二、研究成果

96

四、结论与展望

以上细胞试验结果有力证明了单独及混合霉菌毒素 AFB1 和 AFM1 对肠道

屏障的毒性作用。并且，AFB1 和 AFM1 存在着交互作用。牛奶中的霉菌毒素

可能会对人体肠道造成一定的负面影响，从而引发肠道相关疾病。因此，进一

步研究霉菌毒素在体内生理吸收、代谢、转化规律十分必要。建议在食品中、

尤其是婴幼儿配方食品中优化相关的霉菌毒素尤其是 AFB1 的安全限量标准。

研究成果已在学术期刊《Toxins》2021 年第 13 期上发表。该研究得到国家

自然科学基金（31972190）和现代农业产业技术体系专项资金（CARS-36）等

项目支持，高亚男和包晓宇为共同第一作者，郑楠博士为通讯作者。

——Y. N. Gao, X. Y. Bao, L. Meng, H. M. Liu, J. Q. Wang, N. Zheng*,

Aflatoxin B1 and Aflatoxin M1 Induce Compromised Intestinal Integrity through

Clathrin-Mediated Endocytosis. 2021, 13, 184.

二、研究成果

97

工业区牧场生乳中重金属的风险评估

奶牛养殖环境是保障生乳安全的基本和前提条件，随着人口增长、工业化

和城市化进程的加快，各种污染物被排放到环境中。一些重金属已广泛分布在

环境中，特别是 Cr（铬）、As（砷）、Cd（镉）和 Pb（铅），促进了它们进

入人类食物链对人类健康产生负面影响。美国毒物和疾病登记署（ATSDR）根

据毒性、发生率和人类暴露的可能性，制定了应优先考虑的食品污染物清单，

其中 As、Pb、Cd 和 Cr 被列为了第 1、第 2、第 7 和第 17 位。为了保障人类健

康，我国将生乳中 As、Cr 和 Pb 的限量分别定为 0.1、0.3 和 0.05 mg/kg。生乳

中这些重金属的含量不仅可以作为牛奶卫生的直接指标，也可以作为生乳生产

地区环境污染的间接指标。

重金属污染源包括采矿、靠近道路、燃料燃烧和工业活动。我们假设，由

于工业活动，如果当地水、土壤和青玉米中的重金属含量较高，当地饲养的奶

牛所产生乳中的重金属含量就会升高。

本研究从河北唐山、天津、内蒙古呼和浩特工业区垃圾焚烧场、水泥场附

近 18 个牧场，山东潍坊、黑龙江齐齐哈尔农区 2 个牧场采集样本。评估工业活

动对牧场生乳、水、饲料和土壤中 Cr、As、Cd 和 Pb 污染水平的影响，探索生

乳、青贮玉米、水和土壤中重金属之间的关系，以及重金属从环境到生乳的可

能途径，并对当地居民通过牛奶暴露重金属的风险进行了评估。

生乳中 Cr、As、Cd 和 Pb 的含量范围分别为 0.54–10.61、0.10–1.49、0.02–

0.39 和 ND–15.22 μg/kg（表 1）。工业区生乳中 Cr 和 As 的含量分别为

2.41±2.12 和 0.44±0.31 μg/kg，显著高于非工业区的 1.10±0.15 和 0.25±0.09 μg/kg

（P<0.01）（图 1）。

二、研究成果

表 1 工业区和非工业区牧场生乳样品重金属含量(µg/kg)

N Cr As Cd Pb 非工业区 I 5 平均值±标准差 1.17±0.15bc 0.33±0.03c 0.05 ± 0.02 c 0.45 ± 0.07 b

范围 1.06–1.37 0.31–0.38 0.04–0.09 0.40–0.56

II 5 平均值±标准差 1.04±0.15c 0.17±0.02b 0.11 ± 0.04 ab 0.94 ± 0.19 b

范围 0.87–1.28 0.13–0.19 0.04–0.15 0.74 –1.18

工业区 III 25 平均值±标准差 1.18±0.22c 0.24±0.09bc 0.13 ± 0.09 a 4.46 ± 2.45 a

范围 0.90–1.89 0.12–0.53 0.04–0.41 2.26 –12.68

IV 35 平均值±标准差 1.86±1.24b 0.42±0.24a 0.11 ± 0.06 a 2.68 ± 3.60 b

98

范围 0.54–7.03 0.16–1.47 0.02–0.31 ND–15.22

V 30 平均值±标准差 4.09±2.72a 0.64±0.38a 0.09 ± 0.08 bc 2.29 ± 3.10 b

范围 0.87–10.61 0.10–1.49 0.02–0.39 ND–10.12

合计 100 平均值±标准差 2.28±2.01 0.42±0.40 0.10±0.07 2.18 ± 3.16

范围 0.54–10.61 0.10–1.49 0.02–0.39 ND–15.22

限量 300 100 20 50

注：N表示样本数；I、 II、III、IV和V分别代表齐齐哈尔、潍坊、唐山、天津和呼和浩特；同一列中上标小写字母（a、b、

c）不同表示有显著差异（P<0.05）。

二、研究成果

99

图 1. 工业区和非工业区生乳中重金属浓度的比较

工业区和非工业区青贮玉米中 Cr、As、Cd 和 Pb 的浓度分别为 1.57–4.84、

0.06–0.29、0.01–0.09 和 0.26–1.17 mg/kg 和 1.05–1.66 0.05–0.11 0.02–0.03 和

0.16–0.22 mg/kg。工业区和非工业区水中 Cr、As、Cd 和 Pb 的浓度范围分别为

ND–4.93、0.15–2.80、ND–0.040 和 0.01–0.10 μg/L 和 0.07–0.38、0.30–0.47、

0.001–0.005 和 0.09–0.15μg/L。工业区和非工业区土壤中 4 种重金属的含量范围

分别为 42–218、3.73–17.30、0.06–0.27 和 21–42 mg/kg、59–133、5.48–10.20、

0.09–0.10 和 24–29 mg/kg。青贮玉米中 Cr、As、Cd 和 Pb 的含量低于中国的限

量标准。水中的 Cr、As、Cd 和 Pb 浓度低于中国饮用水的限量，土壤中的 Cr、

As、Cd 和 Pb 浓度低于中国农业土壤的风险筛选值。

表 2 工业区和非工业区牧场奶牛饮水、土壤、TMR 和青贮饲料重金属

重金属 非工业区 工业区 限量

青贮玉米(mg/kg)

