SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

3次（05：00、10：00和17：00），每日下午13：00拣蛋并

统计产蛋数和蛋重。试验期间，蛋鸡按照常规免疫程

序进行免疫接种。

1.3 样品收集

在试验第 4、8、12 周结束时，每个处理随机采集

24枚鸡蛋（每个重复2枚）总计72枚鸡蛋，用于蛋白高

度、哈氏单位、蛋黄颜色、鸡蛋粉的粗蛋白和粗脂肪含

量等指标的测定。每个重复随机选取一只蛋鸡，翅下

静脉采集血液约 5 mL，至盛有肝素钠包被的离心管

中，静置后于3 500 r/min离心10 min，提取血清样品，

于-80 ℃冰箱保存，待测。然后进行屠宰，打开腹腔，

采集输卵管膨大部约 2 cm 样品于 4%多聚甲醛中固

定，剩余输卵管样品于液氮中速冻后转入-80 ℃保

存、备用。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 蛋品质

使用多功能蛋品质自动分析仪（EA-01，北京天

翔飞域有限公司）测定蛋白高度、哈氏单位、蛋黄颜

色；用凯氏定氮法测定鸡蛋粉的粗蛋白含量；索氏抽

提法测定鸡蛋粉的粗脂肪含量。

1.4.2 血清免疫指标

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒测定血

清免疫球蛋白 A（immunoglobulin A, IgA）、免疫球蛋

白 G（immunoglobulin G, IgG）和免疫球蛋白 M（immu⁃

noglobulin M, IgM），试剂盒购于南京建成生物工程研

究所有限公司。

1.4.3 输卵管组织形态结构

输卵管组织样品固定24 h，脱水透明后用石蜡固

定，并用苏木精-伊红染色，制作输卵管组织切片。用

光学显微镜观察切片，每张切片选择10个视野，在显

微照相系统（Olympus，DP72，日本）下拍照，采集输卵

管膨大部图片在Image Pro Plus 6.0软件下进行测量，

共测量10组数据，每组数据包括褶皱宽度（μm）、褶皱

高度（μm）和上皮层厚度（μm）。

1.4.4 输卵管黏膜炎性细胞因子测定

采用PCR检测输卵管黏膜组织中白介素1β（IL1β）、肿瘤坏死因子（TNF- α）、白介素 8（IL- 8）的

mRNA的表达量。以NCBI数据库中鸡的基因组序列

为模板，利用 Primer premier 6.0 软件设计引物，并由

武汉擎科生物技术有限公司合成，引物序列见表2。

1.5 数据处理

所有数据采用SAS（SAS Institute Inc., Cary, NC）

的一般线性模型（GLM）作为随机分组设计进行分

析。用Duncan’s法进行多重比较。P<0.05表示差异

显著，0.05≤P<0.10表示具有差异显著趋势。

2 结果与分析

2.1 不同水平VD3和25-OH-D3对蛋品质的影响

由表3可知，与对照组相比，在第4周末，25-OHD3组鸡蛋的哈氏单位显著上升，且25-OH-D3组鸡蛋

粉的粗蛋白含量显著提高（P<0.05）；在第8周末，25-

OH-D3组鸡蛋的哈氏单位和鸡蛋粉的粗蛋白含量显

著提高（P<0.05），25-OH-D3组鸡蛋的蛋白高度呈现

显著上升趋势（P=0.066）；在第12周末，25-OH-D3组

鸡蛋的蛋白高度、哈氏单位和鸡蛋粉的粗蛋白含量显

著提高（P<0.05）。

2.2 不同水平VD3和25-OH-D3对血清免疫指标的影响

由表 4 可知，与对照组相比，在第 4 周末，VD3组

和25-OH-D3组蛋鸡的血清IgA 含量都显著提高（P<

0.05）；在第 8 周末，VD3组和 25-OH-D3组蛋鸡血清

IgA 含量显著提高（P<0.05），25-OH-D3组蛋鸡血清

IgG和IgM含量显著提高（P<0.05）；在第12周末，25-

OH-D3组蛋鸡血清IgA、IgG和IgM含量显著提高（P<

0.05）；此外，VD3组和25-OH-D3组蛋鸡血清IgG含量

显著提高（P<0.05）。

2.3 不同水平VD3和25-OH-D3对输卵管黏膜形态的

影响

基因

TNF-α

IL-1β

IL-8

β-actin

引物序列（5′~3′）

F:GAGCGTTGACTTGGCTGTC

R: AAGCAACAACCAGCTATGCAC

F:ACTGGGCATCAAGGGCTA

R: GGTAGAAGATGAAGCGGGTC

F:ATGAACGGCAAGCTTGGAGCTG

R: TCCAAGCACACCTCTCTTCCATCC

F:GAGAAATTGTGCGTGACATCA

R: CCTGAACCTCTCATTGCCA

扩增长度（bp）

64

131

233

152

参考序列

NM_204267

NM_204524

AJ009800

L08165

表2 PCR引物序列

63

单 胃 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

由表5和图1可知，与对照组相比，25-OH-D3组

在第 4、8、12 周输卵管黏膜的褶皱宽度、褶皱高度和

上皮层厚度均显著提高（P<0.05），VD3组除第12周褶

皱高度之外，也均差异显著（P<0.05）。

2.4 不同水平VD3和25-OH-D3对炎性细胞因子基因

表达量的影响

由图 2 可知，VD3组和 25-OH-D3组第 4、8、12 周

输卵管黏膜中炎性细胞因子 IL-1β、TNF-α、IL-8 的

mRNA表达量均显著降低（P<0.05）。

3 讨论

项目

试验第4周

蛋白高度（mm）

哈氏单位

蛋黄颜色

鸡蛋粉粗蛋白（%）

鸡蛋粉粗脂肪（%）

试验第8周

蛋白高度（mm）

哈氏单位

蛋黄颜色

鸡蛋粉粗蛋白（%）

鸡蛋粉粗脂肪（%）

试验第12周

蛋白高度（mm）

哈氏单位

蛋黄颜色

鸡蛋粉粗蛋白（%）

鸡蛋粉粗脂肪（%）

对照组

5.53

68.18b

5.83

43.2b

33.5

5.08b

65.44b

6.42

42.3b

34.6

4.30b

57.24b

6.75

42.4b

34.8

VD3组

5.68

71.08ab

5.92

45.3ab

32.2

5.23ab

67.07ab

6.67

46.0ab

32.8

4.83ab

62.23ab

6.75

45.8ab

32.0

25-OH-D3组

5.95

72.88a

6.00

47.8a

31.4

5.81a

70.30a

6.75

47.6a

32.0

5.04a

65.69a

6.83

48.3a

31.5

SEM

0.27

2.22

0.46

1.80

1.50

0.30

2.15

0.65

1.7

1.7

0.29

3.19

0.50

1.8

1.6

P值

0.299

0.089

0.981

0.021

0.383

0.066

0.047

0.961

0.017

0.502

0.016

0.014

0.640

0.020

0.208

表3 维生素D3和25-羟基维生素D3对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

注：同行数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）；下表同。

项目

试验第4周

IgA(μg/mL)

IgG(μg/mL)

IgM(μg/mL)

试验第8周

IgA(μg/mL)

IgG(μg/mL)

IgM(μg/mL)

试验第12周

IgA(μg/mL)

IgG(μg/mL)

IgM(μg/mL)

对照组

58.9b

531

150

61.1b

440b

213b

58.1b

473b

212b

VD3组

69.0a

524

138

75.8a

524ab

243b

63.3ab

597a

203b

25-OH-D3组

72.6a

602

157

77.2a

576a

284a

75.7a

633a

268a

SEM

4.6

42

11

4.1

40

18

5.3

45

17

P值

0.025

0.203

0.321

<0.001

0.012

0.003

0.030

<0.001

0.028

表4 维生素D3和25-羟基维生素D3对产蛋后期蛋鸡血清免疫指标的影响

项目

试验第4周

褶皱宽度

褶皱高度

上皮层厚度

试验第8周

褶皱宽度

褶皱高度

上皮层厚度

试验第12周

褶皱宽度

褶皱高度

上皮层厚度

对照组

1 342b

2 546c

17.2c

1 322b

2 785c

20.6c

1 277b

2 985b

20.0c

VD3组

1 478a

2 875b

18.8b

1 458a

3 078b

24.4b

1 425a

3 001b

22.1b

25-OH-D3组

1 527a

3 259a

21.7a

1 495a

3 214a

27.5a

1 499a

3 278a

24.8a

SEM

42

79

0.7

40

75

0.8

45

72

0.7

P值

<0.001

<0.001

0.018

<0.001

0.004

<0.001

<0.001

0.024

0.040

表5 维生素D3和25-羟基维生素D3对产蛋后期蛋鸡输卵管形态的影响（μm）

64

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

蛋白高度、蛋黄颜色、哈氏单位等是衡量蛋品质

的重要指标[7]

。Chen 等[5]

研究发现，在蛋鸡日粮中单

独添加138 μg/kg的VD3，或69 μg/kg的VD3+69 μg/kg

的 25-OH-VD3鸡蛋的哈氏单位均显著高于仅添加

69 μg/kg的VD3。姜鑫[8]

研究发现，饲粮中添加65 μg/kg

和90 μg/kg水平的25-OH-D3相较于添加90 μg/kg维

生素D3，鸡蛋的哈氏单位显著提升，而在蛋黄颜色和

蛋白高度上无显著差异。研究发现，在 60 周龄的蛋

鸡饲粮中添加不同水平的VD（3 0、62.5、125 μg/kg）对

鸡蛋的蛋黄颜色、蛋白高度和哈氏单位无显著影响[9]

。

与上述研究相同，本试验结果表明，在蛋鸡日粮中添

加125 μg/kg 25-OH-D3能显著提高鸡蛋的蛋白高度、

哈氏单位以及粗蛋白含量，对蛋黄颜色无显著影响。

而弓浩杰等[10]

研究发现，在VD3饲粮中添加25-OH-D3

能显著提高蛋黄颜色，但对蛋白高度和哈氏单位影响

不显著，原因可能与 25-OH-D3的饲喂时间、添加水

平、家禽品种以及产蛋期有关。

血清IgA、IgG和IgM广泛存在于畜禽机体中，是机

体免疫系统的重要组成部分，血清免疫球蛋白含量是

反映畜禽机体免疫功能强弱的主要标志[11]

。Vazquez

等[12]

发现，在含有50、125 μg/kg维生素D3的家禽日粮

中添加 69 μg/kg 25-OH-D3后细胞的免疫反应均提

CON组 VD3组 25-OH-D3组

第4周

第8周

第12周

图1 蛋鸡输卵管H.E.染色结果

mRNA相对表达量

TNF-α

1.5

1.0

0.5

0.0 IL-1β IL-8

（A）第4周

mRNA相对表达量

TNF-α

1.5

1.0

0.5

0.0 IL-1β IL-8

（B）第8周

mRNA相对表达量

TNF-α

1.5

1.0

0.5

0.0 IL-1β IL-8

（C）第12周

CON组 VD3组 25-OH-D3组 CON组 VD3组 25-OH-D3组 CON组 VD3组 25-OH-D3组

注：图柱上含有不同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同字母表示差异不显著（P>0.05）。

图2 维生素D3和25-羟基维生素D3对产蛋后期蛋鸡输卵管炎细胞性因子基因表达量的影响

65

单 胃 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

高，IgA 浓度也显著提高，机体对病毒的抵抗能力增

强。Chou等[13]

研究表明，在肉鸡感染沙门氏菌的情况

下，在饲粮中长期补充25-OH-D3可改善其保护性体

液免疫，提高血清 IgG 水平。研究发现，在肉鸡饲粮

中添加普通水平（18.75 μg/kg）或高水平（125 μg/kg）

VD3对血清IgA、IgG和IgM的影响不显著，但添加高水

平 VD3血清 IgA、IgG 和 IgM 含量较高，说明添加高水

平 VD3有利于血清免疫指标的提高，有利于体液免

疫[14]

。与上述研究结果类似，本试验中，蛋鸡饲粮中

添加 125 μg/kg 的 VD3和 25-OH-D3，血清 IgA、IgG 和

IgM含量均显著提高，机体的免疫功能增强。

蛋品质取决于输卵管的结构和功能，由疾病因素

或环境应激引起的输卵管氧化损伤或炎症是导致蛋

品质降低的主要原因[15]

。本试验结果显示，VD3组和

25-OH-D3组在第 4、8、12 周的炎性细胞因子 IL-1β、

TNF-α、IL-8 的 mRNA 表达量都显著降低，表明 25-

OH-D3 具有一定的抗炎作用，且 VD3 组和 25-OHD3组的输卵管褶皱宽度、褶皱高度和上皮层厚度均

显著提高，表明 VD3和 25-OH-D3都能促进输卵管的

发育。这与高水平 VD3和 25-OH-D3组蛋鸡的鸡蛋

品质提高结果相一致。有研究表明 VD3可以有效地

降低丝羽乌骨鸡体内白介素 6（IL-6）、干扰素γ

（IFN-γ）和 TNF-α炎性因子的表达，反映了日粮中

维生素 D3具有一定的抗炎作用，对于机体的稳态维

持和保护有着一定的作用[16]

。廖波[17]

发现，在饲粮

添加 25-OH-D3抑制了免疫应激仔猪促炎症细胞因

子 IL-6 和 TNF-α的分泌，缓解免疫应激对仔猪的负

面影响。

4 结论

综上所述，在蛋鸡产蛋后期日粮中添加125 μg/kg

25-OH-D3能显著提升蛋品质、提高机体的免疫能力

并缓解输卵管黏膜炎症。

参考文献

[1] 徐宏建, 李昕, 王丽华, 等. 25羟基维生素D3的生理功能及其在

动物生产中的应用[J]. 动物营养学报, 2020, 32(4): 1491-1498.

[2] 杨涛, 甘悦宁, 宋志芳, 等. 不同来源和水平的维生素D3对蛋鸡

生产性能、蛋品质和胫骨质量的影响[J]. 动物营养学报, 2014,

26(3): 659-666.

[3] KONOWALCHUK J D, RIEGER A M, KIEMELE M D, et al.

Modulation of weanling pig cellular immunity in response to diet

supplementation with 25- hydroxyvitamin D3[J]. Veterinary Immu⁃

nology and Immunopathology, 2013, 155(1/2): 57-66.

[4] MATTILA P H, VALKONEN E, VALAJA J. Effect of different vi⁃

tamin D supplementations in poultry feed on vitamin D content of

eggs and chicken meat[J]. Journal of Agriculture and Food Chem⁃

istry, 2011, 59(15): 8298-8303.

[5] CHEN C, TURNER B, APPLEGATE T J, et al. Role of long-term

supplementation of 25- hydroxyvitamin D3 on egg production and

egg quality of laying hen[J]. Poultry Science, 2020, 99(12): 6899-

6906.

[6] ADHIKARI R, WHITE D, HOUSE J D, et al. Effects of addition⁃

al dosage of vitamin D3, vitamin D2, and 25-hydroxyvitamin D3 on

calcium and phosphorus utilization, egg quality and bone mineral⁃

ization in laying hens[J]. Poultry Science, 2020, 99(1): 364-373.

[7] 余祖华, 丁轲, 丁盼盼, 等. 植物乳杆菌DPP8对蛋鸡生产性能、

血清生化指标和蛋品质的影响[J]. 中国兽医学报, 2016, 36(9):

1608-1612,1642.

[8] 姜鑫. 日粮中添加不同水平的25-羟基维生素D3对蛋鸡的产蛋

性能、蛋品质和钙代谢的影响[D]. 硕士学位论文.泰安: 山东农

业大学, 2022.

[9] 康乐,穆雅东,张克英, 等. 不同钙水平饲粮添加维生素D3对产蛋

后期蛋鸡生产性能、蛋品质、胫骨质量和血浆钙磷代谢的影响

[J]. 动物营养学报, 2018, 30(10): 3889-3898.

[10] 弓浩杰, 丁雪梅, 白世平, 等. 饲粮添加25-羟基维生素D3、植物

精油和苯甲酸对蛋鸡生产性能、蛋品质和肠道形态的影响[J].

动物营养学报, 2020, 32(6): 2638-2649.

[11] MCGRATH B A, FOX P F, MCSWEENEY A, et al. Composition

and properties of bovine colostrum: a review[J]. Dairy Science &

Technology, 2016, 96(2): 133-158.

[12] VAZQUEZ J R, GOMEZ G V, LOPEZ C C, et al. Effects of 25-

hydroxycholecalciferol with two vitamin D3 levels on production

and immunity parameters in broiler chickens[J]. Journal of Ani⁃

mal Physiology and Animal Nutrition (Berl), 2018, 102(1): 493-

497.

[13] CHOU S H, CHUNG T K, YU B. Effects of supplemental 25-hy⁃

droxycholecalciferol on growth performance, small intestinal mor⁃

phology, and immune response of broiler chickens[J]. Poultry Sci⁃

ence, 2009, 88(11): 2333-2341.

[14] 张淑云. 钙和维生素D对肉鸡免疫和抗氧化功能的影响[D]. 硕

士学位论文.哈尔滨: 东北农业大学, 2011.

[15] 薛喜梅. 蛋鸡输卵管炎的防治[J]. 家禽科学, 2020(9): 34-35.

[16] 王强. 维生素D3对丝羽乌骨鸡生长性能及淋巴组织细胞因子

表达水平的影响[D]. 硕士学位论文.成都: 四川农业大学, 2014.

[17] 廖波. 25-OH-D3对免疫应激断奶仔猪的生产性能、肠道免疫功

能和机体免疫应答的影响[D]. 博士学位论文. 成都: 四川农业

大学, 2011.

（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

66

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

摘 要：为研究饲料胆固醇添加量对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）幼蟹生长、蜕皮以及亚硝酸盐

应激前后肝胰腺胆固醇含量和抗氧化能力的影响，试验设计了5种等氮等脂的饲料，胆固醇添加量依

次为0、0.25%、0.50%、0.75%和 1.00%。以初始体重为（0.930±0.036）g 的中华绒螯蟹幼蟹为研究对

象，进行为期50 d的摄食生长试验，试验结束后进行亚硝酸盐应激，于应激前后取样分析。结果表

明：①相较于对照组，当饲料中添加0.25%~0.50%胆固醇时，中华绒螯蟹幼蟹增重率、特定生长率和蜕

皮率显著性升高（P<0.05），当饲料中添加0.25%胆固醇时，饲料系数显著降低（P<0.05）。②幼蟹肝胰

腺中胆固醇含量在亚硝酸盐应激前后差异不显著（P>0.05）。在亚硝酸盐应激前，相较于对照组，胆

固醇添加组肝胰腺中胆固醇含量显著升高（P<0.05）。在亚硝酸盐应激后，各组肝胰腺中胆固醇含量

差异不显著（P>0.05）。③相较于亚硝酸盐应激前，应激后的幼蟹肝胰腺中超氧化物歧化酶（SOD）活

性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和总抗氧化能力（T-AOC）显著降低（P<0.05）。在亚硝酸盐

应激前，相较于对照组，饲料中添加0.25%胆固醇时，肝胰腺中GSH-Px活性和T-AOC水平显著性升

高（P<0.05），MDA 含量降低（P>0.05）。在亚硝酸盐应激后，相较于对照组，当饲料中添加 0.50%~

0.75%胆固醇时，GSH-Px、T-AOC、SOD活性显著性升高（P<0.05），MDA含量降低（P>0.05）。综上所

述，饲料中添加0.25%胆固醇可满足中华绒螯蟹幼蟹生长需求，而添加0.5%胆固醇可使幼蟹获得最

佳的抗亚硝酸盐应激能力。

关键词：中华绒螯蟹；胆固醇；生长；抗氧化；亚硝酸盐应激

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.10.011

中图分类号：S816.32 文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2023）10-0067-07 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Dietary Cholesterol Addition Level on Growth, Molting, Cholesterol Content and

Antioxidant Capability of Juvenile Chinese Mitten Crab (Eriocheir sinensis) Before and After

Nitrite Exposure

MAN Dunrui YUAN Rong ZHANG Yuxi JIANG Yusheng HUANG Shu YI Qilin ZUO Rantao*

(Key Laboratory of Mariculture and Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture,

College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Liaoning Dalian 116023, China)

Abstract：To investigate the effects of dietary cholesterol addition level on the growth, molting, cholester⁃

ol content and antioxidant capacity in the hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crabs (Eriocheir si⁃

nensis) before and after nitrite exposure. Five isonitrogenous and isoenergetic diets were formulated and

the cholesterol addition levels of experimental diets were 0, 0.25%, 0.50%, 0.75% and 1.00%, respective⁃

ly. The diets were fed to juvenile crabs with the

initial body weight of (0.930±0.036) g for 50 days.

Nitrite exposure trial was carried out at the end of

the experiment. Samples were taken before and af⁃

ter nitrite exposure. The results showed as fol⁃

lows: ① Compared with the control group, the

weight gain rate, specific growth rate and molting

饲料中添加胆固醇对中华绒螯蟹幼蟹生长、

蜕皮及亚硝酸盐应激前后抗氧化能力的影响

■ 满敦蕊 袁 融 张禹熙 姜玉声 黄 姝 衣启麟 左然涛*

（大连海洋大学水产与生命学院，农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连 116023）

作者简介：满敦蕊，硕士，研究方向为水产动物营养与

饲料。

*通讯作者：左然涛，副教授。

收稿日期：2023-04-17

基金项目：蓝色粮仓重点研发专项[2018YFD0900400]

67

水 产 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹、大闸

蟹，因其独特的风味深受广大消费者喜爱。中华绒螯

蟹自然分布广泛，主要分布在辽河、长江、瓯江三大水

系。20世纪80年代后期，由于过度捕捞和环境破坏

等原因，中华绒螯蟹自然捕捞量急剧下降。随着中华

绒螯蟹育苗和养殖技术的突破，其养殖规模和养殖产

量均得到较快发展，现已成为我国淡水养殖中最重要

的经济甲壳类动物之一。在传统中华绒螯蟹养殖过

程中，养殖户以玉米、小麦等农作物以及冷冻杂鱼进

行投喂，但这种传统投喂方式会带来成本高、营养不

均衡、供应不稳定、水质恶化等问题[1]

，因此开展中华

绒螯蟹营养饲料的研究显得尤为迫切。

胆固醇是一种环戊烷多氢菲的衍生物，通常呈游

离状态或以化学键醇羟基与脂肪酸结合，形成胆固醇

酯的形式广泛存在于动物体内。胆固醇是生物细胞

膜的重要组成成分，可以维持细胞膜的稳定性和流动

性[2]

。此外，胆固醇还是蜕皮激素、性激素、维生素D

和胆汁酸合成的前体物质，在维持正常的生理活动中

发挥着重要作用。甲壳动物不能从头合成胆固醇[3]

，

因而需要从食物中获取以满足其生理需求[4]

。以生长

性能为评价指标，三疣梭子蟹（Portunus tritubercula⁃

tus）、南美白对虾（Litopenaeus vannamei）、锯缘青蟹

（Scylla serrata）以及日本沼虾（Macrobrachium nippon⁃

ense）胆固醇最适需要量分别是 1.00%、0.15%、0.61%

和 0.9%[5-8]

。中华绒螯蟹幼蟹的研究表明，无论是稻

田养殖条件下还是实验室养殖条件下，0.32%胆固醇

添加组幼蟹较 0.11%胆固醇组幼蟹具有更高的生长

速率和免疫酶活性[9]

。陈彦良[10]

发现，中华绒螯蟹幼

蟹胆固醇需求量与饲料磷脂水平有关，当饲料中磷脂

添加水平为1%和2%时，幼蟹生长最适的胆固醇添加

水平为 0.62%和 0.23%。随着集约化养殖的发展，养

殖水体亚硝酸盐含量超标的现象时有发生。有关饲

料胆固醇增强南美白对虾抗亚硝酸胁迫能力的研究

已有报道。王鑫磊等[11]

研究表明，饲料中添加0.2%胆

固醇，南美白对虾在亚硝酸盐胁迫96 h时的累计死亡

率最低。饲料中添加0.2%胆固醇和2%大豆磷脂，南

美白对虾能够表现出最佳的抗亚硝酸盐胁迫能力[12]

。

但是,有关饲料胆固醇对中华绒螯蟹亚硝酸盐应激条

件下抗氧化能力影响的研究鲜有报道。因此，本研究

拟开展胆固醇对中华绒螯蟹幼蟹生长、蜕皮以及亚硝

酸盐应激后抗氧化能力的影响，以期为集约化养殖条

件下中华绒螯蟹幼蟹饲料中胆固醇的精准添加提供

理论依据。

1 材料与方法

1.1 饲料制备

按照饲料配方（表1），配制5种等氮等脂的饲料，

rate of juvenile crabs fed with 0.25% and 0.50% cholesterol addition level significantly increased (P<

0.05). Feed conversion ratio of juvenile crabs fed with 0.25% cholesterol addition level significantly de⁃

creased (P<0.05). ② There was no significant difference in cholesterol content in the hepatopancreas be⁃

fore and after nitrite exposure (P>0.05). Compared with the control group, cholesterol content in the hepa⁃

topancreas significantly increased in the juvenile crabs fed diet with cholesterol (P<0.05). There was no

significant difference in cholesterol content in the hepatopancreas among different cholesterol addition

levels (P>0.05). ③ The activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and

total antioxidant capacity (T-AOC) in the hepatopancreas were significantly lower in nitrite exposure trial

than the activities in feeding experiment (P<0.05). Compared with the control group, the activities of

GSH- Px and T- AOC significantly increased in 0.25% treatment group (P<0.05), malondialdehyde

(MDA) content decreased in 0.25% treatment group (P>0.05). In nitrite exposure trial, compared with the

control group, the activities of GSH- Px, T- AOC and SOD significantly increased between 0.5% and

0.75% treatment group (P<0.05), but the content of MDA decreased between 0.50% and 0.75% treat⁃

ment group (P>0.05). In conclusion, the diet of 0.25% cholesterol addition level can meet the growth re⁃

quirements of juvenile Chinese mitten crabs and the diet of 0.50% cholesterol addition level can make

crabs obtain the best nitrite exposure resistance.

