用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的质量。cDNA

的合成按相应试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 候选内参基因的筛选 根据课题组斑地锦

转录组测序结果,选取 FPKM 值大于 10 且变异

系数小于 0.1 的 9 个基因 EmSE、EmUBC、

EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、

EmRSZ21 、 EmRPL7 以及课题组前期筛选的

EmUBQ 共 10 个基因为候选基因。

1.2.3 引物设计及特异性检测 利用 Primer

Premier 5.0 软件设计 9 个候选内参基因及 EmC4H

基因定量 PCR 引物,EmUBQ 定量 PCR 引物参考

文献[13],各引物序列见表 1。为排除引物二聚体,

检验引物特异性及非特异性扩增产物对结果的影

响,用相应引物进行普通 PCR 扩增。

1.2.4 RT-qPCR 溶解曲线分析 以 cDNA 作为模

板,进行 RT-qPCR 扩增,加热 RT-qPCR 产物从

65 ℃到 95 ℃,每隔 0.5 ℃停留 5 s 检测 1 次荧光

强度以获得溶解曲线。 RT-qPCR 反应体系

(25 µL):2×TB Green Premix Ex Taq II 12.5 µL,

第147页

第 11 期 许建丰等:基于转录组测序的斑地锦内参基因筛选及验证 2275

表 1 内参基因及 EmC4H 基因的引物设计

Tab. 1 Primer design for reference genes and EmC4H gene

引物名称

Primer name

引物序列(5′-3′)

Primer sequences (5′-3′)

退火温度

Annealing

temperature/℃

UBQ-qF ATAACCCTCGAGGTCGAGTC 57

UBQ-qR TGGAGAGTGGACTCCTTCTG

RSZ21-qF TCTCTGCTTCTCTGCACGTC 57

RSZ21-qR CATAACACGCGCTCTGTTGC

SE-qF CCCCAGTGTTGATGCCTGTT 57

SE-qR GCCTTGCATTTCTGCCACC

TRI1-qF AAGCCGTCAAGCAGATTTGG 57

TRI1-qR CCAGGAACCCGACTTTCTCT

GDI1-qF TCTAGGTCCCGTTGACGAGT 57

GDI1-qR TCGAGAGCCTTCCCAGTGAT

SYP22-qF ACCCTTCTCAAGCTGTAGCC 57

SYP22-qR ACCAGATCGCCAATTCGTTG

LSM12-qF TGCAGTCAAAGAACAGCCAC 57

LSM12-qR GGTACACACCCTTCACTGGT

GBP-qF CGCTAAGGTCGATGCAGTTG 57

GBP-qR AAAGCGGAGCTCGTCTTCTG

RPL7-qF ATTTTGCAGCTGTTGCGCTT 57

RPL7-qR TGGTTCACTTTCCCGTAGCC

UBC-qF GCAGTGTCAACACAACCGTC 57

UBC-qR AATAACCTGTGCTGCTCGCT

C4H-qF GTAAACCATCCCGAGATTCAG 57

C4H-qR CATGTGTGGTACAAGCAGC

上游引物、下游引物各 1 µL(10 μmol/L),cDNA

溶液 2 µL,灭菌 ddH2O 8.5 µL。扩增程序:95 ℃

5 min;95 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40

个循环。

1.2.5 候选内参基因的筛选 分别将各样品总

RNA 的反转录产物 cDNA 作为模板,以各定量

PCR 引物进行 RT-qPCR 扩增。将 Ct 值按公式 Q=

E(minCt-sampleCt)(E 为扩增效率,默认值为 2;minCt

为基因在各样品中的最小 Ct 值;sampleCt 为基因

在某样品中的 Ct 值)进行计算,Q 值导入 geNorm

和 NormFinder 软件中进行稳定性分析。将各样品

得到的 Ct 值输入 BestKeeper 软件中,得到候选内

参基因的表达稳定性变异系数(CV)和标准差

(SD)。最后运用几何平均值算法进行综合排名,

得出最适合斑地锦不同生长期基因组织特异性表

达研究的内参基因。

1.2.6 内参基因稳定性验证 以综合分析排名表

达稳定性最优的基因为内参基因,对槲皮素生物

合成过程中的 EmC4H 基因的表达情况进行分析,

RT-qPCR 方法参照 1.2.4,结合 EmC4H 基因的转

录组数据,对内参基因进行表达稳定性验证。

2 结果与分析

2.1 RNA 提取与质量检测

所有样品总 RNA 的 OD260/OD280 及 OD260/

OD230 值,利用 Nanodrop 检测均在 2.0 左右,说

明所提取 RNA 纯度较好。所有 RNA 样品经 1%

琼脂糖凝胶电泳检测显示 28S 和 18S 条带明显

(图 1),说明总 RNA 完整性较好,均可用于

后续试验。

1~3:分别为营养生长期根、茎、叶;

4~7:分别为生殖生长期根、茎、叶、果。

1–3: Root, stem and leaf of vegetative stage; 4–7: Root, stem, leaf

and fruit of reproduction stage.