Cr 1.05–1.66 1.57–4.84 5

As 0.05–0.11 0.06–0.29 2

Cd 0.02–0.03 0.01–0.09 1

Pb 0.16–0.22 0.26–1.17 30

水 (μg/L)

Cr 0.07–0.38 ND–4.93 50

As 0.30–0.47 0.15–2.80 10

Cd 0.001–0.005 ND–0.040 5

二、研究成果

100

Pb 0.09–0.15 0.01–0.10 10

土 (mg/kg)

Cr 59–133 42–218 250 a

As 5.48–10.20 3.73–17.30 240 a

Cd 0.09–0.10 0.06–0.27 0.8 a

Pb 24–29 21–42 170 a

注: a 农业土壤风险管理(pH > 7.5 mg/kg) .

生乳和青贮玉米中的 Cr 含量呈中度正相关（r=0.626），而生乳中的 Cr 含

量与饮水中的 Cr 含量几乎没有相关性（r=0.041），与土壤中的 Cr 含量呈弱负

相关（r=0.344）。生乳和水中 As 浓度呈中度正相关（r=0.637），而生乳浓度

与青贮玉米浓度呈弱正相关（r=0.326）。生乳与土壤 As 含量呈弱负相关（r=-

0.112）。生乳 Cd 浓度与青贮玉米（r=0.676）和土壤（r=0.557）呈中度正相

关。生乳和水样中的 Cd 浓度呈弱正相关（r=0.119）。生乳中 Pb 含量与青贮玉

米中 Pb 含量（r=0.194）和土壤中 Pb 含量（r=0.327）呈弱正相关，而与水中 Pb

含量（r=0.046）几乎没有相关性。

青贮玉米中 Cr 浓度与土壤浓度呈中度正相关（r=0.604），As 浓度与水分

浓度呈中度正相关（r=0.556）。青贮玉米中 Cd、Pb 含量与土壤浓度呈中度正

相关（r=0.739，r=0.654），与水浓度呈弱正相关（r=0.444，r=0.424）。推断生

乳中 Cr 的来源可能是土-青贮玉米-生乳，As 来源可能是水-青贮玉米-生乳或水生乳，而 Cd 的来源可能通过土（水）-青贮玉米-生乳，其他饲料原料可能是生

乳 Pb 重要来源。

表 3 生乳、青贮玉米、水和土中重金属相关性分析

Cr As Cd Pb

生乳-青贮玉米 0.626 ** 0.326 0.676 ** 0.194

生乳-水 0.041 0.637 ** 0.119 0.046

生乳-土 0.344 −0.112 0.557 * 0.327

青贮玉米-水 0.076 0.556 * 0.444 * 0.424

二、研究成果

101

青贮玉米-土 0.604 ** 0.180 0.739 ** 0.654 **

水-土 −0.045 0.113 0.237 0.341

注: * P < 0.05, ** P < 0.01.

(a) (b)