Key words：Eriocheir sinensis; cholesterol; growth performance; antioxidant; nitrite exposure

68

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

通过梯度添加胆固醇原料（纯度99%，北京索莱宝科

技有限公司）使得饲料中胆固醇的实际添加量依次为

0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%。将所有固体饲料原

料破碎，过 100 目筛，采用逐级扩大的方法将各原料

细粉充分混匀，然后添加油脂并再次混匀，最后加水

制成面团，用双螺杆自动制粒机（济南鼎润机械公司）

将其制成直径为2 mm的长条。饲料在烘箱中（60 ℃）

风干10~12 h，冷却至室温后装入自封塑料袋并保存

在-20 ℃冰箱中备用。

表1 试验饲料组成及营养水平（干物质基础，%）

原料

鱼粉

豆粕

玉米淀粉

酪蛋白

谷朊粉

大豆磷脂

亚麻油

豆油

啤酒酵母

纤维素

维生素预混料

矿物质预混料

胆固醇

磷酸二氢钙

氯化胆碱

乙氧基喹啉

丙酸钙

总计

营养水平

粗蛋白

粗脂肪

胆固醇添加量（%）

0

7.00

20.00

18.00

20.00

5.00

2.00

1.80

2.80

5.00

13.09

2.00

2.00

0.00

1.00

0.20

0.01

0.10

100.00

39.95

8.11

0.25

7.00

20.00

17.75

20.00

5.00

2.00

1.80

2.80

5.00

13.09

2.00

2.00

0.25

1.00

0.20

0.01

0.10

100.00

40.19

8.25

0.50

7.00

20.00

17.50

20.00

5.00

2.00

1.80

2.80

5.00

13.09

2.00

2.00

0.50

1.00

0.20

0.01

0.10

100.00

39.78

8.16

0.75

7.00

20.00

17.25

20.00

5.00

2.00

1.80

2.80

5.00

13.09

2.00

2.00

0.75

1.00

0.20

0.01

0.10

100.00

39.98

8.20

1.00

7.00

20.00

17.00

20.00

5.00

2.00

1.80

2.80

5.00

13.09

2.00

2.00

1.00

1.00

0.20

0.01

0.10

100.00

39.72

8.23

注：1. 维生素预混料向每千克日粮提供：VD 5 mg、VK 10 mg、VB12

0.1 mg、VB6 20 mg、叶酸 20 mg、VB1 25 mg、VA 32 mg、VB2

45 mg、泛酸60 mg、生物素60 mg、烟酸200 mg、VE 240 mg、

肌醇800 mg、VC 2 000 mg、微晶纤维素16.47 g；

2. 矿物质预混料向每千克日粮提供：CuSO4 · 5H2O 10 mg、

Na2SeO3(1%) 25 mg、ZnSO4 · H2O 50 mg、CoCl2 · 6H2O(1%)

50 mg、MnSO4·H2O 60 mg、FeSO4·H2O 80 mg、Ca(IO3)2 180 mg、

MgSO4·7H2O 1 200 mg、沸石粉18.35 g；

3. 饲料营养水平为实测值。

1.2 养殖管理

养殖试验于2021年8—10月在辽宁省盘锦市光

合水产有限公司研发中心实验基地进行。在正式养

殖试验之前，将中华绒螯蟹幼蟹暂养于室内水槽中，

试验用水为曝气晾晒后的池塘水，每日早晚各投喂一

次配合饲料，使其适应养殖水环境和配合饲料，驯化

时间为期 1 周。驯化结束后，随机挑选附肢完整、规

格相近、健康活泼的中华绒螯蟹幼蟹[初始体重

（0.930±0.036）g]，将其随机投放至 15 个塑料水箱

（60 cm×40 cm×40 cm）中，每个水箱放养20只，共5个

不同胆固醇添加处理组，每个处理组设置三个重复。

每天在08：00和17：00对中华绒螯蟹进行表观饱食投

喂，每种饲料随机投喂 3 个水箱的中华绒螯蟹，每次

投喂 2 h 后吸出残饵和粪便，日换水量为 1/4 养殖水

体积。在试验过程中，水体的 pH 保持在 7.6~7.8，温

度为 24~26 ℃，溶解氧大于 7 mg/L，水体中氨态氮和

亚硝酸盐的浓度均不超过0.10 mg/L 和0.07 mg/L，养

殖周期50 d。

1.3 样品采集

养殖试验结束后，将中华绒螯蟹停食24 h后计数

并逐个称重。从每个水箱随机挑选4只个体，置于冰

上麻醉，解剖，取其肝胰腺，放入灭菌的离心管中，液

氮速冻后保存于-80 ℃中，用于后续检测分析。

1.4 亚硝酸盐应激试验

50 d的养殖试验结束后，从每个水槽中分别取出

4个幼蟹暴露于10 mg/L亚硝酸盐溶液中，24 h后取出

所有的幼蟹进行相应取样。将幼蟹置于冰上麻醉，解

剖取其肝胰腺，液氮速冻放于-80 ℃保存。

1.5 肝胰腺中抗氧化酶活性、丙二醛含量和胆固醇

含量的测定

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶

（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）的活性，总抗氧化能力

（T-AOC），总胆固醇（TCH）和丙二醛（MDA）含量均采用

南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒进行测定。

1.6 计算与统计分析

存活率（SR，%）=每个水箱幼蟹的终末数量/每个

水箱幼蟹的初始数量×100

增重率（WGR，%）=（末体重-初体重）/初体重×

100

特定生长率（SGR，%/d）=（ln末体重-ln初体重）/

养殖天数×100

饵料系数（FCR）=摄食的饲料重量（/ 末体重-初

体重）

蜕皮率（MR，%）=每个水箱幼蟹蜕皮数量/每个水

箱螃蟹数量×100

采用SPSS 25.0软件对试验数据进行单因素方差

分析（one-way ANOVA），如存在显著性，则通过Dun⁃

can’s法多重比较对组间差异进行两两比较；采用t检验

对同组中华绒螯蟹应激前后的胆固醇含量和抗氧化指

69

水 产 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

标进行比较，显著性水平均认定为P<0.05。统计数据

用”平均值±标准差（Mean±SE）”的表示。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加胆固醇对中华绒螯蟹幼蟹存活、生

长、摄食和蜕皮的影响

如表2所示，饲料中添加胆固醇未显著影响幼蟹

存活率（P>0.05）。随着饲料中胆固醇添加量增加，幼

蟹增重率、特定生长率以及蜕皮率呈先升高后下降的

趋势。0.25%和0.50%胆固醇添加组幼蟹的增重率和

特定生长率显著高于未添加组和 1.00%胆固醇添加

组（P<0.05）。当饲料胆固醇添加量达到0.25%时，幼

蟹的蜕皮率最高，显著高于未添加组和1.00%胆固醇

添加组（P<0.05）。随着饲料中胆固醇添加量增加，饲

料系数呈先降低后升高的趋势，当添加量为0.25%时

饲料系数最低，显著低于0.50%胆固醇添加组之外的

其余各组（P<0.05）。

项目

存活率（SR，%）

增重率（WGR，%）

特定生长率（SGR，%/d）

饲料系数（FCR）

蜕皮率（MR，%）

胆固醇添加量（%）

0

80.00±5.77

165.60 ±4.60b

1.95±0.03b

2.74±0.10a

95.00±7.64b

0.25

87.50±7.50

198.18±13.43a

2.18±0.09a

2.20±0.06b

128.33±6.00a

0.50

75.00 ±0.00

197.89±2.73a

2.18±0.02a

2.67±0.17ab

116.67±4.41ab

0.75

76.67±6.01

182.16 ±3.54ab

2.07±0.02ab

2.95±0.18a

106.66±7.26ab

1.00

80.00±7.63

170.91±8.71b

1.99±0.06b

3.06±0.01a

105.00±7.64b

表2 饲料胆固醇添加量对中华绒螯蟹幼蟹存活、生长、摄食和蜕皮的影响

注：同行数据肩标无字母或含有相同字母表示差异不显著（P>0.05），不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2.2 饲料中添加胆固醇对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺中

胆固醇含量的影响

如图1所示，亚硝酸盐应激前的幼蟹肝胰腺胆固

醇含量普遍高于应激后。在亚硝酸盐应激前，相较于

未添加组，肝胰腺中胆固醇含量在胆固醇添加组显著

升高（P<0.05）。在亚硝酸盐应激后，饲料中添加胆固

醇未显著影响肝胰腺胆固醇含量（P>0.05）。总胆固醇(μmol/g prot.)

0 0.25 0.50 0.75 1.00

400

300

200

100

0

应激前

应激后

Ad A

Abc

A

Ac A

Aa

A

Aab A

胆固醇添加水平(%)

注：相同颜色数据柱形标注不同小写字母表示显著差异（P<0.05），

同一胆固醇添加组中不同大写字母表示显著差异（P<0.05）；含

有相同字母表示差异不显著（P>0.05），下图同。

图1 饲料胆固醇添加量对亚硝酸盐应激前后中华绒螯蟹

幼蟹肝胰腺中胆固醇含量的影响

2.3 饲料中添加胆固醇对中华绒螯蟹幼蟹抗氧化能

力的影响

如图 2 所示，相较于亚硝酸盐应激前，在亚硝酸

盐应激后0.25%和1.00%胆固醇添加组的SOD 活性，

未添加组和 0.25%胆固醇添加组的 GSH-Px 活性，未

添加组、0.50%胆固醇添加组和 0.75%胆固醇添加组

的 T-AOC 水平以及 0.25%和 1.00%胆固醇添加组的

MDA含量显著降低（P<0.05）。在亚硝酸盐应激前，随

着饲料中胆固醇添加量的增加，GSH-Px 活性和 TAOC水平呈现先升高后下降的趋势。0.25%胆固醇添

加组的GSH-Px活性显著高于其他组（P<0.05）。在亚

硝酸盐应激前，0.25%和 0.50%胆固醇添加组的 TAOC活性显著高于未添加和1.00%胆固醇添加组（P<

0.05），0.75%和1.00%胆固醇添加组的MDA含量显著

高于未添加组和0.25%胆固醇添加组（P<0.05）。在亚

硝盐应激后，随着饲料中胆固醇添加量的升高，SOD

活性、GSH-Px活性以及T-AOC水平呈现先升高后下

降的趋势。0.50%和0.75%胆固醇添加组的SOD活性

显著高于未添加和 0.25%胆固醇添加组（P<0.05）。

0.50%和0.75%胆固醇添加组的GSH-PX活性显著高

于未添加组和0.25%胆固醇添加组（P<0.05）。0.50%

及以上胆固醇添加组的T-AOC活性显著高于未添加

组（P<0.05）。随着饲料中胆固醇添加量的增加，MDA

含量呈现先下降后升高的趋势。0.25%胆固醇添加组

的MDA含量显著低于其他组（P<0.05）。

3 讨论

3.1 饲料中添加胆固醇对中华绒螯蟹幼蟹存活、生

长、摄食和蜕皮的影响

70

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

在本研究中，饲料胆固醇添加量对中华绒螯蟹幼

蟹的存活率没有显著性影响，这与对日本沼虾[8]

、中华

绒螯蟹[9]

、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）[13]

的研究

结果相一致。在本研究中，饲料中添加0.25%~0.50%

胆固醇会显著性提高幼蟹的增重率和特定生长率。

一方面，饲料胆固醇能促进甲壳动物总脂含量的积

累，为生长蜕皮提供了良好的能量基础[14]

。另一方

面，胆固醇作为蜕皮激素和维生素D的前体，其含量

不仅能影响甲壳动物蜕皮激素的分泌水平，而且还会

影响食物中钙的吸收效率，影响蜕皮 [9，15]

。本研究中

发现，饲料中添加0.25%胆固醇能显著提高中华绒螯

蟹的蜕皮率，这可能是由于添加适量水平的胆固醇促

进了蜕皮激素的分泌和钙的吸收所致。但本研究同

时发现，1.00%胆固醇添加组中华绒螯蟹的生长速率

和蜕皮率显著下降。研究发现高胆固醇含量不利于

甲壳动物生长蜕皮[16]

，还会导致饲料成本的升高。在

本研究中，随着饲料中胆固醇添加量增加，饲料系数

呈先降低后升高的趋势，当添加量为0.25%时饲料系

数最低，这说明添加0.25%胆固醇的饲料能在显著促

进幼蟹生长的基础上，降低饲料成本。

3.2 饲料中添加胆固醇对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺中

胆固醇含量的影响

胆固醇通过肠道与三酰甘油等物质形成乳糜微

粒，经过血液和淋巴系统运输到机体的组织细胞中。

甲壳动物缺乏将乙酸合成胆固醇的能力，但其有将谷

甾醇转化为胆固醇的能力[17]

。肝胰腺是虾蟹类主要

的营养物质贮存器官，胆固醇会在肝胰腺中蓄积的结

果在南美白对虾中得到验证[18]

。本研究再次证实饲

料中的胆固醇会在中华绒螯蟹的肝胰腺中积累起

来。胆固醇以胆固醇酯的形式储存起来，当机体发生

生理活动时会被积极地调动起来。当面临亚硝酸盐

胁迫时，南美白对虾血淋巴中的胆固醇和三酰甘油含

量会显著降低[19]

。在本研究中，中华绒螯蟹在亚硝酸

盐应激后，肝胰腺的胆固醇含量普遍降低。一方面当

中华绒螯蟹在面对亚硝酸盐胁迫时会通过加速脂肪

分解来满足能量需求[20]

，胆固醇作为脂蛋白的组成部

分能促进脂肪的运输[21]

，中华绒螯蟹在亚硝酸应激

后，可能会通过消耗肝胰腺的胆固醇来生成脂蛋白运

输脂肪。另一方面法尼焦磷酸作为胆固醇和其他活

性萜类物质的合成中间体，由经典的甲羟戊酸途径产

生，通过在节肢动物中独有的一系列反应合成甲基法

尼酯[22]

。甲基法尼酯由甲壳动物大颚器分泌，可以应总抗氧化能力(mmol/g prot.)

0 0.25 0.50 0.75 1.00

0.6

0.4

0.2

0

应激前

应激后

胆固醇添加水平(%)

(C)

过氧化氢酶(U/mg prot.)

0 0.25 0.50 0.75 1.00

0.20

0.15

0.10

0.50

0

应激前

应激后

胆固醇添加水平(%)

(B)

超氧化物歧化酶(U/mg prot.)

0 0.25 0.50 0.75 1.00

150

100

50

0

应激前

应激后

胆固醇添加水平(%)

(A)丙二醛(nmol/mg prot.)

0 0.25 0.50 0.75 1.00

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0

应激前

应激后

胆固醇添加水平(%)

(D)

谷胱甘肽过氧化物酶

(U/mg prot.)

0 0.25 0.50 0.75 1.00

60

40

20

0

应激前

应激后

胆固醇添加水平(%)

(E)

A

Ad Bcd

A

A

Aa Aab

A A

Bbc

A

A A

A

A

A

A A

A

Ab

Bb

Aa

Aab

Aa

Ba Aab

Ba Ab

Aa

Ac

Aab

Ac Bd

Abc

Abc

Aab

Aa

Aa

Ba

Ab

Bb

Aa

Bb

AbAa AbAa

Ab

Aab

图2 饲料胆固醇添加量对亚硝酸盐应激前后中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺中抗氧化能力的影响

A

71

水 产 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

激性调节机体代谢[23]

。中华绒螯蟹在面对亚硝酸盐

应激时可能通过消耗肝胰腺胆固醇和增加甲基法尼

酯含量来调节机体代谢。

3.3 饲料中添加胆固醇对中华绒螯蟹幼蟹抗氧化能

力的影响

抗氧化能力与水生动物的健康状况和生长性能

密切相关[24]

。本试验研究结果表明，饲料中添加适

量的胆固醇能提高中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺中的抗氧

化酶活性。在日本沼虾中报道发现，饲料中添加

0.9%胆固醇可以提高肝胰腺中总抗氧化能力、GPX

和CAT活性，降低MDA含量[8]

。在本试验中，饲料中

添加 0.25%胆固醇可以显著提高中华绒螯蟹幼蟹的

GSH-Px 和 T-AOC 水平。据报道，高胆固醇水平会

使MDA含量和CAT蛋白表达量显著上升，促使细胞

发生了氧化应激反应[25]

。在本试验中0.75%和1.00%

胆固醇添加组的MDA 显著高于对照组，说明过量的

胆固醇添加量能提高机体的氧化应激程度，导致脂

质过氧化产物增多，从而可能导致中华绒螯蟹生长

速度下降[26]

。

氧化应激是指内外源产生的活性氧超过细胞的

抗氧化能力，从而影响信号传导系统，或进而发生对

蛋白质、核酸等生物大分子或细胞器的损伤。高盐度

等环境胁迫因子会触发甲壳类动物产生活性氧，打破

生物体内活性氧代谢的平衡[27]

。在亚硝酸盐对南美

白对虾毒性实验中发现，亚硝酸盐会导致活性氧中间

产物的增加，并且相应抗氧化酶活性降低[28]

。本研究

显示，在亚硝酸盐应激后幼蟹体内SOD活性、GSH-Px

活性和 T-AOC 均显著低于应激前。氧化应激之初，

动物体内抗氧化酶活性增加以避免过多ROS对机体

造成的损伤，随着时间的延长，体内抗氧化酶消耗殆

尽，致使取样时甚至低于应激之前的水平。除对照组

外，其他组亚硝酸盐应激前的MDA 含量普遍高于应

激后的MDA含量，这个结果与其他研究发现不一致，

洪美玲[20]

研究表明，亚硝态氮应激会导致中华绒螯蟹

MDA含量显著性升高。而本试验中MDA含量普遍降

低可能一方面是因为氧化应激初期体内释放较多的

抗氧化酶，降低了ROS对脂质的过氧化，另一方面可

能是因为本次试验的养殖用水为盐碱地池塘水，而水

的盐度或离子浓度升高可以降低亚硝酸盐的毒性[29]

，

刺激机体产生“毒物兴奋效应”[30]

，进而造成MDA含量

降低。亚硝酸盐是造成水产动物氧化应激的一种常

见因子，其毒害作用主要表现在影响水产动物血液

的运氧能力和破坏机体内的氧化还原系统[31-32]

。本

研究中，亚硝酸盐应激后，SOD 活性、GSH-Px 活性、

T-AOC 在 0.5%或 0.75%胆固醇添加组具有最高值，

显著高于未添加组，这说明适中或较高水平的胆固

醇能提高中华绒螯蟹幼蟹抗亚硝酸盐的应激能力。

0.25%胆固醇添加组的 MDA 含量最低，可能是因为

0.25%处理组的应激前抗氧化能力相对最强，导致

MDA 含量最低，在亚硝酸盐短时间应激后 0.25%胆

固醇添加组的抗氧化酶活性迅速消耗，但又没有达

到产生大量 MDA 的程度。胆固醇能促进幼蟹能量

调节的同时，推测还会通过以下原因来增强幼蟹抗

亚硝盐应激能力：一方面，胆固醇在膜融合中起着重

要作用[2]

，可能影响着抗氧化酶的生成和释放，进而

增强了机体的抗硝酸盐氧化应激能力。另一方面，

胆固醇作为甲基法尼酯的前体，甲基法尼酯在环境

应激中起到重要的调节作用[23]

，胆固醇可能通过这

个途径来增强机体的抗逆性，增强机体抗亚硝酸应

激能力。

4 结论

综上所述，饲料中添加0.25%胆固醇可满足中华

绒螯蟹幼蟹生长的需求，而添加0.50%~0.75%饲料胆

固醇可使幼蟹获得最佳的抗亚硝酸盐应激能力。

参考文献

[1] PAN J, WU R F, WU X G, et al. Impacts of different feeding

modes on the gonadal development, total edible yield, and nutri⁃

tional composition of male Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)

[J]. Aquaculture and Fisheries, 2020, 5(6): 300-307.

[2] YANG S T, KREUTZBERGER A, LEE J, et al. The role of choles⁃

terol in membrane fusion[J]. Chemistry & Physics of Lipids, 2016,

199: 136-143.

[3] TESHIMA S I, KANAZAWAT A. Biosynthesis of sterols in the

lobster, Panulirus japonica, the prawn, Penaeus japonicus, and the

crab, Portunus trituberculatus[J]. Comparative Biochemistry and

Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1971, 38(3): 597-

602.

[4] SHEEN S S. Dietary cholesterol requirement of juvenile mud crab

Scylla serrata[J]. Aquaculture, 2000, 189(3/4): 277-285.

[5] HAN T, WANG J, LI X, et al. Effects of dietary cholesterol levels

on the growth, molt performance, and immunity of juvenile swim⁃

ming crab, Portunus trituberculatus[J]. The Israeli Journal of Aqua⁃

culture-Bamidgeh, 2015, 67: 1065-1069.

[6] MORRIS T C, SAMOCHA T M, DAVIS D A, et al. Cholesterol

72

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

supplements for Litopenaeus vannamei reared on plant based diets

in the presence of natural productivity[J]. Aquaculture, 2011, 314

(1/2/3/4): 140-144.

[7] SUPRAYUDI M A, TAKEUCHI T, HAMASAKI K. Cholesterol ef⁃

fect on survival and development of larval mud crab Scylla serrata

[J]. Hayati Journal of Biosciences, 2012, 19(1): 1-5.

[8] GU X, FU H, SUN S, et al. Effects of cholesterol on growth, feed

utilization, body composition and immune parameters in juvenile

oriental river prawn, Macrobrachium nipponense (De Haan) [J].

Aquaculture Research, 2017, 48(8): 4262-4271.

[9] TAO X, WANG C, WEI H, et al. Effects of dietary cholesterol lev⁃

els on moulting performance, lipid accumulation, ecdysteroid con⁃

centration and immune enzymes activities of juvenile Chinese mit⁃

ten crab Eriocheir sinensis[J]. Aquaculture, 2014, 20(5): 467-476.

[10] 陈彦良. 脂类及维生素E对中华绒螯蟹幼蟹生长及免疫性能的

影响[D]. 博士学位论文. 上海: 华东师范大学, 2014.

[11] 王鑫磊, 李航, 黄旭雄, 等. 饲料中胆固醇含量对淡水养殖凡纳

滨对虾生长性能、抗弧菌和抗亚硝态氮胁迫能力的影响[J]. 动

物营养学报, 2016, 28(8): 2639-2649.

[12] 闫明磊. 饲料中胆固醇、大豆-卵磷脂及其交互作用对淡水养殖

凡纳滨对虾抗逆性的影响[D]. 硕士学位论文. 上海: 上海海洋

大学, 2018.

[13] 田红艳, 杨成聪, 张春暖. 等. 饲料胆固醇水平对克氏原螯虾生

长性能、消化酶活性、抗氧化能力和脂代谢相关基因表达的影

响[J]. 动物营养学报, 2022, 34(7): 4630-4641.

[14] BUCHHOLZ F, BUCHHOLZ C. Growth and moulting in north⁃

ern krill (Meganyctiphanes norvegica Sars) [J]. Advances in Ma⁃

rine Biology, 2010, 57(57): 173-197.

[15] 陈四清, 李爱杰. 维生素D对中国对虾生长影响的研究[J]. 海洋

与湖沼, 1995(1): 42-47.

[16] ZHANG X, YUAN J, SUN Y, et al. Penaeid shrimp genome pro⁃

vides insights into benthic adaptation and frequent molting[J].

Nature Communications, 2019, 10(1): 1-14.

[17] TESHIMA S I, KANAZAWA A. In vivo bioconversion of β-sitos⁃

terol to cholesterol in the crab, Portunus trituberculatus[J]. Mem⁃

oirs of Faculty of Fisheries Kagoshiman University, 1972, 21(1):

91-95.

[18] ZHANG W, YANG Q, TAN B, et al. Study of the requirements

of dietary cholesterol at two different growth stages of Pacific

white shrimps, Litopenaeus vannamei[J]. Aquaculture Internation⁃

al, 2019, 27(6): 1583-1597.

[19] 李晓丽. 饲料中添加羟基蛋氨酸硒对凡纳滨对虾生长、抗氧化

和抗亚硝酸盐胁迫的影响[D]. 硕士学位论文. 厦门: 集美大

学, 2017.

[20] 洪美玲. 水中亚硝酸盐和氨氮对中华绒螯蟹幼体的毒性效应及

维生素E的营养调节[D]. 博士学位论文. 上海: 华东师范大学,

2007.

[21] YEPIZ- PLASCENCIA G, VARGAS- ALBORES F, HIGUERACIAPARA I. Penaeid shrimp hemolymph lipoproteins[J]. Aqua⁃

culture, 2000, 191(1/2/3): 177-189.

[22] BORST D W, OGAN J, TSUKIMURA B, et al. Regulation of the

crustacean mandibular organ [J]. American Zoologist, 2001, 41

(3): 430-441.

[23] 邱锡尔, 朱冬发, 汤洁, 等. 甲基法尼酯在甲壳动物中的生理作

用及其机制的研究进展[J]. 生物学杂志, 2015, 32(1): 76-81.

[24] DAVIES K J A. Oxidative stress, antioxidant defenses, and dam⁃

age removal, repair, and replacement systems[J]. International

Union of Biochemistry and Molecular Biology Life, 2000, 50(4/

5): 279-289.

[25] 李凯群. 高胆固醇通过激活ROS介导的NF-кB通路抑制肌腱

干细胞的腱系分化[D]. 博士学位论文. 广州: 南方医科大学,

2019.

[26] CHEN Y, CHEN L, QIN J G, et al. Growth and immune re⁃

sponse of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) fed diets con⁃

taining different lipid sources[J]. Aquaculture Research, 2016, 47

(6): 1984-1995.

[27] FREIRE C A, TOGNI V G, HERMES- LIMA M. Responses of

free radical metabolism to air exposure or salinity stress, in

crabs (Callinectes danae and C. ornatus) with different estuarine

distributions[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part

A, 2011, 160(2): 291-300.

[28] WANG W N, WANG A L, ZHANG Y J. Effect of dietary higher

level of selenium and nitrite concentration on the cellular de⁃

fense response of Penaeus vannamei[J]. Aquaculture, 2006, 256

(1/2/3/4): 558-563.

[29] CHEN J C, LIN C Y. Oxygen consumption and ammonia-N ex⁃

cretion of Penaeus chinensis juveniles exposed to ambient ammo⁃

nia at different salinity levels[J]. Comparative Biochemistry and

Physiology Part C Comparative Pharmacology and Toxicology,

1992, 102(2): 287-291.

[30] STEBBING A. Hormesis—the stimulation of growth by low lev⁃

els of inhibitors[J]. Science of the Total Environment, 1982, 22

(3): 213-234.

[31] AVILEZ I M, ALTRAN A E, AGUIAR L H, et al. Hematological

responses of the Neotropical teleost matrinxa (Brycon cephalus)

to environmental nitrite[J]. Comparative Biochemistry and Physi⁃

ology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2004, 139(1/2/3): 135-

139.

[32] WANG W N, WANG A L, ZHANG Y J, et al. Effects of nitrite

on lethal and immune response of Macrobrachium nipponense[J].

Aquaculture, 2004, 232(1/2/3/4): 679-686.

（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

73

水 产 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

黄粉虫粉作为饲料蛋白源

对草鱼摄食和生长的影响研究

■ 王孝宇1，2 谭青松1，2* 张孝睿1 倪新宇1 解绶启3

（1.农业农村部淡水生物繁育重点实验室，池塘健康养殖湖北省工程实验室，华中农业大学水产学院，湖北武汉 430070；

2.水产养殖国家级实验教学示范中心，湖北武汉 430070；3.中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家

重点实验室，湖北武汉，430072）

摘 要：试验旨在研究黄粉虫粉作为饲料蛋白源对草鱼摄食和生长的影响，从而评价其在草鱼

饲料中的应用价值。分别设计了以黄粉虫和豆粕为单一蛋白源的高、低蛋白质水平的4种饲料，并进

行56 d的养殖试验，对比研究饲料蛋白源以及蛋白质水平对草鱼采食量、生长性能、嗅觉电信号响应

和脑组织中摄食相关基因表达的影响。结果表明：草鱼对以黄粉虫粉为单一蛋白源的饲料摄食不

佳，生长几乎处于停滞状态。对比分析发现，饲料蛋白源种类及蛋白质水平对平均摄食量、增重率、

蛋白质效率、嗅觉电信号响应幅度和部分摄食相关基因（agrp和pomc）表达量影响显著，且因子间的

交互作用显著。①比较以豆粕为蛋白源的饲料而言，黄粉虫粉饲料（L-MW和H-MW）组草鱼的摄食

量、增重率、蛋白质效率和嗅觉电信号响应幅度显著降低（P<0.05）；摄食含黄粉虫饲料的草鱼脑组织

中促食基因npy和agrp的表达量显著下调且抑食基因pomc和cart的表达量显著上调（P<0.05）。②以

豆粕为蛋白源时，H-SM组草鱼摄食量、增重率和嗅觉电信号响应幅度均显著高于L-SM组，而蛋白质

效率却显著下降（P<0.05）；H-SM饲料上调了促食基因npy和agrp的表达并下调了抑食基因pomc的

表达（P<0.05）。以黄粉虫粉为饲料蛋白源时，H-MW 组的增重率和蛋白质效率高于 L-MW 组（P<

0.05），蛋白质水平对摄食量、摄食基因表达和嗅觉电信号响应幅度均无显著影响（P>0.05）。总之，黄

粉虫粉不适宜作为草鱼的单一蛋白源，且饲料蛋白源类型及蛋白质水平可影响草鱼的嗅觉系统并调

节脑组织中食欲相关基因的表达，从而调控草鱼的摄食行为和采食量。

关键词：草鱼；黄粉虫粉；豆粕；摄食基因；蛋白源

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.10.012

中图分类号：S816.48 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）10-0074-07

Dietary Mealworm and Soybean Meal Level Affected Feed Intake and Growth of Grass Carp

(Ctenopharyngodon idellus)

WANG Xiaoyu1,2 TAN Qingsong1,2* ZHANG Xiaorui1 Ni Xinyu1 XIE Shouqi3

(1. Key Laboratory of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei

Provincial Engineering Laboratory for Pond Aquaculture, College of Fisheries, Huazhong Agricultural

University, Hubei Wuhan 430070, China; 2. National Demonstration Center for Experimental Aquaculture

Education, Hubei Wuhan 430070, China; 3. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and

Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Hubei Wuhan 430072, China)

Abstract：This study was conducted to investigate the effects of dietary mealworm meal inclusion on the

feed intake, growth, electro- olfactory signals and

feeding-related genes expression in brain of grass

carp, so as to evaluate the nutritional value of

mealworm meal in this fish. Four diets with lowand high-protein levels based on a single protein

sources, mealworm meal (MW) or soybean meal

(SM) were designed, and the feeding trial lasted

作者简介：王孝宇，硕士，研究方向为水产动物营养与饲料。

*通讯作者:谭青松，博士，副教授，硕士生导师。

收稿日期：2023-04-17

基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点

专项[2019YFD0900200]

74

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

在全球粮食蛋白源紧张和水产养殖饲料对蛋白

源消耗逐步增加的双重压力下，寻找新型非粮食蛋白

质已成为水产养殖可持续发展研究领域中的重要课

题。新型蛋白源除了应具备营养平衡、价格便宜和易

获得等特点外，鱼类对蛋白源的喜好程度通常是筛选

新型蛋白时优先考虑的因素。

昆虫粉蛋白较传统的动物型和植物型蛋白而言，

被认为是水产饲料中最有开发潜力的新型非粮食蛋

白。但据研究报道，舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）[1]

、

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[2]

和短棘鮰（Amei⁃

urus melas）[3]

等鱼虾对昆虫粉的喜好程度差异很大。

黄粉虫易饲养、占地少，其风干产物的蛋白质含量高

达60%，氨基酸平衡，同时含有较高的脂肪，为鱼类提

供能量，故黄粉虫粉被认为是一种非常有潜力的优质

昆虫蛋白源[4]

。大多数关于黄粉虫粉在水产饲料中的

报道认为其有较好的养殖效果[5-7]

，但也有报道认为高

含量的黄粉虫粉可导致鱼类的摄食和生长受阻，消化

率降低[1]

。

鱼类的摄食和蛋白源的类型及含量之间关系密

切，如高植物蛋白含量的饲料会导致花鲈（Lateo⁃

labrax japonicus）[8]

、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[9]

和尼

罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[10]

的采食量下降。与

肉食性或杂食性鱼类相比，草鱼对植物型蛋白源的摄

食喜好和利用程度具有较明显的优势[11]

。鱼类对饲

料中蛋白源的偏好和采食量的调节在很大程度上与

神经调节机制相关。

在鱼类中，几种与摄食相关的神经肽，例如厌食

神经肽[可卡因-安他非明转录调节肽（cocaine and

amphetamine regulated transcript peptide, CART）和阿

片促黑色素原（pro-opiomelanocortin, POMC）]及促食

神经肽[神经肽 Y（neuropeptide, NPY）和刺鼠关联肽

（Agouti-related protein，AgRP）]已经被证实由下丘脑

分泌并在自主神经和内分泌系统的神经元中产生反

应以影响摄食行为[12-15]

。Liang等[8]

的研究表明，植物

性饲料会引起花鲈厌食反应并伴随着pomc基因表达

量的变化。此外，研究发现舌齿鲈会拒食不含蛋白质

的饲料[16]

，但这种拒食行为的机制并不清楚。在哺乳

动物中发现，日粮蛋白质缺乏会引起小鼠下丘脑中

npy转录水平发生改变进而影响摄食量[17]

。

草鱼作为我国重要的集约化淡水养殖品种，饲料

蛋白质在其食物结构中至关重要。关于黄粉虫粉作

为单一蛋白源在草鱼饲料中的研究还未见报道。本

研究探讨了以黄粉虫粉为单一蛋白源时草鱼的生长

和摄食反应，并比较其与豆粕为单一饲料蛋白源时的

for 56 days. The results showed that fish fed with mealworm meal diets showed lower feeding rate and

very low growth rate. Dietary protein sources and protein levels interacted to affect the weight gain rate,

feed intake, protein efficiency ratio and the mRNA levels of agrp and pomc, while showed no significant

effect on the survival rate. Specifically, ① compared with soybean meal, the feeds containing mealworm

meal (L-MW and H-MW) as protein source significantly decreased the weight gain rate, feed intake, pro⁃

tein efficiency ratio and response amplitudes of electro-olfactory signals of grass carp (P<0.05); The ex⁃

pressions of npy and agrp were significantly down-regulated, while the anti-feeding gene pomc and cart

were significantly up-regulated (P<0.05) in the brain tissue of grass carp fed mealworm meal. ② In soy⁃

bean meal groups, the weight gain rate, feed intake and response amplitudes of electro-olfactory signals

of grass carp in the H-SM group were significantly higher than L-SM group, but the protein efficiency ra⁃

tio decreased significantly (P<0.05); H-SM diet up-regulated the expression of npy and agrp, but downregulated pomc expression (P<0.05). The weight gain rate and protein efficiency ratio were also higher in

H-MW diet group than those in L-MW group (P<0.05), while there was no significant effect of dietary

mealworm protein content on feeding-related gene expression and response amplitudes of electro-olfacto⁃

ry signals of grass carp (P>0.05). In conclusion, mealworm meal was not suitable for grass carp diet

when it was used as the sole protein source based on fish feeding and growth performance. And further,

dietary protein levels and protein sources affect the olfactory system and regulate the expression of feed⁃

ing genes in brain tissue to control the feeding behavior and feed intake of grass carp.