图 1 斑地锦各生长期不同组织样品中的总

RNA 琼脂糖凝胶电泳图

Fig. 1 Electrophoresis of total RNA in various tissues

at different stages of E. maculata

2.2 内参基因引物的特异性与熔解曲线分析

内参基因引物 PCR 扩增出单一且较亮的条

带,条带大小与预期相符,无引物二聚体(图 2),

引物特异性强,可用于后续检测分析。对 10 个候

选内参基因在不同时期各个样品的 RT-qPCR 分析

表明,各基因 Ct 值均在 22~31 之间,各基因引

物的熔解曲线均显示单峰(图 3),表明 RT-qPCR

所用引物可与模板 cDNA 特异性结合并扩增靶

基因。

M: Trans2K Plus Ⅱ; 1: EmUBQ; 2: EmRSZ21; 3: EmSE;

4: EmTRI1; 5: EmGDI1; 6: EmSYP22; 7: EmLSM12;

8: EmGBP; 9: EmRPL7; 10: EmUBC.

图 2 10 个内参基因的 PCR 扩增产物

Fig. 2 PCR products of ten reference genes

第148页

2276 热带作物学报 第 44 卷

图 3 候选内参基因熔解曲线

Fig. 3 Melting curves of candidate reference genes

2.3 候选内参基因表达稳定性分析

2.3.1 候选内参基因的表达丰度分析 10 个候

选内参基因中,EmRSZ21 的平均 Ct 值最大,为

28.82,说明该基因的表达丰度最低;EmUBQ 的

平均 Ct 值最小,为 22.26,说明该基因的表达丰

度最高。10 个候选内参基因的平均 Ct 值利用

Excel 中的 t 检验分析显著性差异,表达丰度排

序依次是 EmUBQ>EmGBP=EmGDI1>EmTRI1=

EmRPL7=EmUBC>EmLSM12=EmSE>EmSYP22>

EmRSZ21(图 4)。

2.3.2 geNorm 软件分析 geNorm 软件通过计算

稳定系数 M,以确定表达最稳定的内参基因。该

软件以 M=1.5 作为临界点,M 值越小,稳定性越

好。10 个候选内参基因在不同组织中表达的 M

值均小于 1.5,稳定性排名为 EmSE>EmUBC>

EmGDI1>EmLSM12>EmUBQ>EmGBP>EmSYP22>

EmTRI1>EmRSZ21>EmRPL7(表 2)。

2.3.3 NormFinder 软件分析 NormFinder 软件与

geNorm 类似,也是基于各候选内参基因的 M,通

过方差评估其表达稳定性。NormFinder 分析结果

显示,10 个候选内参基因在各组织中的表达稳定

程度存在差异,按 M 值大小排序依次为 EmGDI1>

EmUBQ>EmUBC>EmSYP22>EmSE>EmRPL7>

EmLSM12>EmGBP>EmTRI1>EmRSZ21(表 3)。

2.3.4 BestKeeper 软件分析 BestKeeper 软件直

接根据各基因的 Ct 值,通过计算变异系数(CV)

和标准偏差(SD)来评估各内参基因的稳定性,

且 CV 和 SD 值与基因的稳定性呈负相关,即稳

定的内参基因具有较小的 CV 值和 SD 的值。

BestKeeper 分析结果显示,10 个候选内参基因的

SD 值只有 EmUBQ 和 EmGDI1 小于 1.0(默认阈

值)(表 4)。

2.3.5 综合性分析 BestKeeper 分析结果与

geNorm 和 NormFinder 软件分析结果差异明显,

采用几何平均值算法进行各候选内参基因的综

合排名,内参基因稳定性越好则几何平均值越

低。10 个候选内参基因在斑地锦不同生长期的不

同组织中表达稳定性综合排名为 EmGDI1 >

EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>

EmTRI1>EmSYP22>EmRSZ21=EmRPL7(表 5)。

第149页

第 11 期 许建丰等:基于转录组测序的斑地锦内参基因筛选及验证 2277

不同小写字母表示在 0.05 水平差异显著。

Different lowercase letters represent significant difference at 0.05 level.

图 4 候选内参基因在不同时期不同组织样品中 RT-qPCR 的 Ct 值

Fig. 4 Ct values of RT-qPCR for candidate reference genes in various tissues at different stages