图 2. 3 至 69 岁人群的铬和镉暴露值（μg/kg/天）与 TDI 和 PTDI 的比较。

膳食暴露是评估食品污染物和确定潜在健康风险的有效方法。本研究计算

了不同年龄（3–69 岁）人群通过牛奶暴露 Cr、As、Cd 和 Pb 的 EDI 值。女性和

男性的 Cr、As、Cd 和 Pb 结果分别为 0.0120–0.0758、0.0022–0.0138、0.0005–

0.0035 和 0.0151–0.0959 μg/kg/d 和 0.0101–0.0726、0.0018–0.0132、0.005–0.0033

和 0.0128–0.0919 μg/kg/d。这些重金属的 EDI 值低于 Cr、As、Cd 和 Pb 的 RfD

值（分别为 3.0、0.3、1 和 4 μg/kg/d）。通过牛奶暴露 Cr 的 EDI 值远低于 TDI

（0.9 μg/kg BW）暴露 Cd 的 EDI 低于 TDI (0.9 μg/kg BW)。

图 3 总结了 3 至 69 岁人群通过牛奶暴露重金属的目标危害商（THQ）和危

害指数（HI）。暴露 Cr、As、Cd、Pb 的 THQ 值与年龄呈负相关。As、Cr、Pb

和 Cd 对总 THQ 的贡献率分别为 46.64%、25.54%、24.30%和 3.52%。

二、研究成果

102

图 3. 3 至 69 岁人群饮用牛奶后四种重金属暴露的目标危害商（THQ）和危

害指数（HI）。

结论：工业区奶牛生乳中 Cr、As 含量显著高于非工业区奶牛生乳中 Cr、

As 含量。生乳中 Cr 的来源途径可能是土-青贮玉米-生乳，As 可能是水-青贮玉

米-生乳或水-生乳，而 Cd 的来源可能通过土（水）-青贮玉米-生乳，其他饲料

原料可能是生乳 Pb 重要来源。通过牛奶暴露 Cr、As、Cd 和 Pb 对消费者造成

的健康风险低。鉴于工业污染会引起生乳中重金属含量升高，强烈建议对牛场

建立一个连续的生乳监测系统，特别是在受高浓度重金属污染的地区。

研究成果已于 2021 年 11 月发表在《Toxics》杂志。该成果由生乳中环境

污染物风险评估项目、中国农业科学院科技创新工程和现代农业产业技术体系

专项资金资助，第一作者苏传友、高亚男，通讯作者郑楠、王加启。

——Chuanyou Su †, Yanan Gao †, Xueyin Qu, Xuewei Zhou, Xue Yang,

Shengnan Huang, Lei Han, Nan Zheng* and Jiaqi Wang *. The Occurrence,

Pathways, and Risk Assessment of Heavy Metals in Raw Milk from Industrial Areas

in China. Toxics. Toxics. 2021, 9(12), 320

二、研究成果

103

3. 奶产品营养功能评价

热处理条件对牛奶乳清蛋白组分含量的影响

蛋白质是构成免疫力防御功能的物质基础，而乳清蛋白是免疫监视、防御和

调控的最重要小分子蛋白质，被认为是“蛋白之王”。因乳清蛋白对热敏感，需要

开展乳品加工热处理影响乳清蛋白活性的研究，从而为提升奶类品质提供基础证

据。

热处理导致牛奶中的乳清蛋白性质及其营养成分发生变化。本研究基于

TMT 10-plex labels 蛋白组定量技术，对比分析了巴氏杀菌（85°C）和超高温灭

菌（UHT, 135℃）条件对牛奶乳清蛋白成分的改变。试验共鉴定到 223 种蛋白，

这些蛋白主要参与了内肽酶活性负调控的生物学过程和蛋白结合的分子功能（图

1）。

表 1 乳清蛋白的主要功能途径

二、研究成果

104

不同热处理导致 32 种乳清蛋白呈现差异表达，这些差异蛋白主要参与了抗

原加工提呈、蛋白聚糖在癌症中的作用等生物学过程（表 1）。

表 1. 热处理影响 KEGG 富集通路分析

KEGG 通路名

称

蛋白名称 超高温灭菌/巴氏

杀菌的差异

抗原加工提呈

蛋白质二硫异构酶 A3 前体物 1.29

组织蛋白酶 L1 前体物 1.31

β2-微球蛋白 1.23

溶酶体

组织蛋白酶 L1 前体物 1.31

激活蛋白原前体物 0.82

组织蛋白酶 D 前体物 0.81

吞噬体

组织蛋白酶 L1 前体物 1.31

Ras 相关 C3 肉毒毒素底物 1 前体物 1.21

单核细胞分化抗原 CD14 前体物 0.78

癌症中的蛋白

聚糖

组织蛋白酶 L1 前体物 1.31

Ras 相关 C3 肉毒毒素底物 1 前体物 1.21

金属蛋白酶抑制剂 3 前体物 0.83

其中，UHT 处理导致 17 种乳清蛋白丰度相对升高，这类乳清蛋白属于非

热敏感类蛋白质；15 种乳清蛋白丰度显著降低，属于热敏感类蛋白（表 2）。

对这部分蛋白进行生物功能分析显示：它们具备生物免疫调制活性功能。巴氏

二、研究成果

105

杀菌对这些蛋白的破坏则较为轻微，侧面反映巴氏杀菌对乳清蛋白的功能活性

保留较好。

表 2. 15 种对热处理敏感类牛奶蛋白

蛋白名称

超高温灭

菌/巴氏杀菌的

差异

αS2-酪蛋白前体物 0.70

肾素受体前体物 0.74

溶质载体家族 28 成员 3 亚型 X1 0.74

免疫球蛋白 g 重链 Mem5-样蛋白, 部分 0.78

单核细胞分化抗原 CD14 前体物 0.78

Ras 相关蛋白 Rab-18 0.79

蛋白激酶 c 结合蛋白 NELL2 前体物 0.81

组织蛋白酶 D 前体物 0.81

激活蛋白原前体物 0.82

Ras 相关蛋白 Rab-11A 0.82

C 4b 结合蛋白链亚型 X6 0.82

αS1-酪蛋白亚型 X5 0.82

金属蛋白酶抑制剂 3 前体物 0.83

富含半胱氨酸的分泌蛋白 3 前体物 0.83

烯醇酶亚型 X1 0.83

另一方面，135°C 灭菌奶中的乳过氧化物酶含量显著高于前人研究报道中

使用的 142°C 热处理。因此，在兼顾货架储存期、运输距离和活性功能等方

面，适当降低灭菌温度，可以减少牛奶中营养功能物质的热损伤或损失。

二、研究成果

106

研究成果已被《Molecules》杂志接收，该成果由中国农业科学院农业科技

创新工程重大产出科研选题(CAAS-ZDXT2019004)、现代农业产业技术体系专

项资金（CARS-36）、中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS12）资助。

—— Zhang Y, Min L, Zhang S, Zheng N, Li D, Sun Z, Wang J. 2021.

Proteomics Analysis Reveals Altered Nutrients in the Whey Proteins of Dairy Cow

Milk with Different Thermal Treatments. Molecules, 26, 4628.

二、研究成果

107

热处理对牛奶 microRNA 组成的影响

一 、研究背景

生乳（RM）可以将哮喘和过敏的风险降低 30%-50%，早期食用 RM，呼吸

道感染和发烧的风险可显著降低约 30%，但是食用 RM 有潜在的感染风险，如

布鲁氏菌病、李斯特菌、结核病或肠出血性大肠杆菌会导致溶血性尿毒症综合

征。考虑到 1 岁婴儿呼吸道感染的高发病率，如果能够克服 RM 的健康风险，

热处理生乳得到无病原体的牛奶可能会对公共卫生产生重大影响。

牛奶中的热敏成分（如脂类、蛋白质甚至微生物成分）在超高温(UHT)处理

过程中发生了变性。据报道，牛奶中的 microRNA(miRNA)可被人体血液吸收并

对人类健康有益，热处理和均质化导致牛奶中 63%的 mir-200c 损失和 67%的 mir29b 损失。然而，热处理对牛奶中 miRNA 影响的信息至今仍缺乏。因此，本研

究目的是揭示不同的热处理方式对牛奶中 miRNA 含量的影响，从而为“优质奶”