Key words：grass carp; mealworm meal; soybean meal; feeding regulatory genes; protein source

75

水 产 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

差异，从而为黄粉虫粉的饲料营养价值评定及其在草

鱼饲料中的应用提供指导。

1 材料方法

1.1 试验饲料

分别以黄粉虫粉和美国豆粕为饲料蛋白源，玉米

淀粉为糖源，大豆油和鱼油为脂肪源配制了低蛋白

（29%）和高蛋白（41%）水平的4种饲料，分别记作黄

粉虫粉低蛋白饲料（L-MW）、黄粉虫粉高蛋白饲料

（H-MW）、豆粕低蛋白饲料（L-SM）和豆粕高蛋白饲

料（H-SM），饲料配方组成及其营养水平见表1。饲料

制作时，先将原料粉碎后过 80 目筛，并称重混匀，然

后用膨化机（饲料水分为 21%，膨胀温度 130 ℃）制

成直径为 2 mm 的颗粒，随后在烘箱中以 60 ℃干燥

30 min，并于-20 ℃冰箱中保存备用。

表1 试验饲料的配方和营养水平（干物质基础，%）

项目

原料组成

豆粕

黄粉虫粉

豆油+鱼油(1?1)

玉米淀粉

微晶纤维素

预混料

磷酸二氢钙

50%氯化胆碱

氧化钇

营养水平

水分

粗蛋白

粗脂肪

灰分

豆粕（SM）

L-SM

56.50

6.25

8.70

25.15

1.00

1.80

0.50

0.10

5.95

27.68

6.87

5.41

H-SM

80.00

6.00

0.00

10.60

1.00

1.80

0.50

0.10

5.32

39.76

7.01

7.17

黄粉虫粉（MW）

L-MW

40.20

5.00

25.50

25.90

1.00

1.80

0.50

0.10

5.36

29.00

6.51

5.01

H-MW

57.00

4.25

25.50

9.85

1.00

1.80

0.50

0.10

5.45

41.09

6.66

5.21

注：1. 每千克豆粕的干物质中含有：粗蛋白512.46 g、粗脂肪11.46 g、

灰分68.44 g；

2. 每千克黄粉虫粉的干物质中含有：粗蛋白 719.45 g、粗脂肪

45.76g、灰分74.92 g；

3. 维生素和矿物质预混料向每千克日粮提供：VC磷酸酯（35%）

900 mg、VE 450 mg、肌醇 225 mg、烟酸胺 120 mg、泛酸钙

60 mg、VA 30 mg、VK3 30 mg、VB2 22.5 mg、VB6 22.5 mg、

VD3 15 mg、VB1 15 mg、叶酸15 mg、VB12 120 μg、生物素3 mg、

一水硫酸铁300 mg、一水硫酸锌200 mg、氯化钠100 mg、一水

硫酸锰25 mg、五水硫酸铜30 mg、氯化钴（10%钴）5 mg、亚硒

酸钠（10%硒）5 mg、碘酸钾（2.9%）3 mg、硫酸镁900 mg；

4. 营养水平为实测值。

1.2 试验设计和管理

试验用草鱼幼鱼购自武汉市新洲渔场。正式饲

养试验前，草鱼被投喂各试验饲料的混合物暂养14 d

使其适应养殖环境。暂养结束后，挑选出体格健壮、

规格一致（[ 6.8±0.1）g]的草鱼随机分入 12 个养殖缸

（直径为0.8 m，水体积为300 L，微流水养殖系统）中，

每缸 30 尾。将各缸鱼随机分组至每种饲料，每个处

理3个重复。在56 d的养殖试验期间进行定时（8：00

和15：00）饱食投喂，剩余残饵收集后烘干。养殖期间

采用自然光照，水温为（28±1.5）℃、溶氧大于5 mg/L、

pH为7.7左右、水流速为1.5 L/min。

1.3 样品采集和指标测定

试验结束时，将草鱼饥饿24 h后进行称重。然后

从每缸中随机取 3 尾草鱼，用 MS-222 麻醉后解剖取

出脑组织并置于液氮中速冻，再保存至-80 ℃直至下

一步分析。

使用 Trizol™试剂（TaKaRa）从脑组织中提取总

RNA，然后用1%琼脂糖凝胶电泳和260/280 nm吸光

度比值（NanoDrop® ND-1000, Thermo Fisher Scientif⁃

ic, 美国）确定 RNA 的质量和数量。用 Prime Script™

RT试剂盒（TaKaRa，日本）将总RNA逆转录为cDNA，

并于-20 ℃保存备用。

通过NCBI数据库获取序列信息，并使用Oligo 7.0

软件为npy、agrp、pomc和cart设计特异性引物（表2）。

使用Unique Aptamer™ qPCR SYBR® Green Mas⁃

ter Mix（Novogene）试剂盒在罗氏荧光定量仪（Light

Cycler 480Ⅱ，Roche）上进行qPCR检测分析。扩增程

序为：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 10 s，55 ℃退火

20 s和72 ℃延伸20 s，40个循环。以ef1-α为内参，利

用2-ΔΔCt的方法计算基因相对表达量。

1.4 嗅觉电生理测定

参照Yu等[18]

方法测定草鱼对四种饲料的嗅觉电

生理响应幅值。①将4种饲料分别称取10.0 g并溶于

200 mL 脱氯自来水中 30 min，然后用滤纸过滤并收

集过滤液；②将记录电极（ME-1微电极放大器，成都

泰盟软件有限公司）接触于草鱼（[ 10.1±1.0）g]嗅囊表

面，同时将参比电极接触于吻端；③以脱氯自来水为

阴性对照，将响应幅度调整为0，随后将饲料溶解液在

相等时间间隔内滴入嗅囊表面，共计滴入 3 次，随后

电信号通过BL-420A生物机能实验系统（成都泰盟软

件有限公司）显示在计算机上并记录幅度值（幅度值=

正电势最大值+负电势最大值的绝对值）。试验结束

后将试验鱼放回水箱，整个试验使用了3尾草鱼进行

重复测试。

1.5 指标计算及数据处理

试验鱼的平均摄食量（AFI，g）、增重率（WGR，%）、

蛋白质效率（PER）和成活率（SR，%）按下列公式计算。

平均摄食量（AFI，g）=总干物质摄食质量/每缸鱼

76

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

的数量

增重率（WGR，%）=100×（鱼体末重-鱼体初重）/

鱼体初重

蛋白质效率（PER）=（鱼体末重-鱼体初重）/蛋白

质摄入量

成活率（SR，%）=存活尾数/初始尾数×100

试验数据以“平均值±标准误（Mean±SE，n=3）”表

示。通过双因素方差分析（two-way ANOVA）来分析

各因素对观测指标的影响。当交互作用显著时，采用

Duncan’s法多重检验来评估各组之间的差异。若交

互作用不显著，则仅在相同蛋白源内部或相同蛋白质

水平之间进行独立样本t检验以比较各因素引起的差

异大小。所有统计分析均采用SPSS 22.0软件进行，

P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲料蛋白质水平和蛋白源类型对草鱼摄食和生

长的影响

由表 3 可知，草鱼对黄粉虫粉饲料的摄食非常

少，仅在维持摄食量水平；两个黄粉虫饲料组的增重

率极低，其中L-MW组为负值。双因素方差分析显示

草鱼的平均摄食量、末重、增重率和蛋白质效率均受

饲料蛋白源类型、蛋白质水平及二者之间的交互作用

影响（P<0.05）。黄粉虫粉为蛋白源时，L-MW 和 HMW 组草鱼的平均摄食量和末重无显著差异（P>

0.05）；而H-MW组的增重率和蛋白质效率相较于LMW 组显著提高（P<0.05）。豆粕为蛋白源时，H-SM

组末重、平均摄食量和增重率显著高于 L-SM 组（P<

0.05），而蛋白质效率则显著降低（P<0.05）。另外，与

豆粕组（L-SM 和 H-SM）相比，相同蛋白质水平下的

黄粉虫粉饲料组（L-MW和H-MW）的平均摄食量、末

重、增重率和蛋白质效率均显著降低（P<0.05）。各组

之间成活率无显著差异（P>0.05）。

项目

L-MW

H-MW

L-SM

H-SM

P值

蛋白源

蛋白水平

蛋白源×蛋白水平

末重（g）

6.57±0.14a

7.47±0.09a

14.59±0.69b

22.11±0.48c

0.000

0.000

0.000

增重率（%）

-1.53±0.69a

7.32±0.15b

100.17±4.57c

223.72±7.12d

0.000

0.000

0.000

平均摄食量（g）

5.69±0.53a

5.93±0.32a

19.39±0.44b

22.98±0.42c

0.000

0.002

0.005

蛋白质效率

-0.05±0.04a

0.21±0.02b

2.75±0.12d

2.08±0.06c

0.000

0.015

0.000

成活率（%）

100

100

100

100

表3 饲料蛋白质水平和蛋白源类型对试验鱼摄食和生长性能的影响

注：1. 同列数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）；

2. P值表示双因素方差分析中各因素及其交互作用影响的显著性。

2.2 饲料蛋白源类型（黄粉虫粉和豆粕）及蛋白质水

平对草鱼嗅觉电信号响应幅度的影响

由表 4 可知，草鱼的嗅觉电信号响应幅度受饲

料蛋白源、蛋白质水平及二者之间的交互作用影响

（P<0.05）。在黄粉虫粉饲料组间，L-MW 和 H-MW

组草鱼的嗅觉电信号响应幅度差异不显著（P>

0.05）；在豆粕饲料组间，H-SM 组嗅觉电信号响应

幅度显著高于 L-SM 组（P<0.05）；另外黄粉虫粉饲

料组的嗅觉电信号响应幅度均显著低于豆粕饲料

组（P<0.05）。

项目

幅度

L-MW组

38.76±0.65a

H-MW组

42.53±1.31a

L-SM组

54.37±1.60b

H-SM组

73.59±1.83c

双因素方差分析（P值）

蛋白源

0.000

蛋白水平

0.001

蛋白源×蛋白水平

0.001

表4 草鱼对4种饲料的嗅觉电信号响应幅度（μV）

注：1. 同行数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）；

2. P值表示双因素方差分析中各因素及其交互作用影响的显著性。

基因

npy

agrp

cart

pomc

ef1-α

正向引物(5’~3’)

CTTCCTCTTGTTCGCCTGCT

GATGCATGTTTGCACCATC

GGACACGAGAGCCATCAGAG

CATGGAGCATTTCCGTTGGG

TGACTGTGCCGTGCTGAT

反向引物(5’~3’)

CCTTTTGCCATACCTCTGCC

AAGCCACCATTAGCCATTTCAGGG

TTTTCTGATCGCGCACTGCT

AGTCGTCTTCGTTGGTTGCC

CGCTGACTTCCTTGGTGATT

登录号

JQ970470.1

PRJEB5920

OL856008

FJ692322

GQ266394

表2 荧光定量引物序列

77

水 产 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

2.3 黄粉虫粉和豆粕蛋白源及蛋白水平对草鱼脑组

织摄食相关基因表达的影响

如图 1 所示，饲料蛋白源、蛋白质水平及二者之

间的交互作用均不同程度影响草鱼脑组织中agrp和

pomc的表达水平；npy的表达也受饲料蛋白源种类及

蛋白质水平的影响显著（P<0.05），但二因子之间不存

在交互作用（P>0.05），抑食基因cart的表达量则仅受

饲料蛋白源种类的影响（P<0.05）。促食基因 agrp 的

表达在黄粉虫粉饲料组（L-MW 和 H-MW 组）最低，

L-SM 饲料组居中，而 H-SM 饲料组最高；抑食基因

pomc的表达则与agrp的变化趋势相反，两个黄粉虫粉

饲料组（L-MW和H-MW组）最高，其次为L-SM饲料

组，而H-SM饲料组最低（P<0.05）。t检验结果显示，

H-SM 组 npy 表达量显著高于 L-SM 组，而黄粉虫粉

高、低蛋白含量组之间没有显著差异；在相同蛋白质

水平下，黄粉虫粉组npy的表达量显著低于豆粕组，而

cart表达量则呈相反趋势（P<0.05）。

3 讨论

注：柱状图中a、b和c字母不同表示差异显著（P<0.05），“*”代表具有显著性（P<0.05），而“NS”代表没有显著性（P>0.05）；图注下

方的P值表示双因素方差分析中各因素及其交互作用影响的显著性。

图1 黄粉虫粉和豆粕蛋白源以及蛋白质水平对草鱼摄食相关基因npy、agrp、pomc和cart表达量的影响

项目

蛋白源

蛋白水平

蛋白源×蛋白水平

P值

0.000

0.003

0.271

项目

蛋白源

蛋白水平

蛋白源×蛋白水平

P值

0.000

0.000

0.001

项目

蛋白源

蛋白水平

蛋白源×蛋白水平

P值

0.000

0.000

0.002

项目

蛋白源

蛋白水平

蛋白源×蛋白水平

P值

0.000

0.144

0.222

基因表达水平

H-MW组

L-SM组

H-SM组

L-MW组

1.5

1.0

0.5

0

a

b

c c

pomc

基因表达水平

H-MW组

L-SM组

H-SM组

L-MW组

2.0

1.5

1.0

0.5

0

NS

* *

*

npy

基因表达水平

H-MW组

L-SM组

H-SM组

L-MW组

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0

0

a

b

c

a

agrp

基因表达水平

H-MW组

L-SM组

H-SM组

L-MW组

1.5

1.0

0.5

0

*

*

cart

3.1 饲料蛋白源和蛋白水平对草鱼摄食、生长和嗅

觉电信号的影响

大量研究表明，长期摄取高蛋白饲料增加了鱼类

的采食量[19-20]

，并因此促进了鱼类的快速生长。本试

验豆粕组中，高蛋白组草鱼的采食量显著高于低蛋白

组，且伴随末重和增重率的增加，这与罗非鱼[19]

和草

鱼[21]

上的研究结果一致。鱼类可利用摄入的蛋白质

作为能量来源以满足机体的能量消耗，剩余的蛋白质

用于生长发育，从而较高的饲料豆粕蛋白质改善了草

鱼的生长[22]

。然而，本试验的草鱼对黄粉虫粉饲料采

食量无差异，相对而言，草鱼摄食黄粉虫粉高蛋白饲

料会获得更多的蛋白质，用于维持日常能量消耗和鱼

体生长，而低蛋白饲料则不能维持本身能量消耗导致

消瘦，因此导致了低蛋白黄粉虫粉组的草鱼体重减少

和负的蛋白质效率。值得注意的是，在本研究中，黄

粉虫粉组的摄食和生长远不如豆粕组，且低蛋白黄粉

虫饲料组的生长为负值，都表明黄粉虫作为草鱼饲料

的蛋白源可能引起草鱼的不适，这与之前在舌齿鲈中

的结果相类似[1]

。此外，蛋白源和蛋白水平的交互作

用显著影响草鱼的生长和饲料摄取，这与Basto-Sliva

等[23]

的发现一致。

在很大程度上，鱼类对食物的喜好差异与嗅觉系

统、味觉系统和消化生理有关。饲料的气味通常具有

诱发鱼类搜索食物的作用，味道和质地最终决定了饲

料的摄取[24]

。本试验中，草鱼在养殖初期到结束过程

中均表现出对黄粉虫粉饲料没有摄食偏好，甚至出现

厌食情况，这种对特定蛋白源厌食行为在花鲈也有类

似的报道[25]

。我们前期的试验表明，部分L-型氨基酸

和化学类物质（二甲基-β-乙酸噻啶和二甲基-β-丙

酸噻啶）具有引诱并促进草鱼摄食的作用[18]

。鱼类行

为学和电生理学研究表明，多种化学物质可以被鱼类

嗅觉系统所识别，并刺激鱼类的嗅觉系统，使鱼类产

生特定的行为反应和嗅觉响应电信号[26]

。通过气相

色谱-质谱联用（GC-MS）方法对黄粉虫粉的气味分析

发现，黄粉虫粉的气味主要由碳氢化合物（50.11%）和

醛类（37.14%）构成[27]

，并且黄粉虫粉的氨基酸谱与豆

78

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

粕和鱼粉具有明显的差别[28]

。此外，植物性蛋白富含

单糖、蔗糖和可溶性非淀粉多糖，并且草鱼对糖类物

质具有偏好性[29]

。为进一步证实黄粉虫粉饲料中某

些物质抑制草鱼摄食的行为，我们通过测定嗅觉电信

号发现草鱼对黄粉虫粉饲料的响应幅度显著低于豆

粕饲料，尤其是高蛋白组豆粕饲料。值得注意的是，

嗅觉电生理学试验不能区分哪些物质对鱼类具有吸

引作用，只能模拟自然条件下某些物质对嗅觉的刺激

强度[18]

。因此，从摄食表现和嗅觉电信号的结果可推

测黄粉虫粉的成分不能引起草鱼的摄食发生，但具体

影响机制需进一步探究。

3.2 饲料蛋白源和蛋白水平对草鱼摄食基因的影响

鱼类摄食行为受到饲料主要的营养成分（即碳水

化合物、脂肪和蛋白质）、水温、光照周期和水质的

影响[30-31]

，且涉及下丘脑和外周信号之间复杂相互作

用[31]

。有研究报道，鱼类摄食高蛋白饲料会增加采食

量[15]

，且伴随着摄食调控因子的变化[23]

。大量研究表

明，下丘脑在摄食上发挥重要作用，其可分泌促食欲

神经肽（NPY 和 AgRP）[14]

和厌食神经肽（CART 和

POMC）[12-13]

。在虹鳟[13]

和草鱼[32]

中，CART和POMC已

被证明参与抑制摄食行为。Chaumontet等[33]

报道，摄

食高蛋白质食物下调了小鼠下丘脑中pomc基因的表

达量。本试验结果表明，摄食高蛋白豆粕饲料降低了

脑组织中 pomc 相对表达量，促进摄食行为的发生。

另外，关于西伯利亚鲟（Acipenser baerii）摄食的研究发

现，CART与下丘脑中NPY受体能够相互作用[34]

，从而

促进对食物的摄入。NPY作为硬骨鱼中促食欲调节

肽，在草鱼[35]

、鳜（Siniperca chuatsi）[36]

、黄条鰤（Seriola

aureovittata）[37]

和金鱼[38]

均有证明。Alam 等[36]

试验表

明，npy 和 agrp 基因表达量随着饲料中 P/E 比的增加

而线性增加，与本试验脑组织中agrp的表达量在豆粕

高蛋白组被上调一致，且npy的表达量也有上调的趋

势。基于以上结果，草鱼对不同蛋白水平饲料的摄食

反应受到中枢神经系统中npy、agrp和pomc等摄食因

子调节。

另一方面，鱼类对蛋白源选择的差异性与神经肽

通过中枢神经系统发出的信号介导有关[39]

。Liang等[15]

认为下丘脑中促食基因agrp的上调和厌食基因pomc

的下调，导致了草鱼偏向于摄食植物性蛋白。本研究

与以上结果类似，即草鱼脑组织中agrp上调并伴随着

pomc下调促进了对豆粕饲料的摄食。Basto-Silva等[23]

报道，金头鲷（Sparus aurata）摄食植物性蛋白的饲料

降低了大脑中cart基因的表达。与之相反，花鲈摄食

植物蛋白导致厌食基因pomc高水平的表达[8]

，这与其

肉食性的特点相符合。相应地，本试验中草鱼脑组织

中agrp下调并伴随着pomc上调限制了对黄粉虫粉饲

料的摄食，这也表明草鱼对黄粉虫粉饲料的摄食是受

到上述基因的调控。因此，黄粉虫粉和豆粕蛋白源在

很大程度上影响了草鱼脑组织中摄食因子相关基因

的表达进而调节了其摄食行为。

4 结论

饲料蛋白源类型和蛋白质水平能够影响草鱼的

摄食、生长、嗅觉电信号幅度和部分摄食基因的表达，

且二因子之间存在交互作用。通过摄食量、增重率、

嗅觉电信号幅度及蛋白质效率判定，黄粉虫粉作为单

一饲料蛋白源时对草鱼摄食和生长均产生负面影

响。与豆粕饲料相比，黄粉虫粉饲料下调了 npy 和

agrp的表达量，且上调了pomc的表达量，导致草鱼的

食欲抑制。这些结果表明黄粉虫粉作为草鱼饲料的

蛋白质源时应谨慎操作，尤其不宜作为单一蛋白源在

草鱼饲料中使用。

参考文献

[1] GASCO L, HENRY M, PICCOLO G, et al. Tenebrio molitor meal

in diets for European sea bass (Dicentrarchus labrax L.) juveniles:

growth performance, whole body composition and in vivo apparent

digestibility[J]. Animal Feed Science and Technology, 2016, 220:

34-45.

[2] PANINI R L, FREITAS L E L, GUIMARÃES A M, et al. Poten⁃

tial use of mealworms as an alternative protein source for pacific

white shrimp: digestibility and performance[J]. Aquaculture, 2017,

473: 115-120.

[3] RONCARATI A, GASCO L, PARISI G, et al. Growth performance

of common catfish (Ameiurus melas Raf.) fingerlings fed insect

meal diets[J]. Journal of Insects as Food and Feed, 2015, 1: 233-

240.

[4] ELAHI U, WANG J, MA Y, et al. Evaluation of yellow mealworm

meal as a protein feedstuff in the diet of broiler chicks[J]. Ani⁃

mals, 2020, 10: 224.

[5] 文远红, 黄燕华, 王国霞, 等. 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼抗氧化

指标、消化酶活性及前肠、肝胰脏组织结构的影响[J]. 饲料工

业, 2015, 36: 29-35.

[6] IACONISI V, BONELLI A, PUPINO R, et al. Mealworm as di⁃

etary protein source for rainbow trout: body and fillet quality traits

[J]. Aquaculture, 2018, 484: 197-204.

[7] SANKIAN Z, KHOSRAVI S, KIM Y-O, et al. Effects of dietary

inclusion of yellow mealworm (Tenebrio molitor) meal on growth

performance, feed utilization, body composition, plasma biochemi⁃

cal indices, selected immune parameters and antioxidant enzyme

activities of mandarin fish (Siniperca scherzeri) juveniles[J]. Aqua⁃

culture, 2018, 496: 79-87.

[8] LIANG X, HAN J, XUE M, et al. Growth and feed intake regula⁃

tion responses to anorexia, adaptation and fasting in Japanese sea⁃

bss, Lateolabrax japonicas when fishmeal is totally replaced by

plant protein[J]. Aquaculture, 2019, 498: 528-538.

79

水 产 动 物 2023年第44卷第10期 总第679期

[9] GOMES E F, REMA P, KAUSHIK S J. Replacement of fish meal

by plant proteins in the diet of rainbow trout (Oncorhynchus

mykiss): digestibility and growth performance[J]. Aquaculture,

1995, 130: 177-186.

[10] EL- SAIDY DMSD, GABER MMA. Replacement of fish meal

with a mixture of different plant protein sources in juvenile Nile

tilapia, Oreochromis niloticus (L.) diets[J]. Aquaculture Research,

2003, 34: 1119-1127.

[11] WANG C, ZHU X, HAN D, et al. Responses to fishmeal and soy⁃

bean meal-based diets by three kinds of larval carps of different

food habits[J]. Aquaculture Nutrition, 2015, 21: 552-568.

[12] KRISTENSEN P, JUDGE M E, THIM L, et al. Hypothalamic

CART is a new anorectic peptide regulated by leptin[J]. Nature,

1998, 393: 72-76.

[13] WINBERG S, LEPAGE O. Elevation of brain 5- HT activity,

POMC expression, and plasma cortisol in socially subordinate

rainbow trout[J]. American Journal of Physiology, 1998, 274:

R645-654.

[14] ZHOU Y, LIANG X-F, YUAN X, et al. Neuropeptide Y stimu⁃

lates food intake and regulates metabolism in grass carp, Cteno⁃

pharyngodon idellus[J]. Aquaculture 2013, 380-383: 52-61.

[15] LIANG X, YU X, HAN J, et al. Effects of dietary protein sourc⁃

es on growth performance and feed intake regulation of grass

carp (Ctenopharyngodon idellus) [J]. Aquaculture, 2019, 510:

216-224.

[16] RUBIO V C, SÁNCHEZ- VÁZQUEZ F J, MADRID J A. Fish

macronutrient selection through post- ingestive signals: effect of

selective macronutrient deprivation[J]. Physiology & Behavior,

2005, 84: 651-657.

[17] WHITE B D, PORTER M H, MARTIN R J. Effects of age on

the feeding response to moderately low dietary protein in rats[J].

Physiology & Behavior, 2000, 68: 673-681.

[18] YU H, WANG X, KONG F, et al. The attractive effects of amino

acids and some classical substances on grass carp (Ctenopharyn⁃

godon idellus) [J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2021, 47:

1489-1505.

[19] ABDEL-TAWWAB M, AHMAD MH, KHATTAB YAE, et al. Ef⁃

fect of dietary protein level, initial body weight, and their interac⁃

tion on the growth, feed utilization, and physiological alterations

of Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.) [J]. Aquaculture, 2010,

298: 267-274.

[20] SEVGILI H, HOŞSU B, EMRE Y, et al. Compensatory growth af⁃

ter various levels of dietary protein restriction in rainbow trout,

Oncorhynchus mykiss[J]. Aquaculture, 2012, 344-349: 126-134.

[21] 王胜. 草鱼幼鱼蛋白质和主要必需氨基酸需求的研究[D]. 博士

学位论文. 广州: 中山大学，2006.

[22] JIANG S, WU X, LUO Y, et al. Optimal dietary protein level

and protein to energy ratio for hybrid grouper (Epinephelus fus⁃

coguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂) juveniles[J]. Aquacul⁃

ture, 2016, 465: 28-36.

[23] BASTO- SILVA C, ENES P, OLIVA- TELES A, et al. Dietary

protein source and protein/carbohydrate ratio affects appetite reg⁃

ulation- related genes expression in gilthead seabream (Sparus

aurata)[J]. Aquaculture, 2021, 533: 736142.

[24] LØKKEBORG S, SIIKAVUOPIO S I, HUMBORSTAD O-B, et

al. Towards more efficient longline fisheries: fish feeding behav⁃

iour, bait characteristics and development of alternative baits[J].

Reviews in Fish Biology and Fisheries, 2014, 24: 985-1003.

[25] LIANG X F, HU L, DONG Y C, et al. Substitution of fish meal

by fermented soybean meal affects the growth performance and

flesh quality of Japanese seabass (Lateolabrax japonicus)[J]. Ani⁃

mal Feed Science and Technology, 2017, 229: 1-12.