表 2 geNorm 分析候选内参基因在各生长期不同组织中的表达稳定性

Tab. 2 Expression stability of candidate reference genes analyzed by geNorm

基因 Gene M 值 M value 排序 Rank 基因 Gene M 值 M value 排序 Rank

EmSE 0.605 1 EmGBP 0.703 6

EmUBC 0.645 2 EmSYP22 0.734 7

EmGDI1 0.650 3 EmTRI1 0.801 8

EmLSM12 0.673 4 EmRSZ21 0.861 9

EmUBQ 0.701 5 EmRPL7 0.886 10

表 3 NormFinder 分析候选内参基因在各生长期不同组织中的表达稳定性

Tab. 3 Expression stability of candidate reference genes analyzed by NormFinder

基因 Gene M 值 M value 排序 Rank 基因 Gene M 值 M value 排序 Rank

EmGDI1 0.049 1 EmRPL7 0.148 6

EmUBQ 0.092 2 EmLSM12 0.160 7

EmUBC 0.124 3 EmGBP 0.169 8

EmSYP22 0.132 4 EmTRI1 0.242 9

EmSE 0.135 5 EmRSZ21 0.264 10

表 4 BestKeeper 分析候选内参基因在各生长期不同组织中的表达稳定性

Tab. 4 Expression stability of candidate reference genes analyzed by BestKeeper

基因 Gene SD CV 排序 Rank 基因 Gene SD CV 排序 Rank

EmUBQ 0.816 3.666 1 EmRSZ21 1.283 4.451 6

EmGDI1 0.849 3.544 2 EmLSM12 1.333 5.129 7

EmTRI1 1.009 4.035 3 EmUBC 1.377 5.432 8

EmGBP 1.121 4.737 4 EmRPL7 1.456 5.764 9

EmSE 1.143 4.377 5 EmSYP22 1.574 5.738 10

第150页

2278 热带作物学报 第 44 卷

表 5 候选内参基因在各生长期不同组织中表达稳定性综合排名

Tab. 5 Overall ranking of expression stability of candidate reference genes

基因 Gene geNorm rank NormFinder rank BestKeeper rank 几何平均值 Geometrical mean 综合排名 Comprehensive rank

EmGDI1 3 1 2 2.000 1

EmUBQ 5 2 1 2.667 2

EmSE 1 5 5 3.667 3

EmUBC 2 3 8 4.333 4

EmLSM12 4 7 7 6.000 5

EmGBP 6 8 4 6.000 5

EmTRI1 8 9 3 6.667 7

EmSYP22 7 4 10 7.000 8

EmRSZ21 9 10 6 8.333 9

EmRPL7 10 6 9 8.333 9

2.4 内参基因稳定性验证

以 EmGDI1 为内参基因,分析槲皮素生物合

成过程中关键基因之一 EmC4H 的表达量差异,

以验证软件分析结果的可靠性。结果表明,以

EmGDI1 为内参基因,EmC4H 在营养生长期的表

达差异与转录组测序结果趋势完全一致,在生殖

生长期的表达差异与转录组测序结果趋势基本一

致(图 5)。因此,使用 EmGDI1 基因为内参基

因,能够较为准确地校准斑地锦不同生长期不同

组织中的 RT-qPCR 检测结果。

A:转录组测序结果;B:RT-qPCR 结果。*代表处理间差异显

著(P<0.05);**代表处理间差异极显著(P<0.01)。

A: The results of transcription sequencing; B: The results of

RT-qPCR. * represents significant difference among treatments

(P<0.05); ** represents the extremely significant difference among

treatments (P<0.01).

图 5 EmC4H 基因在斑地锦各生长期不同组织中表达差异

Fig. 5 Expression differences of EmC4H in various tissues

of E. maculata at different stages

3 讨论

随着药用植物分子生物学研究的不断深入,

药用活性成分生物合成的关键酶基因表达与调控

逐渐成为研究热点。荧光实时定量 PCR 是检测基

因表达模式的高效手段之一,而具有合适、稳定

的内参基因是荧光实时定量 PCR 的基础。Act、

GAPDH、UBQ、18SrRNA 等传统内参基因被广泛

应用,但在不同组织、不同生长期以及不同处理

条件下均稳定表达的内参基因并不存在[7],因此

需要根据试验条件的改变筛选出可靠的内参基

因,或应用内参基因组合以减少基因表达误差[14]。

基于转录组测序的 RT-qPCR 内参基因筛选是近年

来发展的一个新的有效策略,在酿酒酵母中已筛

选鉴定出一套全新的内参基因[15],也已成功应用

于一些丝状真菌、植物和动物中[16-18],例如在马

尔尼菲青霉菌中,Actin 基因在不同细胞类型中表

达最稳定[19],而基于转录组测序获得的 FacpA 和

DigA 基因在双相转换过程中表达稳定性最高[20]。

本研究根据斑地锦转录组测序结果,筛选出

EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、

EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7 和课题

组前期利用同源克隆法获得的内参基因 EmUBQ,

共 10 个候选内参基因进行 RT-qPCR,分别用

geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 软件评价其

在各生长期(营养生长期、生殖生长期)根、茎、

叶和果中的表达稳定性。结果显示,不同软件对

10 个内参基因表达稳定性的评估并不完全一致。

EmUBQ 在 BestKeeper 评价时表达最稳定,而在

geNorm 和 NormFinder 评估中排序居中;EmSE

在 geNorm 中排序最好,而在其他 2 种软件中排

序较差。这种现象在地菍(Melastoma dodecandrum)[21]、扇脉杓兰(Cypripedium japonicum)[22]

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