的加工、处理提供理论支撑。

二、实验方法

1. 牛奶样品和热处理

我们从一家商业牛奶厂获得了所有的牛奶样品，包括RM、巴氏杀菌奶（PM）

和超高温处理奶（UM）。在每个试验中，来自同一批的牛奶都经过巴氏杀菌或

UHT 处理。挤奶后 24 小时内，RM 被冷藏到 4°C，PM（85°C 15s）和 UM（135°C

15s）在-20°C 保存后分析。三批样本中第一批 RM 采集自 1500 多头奶牛，重 40.6

吨(t)，其中 9.6t 进行巴氏杀菌，31t 采用 UHT 处理。第二批 RM 采集自 1500 多

头奶牛，重 48.8t，其中 8.3t 进行巴氏杀菌，40.5t 采用 UHT 工艺处理。第三批采

集自 1200 多头奶牛，重 34.6t，其中 8.9t 进行巴氏杀菌，25.7t 通过 UHT 工艺进

行处理。

2. 总RNA提取与纯化

二、研究成果

108

使用 miRNeasy Mini Kit 从牛奶样本中提取总 RNA(包括小 RNA)。将提取的

牛奶样品放在冰上，与氯仿按 1:5 的比例混合。将洗脱后的 RNA 溶解在 30μL 水

中，使用 Qubit2.0 荧光计测量总 RNA 浓度和 260/280 的比值。使用生物分析仪

2100 系统和小 RNA 芯片试剂盒评估 miRNA 浓度、纯度、miRNA/小 RNA 比值

和 RNA 完整性。RNA 质量经变性琼脂糖凝胶电泳验证。RNA 样本在−80°C 下

保存至分析。

3. RNA测序过程

根据制造商的说明，使用 RNA Library Prep Kit 构建测序文库。利用 Illumina

Hiseq 2500 平台对文库进行测序,使用 FastQC 评估序列、序列位置和长度分布的

Phred 质量分数。使用 SAMtools 计算序列的 GC 百分比、长度、重复水平并生成

read counts。

4. 定量聚合酶链反应(qPCR)验证

取合格的基因组样本(30ng)匹配相对应的引物，qPCR 过程按照制造商的说

明进行。PCR 条件为：95°C 30s（预变性），94°C 30s（变性），57°C 30s（退

火），72°C 30s（延伸）共 35 个循环，最终在 72°C 处延伸 8min。PCR 产物经纯

化后溶于洗脱缓冲液。使 Bioanalyzer 检测文库片段的范围和浓度。

5. RNA测序分析

利用 R 软件(https://cran.r-project.org)构建热图，R ade4 软件包用于主成分分

析(PCA)。使用 VennDiagram (https://cran.r-project.org)绘制维恩图。基因本体(GO)

富集和基因和基因组 Kyoto Encyclopedia (KEGG) 通路分别用

http://www.geneontology.org http://www.genome.jp/kegg/pathway.html 分析。使用

Rfam 数据库中的信息对 miRNA 读取序列进行分析。

6. 数据分析

通过 SPSS 软件中的 Tukey 比较分析数据，结果均以平均值±标准误 (SEM)

显示。

二、研究成果

109

三、结果与讨论

1. PCA结果和miRNA测序

使用 Rfam 数据库提取得到的 rRNAs、小核 Rnas(snRNAs)、小核仁

RNAs(snoRNAs)和 tRNAs(tRNAs)并进行注释（表 1）。主成分分析（PCA）、热

图与 Veen 图结果证实，RM 与 PM 关系密切，RM 与 UM 之间的 miRNA 变化显

著，表明 UHT 处理显著影响牛奶 miRNAs（图 1）。

表 1 使用 Rfam 数据库（生奶）统计 miRNAs

Rfam filtered small

RNA

Total

reads

Total percentage

(%)

Unique

reads

Unique percentage

(%)

rRNA 106993 0.560345 32298 2.82157

tRNA 182524 0.879555667 13213 1.13387

snRNA 21260 0.1082188 6802 0.582962

snoRNA 119637 0.595279 12954 1.11676667

图 1 RM、PM 和 UM 中的 miRNA 的 PCA(A)、热图(B)和 Venn 图(C)