[26] HASSENKLÖVER T, PALLESEN L P, SCHILD D, et al. Amino

acid- vs. peptide-odorants: responses of individual olfactory re⁃

ceptor neurons in an aquatic species[J]. PLoS One, 2012, 7:

e53097.

[27] SEO H, KIM H R, CHO I H. Aroma characteristics of raw and

cooked Tenebrio molitor larvae (mealworms)[J]. Food Science of

Animal Resource, 2020, 40: 649-658.

[28] BARROSO F G, DE HARO C, SÁNCHEZ-MUROS M-J, et al.

The potential of various insect species for use as food for fish[J].

Aquaculture, 2014, 422-423: 193-201.

[29] MORAIS S. The physiology of taste in fish: potential implica⁃

tions for feeding stimulation and gut chemical sensing[J]. Re⁃

views in Fisheries Science & Aquaculture, 2017, 25: 133-149.

[30] DA SILVA R F, KITAGAWA A, SÁNCHEZ VÁZQUEZ F J. Di⁃

etary self-selection in fish: a new approach to studying fish nutri⁃

tion and feeding behavior[J]. Reviews in Fish Biology and Fisher⁃

ies, 2016, 26: 39-51.

[31] SOENGAS J L, CERDÁ-REVERTER J M, et al. Central regula⁃

tion of food intake in fish: an evolutionary perspective[J]. Journal

of Molecular Endocrinology, 2018, 60: R171-R199.

[32] CAI W, LIANG X F, YUAN X, et al. Different strategies of

grass carp (Ctenopharyngodon idella) responding to insufficient

or excessive dietary carbohydrate[J]. Aquaculture, 2018, 497:

292-298.

[33] CHAUMONTET C, EVEN P C, SCHWARZ J, et al. High dietary

protein decreases fat deposition induced by high-fat and highsucrose diet in rats[J]. British Journal of Nutrition, 2015, 114:

1132-1142.

[34] YUAN D, GAO Y, ZHANG X, et al. NPY and NPY receptors in

the central control of feeding and interactions with CART and

MC4R in Siberian sturgeon[J]. General and Comparative Endocri⁃

nology, 2019, 284: 113239.

[35] 方龙, 梁旭方, 何珊. 草鱼禁食后NPY与血糖变化及NPY重组

表达[J].暨南大学学报：自然科学与医学版, 2013, 34(5):533-

538.

[36] ALAM M S, LIANG X F, LIU L, et al. Growth and metabolic re⁃

sponse of Chinese perch to different dietary protein-to-energy ra⁃

tios in artificial diets[J]. International Journal of Molecular Sci⁃

ences, 2019, 20(23): 5983.

[37] 李明月, 高云红, 万金铭, 等. 黄条鰤幼鱼胃排空特征、消化酶

活性及摄食调控基因表达分析[J].水产学报，2021, 46(6): 1-

11.

[38] BERNIER N J, BEDARD N, PETER R E. Effects of cortisol on

food intake, growth, and forebrain neuropeptide Y and corticotro⁃

pin- releasing factor gene expression in goldfish[J]. General and

Comparative Endocrinology, 2004, 135: 230-240.

[39] HOSKINS L J, VOLKOFF H. The comparative endocrinology of

feeding in fish: Insights and challenges[J]. General and Compara⁃

tive Endocrinology, 2012, 176: 327-335.

（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

80

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

好食脉孢菌发酵麸皮产总阿魏酸工艺优化

及其抑菌效果初探

■ 韩向新1，2 牛腾云1 吕 冰1 王 宁1 高 佳1 辛嘉英3 陈书明1*

（1.山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801；2.山西省动物疫病预防控制中心，山西太原 030027；

3.哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076）

作者简介：韩向新，硕士，高级兽医师，研究方向为动物疫

病控制与净化。

*通讯作者：陈书明，教授，硕士生导师。

收稿日期：2023-03-09

基金项目：山西省重点研发计划项目[201903D221013]；

吕梁市重点研发项目[2020NYGG4]；山西省现代农业产业技

术体系建设专项[2022—2023]；山西农业大学横向科技项目

[2022HX124]

摘 要：为了提高麸皮中总阿魏酸的释放量，进而研发出具有替抗功能的麸皮发酵饲料，试验对

好食脉孢菌发酵麸皮产总阿魏酸的工艺进行了优化，比较分析了不同溶剂对总阿魏酸的提取效果，

检测了不同的总阿魏酸提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。结果表明：好食脉孢菌发酵

麸皮产总阿魏酸工艺参数优化组合为：在14 mL液体培养基中添加葡萄糖93.90 mg，尿素31.20 mg，

Mg2+ 1.60 mg。在100 mL烧杯中加入10 g麸皮和14 mL液体培养基，接种好食脉孢菌孢子悬液1.00 mL，

混匀，30 ℃发酵72 h后总阿魏酸的释放量为（1.18±0.02）mg/g，是未优化的2.9倍。以75%乙醇为提

取溶剂，发酵麸皮中总阿魏酸提取量达到（1.42±0.04）mg/g。用75%乙醇提取的总阿魏酸对金黄色葡

萄球菌抑菌效果较好，而用乙酸乙酯提取的总阿魏酸对大肠杆菌的抑菌效果较好。

关键词：好食脉孢菌；发酵；麸皮；阿魏酸；抑菌作用

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.10.013

中图分类号：S816.9 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）10-0081-07

Optimization of The Process for Total Ferulic Acids Production from Wheat Bran Fermented by

Neurospora sitophila and Study on Its Bacteriostasis

HAN Xiangxin1,2 NIU Tengyun1 LYU Bing1 WANG Ning1 GAO Jia1 XIN Jiaying3 CHEN Shuming1*

(1. College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Shanxi Taigu 030801, China;

2. Shanxi Provincial Animal Disease Control Center, Shanxi Taiyuan 030027, China; 3. Key Laboratory

for Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Heilongjiang Harbin 150076, China)

Abstract：In order to improve the release of total ferulic acid and develop a wheat bran fermented feed

with the function of alternative antibiotics, this study optimizated the technology for the fermented wheat

bran total ferulic acids production by Neurospora sitophila, and the extraction effect of total ferulic acids

by different solvents was compared and analyzed. Finally, the bacteriostatic effect of different extracts of

total ferulic acid on Escherichia coli and Staphylococcus aureus were tested. The results showed that the

optimal combination process for total ferulic acids production from wheat bran fermented by Neurospora

sitophila was: Glucose 93.90 mg, urea 31.20 mg, Mg2+ 1.60 mg were added into 14 mL liquid medium.

10 g of wheat bran and 14 mL of the liquid medium to 100 mL beaker, the inoculation amount of Neu⁃

rospora sitophila spore suspension was 1.00 mL,

mixed well. In this case, the total ferulic acids re⁃

lease was (1.18 ± 0.02) mg/g after 72 h of 30 ℃

fermentation, which was 2.9 times than that be⁃

fore optimization. With 75% ethanol as extraction

solvent, the total ferulic acid extraction from fer⁃

mented bran was (1.42±0.04) mg/g. The total feru⁃

lic acid extracted with 75% ethanol had better

bacteriostasis on Staphylococcus aureus, while the

total ferulic acid extracted with ethyl acetate had

81

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

据国家统计局统计，2022 年我国小麦产量为

1.36亿吨。麸皮是小麦加工为面粉后的副产物，年产

量约为2 700万吨[1]

。麸皮中含有蛋白质、脂肪、碳水

化合物以及酚酸类物质等，其中阿魏酸为主要酚酸

类物质[2-5]

。阿魏酸是肉桂酸的衍生物之一，它通过酯

键和醚键与木质素、纤维素和蛋白质等物质相连，形

成一种牢固的网状结构，从而使麸皮细胞壁变得坚

固[6]

。阿魏酸是一种广谱抑菌剂，具有降低胆固醇、抗

氧化和消炎等作用[7]

。有研究表明，阿魏酸可有效抑

制大肠杆菌和蜡状芽孢杆菌增殖，并且抑菌效果随着

阿魏酸浓度增大而增大[8]

。阿来·海拉希[9]

的研究表

明，阿魏酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢

杆菌均有一定程度的抑制作用。目前，阿魏酸常见

的提取方法有碱解法、酶水解法和微生物发酵法

等。张志清等[10]

用超声波辅助碱醇法提取阿魏酸，提

取量为4.48 mg/g。碱解法虽提取阿魏酸得率较高，但

试验后期需处理废液，对环境容易造成污染；酶水解

法成本较高，且耗时较长。而微生物发酵法不仅环境

污染小，而且阿魏酸释放量、生物利用度高，是提取阿

魏酸的常用方法[11]

。

好食脉孢菌又叫链孢霉、红色面包霉或串珠霉，

属于子囊菌的粪壳菌科、脉孢菌属[12]

，在自然界中普

遍存在，生长环境简单。好食脉孢菌为FDA认证的可

使用安全菌种，可分泌木聚糖酶（xylanase，Xyn）、阿魏

酸酯酶（ferulic acid esterase，FAE）等[13]

。而 Xyn 和

FAE等可分解麸皮细胞壁，从而使阿魏酸释放出来。

段睿等[14]

利用好食脉孢菌固态发酵醋糟，使Xyn酶活

达到 412.34 U/g。尹志娜[15]

用黑曲霉发酵麸皮，阿

魏酸释放量达到 416.60 μg/g。Mao 等[16]

用粪肠球菌

M2 固态发酵麸皮，使麸皮中阿魏酸释放量提高了

5.5倍。曹畅达等[17]

利用泡盛曲霉发酵麸皮，使游离阿

魏酸含量达到164.3 μg/g。鉴于上述研究中阿魏酸释

放量较低，本研究运用单因素试验、Box-Behnken试验

和响应面分析，优化了好食脉孢菌发酵麸皮产总阿魏

酸（total ferulic acid，TFA）的工艺，以期提高麸皮中

TFA的释放量。用不同溶剂提取好食脉孢菌发酵麸

皮中的TFA，并测定其抑菌效果，为麸皮合理利用提

供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

好 食 脉 孢 菌（Neurospora sitophila）、大 肠 杆 菌

（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus

aureus）由山西农业大学发酵工程实验室提供，麸皮由

太谷某面粉厂提供。

1.2 方法

好食脉孢菌发酵麸皮产TFA工艺优化及其抑菌

效果试验方法如图1所示。

1.2.1 培养基的制备

better antibacterial effect on Escherichia coli.

Key words：Neurospora sitophila; fermentation; wheat bran; ferulic acid; bacteriostasis

好食脉孢菌

麸皮

发酵

以TFA释放量为主要指标

以Xyn和FAE酶活为次要指标

单因素试验 Box-Behnken试验

及响应面分析

筛选TFA的

提取溶剂 获得麸皮TFA

提取液

抑菌试验 获得抑制大肠杆菌

和金黄色葡萄球菌

的TFA提取液

富含TFA的

发酵麸皮

产TFA工艺优化

图1 好食脉孢菌发酵麸皮产TFA工艺优化及其抑菌效果试验方法

好食脉孢菌斜面培养基、液体种子液培养基和孢

子悬液的制备参照许锡凯等[18]

的方法。

营养肉汤培养基的制备：蛋白胨10 g、牛肉粉3 g，

氯化钠 5 g，纯化水定容至 1 000 mL，调 pH 至（7.2±

0.2），121 ℃高压灭菌20 min。

1.2.2 指示菌液的制备

挑取活化好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌单菌落

于营养肉汤培养基中，37 ℃、160 r/min培养24 h。将

指示菌液稀释至106 CFU/mL，备用。

1.2.3 TFA释放量的动态测定

取10 g麸皮与14 mL水充分混匀，好食脉孢菌孢

子悬液（1.60×106 CFU/mL）接种量为1.00 mL，30 ℃发

酵144 h，每24 h测定麸皮中TFA释放量。

1.2.4 产TFA工艺优化

在100 mL烧杯中加入10 g麸皮和14 mL液体培

养基，在液体培养基中碳源、氮源、金属离子和表面活

82

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

性剂添加量分别为70.00、28.00、1.40、14.00 mg，好食

脉孢菌孢子悬液接种量为 1.00 mL、发酵温度 30 ℃，

发酵时间按照1.2.3最优结果。根据TFA释放量、Xyn

和FAE酶活对添加碳源、氮源、金属离子和表面活性

剂的种类进行单因素试验（见表1）。根据表2筛选出

对TFA释放量影响最显著的最佳碳源、氮源、金属离

子添加量。再以TFA释放量为响应值设置三因素三

水平Box-Behnken试验（见表3），筛选出最佳碳源、氮

源、金属离子的最优添加量。

表1 碳源、氮源、金属离子种类优化

因素

碳源

氮源

金属离子

表面活性剂

种类

麦芽糖

(NH4)2SO4

Mg2+

吐温80

淀粉

豆渣

Na+

植物油

葡萄糖

尿素

K+

EDTA

木糖

蛋白胨

Cu2+

SDS

蔗糖

豆粕

Zn2+

PGE800

表2 碳源、氮源、金属离子添加量优化（mg）

因素

葡萄糖

尿素

Mg2+

1

42.00

14.00

0.70

2

56.00

21.00

1.40

3

70.00

28.00

2.10

4

84.00

35.00

2.80

5

98.00

42.00

3.50

表3 Box-Behnken试验（mg）

水平

-1

0

1

因素A（葡萄糖）

70.00

84.00

98.00

因素B（尿素）

21.00

28.00

35.00

因素C（Mg2+

）

0.70

1.40

2.10

1.2.5 粗酶液的制备

称取5 g发酵好的麸皮置于50 mL纯化水中，用

玻璃棒不断搅拌，浸泡30 min后用四层纱布过滤，将浸

提液4 500 r/min离心15 min，其上清液即为粗酶液。

1.2.6 测定方法

TFA 标准曲线的制作和TFA 释放量的测定参照

孙晓明等[6]

的方法；Xyn 酶活的测定参照高佳[19]

的方

法；FAE酶活的测定和去淀粉麦麸（DSWB）的制作参

照李干[20]

和王萍等[21]

的方法。

1.2.7 TFA的提取与抑菌试验

以未发酵麸皮为对照组，将50 mL的45 ℃热水、

80%甲醇、乙酸乙酯、乙酸乙酯?乙醇（1?1）、乙酸乙

酯?乙醚（1?1）、75%乙醇、80%乙醇、85%乙醇、90%

乙醇、95%乙醇分别加入到5 g发酵麸皮中，45 ℃提取

2 h，反复萃取3次后于4 500 r/min离心15 min，浓缩

后即得TFA提取液。用无水乙醇溶解TFA提取液为

10 mg/mL的溶液。再用打孔器将无菌滤纸片制成直

径为6 mm的药敏片，在小试管内用TFA提取液浸泡

2 min，待晾干后即可。取100 μL指示菌液均匀涂布

于营养琼脂培养基上，静置1 h后用镊子将药敏片均

匀贴于培养基上，37 ℃培养 24 h 后用游标卡尺测量

抑菌圈直径。

1.2.8 数据处理

采用SPSS 22.0进行单因素方差分析和Duncan′s

多重比较，采用Design-Expert 12.0设计Box-Behnken

试验，采用Origin 2022作图。

2 结果与分析

2.1 TFA释放量动态测定

根据文献测得 TFA 标准曲线方程为 y=88.19x，

R2

=0.99。由图2可知，好食脉孢菌发酵麸皮产TFA释

放量随发酵时间增多而增多，并在 72 h 时达到最高

峰，为0.41 mg/g，在此之后TFA释放量随发酵时间增

多而减少。 TFA释放量(mg/g)

0 20 40 60 140

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0 80 100 120

发酵时间(h)

图2 TFA释放量动态测定

2.2 单因素试验

由表4可知，添加麦芽糖和葡萄糖对Xyn酶活和

FAE酶活影响最显著，酶活分别为1 057.57、1.51 U/g；添

加葡萄糖对TFA释放量影响最显著，为0.65 mg/g，所以

确定葡萄糖为最佳碳源。由表 5 可知，添加尿素对

Xyn 酶活、FAE 酶活和 TFA 释放量影响最显著，分别

为1 511.12 U/g、3.51 U/g、1.03 mg/g，所以确定尿素为

最佳氮源。由表6可知，添加Mg2+

对Xyn酶活、FAE酶

活和 TFA 释放量影响最显著，分别为 1 700.67 U/g、

4.73 U/g、1.12 mg/g，所以确定Mg2+

为最佳金属离子。由

表7可知，添加表面活性剂会降低Xyn酶活、FAE酶活和

TFA释放量，所以在液体培养基中不应添加表面活性剂。

2.3 最佳碳源、氮源、金属离子的添加量确定

由表 8~10 可知，TFA 释放量随着葡萄糖、尿素、

Mg2+

添加量增大而增大，在葡萄糖、尿素和Mg2+

添加量

为 84.00、28.00、1.40 mg 时，TFA 释放量达到峰值，分

别为0.66、1.02、1.12 mg/g，此后TFA释放量开始下降。

83

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

表4 添加碳源对Xyn酶活、FAE酶活和TFA释放量的影响

碳源

对照组

麦芽糖

淀粉

葡萄糖

木糖

蔗糖

Xyn酶活(U/g)

750.81±20.57e

1 057.57±7.44a

850.28±5.61c

960.70±22.25b

843.67±42.61cd

825.21±20.17d

FAE酶活(U/g)

0.71±0.02d

1.09±0.07b

1.08±0.05b

1.51±0.07a

0.97±0.05c

1.08±0.06bc

TFA释放量(mg/g)

0.41±0.03d

0.57±0.01ab

0.54±0.02c

0.65±0.02a

0.48±0.01c

0.56±0.01bc

注：同列数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含

有相同字母表示差异不显著（P>0.05）；表5、表6、表7同。

表5 添加氮源对Xyn酶活、FAE酶活和TFA释放量的影响

氮源

对照组

(NH4)2SO4

豆腐渣

尿素

蛋白胨

豆粕

Xyn酶活(U/g)

950.33±23.85c

1 157.27±74.21b

965.27±55.08c

1 511.12±82.11a

1 183.27±77.02b

1 256.23±60.45b

FAE酶活(U/g)

1.43±0.09d

1.96±0.08c

1.38±0.06d

3.51±0.07a

2.97±0.01b

1.98±0.06c

TFA释放量(mg/g)

0.61±0.01e

0.87±0.01b

0.63±0.01d

1.03±0.03a

0.83±0.01c

0.76±0.02c

表6 添加金属离子对Xyn酶活、FAE酶活和TFA释放量的影响

金属离子

对照组

Mg2+

Na+

K+

Cu2+

Zn2+

Xyn酶活(U/g)

1 559.21±84.11bc

1 700.67±44.08a

1 167.37±55.08d

1 485.48±72.64c

1 237.68±97.72d

1 253.21±90.86d

FAE酶活(U/g)

3.67±0.38c

4.73±0.10a

3.67±0.07c

3.33±0.08b

3.02±0.03d

2.43±0.02d

TFA释放量(mg/g)

1.01±0.03b

1.12±0.03a

0.87±0.01cd

1.00±0.03b

0.94±0.02bc

0.78±0.01d

2.4 Box-Behnken响应面优化试验

根据以上试验，选取葡萄糖（A）、尿素（B）、Mg2+

（C）进行 Box-Behnken 试验设计，试验结果见表 11。

利用Design-Expert 12.0软件对表11进行多元回归拟

合，得到TFA释放量（Y）对编码自变量A、B、C的二次

多项回归方程。

Y=1.14+0.043A+0.02B+0.02AC+0.04BC-0.003 5

A2

-0.059B2

-0.084C2

由表12分析可知，模型P<0.01，表明模型对试验

结果具有极显著的影响，模型具有可信度。失拟项P

值为0.52（P>0.05），表明模型选择恰当。该模型的决

定系数 R2

=0.945 9、调整决定系数 R2

Adj=0.876 4，表明

该模型的拟合程度好，预测值和试验值之间的相关性

好、误差小、可信度高。变异系数CV=2.26%，表明该

试验的重复性较好，结果较精确。由此可见，该模型

是可靠的，可用于好食脉孢菌发酵麸皮产TFA的培养

基配方优化的理论预测。

从模型回归系数显著性检验可知，影响TFA释放

量（Y）的3个因素作用大小排序为：A>B>C。BC对响应

值有交互作用，为了进一步探究B、C交互作用对TFA

释放量影响，利用Design-Expert 12.0软件绘制了响应

面图（如图3）。由图3a可知，当固定葡萄糖添加量为

93.90 mg时，TFA释放量随尿素添加量和Mg2+

添加量

增加而增多，到达中心点后逐渐降低。由图3b可知，

尿素添加量与Mg2+

添加量的交互作用是显著的。

表面活性剂

对照

吐温80

植物油

乙二胺四乙酸

十二烷基硫酸钠

PEG800

Xyn酶活(U/g)

1 711.26±44.68a

1 434.67±44.08bc

1 583.67±73.16ab

1 285.48±72.64c

1 371.33±87.85c

1 473.16±63.05bc

FAE酶活(U/g)

5.03±0.12a

4.67±0.26b

3.15±0.22b

2.12±0.11c

2.25±0.32c

2.19±0.13c

TFA释放量(mg/g)

1.12±0.02a

0.83±0.04c

1.02±0.07b

0.97±0.03c

0.91±0.02c

0.90±0.03c

表7 添加表面活性剂对Xyn酶活、FAE酶活和TFA释放量的影响

葡萄糖添加量(mg)

TFA释放量(mg/g)

42.00

0.52±0.03d

56.00

0.57±0.01c

70.00

0.61±0.01b

84.00

0.66±0.02a

98.00

0.61±0.02b

表8 葡萄糖添加量对TFA释放量的影响

注：同行数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同字母表示差异不显著（P>0.05）；下表同。

尿素添加量(mg)

TFA释放量(mg/g)

14.00

0.91±0.01d

21.00

0.97±0.01bc

28.00

1.02±0.04a

35.00

0.98±0.02b

42.00

0.94±0.01c

表9 尿素添加量对TFA释放量的影响

Mg2+

添加量(mg)

TFA释放量(mg/g)

0.70

0.98±0.01b

1.40

1.12±0.03a

2.10

0.90±0.01c

2.80

0.90±0.01c

3.50

0.82±0.01e

表10 镁离子添加量对TFA释放量的影响

84

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

表11 Box-Behnken试验设计及响应值

组别

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

葡萄糖(A)

-1

0

-1

1

1

0

0

0

1

0

0

0

0

-1

0

-1

1

尿素(B)

1

0

0

0

1

0

1

0

-1

0

1

0

-1

-1

-1

0

0

Mg2+

(C)

0

0

1

1

0

0

-1

0

0

0

1

0

1

0

-1

-1

-1

TFA释放量（mg/g）

1.05

1.12

1.00

1.10

1.16

1.12

0.97

1.14

1.11

1.18

1.06

1.15

0.95

1.00

1.02

1.05

1.07

2.5 最优配方参数的确定与验证

根据2.4 Box-Behnken响应面优化试验建立的回

归模型，预测出好食脉孢菌发酵麸皮产TFA工艺优化

参数组合为：在10 g麸皮中添加14 mL液体培养基，

在添加的液体培养基中，葡萄糖添加量为 93.90 mg，

尿素为31.20 mg，Mg2+

为1.60 mg，在此条件下TFA 释

放量预测值为（1.17±0.02）mg/g。经过3次平行验证

试验后测得 TFA 释放量为（1.18±0.02 ）mg/g，与预测

值没有显著差异（P>0.05），从而验证了该模型及优化

工艺参数的可靠性。

好食脉孢菌发酵麸皮工艺优化前 TFA 释放量

为（0.41 ± 0.01）mg/g，优化后 TFA 释放量为（1.18 ±

0.02）mg/g，是未优化的2.9倍，两组数据差异极显著

（P<0.01）。 Mg2+(mg)

21.00

2.10

1.90

1.70

1.50

1.30

1.10

0.90

0.70

B：尿素(mg)

TFA释放量(mg/g)

23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.00

（b）尿素添加量与Mg2+

添加量交互作用的等高线图

27.00

1.15

TFA释放量(mg/g)

2.10

1.20

1.10

1.05

1.00

0.95

0.90

1.901.701.501.301.10

0.70 21.00

25.00 23.00

29.00

C：Mg2+

(mg) B：尿素(mg) 0.90

31.0033.00

（a）尿素添加量与Mg2+

添加量交互作用的响应面

35.00

图3 尿素与Mg2+

交互作用

参数

模型

A

B

C

AB

AC

BC

A2

B2

C2

残差

失拟项

纯误差

总误差

平方和

0.072 0

0.015 0

0.003 2

1.388e-17

1.388e-17

0.001 6

0.006 4

0.000 1

0.014 0

0.029 0

0.004 1

0.001 7

0.002 5

0.076 0

自由度

9

1

1

1

1

1

1

1

1

1

7

3

4

16

均方

0.008 0

0.015 0

0.003 2

1.388e-17

1.388e-17

0.001 6

0.006 4

0.000 1

0.014 0

0.029 0

0.000 6

0.000 5

0.000 6

F值

13.610 0

24.490 0

5.420 0

2.352e-14

2.352e-14

2.710 0

10.850 0

0.087 0

24.420 0

49.760 0

0.880 0

P值

0.001 2

0.001 7

0.053 0

1.000 0

1.000 0

0.140 0

0.013 0

0.780 0

0.001 7

0.000 2

0.520 0

显著性

**

**

*

**

**

表12 回归模型方差分析

注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。

2.6 TFA的提取与抑菌试验

由图 4a 可知，用 75%乙醇提取好食脉孢菌发酵

麸皮中TFA效果最佳，为（1.42±0.04）mg/g。由图4b、

c可知，用乙酸乙酯提取的TFA对大肠杆菌的抑菌效

85

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

果最显著，用75%乙醇提取的TFA对金黄色葡萄球菌

抑菌效果最好，抑菌圈直径分别为（9.92±0.13）mm和

（9.28±0.14）mm。

3 讨论

阿魏酸由于具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗糖

尿病等作用，已经被广泛地应用于制药、食品和化妆

品行业[22-23]

。张康逸等[24]

研究表明，阿魏酸能抑制大

肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌，并且抑

菌能力随阿魏酸浓度增加而增强。麸皮中的阿魏酸

通过酯键和醚键与纤维素等物质交联，而Xyn和FAE

能水解酯键和醚键，从而将麸皮细胞壁中的阿魏酸释

放出来[25-26]

。由于动物体内缺少这两种酶，所以阿魏

酸在动物体内很难释放出来并发挥其功效。好食脉

孢菌为美国FDA认证的安全菌种，已广泛存在于自然

界，并且生长要求简单、繁殖速度快、安全、无毒，具有

产生 Xyn、FAE 和蛋白酶等优点[27]

。孙轶男[28]

优化了

好食脉孢菌发酵麸皮产类胡萝卜素工艺，优化后类胡

萝卜素产量达到147.38 μg/g。

为提高麸皮中TFA的释放量，本试验首先确定好

食脉孢菌在发酵麸皮72 h时TFA释放量最高，在此之

后TFA释放量降低，这可能是因为在好食脉孢菌在发

酵初期可利用的营养物质和分泌的酶较多。但随着

发酵时间延长，好食脉孢菌可利用营养物质减少，菌

种老化以及分泌的酶减少，使TFA释放量降低[29]

。李

干[20]

的研究表明，微生物可直接利用有机氮源中的游

离氨基酸，所以相比于无机氮源，有机氮源更适合微

生物生长。Sharma等[30]

的研究表明，Enterococcus lac⁃

tis SR1深层发酵麸皮产FAE最多，经发酵工艺优化后

FAE提高了1.5倍。因此，本试验在麸皮中额外添加

碳源、氮源、金属离子以及表面活性剂，结果表明，好

食脉孢菌发酵麸皮产 TFA 工艺参数优化组合为：在

100 mL烧杯中加入10 g麸皮和14 mL液体培养基，在

注：柱标含有不同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）。

图4 TFA的提取与抑菌试验

TFA释放量(mg/g)

45 ℃热水

1.80

1.60

1.40

1.20

1.00

0.80

0.60

0.40

0.20

0.00

80%甲醇

乙酸乙酯

乙酸乙酯?乙醇

乙酸乙酯?乙醚

75%乙醇

80%乙醇

90%乙醇

85%乙醇

95%乙醇

未发酵

好食脉孢菌发酵

e

ef

cde

c d c d a b bc c c

b

c

a

def

g

f

g

cd

提取溶剂

（a）不同提取溶剂对TFA提取效果的影响

抑菌圈直径(mm)

45 ℃热水

10

8

6

4

2

0

80%甲醇

乙酸乙酯

乙酸乙酯?乙醇

乙酸乙酯?乙醚

75%乙醇

80%乙醇

90%乙醇

85%乙醇

95%乙醇

未发酵

好食脉孢菌发酵

b

cd

c d a b c

c d

b

f

a

cd e f

提取溶剂

（b）TFA提取液对大肠杆菌的抑菌效果

抑菌圈直径(mm)

45 ℃热水

10

8

6

4

2

0

80%甲醇

乙酸乙酯

乙酸乙酯?乙醇

乙酸乙酯?乙醚

75%乙醇

80%乙醇

90%乙醇

85%乙醇

95%乙醇

未发酵

好食脉孢菌发酵

c d

bc bc bc b bc

b

de

a

g a

de

f e

bc

提取溶剂

（c）TFA提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

86

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

液体培养基中，葡萄糖添加量为 93.90 mg，尿素为

31.20 mg，Mg2+

为 1.60 mg，好食脉孢菌孢子悬液接种

量为1.0 mL，30 ℃发酵72 h，在此条件下麸皮TFA的

释放量为（1.18±0.02）mg/g，是未优化的2.9倍。其中

Mg2+

可能因为充当了酶蛋白的辅助因子才提高了酶

的活性，而表面活性剂会降低Xyn和FAE酶活。

研究表明，提取溶剂极性的大小影响着阿魏酸的

溶解度和Xyn、FAE的稳定性[31]

。极性过大会使酶活

下降，极性过小不易溶解阿魏酸，而中等极性的提

取溶剂既能保证酶的稳定性，又能较好地溶解阿魏

酸[32]

。本试验结果表明，TFA的最佳提取溶剂为75%

乙醇，其提取量为（1.42±0.04）mg/g，用乙酸乙酯提取

的TFA对大肠杆菌的抑菌效果最显著，用75%乙醇提

取的TFA对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直

径分别为（9.92±0.13）mm和(9.28±0.14) mm。但TFA

提取液中抑菌活性成分及其抑菌机制还有待进一步

研究。

4 结论

本研究特色及意义在于利用单因素试验、BoxBehnken试验及响应面分析优化了好食脉孢菌发酵廉

价麸皮产TFA工艺。好食脉孢菌发酵麸皮产TFA工

艺参数优化组合为：在14 mL液体培养基中添加葡萄

糖 93.90 mg，尿素 31.20 mg，Mg2+

1.60 mg。在 100 mL

烧杯中加入10 g麸皮和14 mL液体培养基，接种好食

脉孢菌孢子悬液1.00 mL，混匀，30 ℃发酵72 h后总阿

魏酸的释放量为（1.18±0.02）mg/g，是未优化的2.9倍。

TFA 的最佳提取溶剂为 75%乙醇，提取量为（1.42±

0.04）mg/g，用乙酸乙酯提取的TFA 对大肠杆菌的抑

菌效果最显著，用75%乙醇提取的TFA对金黄色葡萄球

菌抑菌效果最好，抑菌圈直径分别为（9.92±0.13）mm和

（9.28±0.14）mm，这为后续利用廉价麸皮开发具有替

抗功能的麸皮发酵饲料奠定了基础。

参考文献

[1] 安济山, 刘宽博, 王永伟, 等. 发酵麦麸的营养特性及其在畜禽

生产中的应用[J]. 动物营养学报, 2020, 32(7): 3064-3071.