二、研究成果

110

2. 热处理对牛奶miRNAs含量和特性的影响

PM（RM 的 82.90%）和 UM（RM 的 68.21%）中 miRNAs 含量与 RM 相比

均显著降低。具有前 2 名 read count 的 miRNAs 含量（含有 22 和 23 个核苷酸的

miRNAs）在 PM 和 UM 中显著降低（图 2A）。UM 中 miRNAs 的平均长度和

GC 占比与 RM 比显著增加，这表明 UHT 处理可能会提高 miRNAs 的稳定性（图

2B-E）。

图 2 热处理对 RM、PM 和 UM 的总 read counts（A）、22 核苷酸 miRNAs

的 read counts（B）、23 核苷酸 miRNAs 的 read counts（C）、长度（D）和

GC 占比（E）的影响。

二、研究成果

111

3. 通过qPCR验证miRNA的含量

qPCR 的验证结果与 RNA 测序结果一致（图 3）。

图 3 通过 qPCR 验证 RM、PM 和 UM 中 miRNA 的表达

4.GO富集分析

图 4 表明，结果表明，基因在三个主要的生物过程中富集：细胞组分(如 RNA

聚合酶 II 启动子调控转录、细胞内信号转导)、生物过程（如质膜、细胞骨架等）

和分子功能 (如 RNA 聚合酶 II 核心启动子近端区域序列、转录因子结合和 ATP

结合)。

二、研究成果

112

图 4 在 RM、PM 和 UM 差异表达 miRNA 的 GO 富集

5.KEGG富集法分析靶基因

利用 KEGG 数据库分析靶基因的通路，结果表明靶基因在癌症、人乳头瘤

病毒感染、人乳头瘤病毒感染和氨基酸（酪氨酸和组氨酸）代谢等通路显著富集

(图 5)。在 RM、PM 和 UM 中差异显著的排名前 20 的 miRNA（图 6）主要功能

是抗癌、抗炎和抗疾病。

图 5 在 RM、PM 和 UM 差异表达 miRNA 的 KEGG 通路图

二、研究成果

113

图 6 在 RM、PM 和 UM 中差异表达且丰度排名前 20 的 miRNA

6.讨论

在本研究中，RM 和 PM 中显示了 191 个常见的 miRNAs，但 RM 与 UM 相

关的常见 miRNAs 很少，原因可能是 miRNAs 可以被外泌体保护，而这种保护被

UHT 处理破坏。工业牛奶加工中的低热强度可能有助于保护 miRNA 免于降解，

并保持良好的特性，UHT 可能会使这种影响消失。本研究中鉴定出的前 20 个差

异 miRNAs 的功能见表 2。RM 具有潜在的病原体，并不是预防策略的最优，而

巴氏杀菌对牛奶中的 miRNA 没有显著的影响，未来，miRNA 的生物活性功能有

待验证和探索。

五、、结论与展望

UHT 处理显著损失了 miRNAs 的含量，而巴氏杀菌处理则不那么显著，这

些结果表明，含有生物活性 miRNA 且不含致病菌的巴氏杀菌奶可能对人体健康

更有利。研究提示“优质奶”的产出过程中应该考虑使用巴氏杀菌法替代超高温灭

菌法进行灭菌，减少乳中活性 miRNA 和其他活性物质的损伤或失活，能够更充

分的发挥牛奶对人体的健康作用。

二、研究成果

114

该成果由中国农业科学院农业科技创新工程重大产出科研选题、动物营养学

国家重点实验室开放课题、中央高校基本科研业务费、中国现代农业产业技术体

系资助。张养东、许庆彪、侯金秀为共同第一作者，王加启研究员为通讯作者。

—— Zhang Y#, Xu Q#, Hou J#, Huang G, Zhao S, Zheng N, Wang J*. Loss of

bioactive microRNAs in cow's milk by ultra-high-temperature treatment but not by

pasteurization treatment. J Sci Food Agric. 2021 Oct 23. doi: 10.1002/jsfa.11607. Epub

ahead of print. PMID: 34689341.

二、研究成果

115

牛奶十八碳脂肪酸的气质联用检测方法

脂肪酸（FA）是乳脂发挥营养功能的主要活性因子。由于乳 FA 组成的复

杂性导致其在色谱分离上存在困难，单次进样的方法难以全面地分析乳 FA。针

对 FA 有效色谱分离的研究被广泛关注，尤其是 FA 的位置异构体和几何异构

体。由于不饱和脂肪酸在瘤胃中异构化和生物氢化作用以及乳腺的去饱和作

用，C18 FA 在乳脂中具有众多的同分异构体，这些异构体具有潜在的健康益处

和风险。因此，C18 FA 的准确测定是乳 FA 分析的关键和难点。

气相色谱（GC）的方法被广泛应用于 FA 的鉴定和定量，在检测前 FA 通

常需要转化为脂肪酸甲酯（FAME）进行分析。为了提高 C18 FA 的色谱分离

度，研究学者们通过尝试使用不同的色谱柱或温度程序对 C18 FA 进行分离，

将两次分离的结果结合起来对 C18 FA 进行整体分析。还有研究学者应用银离

子色谱法在 GC 分析前预先分离 C18 FA 的顺式和反式异构体，并通过 4 次进样

检测更多种类的 C18 FA。然而，多次进样检测的方法耗时、费力、成本高，并

且会增大数据处理过程中的误差。在定量方面，氢火焰离子化检测器（FID）因

计算简单被广泛用作 GC 检测器，但 FID 对牛奶中低丰度脂肪酸含量检测灵敏

度不足，而质谱（MS）检测器在选择离子监测（SIM）模式下能明显提高灵敏

度，同时以相对更宽或更合理的线性范围满足乳 C18 FA 巨大的含量差异变

化。在甲酯化时，常用多步骤法衍生化 C18 FA，包括 GC 分析前的碱催化和酸

催化反应。然而，碱催化反应对游离 FA 的转化较弱，而酸催化反应的高温条

件可能导致共轭亚油酸等不饱和脂肪酸被降解。因此，高分辨率、高灵敏度和

稳定简便的甲酯化处理是建立牛奶中 C18 FA 准确定量方法的基础。

本试验拟通过调整气相色谱条件优化分离度、建立质谱的选择离子方法提

高灵敏度、对比经不同甲酯化温度处理的牛奶样品的 C18 FA 含量，确定最适

的甲酯化温度，旨在建立高分辨、高灵敏的牛奶 C18 FA 的检测方法，并通过

线性、灵敏度、准确度、精密度等指标进行方法验证，最后应用建立的检测方

法，分析生乳、巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳中 C18 FA 的种类和含量。

二、研究成果

116

1 实验方法

1.1 样品前处理

将冷冻牛奶样品置于 40°C 的水浴中预热解冻。解冻后的牛奶样品，充分混

匀，用于后续的脂肪酸含量分析。样品前处理依据 AOAC 996.06 和 Serafim 等的

方法，准确移取 2 mL 均匀试样至 15 mL 离心管中，加入 5 mL 氨水、1 mL 乙醇

和 50 mg 焦性没食子酸，随后，将离心管放入 70℃水浴 20 min。水解完成后，

取出离心管冷却至室温。而后，加入 4 mL 正己烷/异丙醇混合溶液（V / V = 3/2），

涡旋振荡 30 s 后，于 4℃、12000 rpm 离心 3 min。将正己烷相移至带盖耐高温试

管中，向水解试样中加正己烷 1.3 mL，于相同条件下离心，转移正己烷相后，继

续向水解试样中加正己烷 1.3 mL，离心转移正己烷相，收集三次所得的正己烷相

中即包含脂肪提取物。

向包含脂肪提取物的正己烷相中加入 2 mL 氢氧化钠-甲醇溶液（2%），拧紧

试管盖，摇匀，于 50℃水浴 20 min 进行碱催化甲酯化。冷却至室温后，加入 2

mL 乙酰氯-甲醇（10%）进行酸催化甲酯化处理，比较了不同反应温度(60℃、70℃、

80℃和 90℃)和反应时间(90 min和 150 min)下的十八碳脂肪酸甲酯（C18 FAME）

产率。只用碱催化甲酯化(50°C，20min)处理的样品作为对照组，不进行额外的酸

催化。冷却至室温后，加入 5ml 超纯水，使两相界面更加清晰。转移正己烷相至

10 mL 棕色容量瓶中，用正己烷定容。加入约 0.5 g 无水硫酸钠，涡旋振摇 30 s，

静置 10 min。吸取包含 FAME 的正己烷相到进样瓶中稀释后，使用 GC-MS 进行

分析。

1.2 GC-MS 测定

采用 Agilent 7890A气相色谱和 5975C 质谱(Agilent Technologies, Santa Clara,

California, USA))结合使用 CP-Sil 88 毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.20 µm)分析 C18

FAME。

色谱条件如下：进样量为 1 μL，分流比为 10:1；载气为氦气，压力恒定 38

psi；进样口温度 250℃；色谱柱温度程序如下:初始温度 120℃保持 10min，以 3℃

二、研究成果

117

/min 升至 180℃，再以 1.5℃/min 升至 200℃保持 3min，再以 2℃/min 至 220℃保

持 24min，总运行时间 80.33 min；质谱检测器传输线温度为 250℃。

质谱条件如下：自动调谐；溶剂延迟时间为 10 min；质谱离子源温度为 230℃，

四极杆温度为 150℃，电子能量为 70 eV。采用 SIM 模式对 C18 FAME 进行定性

和定量分析，24 种 C18 FAME 的保留时间及质谱参数见表 1。FAMs 的定性基于

与 FAMEs 标准品的保留时间和特征离子(1 个定量离子和 3 个定性离子)的比较，

以及在全扫描模式下进行结构验证，与 NIST 数据库中的谱图进行比较。FAMEs

的定量基于定量离子的峰面积，并通过各 FAME 外标的标准曲线计算。在 GCMS SIM法中，针对各 FAME建立了相应的标准曲线和线性范围，以避免各 FAME

响应因素的差异造成的定量不准确的问题。为了提高灵敏度，以最佳信噪比（S/N）

选择各 FAMEs 的定量离子，将运行时间分为 5 个时间窗口，在每个时间窗口中

仅选择有限的特征离子进行扫描，其中每个离子的驻留时间为 20 ms，扫描频率

超过 12 cycle/s。脂肪酸含量结果以绝对浓度（mg/L）表示。

1.3 方法验证

依据方法验证指南（ICH, 2005）和《合格评定 化学分析方法确认和验证指

南 GB/T 27417-2017》对方法的线性、灵敏度、精密度和准确度进行验证。通过

在 0.15~400 μg/mL 范围内测定 6 个不同浓度的 C18 FAMEs 标准溶液，得到了线

性回归。以 S/N 为 3 和 10 计算检出限（LOD）和定量限（LOQ）。一天的三个

时间点检测同一份样品所得的相对标准偏差反映日内差异，通过连续三天每天对

同一份样品检测一次所得的相对标准偏差反映日间差异。在空白样品即乳清溶液

中添加浓度分别为 20、100 和 400 μg/mL 的 3 水平的 C18:1 c9, C18:2 c9,c12, C18:3

c9,c12,c15, 和 C18:3 c6,c9,c12 甘油三酯标准溶液，进行添加回收试验，重复 4 次，

计算平均回收率和相对标准偏差。应用该方法测定了 50份牛奶样品中的 C18 FA，

其中包含 20 份生乳样品、15 份巴氏杀菌乳和 15 份超高温灭菌乳。

2 结果与讨论

二、研究成果

118

图 1 24 种十八碳脂肪酸甲酯选择离子流图（a）标准品（b）生乳样品

如图 1 所示，该方法同时检测了 24 个 C18 FAME，包括 1 个 C18:0、8 个

C18:1、6 个 C18:2 和 9 个 C18:3 FAME。色谱上有 3 组共洗脱峰，分别为 C18:1

c6/c8、C18:3 t9,t12,c15/t9,c12,t15 和 C18:3 c9,t12,t15/c9,c12,t15。此外，本研究尝

试了不同的色谱柱温度和压力来分离牛奶样品中的 C18 FAME，发现共洗脱峰的

峰形随分离度变化不大，表明共洗脱峰所对应的 FA 或其他 C18 FA 异构体，其

含量在牛奶中处于极低水平。因此，本试验所提出的方法能满足对牛奶中 C18

FAs 检测需求，实现高通量分析。

二、研究成果

119

图 2 不同甲酯化条件下的共轭亚油酸甲酯产率（a）C18:2 c9,t11（b）C18:2

t10,c12

如图 2 所示，在碱催化甲酯化之后进行的酸催化甲酯化对共轭亚油酸甲酯的

产率影响不大，如 C18:2 c9,t11 和 C18:2 t10,c12，因此，省略酸催化步骤以提高

前处理效率。

通过方法学验证，该方法具有良好的线性、灵敏度、准确度和精密度。C18:0、

C18:1、C18:2 和 C18:3 FAME 的 LOQs 分别为 30.1、498.0~562.7、283.0~343.4

和 101.2~148.9 μg/L，分别能对牛奶中低至 0.6、9.5~10.7、5.4~6.5 和 1.9~2.8 mg/L

的脂肪酸进行定量。假设乳脂总含量约为 4%，C18:0、C18:1、C18:2、C18:3 FA

的相对含量分别为 0.001、0.024~0.027、0.013~0.016、0.005~0.007 g/100g FA。C18

FAME 标准曲线的回归方程在 0.15 ~ 400 μg/mL 的线性范围内，决定系数均在

0.998 以上，单个 C18 FAME 的线性范围符合牛奶中 C18 FA 的实际含量要求。

二、研究成果

120

对于各 C18:1、C18:2 和 C18:3 FAME 的同分异构体，当使用相同的定量离子时，

其标准曲线非常相似，因此可以使用相同的标准曲线用于共洗脱脂肪酸的定量。

根据牛奶中检测到的 C18 FA，日间差异为 2.1% ~ 4.6%，日内差异为 1.8% ~ 4.9%。

根据回收率试验，平均回收率为 95.5% ~ 105.8%，变异系数为 1.8%~5.1%。

图 3 生乳（n=20）、巴氏杀菌乳（n=15）和超高温灭菌乳（n=15）的十八

碳脂肪酸含量的主成分分析图

应用上述建立的检测方法，测定 20 份生乳、15 份巴氏杀菌乳和 15 份超高

温灭菌乳样品中的十八碳脂肪酸。如图 3 所示，本研究基于每份样品的 C18 FA

组成，使用主成分分析来阐述观测值与变量之间的关系。前三个主成分（PCs）