[2] 包成龙, 许晓燕, 刘博文. 小麦麸皮营养成分和综合利用[J]. 粮

食与油脂, 2014, 27(8): 58-60.

[3] 丁岩, 唐世云, 侯汉学, 等. 小麦麸皮中酚酸提取方法的研究[J].

中国食物与营养, 2012, 18(6): 52-58.

[4] 孙元琳, 崔璨, 顾小红, 等. 黑小麦麸皮酚酸物质的定性分析与

阿魏酸含量测定[J]. 中国粮油学报, 2014, 29(11): 113-117.

[5] 王淑芳, 董飞, 王刚, 等. 小麦酚酸提取工艺优化及产区与品种

差异对酚酸含量的影响[J]. 食品科学, 2019, 40(22): 306-312.

[6] 孙晓明, 辛嘉英, 王艳, 等. 微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿

魏酸研究概述[J]. 食品研究与开发, 2019, 40(1): 201-206.

[7] 刘洋, 戴求仲, 黄兴国, 等. 阿魏酸的生物学功能及其在畜禽生

产上的应用[J]. 动物营养学报, 2020, 32(12): 5524-5531.

[8] 赵利利, 李志田, 李彬彬, 等. 阿魏酸对大肠杆菌和蜡状芽孢杆

菌产组胺的影响[J]. 食品工业科技, 2018, 39(8): 113-118.

[9] 阿来·海拉希. 新疆阿魏中阿魏酸的提取纯化、结构修饰及生物

活性研究[D]. 硕士学位论文. 乌鲁木齐: 新疆师范大学, 2018:

47-49.

[10] 张志清, 吕晓飞, 姚艳艳, 等. 响应面法优化超声波辅助提取麦

麸中阿魏酸[J]. 中国粮油学报, 2010, 25(9): 76-81.

[11] ANSON N M, SELINHEIMO E, HAVENAAR R, et al. Biopro⁃

cessing of wheat bran improves in vitro bioaccessibility and co⁃

lonic metabolism of phenolic compounds[J]. Journal of Agricultur⁃

al & Food Chemistry, 2009, 57(14): 6148-6155.

[12] 张瑜. 好食脉孢菌固态发酵转化玉米秸秆的研究[D]. 硕士学位

论文. 太谷: 山西农业大学, 2018.

[13] DENG Y P, LIU X L, KATROLIA P, et al. A dual-function chy⁃

motrypsin- like serine protease with plasminogen activation and

fibrinolytic activities from the GRAS fungus, Neurospora sitophila

[J]. International Journal of Biological Macromolecules: Struc⁃

ture, Function and Interactions, 2018, 109: 1338-1343.

[14] 段睿, 邓永平, 刘晓兰, 等. 好食脉孢菌固态发酵醋糟产木聚糖

酶的工艺优化[J]. 食品与机械, 2019, 35(10): 214-222.

[15] 尹志娜. 小麦麸皮固态发酵过程中活性成分释放的机理研究

[D]. 博士学位论文. 广州: 华南理工大学, 2018.

[16] MAO M, WANG P, SHI K, et al. Effect of solid-state fermenta⁃

tion by Enterococcus faecalis M2 on antioxidant and nutritional

properties of wheat bran[J]. Journal of Cereal Science, 2020, 94:

102997.

[17] 曹畅达, 方一铭, 黄兴, 等. 麦麸发酵条件的优化及其多酚提取

物的抗氧化活性研究[J]. 工业微生物, 2022, 52(2): 25-29.

[18] 许锡凯, 辛嘉英, 孙轶男, 等. 好食脉胞菌发酵过程中酶活性变

化对麸皮阿魏酸释放的影响[J]. 饲料研究, 2019, 42(7): 72-77.

[19] 高佳. 黑曲霉发酵产酶与酶解麸皮产总阿魏酸的工艺优化及其

抗菌活性检测[D]. 硕士学位论文. 太谷: 山西农业大学, 2021.

[20] 李干. 产阿魏酸酯酶菌筛选、培养条件及酶学性质研究[D]. 硕

士学位论文. 南京: 南京林业大学, 2011.

[21] 王萍, 葛丽花, 夏德安. 酶解麦麸制备阿魏酸低聚糖的研究[J].

中国粮油学报, 2008(1): 152-156.

[22] GONG L, WANG H, WANG T, et al. Feruloylated oligosaccha⁃

rides modulate the gut microbiota in vitro via the combined ac⁃

tions of oligosaccharides and ferulic acid[J]. Journal of Function⁃

al Foods, 2019, 60: 103453.

[23] ZDUNSKA K, DANAA, KOLODZIEJCZAK A, et al. Antioxidant

properties of ferulic acid and its possible application[J]. Skin

Pharmacology and Physiology, 2018, 31(6): 332-336.

[24] 张康逸, 杨徐宁, 许国震, 等. 青麦仁麸皮中阿魏酸的抗氧化性

和抑菌活性研究[J]. 包装与食品机械, 2021, 39(5): 27-34.

[25] 宋微, 辛嘉英, 路雪纯, 等. 小麦中阿魏酸的分布、存在形式以及

制备方法的研究进展[J]. 食品工业科技, 2022, 43(14): 445-452.

87

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

[26] 王秋月, 林美柔. 酶解处理提升谷物麸皮营养价值与功能的研

究进展[J]. 食品科技, 2022, 47(7): 155-159.

[27] 王倩倩. 红酵母和好食脉孢霉发酵糟渣产类胡萝卜素的研究

[D]. 硕士学位论文. 太谷: 山西农业大学, 2016.

[28] 孙轶男. 好食脉孢菌固态发酵麸皮产类胡萝卜素功能性饲料

[D]. 硕士学位论文. 哈尔滨: 哈尔滨商业大学, 2020.

[29] 姜晓阳, 胡迎芬, 郑靖义, 等. 混菌固态发酵花生粕的工艺优化

[J]. 食品工业科技, 2019, 40(22): 120-124.

[30] SHARMA A, SHARMA A, SINGH J, et al. A biorefinery ap⁃

proach for the production of ferulic acid from agroresidues

through ferulic acid esterase of lactic acid bacteria[J]. 3 Biotech,

2020, 10(8): 367.

[31] AARABI A, MIZANI M, HONARVAR M, et al. Extraction of fe⁃

rulic acid from sugar beet pulp by alkaline hydrolysis and organ⁃

ic solvent methods[J]. Journal of Food Measurement & Character⁃

ization, 2016, 10(1): 42-47.

[32] 何粉霞. 小麦麸皮中阿魏酸的提取、结构修饰及生物活性的研

究[D]. 硕士学位论文. 郑州: 河南工业大学, 2011.

（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

作者简介：李萌，硕士，研究方向为动物生理学、微生物学。

*通讯作者：孙志宏，教授，硕士生导师。

收稿日期：2023-03-03

摘 要：研究旨在探究百里香酚和植酸对猪源大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果，为进一步改善

猪舍环境和猪肠道功能研究提供参考。试验采用牛津杯法、二倍稀释法和平板涂布法，分别测定百

里香酚和植酸对两种猪源致病菌的抑菌圈直径、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的影

响。结果表明：猪源大肠杆菌和沙门氏菌对50 mg/mL百里香酚表现为高度敏感，对17.5%植酸表现

为极度敏感。百里香酚对猪源大肠杆菌MIC和MBC分别为1.56 mg/mL和3.12 mg/mL，对猪源沙门氏

菌MIC和MBC均为1.56 mg/mL；植酸对猪源沙门氏菌的抑制效果强于猪源大肠杆菌，对猪源大肠杆

菌MIC和MBC均为4.37%，对猪源沙门氏菌MIC和MBC均为2.18%。说明百里香酚和植酸对猪源大肠

杆菌和沙门氏菌具有较好的抑菌效果，在抑菌活性物质筛选中具备较好的应用前景。

关键词：百里香酚；植酸；猪腹泻；粪便；致病菌；抑菌效果

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.10.014

中图分类号：S852.61 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）10-0088-05

Study on The Bacteriostatic Effect of Thymol and Plytic Acid on Porcine Pathogenic Bacteria

LI Meng1 SUN Zhihong2*

(1. School of Life Sciences, Yan’an University, Shaanxi Yan’an 716000, China; 2. Shaanxi Regional

Biological Resources Conservation and Utilization Engineering and Technology Research Center, Shaanxi

Yan’an 716000, China)

Abstract：This experiment was conducted to study the antibacterial effect of thymol and phytic acid on

porcine Escherichia coil and Salmonella, so as to provide reference for further improvement of piggery en⁃

vironment and porcine intestinal function. Oxford Cup method, double dilution method and plate coating

method were used to determine the inhibitory zone diameter, minimum inhibitory concentration (MIC) and

minimum bactericidal concentration (MBC) of thymol and phytic acid against two kinds of porcine pathogen⁃

ic bacteria. The results showed that:Porcine E. coli and Salmonella were highly sensitive to 50 mg/mL thy⁃

mol and extremely sensitive to 17.5% phytic acid.

The MIC and MBC values of thymol against por⁃

cine E. coli were 1.56 mg/mL and 3.12 mg/mL, re⁃

spectively, while the MIC and MBC values of thy⁃

mol against porcine Salmonella were 1.56 mg/mL.

百里香酚和植酸对猪源致病菌的抑菌效果研究

■ 李 萌1 孙志宏2*

(1.延安大学生命科学学院，陕西延安 716000；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安 716000）

?????????????????????????????????????????????????????

88

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

随着现代畜牧业的发展，大多数地区养殖行业已

经形成集约化、规模化的养殖模式。大量未处理的畜

禽粪便及其废弃物的排放容易引起严重的水体污染、

土壤污染以及大气污染。猪粪便中有多种病原微生

物，其中大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等为

主要的致病性病原菌[1]

。有研究发现,作为条件致病

菌，粪便中的大肠杆菌和沙门氏菌都具有水平和垂直

传播的特点，一年四季均会发病且常发生两种菌混合

感染现象，不仅对养殖生产造成严重的经济损失,甚

至威胁人类的健康[2-3]

。由于抗生素的长期滥用，病原

菌的耐药性也越来越强[4]

，抑菌天然活性物质研究应

用变得关键，张坤等[5]

研究了植物精油在苹果病害病

原菌中的抑菌作用，发现陈皮精油、松树油、薄荷精

油、柠檬精油对黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌具

有抑制效果，植物源天然药物也可通过改变菌体细胞

膜通透性抑制生物膜的形成，影响蛋白质合成和遗传

物质来发挥抑菌作用[6]

。因此，天然植物抗菌物质的

筛选及开发利用越来越重要，合理使用天然活性物质

有利于调节动物肠道微生物菌群生态平衡，有效提高

动物的生产性能，也能达到改善生态环境的效果，且

具有无副作用、绿色安全等优点[7-8]

，具有良好的应用

前景。试验选取了酚类和有机酸类植物提取物，探究

其对猪源大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果，为进一步

猪肠道功能和改善猪舍环境研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

从腹泻猪的粪便中分离鉴定出猪源大肠杆菌和沙

门氏菌，由延安大学生命科学学院实验室分离鉴定。

1.1.2 主要试剂

LB琼脂培养基、LB肉汤培养基，均购自北京奥博

星生物有限公司；百里香酚、植酸（BR，70%）、二甲基

亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO），均购自上海源叶生

物科技有限公司；0.22 μm水系微孔滤膜，购自西安鑫

茂仪器设备有限公司。

1.1.3 主要试验仪器及设备

HPX-9162MBE电热恒温培养箱，购自上海博讯

实业有限公司医疗设备厂；MQD-B2R叠加式全温振

荡培养箱，购自上海晏泉仪器有限公司；HFsafe1200A2 生物安全柜，购自上海力申科学仪器有限公

司；GR110DA高压蒸汽灭菌锅，购自致微（厦门）仪器

有限公司；Multiskan Sky 酶标仪，市购；培养皿、牛津

杯，购自盐城市悦成贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物提取物和菌悬液的制备

百里香酚溶液的制备：称取一定量的百里香酚溶

于DMSO中，旋涡振荡混匀，配成100 mg/mL溶液，使

用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存，备用。

植酸溶液的制备：称取一定量的植酸溶于无菌水

中，旋涡振荡混匀，配成35%溶液，使用0.22 μm滤膜

过滤除菌，4 ℃保存，备用。

菌悬液的制备：把试验菌种先接种在LB琼脂培

养基平板上，37 ℃恒温培养24 h后挑取1个特征性菌

落，接种于10 mL的LB液体培养基中，37 ℃恒温培养

18 h；从该培养液中移取 100 μL 加到 10 mL 新鲜 LB

培养基中，继续37 ℃培养18 h，将细菌培养至对数生

长期，待用。

1.2.2 抑菌活性的测定

采用双层平板透明圈法，即取5 mL 高压灭菌的

LB 琼脂倒入层无菌培养皿，待凝固后迅速在平板上

放入4只灭菌过的牛津杯，接着加入混有试验菌的培

养基15 mL。待培养基凝固后取出牛津杯，分别向每

个孔中加入 100 μL 上述制备好的植物提取物溶液；

对照组分别为相同体积的 DMSO 和无菌水。将平板

置于 37 ℃恒温培养箱中培养 24 h，观察并测量抑菌

圈的直径，每个浓度做3次重复取平均值。

1.2.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定

参考贾睿等[9]

和Wang等[10]

的方法，以二倍等度稀

释96孔板法测定植物提取物对大肠杆菌和沙门氏菌

的MIC值。将两种细菌分别接种于LB液体培养基内，

37 ℃、200 r/min 条件下培养至对数期（OD600为 0.5），

取100 μL稀释好的植物提取物溶液与100 μL对数期

Phytic acid had stronger bacteriostatic effect on Salmonella than E. coli. The MIC and MBC of phytic ac⁃

id against porcine E. coli were 4.37%, and the MIC and MBC of phytic acid against porcine Salmonella

were 2.18%. In conclusion,thymol and phytic acid have good antibacterial effects on E. coli and Salmo⁃

nella from pigs and it has a good application prospect in screening bacteriostatic active substances.

Key words：thymol; phytic acid; pig diarrhea; feces; pathogenic bacteria; antibacterial effect

89

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

项目

100 mg/mL 百里香酚

50 mg/mL 百里香酚

17.5%植酸

8.75%植酸

大肠杆菌

抑菌圈直径（mm）

19.20±1.18

17.26±0.22

29.36±0.40

18.90±0.82

判定结果

高度敏感

高度敏感

极度敏感

高度敏感

沙门氏菌

抑菌圈直径（mm）

17.24±0.16

17.06±0.07

31.2±1.03

23.08±0.42

判定结果

高度敏感

高度敏感

极度敏感

极度敏感

表1 百里香酚和植酸对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌圈直径测定及影响

图1 百里香酚对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用

（a）大肠杆菌 （b）沙门氏菌

（a）大肠杆菌 （b）沙门氏菌

图2 植酸对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用

菌液，于96孔板内并混合均匀，37 ℃培养24 h，通过

酶标仪测定菌液 OD600，以没有菌体生长所对应的植

酸终质量浓度为MIC，每个处理设置3个重复。

1.2.4 最小杀菌浓度（MBC）的测定

采用琼脂培养基平板法，取MIC以上未见细菌生

长的孔内混合液于LB琼脂培养基上，均匀涂布，37 ℃

恒温培养箱中培养24 h，观察有无细菌生长，以不生长

菌落的平板所对应孔中的最低浓度为该药物的MBC。

1.3 数据的统计分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0对数据结果进行处

理，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 抑菌活性的测定

根据李美发等[11]

抑菌圈敏感判定标准：抑菌圈直

径≥20 mm，极度敏感；抑菌圈直径15~<20 mm，高度

敏感；抑菌圈直径10~<15 mm，中度敏感；抑菌圈直径

<10 mm，低度敏感。测定结果见表1及图1、图2。结

果表明，当百里香酚浓度为50 mg/mL时，对大肠杆菌

和沙门氏菌呈高度敏感。当植酸质量浓度为 17.5%

时，对大肠杆菌和沙门氏菌呈极度敏感；且随着植

酸浓度的升高，抑菌圈直径逐渐变大，抑菌效果越

加明显。

90

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

2.2 最低抑菌浓度的测定

百里香酚和植酸均具有一定的抑制效果，其中百里

香酚对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC值均为1.56 mg/mL，

植酸对大肠杆菌的 MIC 值为 4.37%，对沙门氏菌的

MIC 值为 2.18%，二者均表现出良好的抑菌活性，见

表2、表3。

百里香酚浓度（mg/mL）

大肠杆菌生长情况

沙门氏菌生长情况

0

+

+

0.78

+

+

1.56

+

-

3.12

-

-

6.25

-

-

12.5

-

-

25

-

-

表4 百里香酚对大肠杆菌和沙门氏菌的MBC

注：+为固体培养基菌体生长，-为固体培养基菌体不生长；下表同。

植酸质量浓度（%）

大肠杆菌生长情况

沙门氏菌生长情况

0

+

+

0.54

+

+

1.09

+

+

2.18

+

-

4.37

-

-

8.75

-

-

17.5

-

-

表5 植酸对大肠杆菌和沙门氏菌的MBC

表3 植酸对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC

植酸质量浓度（%）

大肠杆菌菌悬液浑浊情况

沙门氏菌菌悬液浑浊情况

0

+

+

0.54

+

+

1.09

+

+

2.18

+

-

4.37

-

-

8.75

-

-

17.50

-

-

注：+为肉眼可见菌液浑浊，-为肉眼可见菌液清晰。

2.3 最低杀菌浓度的测定

百里香酚对猪源大肠杆菌的MBC值为3.12 mg/mL，

对猪源沙门氏菌的 MBC 值分 1.56 mg/mL，植酸对猪

源大肠杆菌的 MBC 值为 4.37%，对猪源沙门氏菌的

MBC值为2.18%，见表4、表5。

3 讨论

在禽畜养殖环境出现卫生状况差、消毒不彻底、

空气流通不足等情况时，极易发生大肠杆菌病、沙门

氏菌单一或混合感染的情况[2]

。有研究表明，大肠埃

希氏菌属会造成动物的腹泻、呕吐、出血性结肠炎等

疾病，引发大规模的流行性疾病[12-13]

，其中断奶仔猪腹

泻也是影响我国生猪养殖业的重要疾病之一。沙门

氏菌与其他病原混合感染是现在生猪养殖的重要疾

病之一[14]

。胡心怡等[15]

研究发现，百里香酚与肉桂醛

可以通过破坏沙门氏菌细胞膜完整性，干扰其正常新

陈代谢使菌体死亡，二者协同作用可以有效抑制有害

微生物的生长。杨阳等[16]

采用百里香酚、肉桂醛和香

芹酚复配溶液处理大肠埃希氏菌，发现可破坏其细胞

壁、膜结构，造成内容物流失，细菌解体，达到抑菌效

果。百里香酚除了能够破坏菌体细胞膜结构，影响生

物膜、蛋白质形成和功能发挥抗菌作用外，还有增强

宿主免疫、间接调控肠道菌群的作用[17]

。另有研究表

明，百里香酚等植物精油和有机酸复配可以改善畜禽

肠道健康，提高动物生长性能[18]

。本试验中，一定浓

度的百里香酚对猪源大肠杆菌和沙门氏菌作用表现为

高度敏感，表明百里香酚具有较好的抑菌活性，确定其

对猪源大肠杆菌的MIC与MBC值分别为1.56 mg/mL

和 3.12 mg/mL，对猪源沙门氏菌 MIC 和 MBC 值均为

1.56 mg/mL。严欣茹等[19]

研究发现，复配酸化剂在一

定程度上能抑制大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌

的生长，酸化剂可作为禽畜饮用水消毒用品或在饮用

水和饲料中适量添加，有利于动物健康。有机酸可通

过自由扩散进入菌体，改变细胞内环境稳定，干扰正

常代谢，也会破坏菌体膜完整性，阻断生物大分子物

质的合成，抑制细菌生长[20]

。植酸具有较好的抑菌活

性，在食品保鲜添加方面已有应用研究[21-22]

，但在禽畜

百里香酚浓度（mg/mL）

大肠杆菌菌悬液浑浊情况

沙门氏菌菌悬液浑浊情况

0

+

+

0.78

+

+

1.56

-

-

3.12

-

-

6.25

-

-

12.5

-

-

25

-

-

表2 百里香酚对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC

注：+为肉眼可见菌液浑浊，-为肉眼可见菌液清晰。

91

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

养殖相关研究较少。侯伟峰等[23]

研究发现，植酸可以

破坏大肠杆菌细胞壁、细胞膜完整性，使菌体细胞质

外渗，使碱性磷酸酶含量和电导率增加，进一步抑制

菌体生长。高飞雄等[24]

研究发现，蒲公英植酸可通过

破坏沙门氏菌细胞膜结构，使内容物外泄和细胞凋

亡，且浓度越高抑制作用越强。本试验中，17.5%植酸

对两种菌表现为极度敏感，植酸对沙门氏菌的抑制作

用强于大肠杆菌，且随溶液浓度增加抑菌效果也增

强，这与已有研究结果一致。本试验中，确定了植酸

对猪源大肠杆菌的 MIC 和 MBC 值均为 4.37%，对猪

源沙门氏菌 MIC 和 MBC 值均为 2.18%，认为植酸对

猪源大肠杆菌和沙门氏菌均有较好的抑菌效果。抑

菌性天然植物提取物的筛选和应用对猪体健康生长

和发育具有重要意义，也对预防猪腹泻有积极作

用。植物提取物成分复杂，其单一成分或者多种成

分之间的相互作用及其可能存在的抑菌机制还有待

深入研究。

4 结论

综上所述，猪源大肠杆菌与沙门氏菌对百里香酚

和植酸都存在一定的敏感性，其中对 50 mg/mL 的百

里香酚表现为高度敏感，对17.5%植酸表现为极度敏

感；百里香酚对猪源大肠杆菌的 MIC 和 MBC 值分别

为1.56 mg/mL和3.12 mg/mL，对猪源大肠杆菌的MIC

和 MBC 值均为 1.56 mg/mL；植酸对猪源大肠杆菌的

MBC和MIC值均为4.35%，对猪源沙门氏菌的MBC和

MIC值均为2.18%。百里香酚和植酸天然植物提取物

均表现出良好的抑菌效果。

参考文献

[1] 张小华, 郭钦, 马爱军. 猪粪便中致病性病原菌检测与耐药性分

析[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2018(23): 121-124.

[2] 高强, 薛瑞林, 李守湖, 等. 鸡源大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴

定及耐药分析[J]. 中国兽药杂志, 2020, 54(11): 14-21.

[3] 赵学亮, 王斌, 苗永强, 等. 陕西地区羊源致病性大肠杆菌耐药

性分析与毒力基因检测[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(5): 1644-

1648.

[4] 刘艳红, 李颖, 吕淑霞. 沙门氏菌和大巷杆菌耐药性研究进展

[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2016(19): 88-90.

[5] 张坤, 张鹏九, 高越, 等. 7种植物精油对2种苹果病害病原菌的

抑菌活性[J]. 中国果树, 2022(5): 72-77, 83.

[6] 周凯仁, 李冰, 张继瑜. 植物源性天然药物抑菌机制的研究进展

[J]. 中兽医医药杂志, 2021, 40(2): 84-88.

[7] 刘欢, 肖苗, 贺小贤, 等. 植物精油对病原微生物抑菌作用和机

制的研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2021, 47(16): 278-282.

[8] 李元政, 胡文忠, 萨仁高娃, 等. 天然植物提取物的抑菌机理及

其在果蔬保鲜中的应用[J]. 食品与发酵工业, 2019, 45(14): 239-

244.

[9] 贾睿, 蔡丹, 葛思彤, 等. 红豆皮多酚提取物对两种致病菌的抑

菌活性及作用机理[J]. 食品科学, 2021, 42(23): 64-71.

[10] WANG Z, YANG Q, WANG X, et al. Antibacterial activity of

xanthan-oligosaccharide against Staphylococcus aureus via target⁃

ing biofilm and cell membrane[J]. International Journal of Biolog⁃

ical Macromolecules, 2020, 153: 539-544.

[11] 李美发, 陈作栋, 梁欢, 等. 单一中草药以及复方中草药体外抑

菌效果研究[J]. 饲料工业, 2019, 40(12): 22-26.

[12] 高强, 薛瑞林, 李守湖, 等. 鸡源大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴

定及耐药分析[J]. 中国兽药杂志, 2020, 54(11): 14-21.

[13] 刘亚丹, 左周, 秦军军, 等. 仔猪不同生长阶段粪便微生物多样

性分析[J]. 国外畜牧学: 猪与禽, 2020, 40(6): 22-29.

[14] 焦连国. 猪源沙门菌分离鉴定及鼠李糖乳杆菌预防断奶仔猪腹

泻效果研究[D]. 博士学位论文. 北京：中国农业大学, 2019.

[15] 胡心怡, 胡郁汉, 潘振辉. 百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌

的协同抑菌效应及其应用[J]. 现代食品科技, 2021, 37(12):

112-119.

[16] 杨阳, 聂丰秋, 邹盼盼, 等. 复合植物精油对猪源3种细菌的体

外抑菌作用[J]. 动物医学进展, 2022, 43(6): 79-85.

[17] 李振翼, 彭芳, 贺喜, 等. 百里香酚调控动物肠道菌群的可能机

制及其在畜禽生产中替代抗生素的应用[J]. 动物营养学报,

2020, 32(7): 3072-3079.

[18] YANG C, ZHANG L, CAO G, et al. Effects of dietary supplemen⁃

tation with essential oils and organic acids on the growth perfor⁃

mance, immune system, fecal volatile fatty acids, and microflora

community in weaned piglets[J]. Journal of Animal Science,

2019, 97(1): 133-143.

[19] 严欣茹, 董瑷榕, 罗璋, 等. 磷酸复合型酸化剂及抗生素添加剂

体外抑菌效果研究[J]. 畜牧产业, 2020(9): 65-70.

[20] 刘旺景, 敖长金, 萨茹丽, 等. 植物提取物抑菌活性及作用机理

[J]. 动物营养学报, 2016, 28(8): 2344-2352.

[21] 陈超. 壳聚糖、植酸复合涂膜对柑橘贮藏效果的影响[D]. 硕士

学位论文. 杭州: 浙江农林大学, 2020.

[22] JAŚKIEWICZ A, BUDRYN G, NOWAK A, et al. Novel biode⁃

gradable starch film for food packaging with antimicrobial chico⁃

ry root extract and phytic acid as a cross- linking agent[J].

Foods, 2020, 9(11): 1696.

[23] 侯伟峰, 谢晶, 蓝蔚青, 等. 植酸对大肠杆菌抑菌机理的研究

[J]. 江苏农业学报, 2012, 28(2): 443-447.

[24] 高飞雄, 梁引库, 李云祥. 蒲公英植酸对沙门氏菌抑制作用及

其抑菌机理研究[J]. 天然产物研究与开发, 2019, 31(6): 975-

980，985.