的累积贡献率为 69.0% （PC1(34.4%)、PC2(23.4%)、PC3(11.2%)）。生乳和巴

氏杀菌乳之间存在一些重叠，而超高温灭菌乳与其他牛奶样品有区别。结果表

明，超高温处理显著影响了 C18 FA 的组成，即过度加热会改变牛奶中 C18 FA

的组成。

3 结论

本研究建立了同时测定牛奶中 C18 FA 的气相色谱-质谱联用方法。结果表

明，50℃、20 min 的碱性条件是牛奶 C18 FA 的甲酯化处理的适宜条件，而无

需额外的酸性甲酯化。C18 FAME 在 0.60~400 μg/mL 浓度范围内呈现良好的线

性关系。此外，该方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度。通过分析生乳、

二、研究成果

121

巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳样品的 C18 FA，发现超高温灭菌乳与生乳和巴氏杀

菌乳的 C18 FA 组成有差异，表明过度加热会改变牛奶中 C18 FA 的组成。综上

所述，该方法是一种高通量测定牛奶中 C18 FA 的替代方法，提高了色谱的分

辨率和灵敏度，并简化了甲酯化过程。

研究成果已在国际学术期刊《separations》上发表。该研究得到中国农业科

学院农业科技创新工程重大产出科研选题（CAAS-ZDXT2019004）、中国农业

科学院科技创新工程（ASTIP-IAS12）、财政部和农业农村部：国家现代农业

产业技术体系（CARS-36）等项目支持，硕士研究生陈美庆和张养东副研究员

为共同第一作者，王加启研究员为通讯作者。

——Chen, M., Y. Zhang, F. Wang, N. Zheng, and J. Wang. 2021. Simultaneous

Determination of C18 Fatty Acids in Milk by GC-MS. Separations 8(8).

二、研究成果

122

乳铁蛋白和亚麻酸通过凋亡通路抑制结直肠癌生长机制

结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症之一，死亡率较高。2015 年，中国约

39 万人患有结直肠癌，男性 22.5 万例，女性 16.26 万例，亟待研发相关有效的预

防药物或膳食产品。天然食品成分结合辅助治疗，可能在预防和抑制结直肠癌中

发挥重要作用。近年来研究表明，乳制品消费量的增加与结直肠癌的降低显著相

关，这可能是由于乳制品中含有的多种活性脂肪酸和活性蛋白。乳铁蛋白

(Lactoferrin, LF)是牛奶中的主要活性生物因子之一，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、

抗肿瘤的作用。而活性脂肪酸，其中主要为油酸、亚麻酸和二十二碳六烯酸

（DHA），也被证实具有抗肿瘤作用。为研究乳铁蛋白和活性脂肪酸联合抗肿瘤

的效果，本研究通过体内与体外方法探究了乳铁蛋白与油酸/DHA/亚麻酸组合对

食道癌的抑制作用，并初步探究其机制。

试验采用结肠癌细胞（HT29 细胞），分为对照组、乳铁蛋白组、油酸组、

亚麻酸组、DHA 组、乳铁蛋白+油酸组、乳铁蛋白+亚麻酸组、乳铁蛋白+DHA

组。首先利用 CCK-8 检测细胞活力，以选择 LF 和 3 种不饱和脂肪酸的最佳处理

浓度；而后在最佳剂量浓度下，分别进行细胞划线实验、transwell 实验以确定 LF

和不饱和脂肪酸的最佳组合。对以上不同组别的 HT29 细胞同时裂解并提取总蛋

白，并采用 western blot 方法检测细胞裂解液中 β-actin、AMPK/(p)-AMPK、

JNK/(p)-JNK、Caspase-3/Cleaved Caspase-3、Bcl-2 和 Bax 的蛋白表达量。

试验采用 BALB/c 裸鼠（18-22 g 左右），皮下注射 HT29 细胞构建食管癌小

鼠模型。该试验的空白对照组为正常饲养的小鼠；乳铁蛋白处理组灌胃 50 mg/kg

体重的乳铁蛋白；亚麻酸组处理组灌胃 5 mg/kg 体重的亚麻酸；乳铁蛋白+亚麻

酸处理组灌胃 50 mg/kg 体重的乳铁蛋白+5 mg/kg 体重的亚麻酸。试验结束后，

断颈处死小鼠，解剖取肿瘤组织称重，并计算肿瘤体积及相对肿瘤体积（RTV）。

二、研究成果

123

试验结果：

图 1 显示，与对照组相比，6.25 mM 乳铁蛋白可显著抑制 HT29 细胞活力，

而油酸、DHA 和亚麻酸分别在 0.18 mM、0.18 mM 和 0.15 mM 时可显著抑制

HT29 细胞活力(p<0.05)。基于剂量选择的两个原则，即细胞活力>80%和显著差

异(与对照组相比，p<0.05)，选择 6.25 mM 为 LF 的适宜剂量，同时 0.18 mM 为

油酸、DHA 的适宜剂量，0.15 mM 为亚麻酸的适宜剂量。

如图 1B 所示，在选定的浓度下，4 种化学物质对 HT29 细胞生长的抑制作用

均高于其他 4 种细胞系，说明 HT29 细胞对 LF 和 3 种多不饱和脂肪酸的敏感性

高于其他细胞系。此外，在 IC50 浓度条件下，乳铁蛋白和 3 种不饱和脂肪酸对

HT29 细胞生长的抑制作用约为 50%，而对其他癌细胞生长的抑制作用仅为 30%-

40%(图 1C)。

图 1 乳铁蛋白、油酸（OA）、亚麻酸（LA）和 DHA 处理 HT29 细胞后 CCK8 试剂盒检测细胞活力。 (A)以 5-Fu 为阳性对照，乳铁蛋白和 3 种不饱和脂肪酸