（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

92

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

摘 要：试验旨在筛选出对赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）有降解能力的菌株，以用于赭曲霉

毒素A污染的饲料谷物降解。研究采集霉变饲料、土壤等样品，通过在LB培养基中添加OTA制成改

良固体培养基进行菌株初筛，以初筛菌株对OTA标准品的降解率为指标，采用ELISA法进行复筛；通

过形态学、生理生化试验、16S rRNA序列分析等方法对筛选菌株进行鉴定，并对筛选菌株进行耐酸、

耐胆盐、模拟人工胃液和肠液耐受性、抑菌性及产酶特性等生物学特性进行研究。结果表明：通过筛

选获得 1 株对 OTA 降解率为 86.31%的菌株 MM28，鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefa⁃

ciens）。其在pH2.0的酸性液中存活率为52.13%，0.3%胆盐中存活率可达到65.94%，人工模拟胃液和

肠液中存活率分别为 50.54%和 55.68%。菌株 MM28 发酵上清液对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella ty⁃

phimurium）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均有抑制作用。产

酶水解圈试验表明，该菌具有产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的活性。综上，筛选获得的高

效降解OTA的解淀粉芽孢杆菌有一定的抗逆性、抑菌性及产酶性，有望开发成为降解OTA的益生菌

用于饲料工业中。

关键词：赭曲霉毒素A；分离筛选；解淀粉芽孢杆菌；抑菌；产酶

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.10.015

中图分类号：S854.4+

3 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）10-0093-07

Isolation, Screening and Biological Characterization of Ochratoxin A Degrading Bacteria

TANG Mengmeng1 JIA Yanyan1,2 LIAO Chengshui1,2 CHEN Jian1,2 LIU Yumei1

ZHANG Ziqiang1 YU Zuhua1,2 DING Ke1,2*

(1. Laboratory of Functional Microbiology and Animal Health, Henan University of Science and

Technology, Henan Luoyang 471003, China; 2. Luoyang Key Laboratory of Live Carrier Biomaterial and

Animal Disease Prevention and Control, Henan Luoyang 471003, China)

Abstract：The experiment aimed to screen strains with degradation ability to ochratoxin A (OTA) for the

degradation of ochratoxin A contaminated feed grains. Samples of moldy feed and soil were collected,

and the strains were initially screened by adding OTA to LB medium to make modified solid medium,

and the degradation rate of the initially screened strains to OTA standards was used as an index, and the

ELISA method was used for re-screening. The screening strains were identified by morphology, physiolog⁃

ical and biochemical tests, 16S rRNA sequence analysis and other methods. The screening strains were

also investigated for their biological properties such as acid tolerance, bile salt tolerance, simulated artifi⁃

cial gastric and intestinal fluid tolerance, bacterial inhibition and enzyme production characteristics. The

results showed that one strain MM28 with 86.31% degradation rate of OTA was obtained through screen⁃

ing, which was identified as Bacillus amyloliquefaciens. Its survival rate was 52.13% in acidic solution at

pH 2.0, 65.94% at 0.3% bile salt concentration,

and 50.54% and 55.68% in artificial simulated

gastric and intestinal fluids, respectively. The fer⁃

mentation supernatant of strain MM28 had inhibi⁃

tory effects on Salmonella typhimurium, Escherich⁃

ia coli and Staphylococcus aureus. The enzyme赭曲霉毒素 A 降解菌的分离筛选及生物学特性研究

■ 唐梦梦1 贾艳艳1，2 廖成水1，2 陈 建1，2 刘玉梅1 张自强1 余祖华1，2 丁 轲1，2*

（1.河南科技大学功能微生物与畜禽健康实验室，河南洛阳 471003；

2.洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南洛阳471003）

作者简介：唐梦梦，硕士，研究方向为动物微生态学。

*通讯作者：丁轲，教授，硕士生导师。

收稿日期:2023-03-03

基金项目：河南省自然科学基金项目[182300410052]

93

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

赭曲霉毒素主要是由青霉属（Penicillium）和曲霉

属（Aspergillus）的部分真菌所产生的次级代谢产物，

最常见的分别为赭曲霉毒素A、B、C、D 四种结构，其

中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A ,OTA)的毒性最强、危

害最大[1-2]

。其主要能引起肾毒性、肝毒性、致癌、致畸

和免疫抑制等，1993 年已被国际癌症研究机构列为

2B类致癌物质[3-4]

。饲料、谷物、水果等容易发生霉变

而污染OTA，被污染的产品又可以通过食物链给人类

和动物的健康带来危害[5-6]

。因此寻找安全有效脱除

OTA的方法对保障人类和动物健康具有重要的意义。

目前OTA的去除方法主要有物理法、化学法、生

物法。物理法主要有吸附、高温和辐射等方式，化学

法主要有氨化处理、碱处理等方式。但在实际生产过

程中，由于物理法和化学法处理OTA会使谷物和饲料

原料等产品中的营养成分损失或口感变差，且易引起

二次污染等问题，难以被广泛应用。生物法是通过微

生物吸附或酶解反应等方式将毒素吸附于细胞壁或

分解代谢为低毒或无毒产物，具有无毒、对环境友好、

不会破坏谷物及饲料的营养成分等优势，逐渐成为近

年来国内外的研究热点[7-9]

。Elhady 等[10]

研究结果表

明，肉鸡在饲喂枯草芽孢发酵提取物后可降低OTA对

其肾脏及免疫功能的毒性。熊科等[11]

报道，从土壤中

筛选到的米曲霉对OTA的降解率为75%，该菌株在优

化培养条件后降解能力有所提高。Xu等[12]

研究了枯

草芽孢杆菌及从其中克隆表达的羧肽酶对OTA的降

解作用，结果显示二者均可以降解OTA。Debellis等[13]

从葡萄园土壤中筛选到的2株不动杆菌对OTA 的降

解率分别可达到82%和91%。但理想的降解菌株作

为微生态制剂还应具有抗逆性、抗菌和促进动物消化

等方面的益生功能。因此，本试验旨在筛选能够有效

降解OTA的菌株并对菌株的益生特性进行初步研究，

为通过生物学方法降解饲料谷物等产品中的OTA奠

定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

动物粪便、土壤样品、霉变饲料等,均来自于洛阳

周边地区。

1.1.2 试剂

OTA标准品（山东美正生物科技有限公司），胰蛋

白酶、胃蛋白酶、牛胆盐（合肥博美生物科技有限责任

公司），OTA酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（北京

华安麦科生物有限公司），DNA提取试剂盒[天根生化

科技（北京）有限公司]。

1.1.3 培养基

LB固体培养基：胰蛋白胨1 g、氯化钠1 g、酵母浸

粉0.5 g、琼脂粉2 g、100 mL纯化水，pH 7.0，121 ℃高

压灭菌30 min，灭菌后将培养基冷却至室温向其中添

加OTA标准品（含有0.4 μg/mL）。

LB液体培养基：除未添加琼脂粉外，其他营养成

分和LB固体培养基相同。

蛋白酶培养基：酵母粉 0.05 g、（NH4）2SO4 0.5 g、

CaCl2 0.01 g、MgSO4 0.01 g、氯化钠 0.01 g、K2HPO4

0.001 g、MnSO4 0.001 g、FeSO4 0.001 g、脱脂奶粉 1 g、

琼脂粉2 g、100 mL纯化水，115 ℃高压灭菌15 min。

淀粉酶培养基：蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、牛肉膏

0.5 g、可溶性淀粉 0.2 g、琼脂粉 2 g、100 mL 纯化水，

121 ℃高压灭菌30 min。

纤维素酶培养基：羧甲基纤维素钠 1 g、蛋白胨

0.5 g、酵母膏 0.05 g、KH2PO4 0.15 g、MgSO4 0.02 g、琼

脂粉2 g、100 mL纯化水，121 ℃高压灭菌30 min。

木聚糖酶培养基：胰蛋白胨 0.5 g、木聚糖 0.5 g、

氯化钠 0.3 g、酵母浸粉 0.3 g、MgSO4 0.05 g、KH2PO4

0.1 g、琼脂粉 2 g、100 mL 纯化水，121 ℃高压灭菌

30 min。

1.2 方法

1.2.1 样品的处理

将采集的土壤、粪便、霉变饲料等样品各取1 g，

每种样品中加入9 mL的无菌水，用玻璃珠充分打散

混匀，振荡结束后静置30 min，制得悬浮液备用。

producing hydrolysis circle test showed that it also had cellulase, protease, amylase and xylanase produc⁃

ing activities. In conclusion, a strain of Bacillus amyloliquefaciens with high OTA degradation has certain

stress resistance, bacteriostasis and enzyme production, and is expected to be developed into OTA degra⁃

dation probiotics for feed industry.

Key words：ochratoxin A; isolation and screening; Bacillus amyloliquefaciens; inhibition; enzyme produc⁃

tion

94

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

1.2.2 降解菌株的初筛

取上述悬液100 μL与900 μL无菌生理盐水混匀

后进行梯度稀释，吸取合适梯度的稀释液 100 μL 均

匀涂布于含有OTA（0.4 μg/mL）的LB固体培养基上，

37 ℃恒温培养24 h。挑取单菌落进行3次纯化，纯化

后菌株于4 ℃保存，备用。

1.2.3 降解菌株的复筛

将初筛的菌株活化后以3%的接种量接种于含有

OTA（0.4 μg/mL）的LB液体培养基中，以未接菌含有

相同含量 OTA 的 LB 液体培养基为对照。将其置于

37 ℃、200 r/min的摇床上振荡培养48 h，参照ELISA

试剂盒中的说明书检测OTA残留量。检测结束后，选

取降解率最高的菌株作为目的菌株进行鉴定并探究

其生物学特性。

OTA降解率（%）=（对照组OTA含量-处理组OTA

含量）/对照组OTA含量×100

1.2.4 菌株形态学及生理生化鉴定

选取降解率最高的菌株进行培养后观察菌落形

态，挑取少量的菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜

下观察其显微形态。并参照东秀珠等[14《] 常见细菌系

统鉴定手册》对菌株进行生理生化鉴定。

1.2.5 菌株16S rRNA鉴定

根据细菌基因组试剂盒中的说明书对菌株进行

基因组提取，以提取的 DNA 为模板用细菌通用引物

27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-

GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对菌株进行PCR片段

的扩增。PCR 反应体系（25 μL）：PCR Mix12.5 μL、

27F1 μL、1492R1 μL、DNA 模板 1 μL、ddH2O 9.5 μL。

PCR 反应条件：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，

55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延

伸 10 min；4 ℃保存。用 1%琼脂糖凝胶电泳对 PCR

产物进行检测，凝胶成像系统观察目的条带。

1.2.6 菌株系统发育树的建立分析

将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限

公司进行测序，测序结果登录NCBI（美国国家生物技

术信息中心）网站。在BLAST中进行序列比对下载与

目标序列相似度较高的序列，利用 MEGA7.0 软件中

的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.7 菌株生物学特性研究

1.2.7.1 菌株生长曲线的测定

以菌液 3%的接种量接入 LB 液体培养基中振荡

培养24 h，测定每2 h菌液在600 nm 处的吸光度，以

时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制生长曲线。

1.2.7.2 菌株耐酸试验

菌液离心后弃掉上清液将所得菌体用无菌 PBS

洗涤2次，将洗涤后的菌体重悬于等体积pH值为2.0、

3.0、4.0的无菌PBS中，37 ℃摇床培养3 h。分别在0、1、

2、3 h取100 μL于900 μL无菌生理盐水中进行梯度稀

释，选择适宜梯度后取100 μL涂布于LB固体培养基

上，37 ℃恒温培养24 h后进行活菌计数，计算存活率。

菌株存活率（%）=Nt/N0×100

式中：Nt——不同时间段培养的活菌数；

N0——0 h培养的活菌数。

1.2.7.3 菌株耐胆盐试验

将洗涤后的菌体重悬于胆盐浓度为0.1%、0.2%、

0.3%无菌的 PBS 中，37 ℃摇床培养 6 h，分别在 0、2、

4、6 h 取样进行稀释。按照 1.2.7.2 方法进行活菌计

数，计算存活率。

1.2.7.4 菌株对模拟胃肠液耐受性试验

模拟胃液的配制：0.3%胃蛋白酶，0.2%氯化钠，

调节pH至2.0，用0.22 μm滤膜器滤过除菌。

模拟肠液的配制：0.1%胰蛋白酶，0.3%牛胆盐，

1.1%NaHCO3，0.2%氯化钠，调节pH至8.0，用0.22 μm

滤膜器滤过除菌。

将菌体分别悬浮于配制好的模拟胃液肠液中，模

拟胃液分别在0、1、2、3 h取样，用无菌的生理盐水进

行稀释。模拟肠液分别在0、2、4、6、8 h取样用无菌生

理盐水稀释，按照1.2.7.2方法进行活菌计数并计算存

活率。

1.2.7.5 菌株抑菌性试验

以大肠杆菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌

（Salmonella typhimurium）、金黄色葡萄球菌（Staphylo⁃

coccus aureus）为指示菌，先将无菌的牛津杯放置于灭

菌的培养皿中，待LB固体培养基冷却至适宜温度时

将活化好的指示菌菌液加入，轻轻摇晃均匀，倒入培

养皿中。待含有指示菌的固体培养基完全凝固后取

出牛津杯形成杯孔，吸取 100 μL 菌株上清液加入孔

中培养12 h后观察有无抑菌圈，根据抑菌圈直径来判

定菌株上清液对指示菌的抑菌性。

1.2.7.6 菌株产酶试验

将菌液离心后弃掉上清液保留菌体，取 0.5%的

琼脂生理盐水100 μL，加入菌体沉淀中，均匀吹吸后

取10 μL分别滴在产酶培养基上，37 ℃恒温培养24 h。

将产淀粉酶培养基中添加碘液进行染色，产纤维素

酶、木聚糖酶培养基中倒入 0.5%刚果红溶液进行染

色，再用生理盐水进行脱色，产蛋白酶培养基无需染

95

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

色。观察每种产酶培养基中的菌落周围有无水解圈，

有水解圈则表示产此酶，无水解圈则表明不产此酶。

1.2.8 数据处理

试验结果以“平均值±标准差”表示，使用Graph⁃

pad Prism 7.0软件对数据进行处理分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛结果

通过在LB固体培养基中加入OTA对样品进行初

步分离筛选，得到潜在可能对OTA有降解作用的菌株

56株。

2.2 菌株复筛结果

以初筛菌株对OTA标准品溶液的降解率为指标

进行复筛，获得降解率 15%以上的菌株7株。其中菌

株MM28降解率为86.31%，因此选择此菌株继续进行

后续的研究（如表1）。

表1 对OTA具有降解作用的菌株(%)

菌株编号

MM9

MM28

MM15

MM39

降解率

16.61±1.28

86.31±0.83

60.12±0.58

45.60±1.07

菌株编号

MM43

MM25

MM12

降解率

25.32±0.91

78.37±1.38

31.82±0.65

2.3 菌株MM28的形态特征及生理生化特性

菌株 MM28 菌落形态为乳白色、形状不规则，中

央有圆形凸起，边缘不光滑；显微形态为革兰氏阳性

菌，杆状、有芽孢生成（如图 1）。该菌株能够利用蔗

糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖，在5%氯化钠、温度40 ℃环

境中均能生长，接触酶、硝酸盐还原、VP、明胶液化、

柠檬酸试验呈阳性；吐温80、甲基红、甘露醇试验呈阴

性（见表2），根据《常见细菌系统鉴定手册》初步判定

为芽孢杆菌。

2.4 菌株MM28的16S rRNA鉴定结果

对菌株 MM28 DNA 进行 PCR 扩增后在 1 500 bp

左右处有1条特异性的目的条带（见图2），与预期大

小基本符合。将所得PCR产物送至上海生物工程股

份有限公司进行测序结果显示该菌株的序列长度为

1 452 bp，登录NCBI网站将序列提交GenBank中获取

登录号为：ON202807。

2.5 基于16S rRNA序列系统发育树的构建结果

将所得到的测序结果在NCBI中与现有的序列经

BLAST比对并构建菌株系统发育树，结果发现菌株MM28

与 Bacillus amyloliquefaciens strain JR20 KX137853.1

进化树中处于同一分支上，表示亲缘关系最近。因

此，鉴定其为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefa⁃

ciens）（见图3）。

（a）菌落形态

（b）显微形态

图1 菌株MM28菌落形态和显微形态（1 000×）

表2 菌株MM28的生理生化特性

项目

接触酶

硝酸盐还原

麦芽糖

乳糖

甲基红

40 ℃

柠檬酸

结果

＋

＋

＋

＋

－

＋

＋

项目

明胶液化

VP

葡萄糖

蔗糖

5% 氯化钠

吐温80

甘露醇

结果

＋

＋

＋

＋

＋

－

－

注：＋表示阳性，－表示阴性。

M a b

2 000 bp

1 000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

100 bp

注：M.DL2 000Marker；a.MM28 PCR产物；b.阴性对照。

图2 菌株MM28 16S rRNA PCR扩增结果

96

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

2.6 菌株生物学特性研究结果

2.6.1 菌株生长曲线

菌株MM28的生长曲线结果显示，在0~4 h为菌

株的迟缓期，4~14 h 其生长速度较快进入生长对数

期，14 h后该菌进入生长稳定期。该菌株的生长规律

表明其在进入肠道后可以快速活化并且能够在肠道

内生长繁殖和产生代谢产物（见图4）。 OD600 nm

0 2 4 6 24

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

8 10 12 14 16 18 20 22

时间（h）

图4 菌株MM28生长曲线

2.6.2 菌株耐酸结果

胃液呈酸性在摄入食物后pH会出现波动，菌株

MM28进行耐酸试验后结果表明其在pH 4.0、3.0、2.0

的 PBS 中 作 用 3 h 后 ，存 活 率 可 以 达 到 78.13% 、

63.54%、52.13%，说明该菌株对酸性环境有一定的耐

受能力（见图5）。

2.6.3 菌株耐胆盐结果

小肠内胆盐的浓度含量一般为0.03%~0.30%，菌

株MM28在胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%的PBS中培

养 6 h 后，存活率仍然可以达到 83.56%、74.23%、

65.94%，表明该菌株对胆盐具有抗逆性（见图6）。

2.6.4 菌株对模拟胃肠液耐受性结果

由图 7 可知，菌株 MM28 在模拟胃液作用 3 h 后

其存活率为50.54%，在模拟人工肠液作用8 h后存活

率为55.68%，说明其对胃肠液均有耐受性。活菌数(108 CFU/mL)

0 1 2 3

10

9

8

7

6

5

4

pH 2.0

pH 3.0

pH 4.0

时间（h）

图5 菌株MM28对不同pH值的耐受性

活菌数(108 CFU/mL)

0 2 4 6

10

9

8

7

6

5

0.1%胆盐

0.2%胆盐

0.3%胆盐

时间（h）

图6 菌株MM28对不同浓度胆盐的耐受性

2.6.5 菌株抑菌结果

本试验探究了菌株MM28对常见的大肠杆菌、金

黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌3种有害菌的抑菌作

用，其抑菌圈直径分别为（15.43±0.27）、（14.21±0.56）、

（14.15±0.39）mm，表明菌株MM28对这3种致病菌均

图3 菌株MM28基于16S rRNA序列系统发育树构建

97

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

有抑制作用。

2.6.6 菌株的产酶结果

通过在不同产酶培养基上形成水解透明圈的方

式判断菌株的产酶情况，结果如图8所示，菌株MM28

在4种培养基上均出现了不同程度的水解圈，表明其

具有产生蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和木聚糖酶多种

酶类物质的活性。

3 讨论

注：a.蛋白酶；b.纤维素酶；c.淀粉酶；d.木聚糖酶。

图8 菌株MM28产酶情况

活菌数(108 CFU/mL)

0 1 2 3

10

9

8

7

6

5

4

时间（h）

（a）人工胃液

活菌数(108 CFU/mL)

0 2 4 6

9

8

7

6

5

4

3 8

时间（h）

（b）肠液

图7 菌株MM28对模拟人工胃液和肠液的耐受性

OTA是继黄曲霉毒素后再次引起世界广泛关注

的真菌毒素，普遍存在于饲料、谷物粮食等产品中。

肾脏是被毒害的最主要靶器官，研究发现巴尔干地方

性肾病的发生与其有着密切的联系[15-16]

。利用生物法

脱除OTA对于动物饲料和食品安全有着重要的意义，

近年来有关微生物菌株降解 OTA 的报道越来越多。

刘长宇 [17]

研究了藤黄单孢菌对OTA的降解作用，发现

该菌株与 OTA 共培养 120 h 后对其降解率为 75%。

Zhang等[18]

研究了贝莱斯芽孢杆菌对OTA的降解，结

果显示该菌株在 48 h 内对 OTA 的降解率可以达到

96.1%。胡海宁等[19]

从小鼠肠道筛选到的大肠杆菌在

培养20 h后对OTA降解率为84.6%。本试验筛选到的

解淀粉芽孢杆菌，在37 ℃培养48 h后对OTA的降解率

可达到86.31%，与以上文献中所报道的微生物菌株对

OTA的降解率有所不同，可能是由于菌株的种属不同

在降解率方面存在着差异，或是由于培养条件中的温

度、时间等方面因素的不同造成。解淀粉芽孢杆菌是

一类存在于食物、土壤等环境中的微生物，已经被美

国食品药品监督管理局（FDA）列入安全无毒的菌种，

因具有益生性而在农业、食品、医药等行业中被广泛应

用[20]

。作为益生菌能否在胃肠道内存活是其发挥益生

作用的首要条件，体外评价益生菌的耐受能力对其在

生产应用中有着重要的参考价值。胃酸、胆盐、胃蛋白

酶等因素对菌株在肠道内的存活影响较大，所以本研

究对菌株进行了抗逆能力的耐受性试验，结果显示该

菌株在较低pH、不同胆盐浓度及模拟胃肠液环境中均

具有耐受性，说明该菌株可以适应胃肠道内的复杂环

境存活，达到益生作用。夏超笃等[21]

曾对筛选到的解

淀粉芽孢杆菌进行耐酸、胆盐及模拟胃肠液的试验，与

本研究所筛选到的解淀粉芽孢杆菌在抗逆性方面结果

相似。

芽孢杆菌可以通过自身分泌消化酶及抑菌物质

而发挥益生的作用[22]

。其在生长过程中可能会产生

脂肽类、抗菌蛋白、多肽类等物质对致病菌进行抑制，

减少致病菌动物的损害。大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏

菌、金黄色葡萄球菌是常见的肠道致病菌，当这些致

98

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

病菌进入动物体内后会引起动物食欲下降、脱水、腹

泻、消瘦，给畜牧业带来危害和经济损失。本研究中

筛选到的解淀粉芽孢杆菌对 3 种细菌性致病菌均有

一定的抑制作用，说明该菌可以抵抗有害菌的危害，

发挥更好的益生作用。张彤等[23]

从鹿的分泌物中筛

选到的解淀粉芽孢杆菌，研究了其对大肠杆菌、金黄

色葡萄、沙门氏菌等致病菌的抑制能力，结果该菌对

以上致病菌都有良好的抑菌作用，与本研究结果基本

相似。蛋白酶、木聚糖酶、纤维素酶等酶类物质在饲

料行业中已有广泛应用，在动物体内酶源不足情况下

可以通过体外添加多种酶提高消化吸收率，改善生产

性能。本研究筛选到的解淀粉芽孢杆菌不仅可以产

生纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶，而且还有降

解OTA及抑菌的功能，为其开发成为微生物饲料添加

剂提供技术支持。

4 结论

本研究通过筛选得到了1株对OTA 有降解作用

的解淀粉芽孢杆菌，其对 OTA 的降解率为 86.31%。

在进行耐酸、耐胆盐及模拟胃肠液试验后发现，该菌

株在较低pH、不同胆盐浓度及模拟胃肠液环境下均

表现出良好的耐受性。该菌株对常见的致病菌均有

抑制作用，还具有产生多种消化酶的益生特性。综

上，该菌株在未来开发成为微生态制剂应用于饲料工

业中具有很大的潜力。

参考文献

[1] WANG G, LI E F, GALLO A P, et al. Impact of environmental

factors on ochratoxin A: from natural occurrence to control strategy

[J]. Environmental Pollution, 2022, 317: 120767.

[2] YANG Q Y, DHANASEKARAN S, NGEA G, et al. Unveiling och⁃

ratoxin a controlling and biodetoxification molecular mechanisms:

opportunities to secure foodstuffs from OTA contamination[J].

Food Chem Toxicol, 2022, 169: 113437.

[3] SCHRENK D, BODIN L, CHIPMAN J K, et al. Risk assessment

of ochratoxin A in food[J]. Efsa Journal, 2020, 18(5): 6113.

[4] IARC. Some naturally occurring substances: food items and con⁃

stituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins[M]. Lyon:

World Health Organization, 1993.

[5] LI X J, MA W, MA Z Y, et al. The occurrence and contamination

level of ochratoxin A in plant and animal-derived food commodi⁃

ties[J]. Molecules, 2021, 26(22): 6928.

[6] LIU W C, PUSHPARAJ K, MEYYAZHAGAN A, et al. Ochratox⁃

in A as an alarming health threat for livestock and human: a re⁃

view on molecular interactions, mechanism of toxicity, detection,

detoxification, and dietary prophylaxis[J]. Toxicon, 2022, 213: 59-

75.

[7] LUO Y, LIU X J, YUAN L, et al. Complicated interactions be⁃

tween bio- adsorbents and mycotoxins during mycotoxin adsorp⁃

tion: current research and future prospects[J]. Trends in Food Sci⁃

ence and Technology, 2020, 96: 127-134.

[8] XU H W, WANG L Z, SUN J D, et al. Microbial detoxification of

mycotoxins in food and feed[J]. Critical Reviews in Food Science

and Nutrition, 2022, 62(18): 4951-4969.

[9] WANG L, HUA X, SHI J, et al. Ochratoxin A: occurrence and re⁃

cent advances in detoxification[J]. Toxicon, 2022, 210: 11-18.

[10] ELHADY M A, KHALAF A A A, IBRAHIM M A, et al. Protec⁃

tive effects of Bacillus Subtilis fermentation extract against ochra⁃

toxin A induced nephrotoxicity and immunotoxicity in broiler

chickens[J]. Journal of Veterinary Research, 2022, 66(2): 167-

177.

[11] 熊科, 熊苏玥, 支慧伟, 等. 一株降解赭曲霉素A的新颖米曲霉

菌株筛选鉴定及其产酶优化[J]. 河南工业大学学报: 自然科学

版, 2017, 38(2): 80-87.

[12] XU X G, PANG M, LIU J W, et al. Genome mining reveals the

genes of carboxypeptidase for OTA-detoxification in Bacillus sub⁃

tilis CW14[J]. International Journal of Biological Macromole⁃

cules, 2021, 186: 800-810.

[13] DEBELLIS P, TRISTEZZA M, HAIDUKOWSKI M, et al. Biodeg⁃

radation of ochratoxin A by bacterial strains isolated from vine⁃

yard soils[J]. Toxins, 2015(7): 5079-5093.

[14] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版

社, 2001: 43-65.

[15] GANESAN A R, MOHAN K, RAJAN D K, et al. Distribution,

toxicity, interactive effects, and detection of ochratoxin and de⁃

oxynivalenol in food: areview[J]. Food Chemistry, 2022, 378:

131978.

[16] BUI KLIMKE T, WU F. Evaluating weight of evidence in the

mystery of Balkan endemic nephropathy[J]. Risk Analysis, 2014,

34(9): 1688-1705.

[17] 刘长宇. 藤黄单胞菌CW574对AFB1和OTA降解特性及在生物

脱毒中的应用[D]. 硕士学位论文. 合肥: 安徽农业大学, 2019.

[18] ZHANG Y M, LI Z C, LU Y A, et al. Characterization of Bacillus

velezensis E2 with abilities to degrade ochratoxin A and biocon⁃

trol against aspergillus westerdijkiae fc-1[J]. Toxicon, 2022, 216:

125-131.

[19] 胡海宁, 袁国强, 何鸿建, 等. 赭曲霉毒素A脱毒菌株的筛选与

鉴定[J]. 食品科学, 2018, 39(14): 73-78.

[20] WOLDEMARIAMYOHANNES K , WAN Z , YU Q L, et al. Pre⁃

biotic, probiotic, antimicrobial, and functional food applications

of Bacillus amyloliquefaciens[J]. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 2020, 68(50): 14709-14727.

[21] 夏超笃, 湛穗璋, 艾琴, 等. 一株解淀粉芽孢杆菌的益生特性及

抑菌性研究[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(2): 425-432.

[22] 郭艺伟, 刘依山, 包永占, 等. 蚯蚓源贝莱斯芽孢杆菌Y1鉴定

及生物学特性研究[J]. 中国兽医杂志, 2022, 58(4): 24-29.

[23] 张彤, 何剑斌, 李鹏, 等. 两株鹿源芽孢杆菌的分离鉴定及生物

学特性研究[J]. 沈阳农业大学学报, 2017, 48(2): 166-173.

（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

99

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

大头金蝇（Chrysomya megacephala，fabricius）是

双翅目（Diptera）丽蝇科（Calliphoridae）金蝇属（Chrys⁃

omya）的一种昆虫，分布于热带和亚热带绝大部分地

区[1]

。大头金蝇作为一种重要的经济昆虫，其蛋白质、

脂肪含量较高，具有很高的潜在开发利用价值。在法

医学、有机废弃物转化、幼虫的活性物质及成虫传粉

等方面研究报道较多[1-4]

。

随着研究的不断深入，大量健康、发育一致的大

头金蝇幼虫成为急需的虫源。由于目前国内外关于

大头金蝇的研究多集中在有机废弃物转化、公共卫生

和法医学领域，在规模化饲养的人工饲料方面的研究

较少，且在研究过程中主要使用动物组织作为大头金

蝇的产卵基质和幼虫培养基质[5-7]

。肉类或动物肝脏

作为规模化饲养系统的产卵和幼虫培养基质无论从

材料来源和经济成本上考虑都是不划算的[8]

。有学者

用鱼粉配方[4]

、猪血粉配方[8]

、奶粉配方[5]

等作为代饲料

大头金蝇（Chrysomya megacephala）

幼虫人工饲料配方优化

■ 李黔勇 符雨静 朱 麟*

（海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158）

摘 要：为规模化人工饲养大头金蝇，研究采用6因素5水平正交试验，对大头金蝇幼虫人工饲

料进行了优化，得出饲料优化配方：麦麸25%、猪血15%、啤酒酵母4%、山梨酸0.8%、菠萝蜜20%、椰

子肉10%。同时比较了大头金蝇饲喂该优化配方饲料和猪肉的饲养效果。结果表明：在一些关键指

标上（如幼虫发育历期、蛹期、产卵前期和产卵期等），优化配方的饲养效果明显好于猪肉；而其他指

标（如存活率、蛹重、羽化率、产卵量和孵化率等）与猪肉无显著差异。说明该优化配方可适于大头金

蝇幼虫的规模化饲养。

关键词：大头金蝇；幼虫；人工饲料；正交优化；关键因子

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.10.016

中图分类号：S816.4 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）10-0100-05

Optimization of Artificial Feed Formula for Chrysomya megacephala larvae

LI Qianyong FU Yujing ZHU Lin*

(School of Life Sciences, Hainan Normal University, Hainan Haikou 571158, China)

Abstract：In order to breed Chrysomyria megacephala on a large scale, the artificial feed formula of its

larvae was optimized by orthogonal experiment with six factors and five levels. The optimal diet constitu⁃

ent complex was obtained: wheat bran 25%, pig blood 15%, beer yeast 4%, sorbic acid 0.8%, jackfruit

20%, and coconut meat 10%. Meanwhile, the rearing effect of the optimized formula and that of the pork

diet was compared. The results showed that the rearing effect of the optimized complex diet was signifi⁃

cantly better than those of the pork diet in some key indicators (namely developmental period, pupal peri⁃

od, pre-oviposition period and oviposition duration), and many other indicators (such as survival rate, pu⁃

pal weight, emergence rate, adult duration, fecundity and hatchability)were not significantly different

from those of pork. It indicates that the optimized complex diet is suitable for mass rearing of Chrysomya

megacephala larvae.

Key words：Chrysomya megacephala; larvae; artificial diet; orthogonal optimization; key factor

作者简介：李黔勇，硕士，研究方向为昆虫生态学。

*通讯作者：朱麟，博士，教授。

收稿日期：2023-03-06

基金项目：海南省科技厅项目（自然）[RZ2100001711]

100

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

饲养大头金蝇幼虫，在幼虫饲养方面取得一定进展，

但一直未能实现工业化生产。所以筛选和优化大头

金蝇室内人工饲养的简易配方已经成为当前重要的

研究内容。本研究采用6因素5水平正交试验，对大

头金蝇幼虫人工饲料进行了优化，以得出饲料优化配

方，并比较了该优化配方和猪肉的饲养效果，结果可

为大头金蝇规模化人工饲养和繁殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

大头金蝇，由海南师范大学热带动物生理生态实

验室提供，已在室内饲养半年，形成稳定遗传的实验

室种群。

1.2 人工饲料的组分及其优化方案

饲料以豆腐渣为基本成分，并添加麦麸、猪血、啤

酒酵母、山梨酸、菠萝蜜、椰子肉。根据预试验筛选出

的6个成分作为此次正交试验的6个因素，即A、B、C、

D、E、F。6个因素均设5个水平（见表1）。为明确各

组分比例，研究各原料及其不同水平组合对大头金蝇

幼虫生长发育的影响，试验选择L25（56

）正交设计表，

共 25 个处理。对 6 个因素的 5 个水平进行随机化处

理，确定出正交试验的方案，以筛选出各组分的最佳

用量。

水平

1

2

3

4

5

因素

A（麦麸，%）

5

10

15

20

25

B（猪血，%）

5

10

15

20

25

C（啤酒酵母粉，%）

1

2

3

4

5

D（山梨酸，%）

0.2

0.4

0.6

0.8

1

E（菠萝蜜，%）

5

10

15

20

25

F（椰子肉，%）

5

10

15

20

25

表1 大头金蝇幼虫人工饲料正交试验因素水平表

1.3 饲料配制方法

饲料配制总量为 200 g，根据表 1 称取麦麸、猪

血、啤酒酵母、山梨酸、菠萝蜜和椰子肉混合放入塑料

盒中，加水 100 mL。用粉碎机搅拌均匀，含水量控

制在 60%~70%；自然条件下密封发酵 1 d，于 2 ℃保

存，备用。饲养过程中根据需要添加适量水保持饲

料湿度。

1.4 饲养方法

将配好的饲料放入一次性塑料盒中，接种100只

初孵幼虫，并将一次性塑料饭盒置于口径 10 cm×

20 cm的塑料盒内，外罩纱网以免幼虫爬出。每个试

验处理重复 3 次。养虫室内环境条件保持在温度

（28±1）℃，相对湿度60%~70%，自然光照。

观察幼虫的生长发育情况，记录幼虫发育历期、

30条幼虫重、存活率、蛹期、羽化率，作为评判配方优

劣的指标。

1.5 优化配方的初步饲养效果

用上述筛选到的优化饲料配方对大头金蝇进行

饲养。试验环境条件为温度（28±1）℃，相对湿度

65%~75%，自然光照，保持洁净与通风。以猪肉（CK）

饲养的大头金蝇为对照，评价其饲养效果。每日早上

于市场购买新鲜瘦猪肉，切成大小一致的块，根据大

头金蝇幼虫取食量按时添加。

饲养过程中，记录幼虫发育历期、存活率、30条蛹

重、蛹期、羽化率、卵孵化率、雌成虫期、单雌产卵量、

产卵前期、产卵期。

1.6 数据处理

利用Excel软件对试验数据进行初步整理，对正

交试验数据进行极差分析和趋势图分析，用SPSS27.0

软件进行正交试验设计各因素不同水平的方差分析，

并采用Duncan’s新复极差法进行比较进行。在优化

饲料和猪肉饲养大头金蝇的处理中用t检验比较分析。

2 结果与分析

2.1 饲料成分的优化

统计结果见表2，分析结果见表3。

极差分析和趋势图分析是正交试验筛选关键因

素的常用方法。极差大说明该因素的不同水平间产

生的差异大，是关键因素。极差分析显示影响大头金

蝇幼虫发育历期的各因素主次关系依次为 B>A>C>

D=E>F。影响大头金蝇幼虫存活率的各因素主次关

系依次为 B>E>C>F>A>D。影响大头金蝇幼虫 30 条

幼虫重的各因素主次关系依次为A>B>D>E>F>C。影

响大头金蝇蛹期的各因素主次关系依次为E>A>F>B=

D>C。影响大头金蝇羽化率的各因素主次关系依次

为A>E>F>B>D>C。

极差和趋势分析的结果均表明，在大头金蝇发育

的不同阶段，影响其发育的关键因素不同。其中B是

影响大头金蝇幼虫发育历期、幼虫存活率的关键因

101

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

素，A是影响大头金蝇幼虫重、羽化率的关键因素，E

是影响大头金蝇蛹期的关键因素。

2.2 饲料的优化配方

各因素不同水平间方差分析表明（表3）：因素B

对幼虫存活率的影响各水平间差异极显著（F=6.317，

P<0.01），因素 A、C、D、E、F 各水平间差异不显著，与

极差分析一致；因素A对幼虫重的影响各水平间差异

显著（F=3.28，P<0.05），因素B、C、D、E、F各水平间差

异不显著，与极差分析一致；因素E对蛹历期的影响

各水平间差异显著（F=4.097，P<0.05），因素 A、B、C、

D、F 各水平间差异不显著，与极差分析一致；因素 A

对羽化率的影响各水平间差异显著（F=3.836，P<

0.05），因素B、C、D、E、F各水平间差异不显著，与极差

分析一致。

方差分析表明，6个试验因素对大头金蝇幼虫发

育历期影响不显著，所以对6个因素可以根据需要选

用。由表 2、3 可得出各指标的 6 个因素的优水平组

合，见表4。从经济角度出发，综合各指标的情况，考

虑大头金蝇整体的发育，得出6个关键因素的优水平

组合为A5B3C4D4E4F2。因此大头金蝇幼虫饲料优化配

方为：麦麸 25%，猪血 15%，啤酒酵母 4%，山梨酸

0.8%，菠萝蜜20%，椰子肉10%。

2.3 优化配方的初步饲养效果

本试验进一步对优化配方的饲养效果进行了研

究，结果（表5）表明：优化配方饲养的大头金蝇幼虫发

育历期（F=7.5，P=0.034）、蛹期（F=7.5，P=0.034）、产卵

前期（F=23.42，P=0.003）、产卵期（F=8.652，P=0.026）

与猪肉饲养的存在显著差异，且都优于猪肉的饲养效

果。而优化配方饲养的大头金蝇存活率（F=2.2，P=

0.189）、30粒蛹重（F=1.88，P=0.219）、羽化率（F=0.101，

P=0.762）、雌成虫期（F=1.109，P=0.352）、产卵量（F=

0.042，P=0.845）和孵化率（F=0.044，P=0.841）均与猪

肉饲养无显著差异。由此说明，在一些关键指标上

（如幼虫发育历期、蛹期、产卵前期和产卵期），所优化

的大头金蝇人工饲料配方的饲养效果明显好于猪肉；

而在其他指标上（如存活率、蛹重、羽化率、成虫期、产

卵量和孵化率），优化配方与猪肉的效果相当。优化

饲料配方饲养的大头金蝇与正交试验处理结果（表2）

相比，各生物参数都明显上升了，各项指标都优于正

交试验的结果。

3 讨论

本研究在王俊刚[4]

、杨森[8]

饲料配方的基础上加以

改进并新添加两种天然物质，通过一次正交设计优化

筛选，获得了优化的配方组合；还进行了饲养效果评

价。研究发现当饲料中的营养不够或者饲料添加不足

时会幼虫生长缓慢，提前进入蛹期，羽化出来的成虫存

试验号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

评价指标

幼虫发育历期(d)

9.00

7.00

6.00

7.00

7.00

8.00

7.00

5.50

7.00

7.00

9.00

7.00

6.00

7.00

6.00

6.00

6.50

7.00

6.50

6.00

6.00

7.00

5.00

5.00

6.00

存活率(%)

39.67

53.50

59.33

57.14

53.20

33.50

57.57

53.00

62.20

55.20

30.67

59.25

54.29

49.40

49.76

47.80

54.33

49.33

67.50

57.40

50.00

44.00

52.00

56.75

64.89

30条幼虫重(g)

2.00

1.80

2.50

2.76

2.50

2.00

2.25

2.50

2.15

2.30

1.51

1.72

1.93

2.02

2.46

1.71

2.04

2.21

2.06

2.44

2.58

2.44

2.65

2.45

2.55

蛹期(d)

5.00

5.00

4.00

4.00

4.50

4.00

4.00

3.50

4.50

4.00

5.00

4.50

4.00

4.00

4.00

5.00

5.00

5.00

4.00

4.00

4.00

4.00

4.50

5.00

5.00

羽化率(%)

73.22

31.52

52.81

32.78

78.46

35.71

67.52

52.15

51.39

47.97

40.00

48.80

46.32

31.05

65.00

60.09

62.22

37.00

75.19

73.00

73.57

80.00

79.75

82.82

74.35

表2 大头金蝇幼虫人工饲料正交试验结果

102

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

活率低、个体小、寿命短，这与已有的研究报道一致[9]

。

表4 大头金蝇幼虫人工饲料各因素优水平组合

指标

幼虫发育历期（d）

存活率（%）

30条幼虫重（g）

蛹期（d）

羽化率（%）

整体发育

最优水平组合

A5B3C4D2E1F2

A4B4C4D1E3F1

A5B5C4D4E4F2

A2B3C2D4E4F2

A5B5C3D1E1F1

A5B3C4D4E4F2

在本试验中，啤酒酵母粉、山梨酸、椰子肉对大头

金蝇各项指标的影响都未达显著水平。酵母所含的

营养物质较为丰富，具有昆虫所需的全部或大部分营

养成分[10]

，添加在饲料中可保障饲料营养成分全面，

且能使饲料疏松，便于取食[11]

；山梨酸对大头金蝇生

长发育无显著影响，但能够很好地抑制霉菌的生长，

且不影响大头金蝇的生长发育。因此，还应进一步探

讨酵母粉、山梨酸对幼虫的影响。椰子肉对大头金蝇

幼虫各项指标的影响均不显著，从本试验结果来看可

能是由于其他营养成分含量能满足大头金蝇幼虫生

长发育需要。麦麸对幼虫重、羽化率的影响显著，且

是大头金蝇上述指标的关键影响因素。可见麦麸在

大头金蝇幼虫人工饲料中起到相当重要的作用，在已

报道的大头金蝇饲养研究中多数都使用麦麸作为饲

料添加物[5，8]

。猪血对幼虫存活率、蛹重影响显著，猪

血含量在一定范围内增加可加速幼虫的生长。菠萝

蜜对大头金蝇蛹期影响显著，因其含有丰富的碳水化

合物，利于大头金蝇幼虫个体的生长发育，随着菠萝

蜜含量增加，蛹期明显缩短，直到添加量为20%时蛹

期最短，为4 d。此外也有研究发现碳水化合物含量

对蝇类幼虫的生长发育有显著影响，低碳水化合物的

饲料能够缩短伏蝇幼虫的发育历期[12]

。

从初步饲养的结果来看，该人工饲料可以很好地

满足大头金蝇发育的营养需求，且缩短了世代发育历

期，此配方饲养的大头金蝇各生物指标都得到较大的

提高，蛹重等指标明显优于以往报道的大头金蝇人工

饲料[5，13-14]

，达到了较为满意的结果，这为下一步研究

该饲料大规模应用和继代饲养等方面奠定了基础。

注：表中数值为平均值，R表示极差。多重比较是在5个水平间，同列5个水平间数据肩标不含有相同小写字母表示差异

显著（P<0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）；下表同。

指标

幼虫发育历期（d）

存活率（%）

30条幼虫重（g）

蛹期（d）

羽化率（%）

水平

1

2

3

4

5

R

1

2

3

4

5

R

1

2

3

4

5

R

1

2

3

4

5

R

1

2

3

4

5

R

因素

A

7.20

6.90

7.00

6.40

5.80

1.40

52.57

52.29

48.67

55.27

53.53

6.60

2.31 ab

2.24ab

1.93a

2.09a

2.53b

0.61

4.50

4.00

4.30

4.60

4.50

0.60

53.76a

50.95 a

46.23a

61.50 ab

78.10b

31.86

B

7.60

6.90

5.90

6.50

6.40

1.70

40.33a

53.73 b

53.59b

58.60 b

56.09b

18.27

1.96

2.05

2.36

2.29

2.45

0.49

4.60

4.50

4.20

4.30

4.30

0.40

56.52

58.01

53.61

54.65

67.76

14.15

C

7.40

6.50

6.60

6.30

6.50

1.10

47.52

51.25

52.34

56.42

54.80

8.90

2.19

2.19

2.23

2.25

2.24

0.05

4.40

4.30

4.40

4.40

4.40

0.10

53.85

57.44

63.23

53.63

62.39

9.60

D

6.80

6.20

6.70

6.60

7.00

0.80

54.10

53.51

52.29

52.76

49.67

4.43

2.19

2.04

2.22

2.45

2.20

0.41

4.50

4.60

4.40

4.20

4.20

0.40

65.23

53.74

51.23

55.17

65.16

14.00

E

6.40

7.20

6.50

6.80

6.40

0.80

50.70

52.12

58.26

49.27

51.99

8.99

2.29

2.04

2.23

2.31

2.23

0.27

4.50ab

4.90b

4.10a

4.00 a

4.40 ab

0.90

67.08

46.85

59.67

53.56

63.37

20.23

F

6.90

6.30

6.40

6.90

6.80

0.60

56.78

52.66

52.62

49.87

50.41

6.91

2.16

2.27

2.25

2.25

2.18

0.11

4.40

4.10

4.30

4.50

4.60

0.50

67.32

52.26

61.86

52.54

56.56

15.06

表3 正交试验结果的极差分析及各水平的差异显著性检验（Duncan’s新复极差检验）

103

问 题 探 讨 2023年第44卷第10期 总第679期

综上所述，该优化配方适于大头金蝇的种群规模化、

长期饲养；而且该饲料饲养成本低，能减少资源的浪

费和环境污染，也能够对有机废弃物进行资源化处

理，同时实现大头金蝇的资源化利用。

在研究中发现，2日龄幼虫在添加少量或不添加

猪血情况下均可完成生长发育，但幼虫历期、幼虫重

等指标会有所变化。且将幼虫用于饲养水生动物如

鱼类、龟类时，活体幼虫比死亡幼虫更吸引动物取食，

而且幼虫可浮于水面几个小时不死，证明将大头金蝇

幼虫作为饲用昆虫切实可行，且已有报道大头金蝇幼

虫用于饲料添加物饲养动物效果理想[15]

。

通过正交试验优化的人工饲料比较适合大头金

蝇饲养，且这种饲料的配制过程不需要太大的空间和

过多的时间，配制简单、快速、价格低廉。但饲喂该饲

料与饲喂猪肉相比，大头金蝇表现出产卵量、存活率

和孵化率低；本试验只进行了一代饲养，该饲料是否

能长期饲喂、需要饲养多代才能判断。因此，在以后

的研究中还将继续开展大头金蝇幼虫饲料的优化和

幼虫饲料的开发。

4 结论

本试验采用6因素5水平正交试验，对大头金蝇

幼虫人工饲料进行了优化，得出饲料优化配方，采用

该饲料饲喂大头金蝇，各项指标均优于正交试验设计

的25个处理。并比较了该优化配方和猪肉的饲养效

果，结果表明，在一些关键指标上（如幼虫发育历期、

蛹期、产卵前期和产卵期等），优化配方的饲养效果明

显好于猪肉；而在其他指标上（如存活率、蛹重、羽化

率、成虫期、产卵量和孵化率等），饲养效果与猪肉无

显著差异。说明该优化配方可适于大头金蝇幼虫的

规模化饲养。

参考文献

[1] 时燕薇, 刘小山, 汪海洋, 等. 大头金蝇的生物学及其在法医昆

虫学上的应用[J]. 中山大学学报：自然科学版, 2008, 47(S1): 70-

76.

[2] 王小云, 李逵, 雷朝亮, 等. 大头金蝇的综合利用研究进展[J]. 昆

虫学报, 2016, 59(10): 1143-1150.

[3] 吴少英, 胡萌, 汤清波. 我国法医昆虫大头金蝇的研究进展[J].

中国媒介生物学及控制杂志, 2012, 23(4): 370-373.

[4] 王俊刚. 大头金蝇 Chrysomya megacephala（Fabricius）人工饲养

技术及授粉行为学的研究[D]. 博士学位论文. 武汉: 华中农业大

学, 2006.

[5] BAMBARADENIYAY T B, KARUNARATNEW A IP, TOMBER⁃

LINJ K, et al. Effect of temperature and tissue type on the devel⁃

opment of the forensic fly Chrysomya megacephala (Diptera: Calli⁃

phoridae)[J]. Journal of Medical Entomology, 2019, 56(6): 1571-

1581.

[6] 王争艳. 家蝇与大头金蝇幼虫取食与成虫产卵行为研究[D]. 博

士学位论文. 杭州: 浙江大学, 2008.

[7] KAYNARA C. N. RABÊLO, PATRÍCIA J. THYSSEN, SALGADO

R L, et al. Bionomics of two forensically important blowfly species

Chrysomya megacephala and Chrysomya putoria (Diptera: Calli⁃

phoridae) reared on four types of diet[J]. Forensic Science Interna⁃

tional, 2011, 210(1/2/3): 257-262.

[8] 杨森. 微生物联合蝇蛆转化固体有机废弃物和相关产品的研发

[D]. 博士学位论文, 武汉: 华中农业大学, 2013.

[9] 高萌. 厨余垃圾经大头金蝇幼虫转化养殖塘鱼方法建立及其环

境健康风险评价[D]. 硕士学位论文. 成都: 四川农业大学,

2019.

[10] 曾凡荣. 昆虫人工饲料研究[J]. 中国生物防治学报, 2018, 34

(2): 184-197.

[11] 方杰, 朱麟, 杨振德, 等. 昆虫人工饲料配方研究概况及问题探

讨[J]. 四川林业科技, 2003(4): 18-26.

[12] GREEN P, SIMMONDS M, BLANEY W M. Diet nutriment and

rearing density affect the growth of black blowfly larvae, Phor⁃

mia regina (Diptera: Calliphoridae)[J]. European Journal of Ento⁃

mology, 2003, 100(1): 39-42.

[13] RAMI P V, RAJAN V. A non-meat-based artificial diet and pro⁃

tocol for mass rearing of Chrysomya megacephala (Fab.) (Dip⁃

tera: Calliphoridae), an important pollinator of mango[J]. Current

Science, 2015, 108(1): 17-19.

[14] MOHAMED R, GALIL F, AL-KERIDIS L A, et al. Effect of di⁃

ets on the developmental rate of calliphorid fly of forensic impor⁃

tance Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) [J]. Journal of

Asia-Pacific Entomology, 2021, 24(3): 832-836.

[15] 陈晓明, 黄国忠, 陈济宽, 等. 食用昆虫的营养与应用研究进展

[J]. 中国蜂业, 2021, 72(9): 60-64，68.

（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

项目

人工饲料

猪肉

幼虫发育历期(d)

5.00±0.00b

6.00±0.50a

存活率(%)

76.93±5.13

78.39±1.68

30粒蛹重(g)

2.21±0.13

2.34±0.23

蛹期(d)

4.00±0.00b

4.50±0.50a

羽化率(%)

85.14±5.38

84.23±4.15

表5 大头金蝇幼虫人工饲料优化配方饲养效果

项目

人工饲料

猪肉

雌虫寿命(d)

63.20±6.72

54.67±5.69

产卵前期(d)

9.80±0.45b

12.33±4.62a

产卵期(d)

26.20±1.49a

22.00±5.29b

产卵量(粒)

346.00±43.38

349.00±45.40

孵化率(%)

74.73±3.20

77.22±2.55

表5（续） 大头金蝇幼虫人工饲料优化配方饲养效果

注：同列数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）。

104

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

复合益生菌和酶制剂对猫生长、血清指标、

营养物质表观消化率及粪便菌群的影响

■ 陈 斌１ 姜博文2 段卫帅2 刘婷婷3 蔡 旋4 徐建雄5 张洪才1，2，5*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 230306；2. 深圳豆柴宠物用品有限公司，广东深圳 518000；3.奥特奇生物制品（中国）有限公司，

天津 301599；4.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；5.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240）

作者简介：陈斌，硕士，研究方向为宠物营养与饲料科学。

*通讯作者：张洪才，副研究员，硕士生导师。

收稿日期：2023-03-31

基金项目：豆柴宠物项目[SA1500256]

摘 要：研究旨在探究猫粮中添加复合益生菌和酶制剂对猫营养物质表观消化率、血常规和粪

便菌群的影响。试验将18只英国短毛猫随机分为3组，对照组饲喂基础日粮，A组在基础日粮中添加

0.1%复合益生菌+0.5%酶制剂，B组在基础日粮中添加0.6%复合益生菌+0.6%酶制剂，试验期为63 d，

测定猫生长指标、血常规指标、营养物质表观消化率、粪便菌群丰富度和多样性等指标。结果表明：

①对照组第63天白细胞数量显著升高（P<0.05）。②A组和B组平均日采食量显著低于对照组（P<

0.05），但体重变化差异不显著（P>0.05）；与对照组和 A 组相比，B 组猫的粪便情况显著变好（P<

0.05）。③随着复合益生菌比例的增加，营养物质表观消化率显著提高（P<0.05）。④试验第63天，A

组和B组猫粪便菌群Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数和观测样本指数均高于对照组。⑤与对

照组相比，A组和B组拟杆菌门和纲的相对丰度显著提高（P<0.05）；3组间其他菌群的相对丰度无显

著差异（P>0.05）。说明猫粮中添加复合益生菌和酶制剂可提高猫营养物质表观消化率，改善宠物排

便，从而改善猫机体健康并降低腹泻率，此外还能降低肠道有害菌比例，改善猫肠道菌群结构和提高

抵抗力。

关键词：复合益生菌；酶制剂；猫；表观消化率；血常规指标；粪便菌群

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.10.017

中图分类号：S816.73 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）10-0105-08

Effects of Feeding Compound Probiotics and Enzymes on Growth, Apparent Nutrient

Digestiblity, Blood Routine and Fecal Flora of Pet Cats

CHEN Bin1 JIANG Bowen2 DUAN Weishuai2 LIU Tingting3 CAI Xuan4

XU Jianxiong5 ZHANG Hongcai1,2,5*

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 230306, China;

2. Shenzhen Douchai Pet Products Co., Ltd., Guangdong Shenzhen 518000, China; 3. Alltech Biological

Products (China) Co., Ltd. Tianjing 301599, China; 4. Institute of Animal Husbandry & Veterinary

Science, Shanghai Academy of Agricultural Science, Shanghai 201106, China; 5. School of Agriculture

and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Abstract：The purpose of this study was to investigate the effects of feeding compound probiotics and en⁃

zymes on apparent nutrient digestibility, blood routine and fecal flora of pet cats. The 18 British shorthair

cats were randomly divided into 3 groups, the control group and group A (0.1% compound probiotics +

0.5% complex enzymes) and group B (0.6% com⁃

pound probiotics + 0.6% complex enzymes).The

experiment was lasted for 63 days. Growth index,

blood routine index, nutrient apparent digestibili⁃

ty, fecal flora richness and diversity were mea⁃

sured in thisexperiment. The results showed: ①

105

特 种 养 殖 2023年第44卷第10期 总第679期

近年来，人们将宠物视为自己的伴侣，其健康也

越来越受到人们的重视[1]

。在宠粮中添加复合益生菌、

酶制剂和益生元等[2]

，可有效调节肠道菌群平衡[3-4]

，增

加有益菌数量[5]

，抑制有害菌生长[6]

，改善肠道健康[7]

，

提高营养物质吸收率[8-10]

和提高猫抵抗力等[1]

。如酶

制剂可提高猫日粮中蛋白质和淀粉消化率，减少食糜

黏度[11]

、降低猫腹泻率[12-14]

、提高机体免疫力、减少疾病

发生[15]

和增强特定生理机能等。复合益生菌和酶制剂

在传统畜禽日粮上已有广泛应用[16]

，如在羊日粮中添

加1×1011 CFU/g枯草芽孢杆菌可促进湖羊瘤胃发酵，

提高瘤胃消化酶活性和瘤胃有益菌相对丰度[17]

；在鸡

饲料中添加枯草芽孢杆菌和淀粉芽孢杆菌不仅可提高

鸡蛋中胆固醇含量，也可提高血清总蛋白和总抗氧

化能力，从而提高鸡的免疫水平[18]

；鸡饲料中添加酶

制剂可提高鸡的营养物质代谢率,增加有益菌群数

量和改善肠道菌群结构[19]

。此外也有研究表明，在

幼犬日粮中添加复合益生菌可增强其肠道屏障功能

和防止病菌体的侵害[20]

。单一益生菌和复合酶在动

物上均有应用，但复合益生菌和酶制剂联合应用在

猫上的研究还鲜有报道。因此，本试验探究复合益

生菌和酶制剂对猫生长情况、血常规指标和肠道菌

群的影响，为在猫日粮中添加复合益生菌和酶制剂

提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

复合益生菌和酶制剂由奥特奇生物制品（中国）有

限公司提供。其中双歧杆菌总活菌数为1.2×109 CFU/g，

枯草芽孢杆菌总活菌数为4×1010 CFU/g；酶制剂包含

淀粉酶 1×104 U/g，植酸酶 4×104 U/g，木聚糖酶 2×

104 U/g，纤维素酶 2×104 U/g，果胶酶 2×105 U/g，蛋白

酶2×104 U/g，β-葡聚糖酶1×104 U/g。

1.2 试验设计

选择18只英国短毛猫（公母各半），年龄1~2岁，

平均体重为（4.17±0.56）kg。试验前已进行驱虫及免

疫，未处于孕期、哺乳期、疾病治疗等特殊阶段，试验

前将18只猫饲养在同一个环境下至少45 d。试验期

为63 d。

猫饲养过程都经过上海市农业科学院伦理委员会

审查批准。每只猫单笼饲养，每天早、晚各铲屎1次，

3 d 更换猫砂 1 次，定期打扫猫舍卫生和消毒。每天

定时称取并记录猫的饲喂量和剩余量，记录粪便状态

并评分，整个试验期间保证猫自由进食和饮水。

1.3 日粮样品的收集

对照组猫饲喂的基础猫粮由豆柴宠物用品有限

公司提供，主要是由鸡肉粉、鸡肉、鱼粉、鸡油和鱼油

等制备的全价膨化日粮，其组成及营养水平见表1，饲

The number of leukocytes in the blood of cats in the control group was significantly increased on the day

63 (P<0.05). ② Compared with the control group, the average feed intake of cats in group A and B was

significantly reduced (P<0.05). There were no significant differences in body weight (P>0.05) among the

three groups(P>0.05). Compared with the control group and test group A, the feces of the cats in the test

group B were significantly improved (P<0.05). ③ Moreover, compared with the control group, the appar⁃

ent digestibility of crude protein in the group A was also improved (P<0.05). ④ On the day 63, the

Chao1 index, Shannon index, Simpson index and observed sample index of fecal flora of cats in test

group A and B were all higher than those in the control group. ⑤ Compared with the control group, the

relative abundance of Bacteroides phylum and class of Bacteroides in group A and B group was signifi⁃

cantly increased (P<0.05); There was no significant difference of relative abundances among the three

groups (P>0.05). Therefore, the addition of compound probiotics and compound enzyme to pet cat food

could improve the apparent digestibility of pet cat nutrients and improve pet feces, thereby improving the

body health of cats and reducing the rate of diarrhea. In addition, It could also increase the proportion of

beneficial bacteria, reduce the proportion of opportunistic pathogens, and have a good regulating effect

on the structure of pet cat feces flora.

Key words：compound probiotics; enzymes; cat; apparent nutrient digestibility; blood routine; fecal flora

106

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

喂量为每只猫每天120 g；A组猫饲喂基础日粮+0.1%

复合益生菌+0.5%酶制剂；B组猫饲喂基础日粮+0.6%

复合益生菌+0.6%酶制剂。

表１ 基础日粮组成及营养水平（干物质基础，%）

项目

原料组成

鸡肉粉

鸡肉

鱼粉

鸡油

鱼油

马铃薯粉

木薯粉

褐藻粉

胡萝卜粉

苹果干

食盐

丝兰粉

甜菜粕

磷酸氢钙

冻干鳕鱼松

预混料

合计

营养水平

粗蛋白

粗脂肪

粗纤维

水分

粗灰分

钙

总磷

水溶性氯化物

牛磺酸

含量

43.67

13.89

3.97

10.92

0.99

12.45

2.98

0.10

0.10

0.10

0.40

0.02

4.95

1.49

1.98

1.99

100

36.00

15.00

1.80

5.00

8.00

1.60

1.20

0.45

0.30

注：1. 预混料为每千克日粮提供：Fe 120 mg、Cu 21.25 mg、Mn 40 mg、

Zn 110 mg、Se 0.3 mg、I 0.5 mg、P 0.4 mg、VA 12 000 IU、VD

32 000 IU、VE 66 IU、VK 34.4 mg、VB1 9.90 mg、VB2 9.90 mg、

VB6 17.0 mg、烟酸 60.9 mg、泛酸 43.0 mg、生物素 0.340 mg、

叶酸1.64 mg；

2. 营养水平为计算值。

1.4 营养物质表观消化率的测定

分别在第 1、63 天对猫进行空腹称重，每天早上

08：00 记录猫采食量、观察粪便情况和进行粪便评

分。犬猫粪便的评分标准：5分，含水量极低、干燥、易

碎和呈块状；4 分，粪便表面有清晰可见的纹路和干

裂，容易拾起，基本不在地面有残留；3分，粪便潮湿，

呈圆柱状，从地面捡起时会有残留；2分，粪便湿度较

大，但不是完全呈液态，不易拾起，有时还会在肛周粘

连；1分，完全呈液态粪便。

分别采集3组猫粪样100 g，立即用10%盐酸固氮

处理，在60 ℃条件下烘干至恒重，粉碎，过60目分样

筛，冷藏，备用。采用酸不溶灰分法测定饲日粮营养

物质表观消化率，方法参见标准《饲料中盐酸不溶灰

分的测定》（GB/T 23742—2009）；粗灰分含量采用

550 ℃灼烧法测定，方法参见（GB/T 6438—1992）；干

物质含量测定时参照（GB/T 6435—1986）测定样品水

分含量，再计算干物质含量；粗蛋白含量采用全自动

凯氏定氮仪测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，

方法参照GB/T 6433—2006。

营养物质表观消化率（%）=[1-（A/B×C/D）]×100

式中：A——粪中某营养物质含量（%）；

B——日粮中相应营养物质含量（%）；

C——日粮中酸不溶灰分含量（%）；

D——粪便中酸不溶灰分含量（%）。

1.5 血液样品的制备及生化指标的测定

分别于第0、63天每组随机选取6只猫进行前肢

静脉采血。将血液收集在含乙二胺四乙酸二钾

（EDTA-K2）的乙二胺四乙酸（EDTA）管中，用于血常

规检测。全血血常规指标采用全自动血液学分析仪

进行测量。

1.6 粪便收集和粪便菌群测定

在第 1、63 天分别收集各组每个重复的新鲜粪

便，并立即置于-80 ℃冰箱保存。将粪便样品进行

16SrDNA V3~V4区域的扩增、测序及数据分析。对测

得的序列进行质控过滤后，在97%的相似水平下进行

操作分类单元（OTU）聚类和生物信息统计分析，接着

进行α-多样性β-多样性分析；最后在各分类水平上进

行群落结构的统计分析。

1.7 数据处理与分析

统计结果用 SPSS 23.0 单因子方差分析（oneway ANOVA）和最小显著差数法（LSD）进行，结果用

“平均值±标准差”来表示，P<0.05为差异显著，P>0.05

表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌和酶制剂对猫采食量及体重影响

饲养试验期间，3组猫食欲正常，体重基本不变，

精神状态良好，毛色有光泽。由表2可见，对照组、A组

和B组猫平均日采食量分别是102.10、88.67、96.06 g，

A 组和 B 组显著低于对照组（P<0.05）；3 组体重均上

升，对照组、A 组和 B 组分别增加 0.06、0.03、0.10 kg，

但差异不显著（P>0.05）；B组猫粪便情况显著好于对

照组和A组（P<0.05），并且软便情况减少。

107

特 种 养 殖 2023年第44卷第10期 总第679期

2.2 复合益生菌和酶制剂对猫营养物质表观消化率

的影响

由表3可见，对照组、A组和B组干物质表观消化

率分别为74.08%、76.85%和87.55%，B组显著高于对

照组和A组（P<0.05），B组粗蛋白和粗脂肪表观消化

率B组也显著高于对照组和A组（P<0.05）。

项目

红细胞数量(×1012/L)

血红蛋白浓度(g/dL)

平均红细胞血红蛋白浓度(g/dL)

平均红细胞血红蛋白量(pg)

红细胞分布宽度变异系数(%)

红细胞压积(%)

平均红细胞体积(fL)

对照组

0 d

16.16±2.17a

22.04±3.40a

30.72±1.18

13.64±0.93

31.68±2.11a

72.04±12.68a

44.44±3.18

63 d

8.22±1.28b

10.83±1.84b

32.63±0.86

13.17±1.14

24.05±2.36b

33.12±5.93b

40.47±4.14

A组

0 d

13.86±2.61a

20.64±2.17a

32.94±3.54

15.44±4.10

28.74±4.00a

63.08±8.84a

46.36±7.29

63 d

8.53±1.23b

11.83±2.37b

32.45±1.15

13.80±1.25

23.80±1.30b

36.68±8.33b

42.57±4.72

B组

0 d

14.81±3.93a

19.78±5.25a

31.04 ±2.85

13.36 ±0.36

30.64±3.95a

64.98±20.34a

43.28 ±4.21

63 d

8.19±2.12b

10.80±2.39b

32.27±2.67

13.37±1.16

23.60±2.66b

34.08±9.07b

41.57±3.18

表4 复合益生菌和酶制剂对猫血液中红细胞相关指标的影响

2.3 复合益生菌和酶制剂对猫血常规指标的影响

2.3.1 复合益生菌和酶制剂对猫血液中红细胞相关

指标的影响

由表4可见，3组中平均红细胞血红蛋白浓度、平

均红细胞血红蛋白量和平均红细胞体积无显著差异

（P>0.05）。第 63 天各组间红细胞数量、血红蛋白浓

度、红细胞分布宽度变异系数和红细胞压积差异不

显著（P>0.05）。

2.3.2 复合益生菌和酶制剂对猫血液中白细胞相关

指标的影响

由表 5 可见，对照组、A 组和 B 组全血白细胞

数目均处于正常范围，第 0 天对照组、A 组和 B 组

全血白细胞数目无显著差异（P>0.05）；但第 63 天，

与对照组相比，A 组和 B 组白细胞数显著降低（P<

0.05），A 组和 B 组无显著差异（P>0.05）。3 组间单

核细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数无显著差异

（P>0.05）。

2.3.3 复合益生菌和酶制剂对猫血液中血小板相关

指标的影响

由表6可见，第63天，与对照组相比，A组和B组

血小板数显著降低（P<0.05），A组和B组间无显著差

异（P>0.05）；3组平均血小板压积、平均血小板体积无

显著差异（P>0.05）。

2.4 基于操作分类单元（OTU）水平分析

采用 Illumina Miseq 高通量测序平台进行测序，

然后进行去引物、拼接、质量过滤、去重和聚类等步

骤，总样本测出1 772 577条高质量序列，序列长度分

布 范 围 为 50~441 bp，平 均 长 度 为 414 bp。 使 用

Vsearch方法建立OTU聚类，得到18个粪便样本OTU

数为 924。由图 1 可见，对照组、A 组和 B 组第 0 天和

第63天6组共有OTU数为569，对照组第0天OTU数

是 24，A 组第 0 天 OTU 数是 73，而 B 组第 0 天 OTU 数

表2 复合益生菌和酶制剂对猫采食量及体重影响

项目

平均日采食量(g)

体重变化(kg)

粪便评分

对照组

102.10±17.51a

0.06±0.12

3.19±0.63b

A组

88.67±22.23b

0.03±0.18

3.34±0.91b

B组

96.06±19.78b

0.10±0.94

3.72±0.64a

注：同行数据肩标无字母或含有相同小写字母表示差异不显著（P>0.05），不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05）；

下表同。

项目

干物质

粗蛋白

粗脂肪

对照组

74.08±6.61b

81.69±1.91b

92.98±1.04b

A组

76.85±3.01b

81.21±1.24b

91.72±1.04b

B组

87.55±1.63a

85.89±1.12a

94.39±1.47a

表3 复合益生菌和酶制剂对猫营养物质表观消化率的影响(%)

108

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

项目

白细胞数(WBC，×109

/L)

淋巴细胞数(Lym，×109

/L)

单核细胞数(Mon，×109

/L)

中性粒细胞数(NEU，×109

/L)

嗜碱性粒细胞数量(BASO，×109

/L)

嗜酸性粒细胞数(Eos，×109

/L)

淋巴细胞百分比(Lym，%)

单核细胞百分比(Mon，%)

中性粒细胞百分比(NEU，%)

嗜碱性粒细胞百分比(BASO，%)

嗜酸性粒细胞百分比(Eos，%)

对照组

0 d

12.50±4.69b

3.25±1.42

0.66±0.20

7.89±2.92

0.05±0.03

0.65±0.49

25.84±6.67

5.50±1.25

63.32±5.22

0.42±0.13

4.92±2.59

63 d

23.49±8.50a

5.59±2.71

0.82±0.26

15.11±6.24

0.12±0.06

1.49±0.92

23.48±6.05

5.45±1.35

63.70±5.50

0.55±0.34

6.82±4.99

A组

0 d

9.32±4.13b

2.04±0.67

0.72±0.56

5.94±3.43

0.12±0.15

0.51±0.53

24.42±9.31

7.76±4.17

61.08±12.67

1.06±0.99

5.68±4.98

63 d

14.55±3.91b

3.82±0.92

0.82±0.26

9.14±3.51

0.07±0.05

0.70±0.41

27.85±10.33

5.73±1.54

61.38±10.06

0.47±0.29

4.57±1.61

B组

0 d

7.19±3.50b

1.84±1.06

0.59±0.36

4.36±2.30

0.04±0.03

0.36±0.25

26.54±8.97

8.06±5.90

60.42±7.43

0.52±0.22

4.46±2.09

63 d

13.62±4.41b

3.81±1.80

0.91±0.32

8.06±2.88

0.06±0.05

0.53±0.16

27.00±4.92

6.72±1.80

58.25±8.16

0.37±0.26

4.18±1.94

表5 复合益生菌和酶制剂对猫血液中白细胞相关指标的影响

项目

血小板数(×109

/L)

平均血小板体积(fL)

血小板压积(%)

对照组

0 d

139.40±66.01ab

14.18±1.66

0.40±0.18a

63 d

392.00±76.17c

14.48±1.72

0.57±0.12b

A组

0 d

136.40±95.74ab

14.42±1.42

0.20±0.09a

63 d

281.00±150.82b

14.58±1.40

0.43±0.08b

B组

0 d

78.60±56.94a

15.40±4.03

0.13±0.09a

63 d

260.67±63.34b

16.58±1.31

0.19±0.13b

表6 复合益生菌和酶制剂对猫血液中血小板相关指标的影响

是 59。对照组和 A 组第 63 天 OTU 数都是 29，而 B 组

第63天OTU数是141。表明酶制剂可提高宠物粪便

物种多样性。

注：A：对照组，第0天；B：A组，第0天；C：B组，第0天；D：对照组，

第63天；E：A组，第63天；F：B组，第63天；下图同。

图1 OTU花瓣图

2.5 α-多样性分析

α-多样性指数表示单个样本的物种多样性，包括

Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数和观测样本指

数等，这四个指数的大小，表明样本中物种多样性的

丰富程度[21-22]

。本试验中所有样本的平均测序深度指

数为 0.991，测序深度指数都在 0.989 以上，说明试验

中所有样本都满足要求。

由图 2 可见，B 组的 Chao1 指数、Shannon 指数、

Simpson指数（QIIME2）和观测样本指数均高于A组和

对照组，同时A 组略高于对照组，这表明B 组的粪便

菌群丰度及多样性最高，对照组粪便菌群丰度及多样

性最低。 PCo2[17.1%]

-0.1 0.0 0.1 0.2 0.5

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

-0.05

-0.10

-0.15

-0.20

-0.25

-0.30

0.3 0.4

PCo1[18.3%]

图2 α-多样性

2.6 β-多样性分析

图 3 为基于 Unweighted Unifrac 距离的 PCoA，横

坐标（PCo1）表示第1个主成分，纵坐标（PCo2）表示第

2个主成分，其中主成分对样品差异的贡献值分别为

18.3%和17.1%。3组的9个样本分开较明显，对照组

和A 组相对分开，而B 组内样本相对聚集在一起，表

明B组内菌群组成相似。

2.7 物种及其丰度分析

2.7.1 门水平上的优势菌群分布

109

特 种 养 殖 2023年第44卷第10期 总第679期

由表7可见，A组和B组拟杆菌门的相对丰度显

著高于对照组（P>0.05）；B组和A组放线菌门的相对

丰度显著低于对照组（P>0.05）。3组间厚壁菌门和变

形菌门相对丰度差异不显著（P>0.05）。

注：图中每个点表示 1个样本，同一组的样本使用同一种颜色和形状表示。

图3 基于UnweightedUnifrac距离的主坐标分析

A B C D F

3 000

2 500

2 000

1 500

P=0.098

E A B C D F

8

7

6

P=0.074

E

A B C D F

1.00

0.95

0.90

0.85

P=0.14

E A B C D F

P=0.045

E

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

项目

厚壁菌门（Firmicutes）

拟杆菌门（Bacteroidetes）

放线菌门（Actinobacteria）

变形菌门（Proteobacteria）

对照组

47.34±12.83

29.45±4.20b

19.09±4.57a

3.37±4.64

A组

49.63±6.02

40.40±1.78a

5.31±6.71b

2.07±1.15

B组

48.90±3.54

45.08±3.62a

4.76±1.72b

0.92±0.44

表7 门水平上的优势菌群分布

项目

拟杆菌纲（Bacteroidia）

梭菌纲（Clostridia）

红蝽菌纲（Coriobacteriia）

丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）

放线菌纲（Actinobacteria）

β-变形菌纲（Betaproteobacteria）

梭杆菌纲（Fusobacteria）

对照组

29.12±3.85c

42.29±8.15

13.38±0.89a

5.17±1.11b

5.69±1.06b

1.78±2.30b

0.31±0.48

A组

41.40±3.48b

44.60±5.85

5.02±2.00b

3.51±0.54b

0.28±0.29a

1.23±0.54b

2.14±0.86

B组

48.42±1.03a

36.10±0.66

3.30±1.87b

8.73±0.88a

1.47±1.41a

0.25±0.05a

0.08±0.05

表8 纲水平上的优势菌群分布

2.7.2 纲水平上的优势菌群分布

猫粪便菌群在纲水平上主要分布于 11 个菌纲。

由表8可见，3组间猫粪便中拟杆菌纲的相对丰度均

差异显著（P<0.05），其中B组的相对丰度最高；A组和

B 组猫粪便中放线菌纲的相对丰度均显著低于对照

组（P<0.05）。

2.7.3 属水平上的优势菌群分布

猫粪便菌群在属水平上主要分布于 10 个菌

属。由表 9 可见，对照组梭菌属的相对丰度最高，显

著高于 A 组和 B 组（P<0.05）；拟杆菌属和小杆菌属

110

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第10期 总第679期

项目

普氏菌属（Prevotella）

巨球形菌属（Megasphaera）

梭菌属（Clostridium）

拟杆菌属（Bacteroides）

巨单胞菌属（Megamonas）

柯林斯氏菌属（Collinsella）

小杆菌属（Dialister）

小球菌属（Subdoligranulum）

对照组

41.26±14.12

8.82±6.56

9.01±5.80a

1.42±1.22 a

2.09±1.14

2.88±1.79

0.41±0.57a

1.58±0.85

A组

31.85±20.06

7.24±7.95

2.34±1.68b

5.81±6.53 b

3.99±1.19

1.28±1.60

6.45±5.23b

4.26±5.09

B组

18.20±14.40

11.03±18.90

0.84±0.80b

5.80±5.40 b

7.43±10.31

1.55±0.92

2.56±3.94b

2.22±2.22

表9 属水平上的优势菌群分布

相对丰度则对照组最低，显著低于 A 组和 B 组（P<

0.05）。3 组间猫粪便菌群中普氏菌属、巨球形菌

属、巨单胞菌属、柯林斯氏菌属和小球菌属的相对

丰度无显著差异。

3 讨论

3.1 复合益生菌和酶制剂对猫采食量及营养物质表

观消化率影响

尽管 3 组猫平均日采食量稳定，没有明显的变

化，但是复合益生菌和酶制剂可在一定程度上减少

猫采食量，而使体重无显著变化，日粮的消化吸收利

用率明显升高，这与在畜禽上的应用效果一致[23-24]

。

猫日粮中添加复合益生菌和酶制剂可有效地降低

腹泻率和软便率，并提高粪便评分，这可能与猫肠

道屏障功能提高、有益菌群数量增加及肠道菌群改

善有关。由于 A 组和 B 组营养物质表观消化率高于

对照组，表明复合益生菌和酶制剂可提高猫对营养

物质的消化吸收率，与王斐等[25]

在猫日粮中添加益

生芽孢杆菌，结果营养物质表观消化率和机体抗氧

化功能提高，猫机体健康、改善腹泻率的研究结果

一致。

3.2 复合益生菌和酶制剂对猫血常规指标的影响

炎症常引起机体血液中白细胞数量的变化，当

白细胞数量变多，则表明机体存在炎症[26-27]

。A组和

B 组血液中白细胞总数显著低于对照组，表示炎症

较轻；此外单核细胞与淋巴细胞协同作用参与机体

特异性免疫反应[28]

。当机体发生特定疾病时可引起

单核细胞和淋巴细胞数目发生改变[29]

。试验组猫血

液中的单核细胞数目与对照组相比降低，淋巴细胞

数目也有降低的趋势，可能是由于猫受某些因素影

响导致机体发生炎症反应，而益生菌可改善猫机体

健康。

3.3 复合益生菌和酶制剂对猫粪便菌群的影响

肠道菌群对宿主肠道结构功能、营养物质代谢和

机体免疫调节等具有重要影响[30]

，然而致病菌（如大

肠杆菌）的数量会影响机体健康程度和免疫调节能力

等[31]

。本试验结果表明，B组猫粪便菌群丰度及多样

性较高，对照组猫粪便菌群丰度及多样性较低。试验

组肠道菌群的物种丰富度和多样性能得到提高，有利

于肠道菌群平衡和机体健康。梁琳[32]

的研究也表明，

腹泻组猫的菌群多样性指数和丰度指数的平均值均

低于正常组猫。

在不同分类等级中，对照组拟杆菌门、纲、目、科

和属的相对丰度均显著低于 A 组和 B 组。拟杆菌是

肠道的优势菌，研究表明拟杆菌能提高营养物质利用

率、改善肠道菌群平衡及机体免疫系统[22，33-34]

。复合

益生菌中枯草芽孢杆菌在肠道内能产生抗菌物质，从

而改善肠道菌群结构[35]

。变形菌门是胃肠道中一类

适应性强、具有潜在致病性的常见菌，其丰度变化可

直接对宿主健康产生影响[36]

。本试验结果表明，B组

猫粪便菌群中的β-变形菌纲相对丰度均低于对照组

和A组，其中A组猫粪便菌群中的β-变形菌纲相对丰

度低于对照组。因此，试验组日粮可抑制致病菌生长

以及改善猫肠道菌群平衡。

４ 结论

在基础日粮中添加复合益生菌和酶制剂可提高

营养物质表观消化率，在一定程度上降低腹泻率、减

少软便率并改善粪便评分。此外也可提高猫粪便菌

群丰富度和多样性，降低有害菌群比例，增加有益菌

群所占比例，有益于猫的肠道健康。

参考文献

[1] 包书芳, 罗佩先, 陈燕妮. 宠物肠道健康与营养调控研究[J]. 兽

医导刊, 2021(5): 91-92.

[2] 毛爱鹏, 孙皓然, 张海华, 等. 益生菌、益生元、合生元与犬猫肠

道健康的研究进展[J]. 动物营养学报, 2022, 34(4): 2140-2147.

111

特 种 养 殖 2023年第44卷第10期 总第679期

[3] YANG J, WANG C, HUANG K, et al. Compound Lactobacillus

sp. administration ameliorates stress and body growth through gut

microbiota optimization on weaning piglets[J]. Applied Microbiolo⁃

gy and Biotechnology, 2020, 104(15): 6749-6765.

[4] BASTOS T S, DE LIMA D C, SOUZA C M M, et al. Bacillus subti⁃

lis and Bacillus licheniformis reduce faecal protein catabolites con⁃

centration and odour in dogs[J]. BMC Veterinary Research, 2020,

16(1): 116.

[5] HOD K, DEKEL R, AVIV COHEN N, et al.The effect of a multi⁃

species probiotic on microbiota composition in a clinical trial of

patients with diarrhea- predominant irritable bowel syndrome[J].

Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the Eu⁃

ropean Gastrointestinal Motility Society, 2018, 30(12): e13456.

[6] JANK R, THOMASON L A M, STANISZ A M, et al. Magnetic res⁃

onance spectroscopy reveals oral Lactobacillus promotion of in⁃

creases in brain GABA, N-acetyl aspartate and glutamate[J]. Neu⁃

roImage, 2016, 125: 988-995.

[7] CHANG J, WANG T, WANG P, et al. Compound probiotics allevi⁃

ating aflatoxin B1 and zearalenone toxic effects on broiler produc⁃

tion performance and gut microbiota[J]. Ecotoxicology and Environ⁃

mental Safety, 2020,194: 110420.

[8] HU S, CAO X, WU Y, et al. Effects of probiotic Bacillus as an al⁃

ternative of antibiotics on digestive enzymes activity and intestinal

integrity of piglets[J].Frontiers in Microbiology, 2018(9): 2427.

[9] WANG J, JI H. Influence of probiotics on dietary protein diges⁃

tion and utilization in the gastrointestinal tract[J].Current Protein

& peptide Science, 2019, 20(2): 125-131.

[10] DICKS L M T, GELDENHUYS J, MIKKELSEN L S, et al. Our

gut microbiota: a long walk to homeostasis[J]. Beneficial Mi⁃

crobes, 2018, 9(1): 3-20.

[11] 李旦旦, 王兴吉, 王克芬, 等. 复合酶制剂在宠物行业中的应用

进展[J]. 饲料研究, 2021, 44(12): 153-155.

[12] D'ANGELA S, FRACASSI F, BRESCIANI F, et al. Effect of Sac⁃

charomyces boulardii in dog with chronic enteropathies: doubleblinded, placebo- controlled study[J]. The Veterinary Record,

2018,182(9): 258.

[13] ROSE L, ROSE J, GOSLING S, et al. Efficacy of a probiotic-pre⁃

biotic supplement on incidence of diarrhea in a dog shelter:a ran⁃

domized, double- blind, placebo- controlled trial[J]. Journal of

Veterinary Internal Medicine, 2017, 31(2): 377-382.

[14] 黄健, 邓红. 枯草芽孢杆菌和壳聚糖对幼狗生长和健康的影响

[J]. 畜禽业,2019,30(11): 14-15.

[15] DI CERBO A, MORALES- MEDINA J C, PALMIERI B, et al.

Functional foods in pet nutrition: focus on dogs and cats[J]. Re⁃

search in Veterinary Science, 2017, 112: 161-166.

[16] GUO M J, LI M T, ZHANG C C, et al. Dietary administration of

the Bacillus subtilis enhancesimmune responses and disease re⁃

sistance in chickens[J]. Froniers in Microbioogyl, 2020(11): 1768.

[17] 刘俊斌, 张利平, 宋淑珍. 枯草芽孢杆菌对湖羊胃肠道发育、瘤

胃发酵参数及微生物区系的影响[J]. 动物营养学报, 2022, 34

(9): 5984-5994.

[18] 刘冰冰. 饲料中添加枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌对鸡的产

蛋率、免疫水平及鸡蛋品质的影响[D]. 硕士学位论文. 沈阳: 辽

宁大学, 2022.

[19] 段俊辉. 复合酶制剂对肉鸡生产性能、养分代谢率的影响[D].

硕士学位论文. 晋中:山西农业大学, 2019.

[20] 陆江, 朱道仙, 卢鹏飞, 等. 补喂复合益生菌对幼犬生长性能、

肠道动力及肠道屏障功能的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31

(9): 4242-4250.

[21] 曹护群. 犬源复合益生菌对脾虚犬肠道菌群及消化和免疫功能

的影响[D]. 硕士学位论文. 合肥: 安徽农业大学, 2020.

[22] 曹护群, 贺濛初, 舒迎霜, 等 .犬源复合益生菌对脾气虚犬盲肠

菌群的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(8): 3810-3820.

[23] 苏海燕. 枯草芽孢杆菌制剂对仔猪生长性能的影响[D]. 硕士学

位论文. 长沙: 湖南农业大学, 2010.

[24] 唐千甯. 高粱饲粮中添加复合酶和益生菌对肉鸡的生长及养分

消化率的影响[D]. 硕士学位论文. 长沙: 湖南农业大学, 2016.

[25] 王斐, 李响, 徐树杰, 等. 复合芽孢杆菌对猫生长、养分表观消

化率及健康的影响[J]. 动物营养学报, 2022, 34(4):2596-2605.

[26] 阮裕武. 简谈宠物血常规检验的分析判断[J]. 黑龙江畜牧兽

医, 2012(20): 32-34.

[27] 王朝好, 孙皓然, 刘晓雅, 等. 不同猫粮对猫应激刺激后生理指

标和血液指标的影响[J].动物营养学报, 2020, 32(11): 5458-

5471.

[28] OLINGY, C E, DINH, H Q, Hedrick C C. Monocyte heterogene⁃

ity and functions in cancer[J]. Journal of Leukocyte Biology,

2019,106(2): 309-322.

[29] KRATOFIL R M, KUBES P, DENISET J F. Monocyte conver⁃

sion During inflammation and injury[J]. Arteriosclerosis,Thrombo⁃

sis,and Vascular Biology, 2017, 37(1): 35-42.

[30] DELZENNE N M, CANI P D. Interaction between obesity and

the gut microbiota: Relevance in nutrition[J]. Annual Review of

Nutrition, 2011, 31: 15-31.

[31] 孙文恺, 刘强, 刘洋, 等. 载锌凹凸棒石对断奶仔猪肠道免疫功

能、食糜挥发性脂肪酸及粪便菌群的影响[J]. 畜牧与兽医,

2020,52(1): 43-49.

[32] 梁琳. 健康猫与腹泻猫粪便菌群比较及腹泻相关的实验室检测

[D]. 硕士学位论文. 长沙: 湖南农业大学, 2019.

[33] WANG C, SHI C, ZHANG Y, et al. Microbiota in fermented feed

and swine gut[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2018,

102(7): 2941-2948.

[34] WEXLER A G, GOODMAN A L. An insider's perspective: Bacte⁃

roides as a window into the microbiome[J]. Nature Microbiology,

2017, 2(5): 17026.

[35] 向亚萍, 陈志谊, 罗楚平, 等. 芽孢杆菌的抑菌活性与其产脂肽

类抗生素的相关性[J].中国农业科学, 2015, 48(20): 4064-4076.

[36] 郭仕辉, 余永涛, 万佳宏, 等. 变形菌门与哺乳动物结肠肠道菌

群失调相关研究进展[J]. 中国微生态学杂志, 2022, 34(4): 479-

484.

（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

112