处理 48 h 后对 HT29 细胞存活率有不同程度的抑制作用。(B)比较(A)中所选浓度

二、研究成果

124

下乳铁蛋白(6.25 mM)、OA (0.18 mM)、DHA (0.18 mM)和 LA (0.15 mM)对其他 4

种不同癌细胞的抑制作用。(C) 比较乳铁蛋白(39.14 mM)、OA (87.43 mM)、

DHA(116.30 mM)和 LA (36.61 mM)在 IC50 浓度(对 HT29 细胞)下对其他 4 种不

同癌细胞株的抑制作用。

我们通过 Annexin V-FITC/PI 染色进一步探讨了 LF 和 3 种不饱和脂肪酸对

HT29 细胞凋亡的影响。发现 LF 和 3 种不饱和脂肪酸均可诱导 HT29 细胞产生

不同程度的凋亡，其中 LF + LA 组凋亡率最高(17.40%±2.31%)。

图 2 乳铁蛋白、油酸（OA）、亚麻酸（LA）和 DHA 处理对 HT29 细胞凋

亡的影响

二、研究成果

125

为了研究 LF 和三种不饱和脂肪酸对 HT29 细胞侵袭、迁移能力的影响，我

们进行了 transwell 和划线实验。结果表明 LF、不饱和脂肪酸、乳铁蛋白和其组

合可不同程度抑制 HT29 细胞侵袭和迁移能力。其中，与其他组相比，乳铁蛋

白+亚麻酸组对细胞侵袭和迁移能力的抑制作用最强(p<0.05)。因此，选择乳铁

蛋白+亚麻酸组进行后续试验。

图 3 乳铁蛋白、油酸（OA）、亚麻酸（LA）和 DHA 处理对 HT29 细胞侵

袭（左）和迁移能力（右）的影响

根据体外实验结果，选择乳铁蛋白和亚麻酸的组合进行体内实验。如图所

示，与对照组相比，治疗组相对肿瘤体积(RTV)和肿瘤相对增殖率均降低

(p<0.05)。25 天时，与其他组相比，HT29 肿瘤重量在乳铁蛋白+亚麻酸组显著

降低（p<0.05）。

二、研究成果

126

图 4 乳铁蛋白及亚麻酸乳铁蛋白和亚麻酸对 HT29 荷瘤裸鼠的影响。

为探讨 LF 和 LA 在 HT29 肿瘤模型中的抗肿瘤作用，采用 western blotting

检测 AMPK/JNK 相关因子的蛋白水平。如图所示，与对照组相比，LF、LA 或

LF + LA 组合显著上调 p-AMPK、p-JNK、Bax 和 cleaved Caspase-3 (p<0.05)，显

著下调 Bcl-2 (p<0.05)。LF+LA 联合组的 p-AMPK、p-JNK、cleaved Caspase-3

和 Bax 水平高于 LF 组和 LA 组。与对照组相比，JNK、AMPK 和 Caspase-3 水

平无明显变化(p>0.05)。为了验证 AMPK 在调节凋亡因子中的作用，我们用

AMPK 抑制剂(dorsomorphin)处理 HT29 细胞，并检测其下游蛋白。结果显示，

与对照组相比，这些蛋白(p-AMPK、AMPK、JNK、p-JNK 和 cleaved Caspase3)水平显著下调，Bcl-2 水平显著上调(p<0.05)。此外，LF+LA+AMPK 抑制剂组

的这些因子与 AMPK 抑制剂组表现出相似的趋势，提示 LF+LA 激活了

AMPK/JNK 相关通路和随后的凋亡因子。

二、研究成果

127

图 5 乳铁蛋白和亚麻酸处理后 HT29 细胞中 p-AMPK/AMPK、JNK/p-JNK,

Bcl-2, Bax, Caspase-3/cleaved Caspase-3 蛋白的表达

结论：乳铁蛋白+亚麻酸组合通过上调 AMPK/JNK 磷酸化水平，下调凋亡

相关因子 Bcl-2/Bax 比例，从而抑制 HT29 细胞和结肠癌荷瘤裸鼠肿瘤生长。要

证明乳铁蛋白和亚麻酸之间的添加效应，还需要进一步的药物实验证实。

二、研究成果

128

研究成果已被《peerJ》杂志接收，该成果由中国农业科学院农业科技创新

工程重大产出科研选题(CAAS-ZDXT2019004)、现代农业产业技术体系专项资

金（CARS-36）、中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS12）资助。姚倩

倩和李慧颖为第一作者，郑楠和王加启为通讯作者。

—— Yao Q, Li H, Fan L, Huang S, Wang J, Zheng N. 2021. The combination of

lactoferrin and linolenic acid inhibits colorectal tumor growth through activating

AMPK/JNK-related apoptosis pathway. PeerJ, e11072.

二、研究成果

129

乳铁蛋白通过调节坏死因子途径减轻糠氨酸引起的肝

损伤

美拉德反应在食品的热加工过程中很常见，尤其是乳制品加工和烘焙过程。

不同的美拉德反应产物(MRPs)在美拉德反应的早期、中期和晚期产生，包括 N(ε)-

2-呋喃甲酰甲基-烯丙基辛(furosine)、N(6)-(1-羧乙基)-l-赖氨酸(CEL)、果聚糖(FL)、

链酰赖氨酸、N(ε)-羧甲基-l-赖氨酸(CML)、戊聚糖、吡喃糖和 5-羟甲基糠醛(5-

HMF)。MRPs 不仅会影响热加工食品的感官属性，改变其外观、风味、香气和质

地，还会损害其营养价值。此外，越来越多的证据表明，服用 MRPs 可能导致多

种疾病，如白内障、糖尿病、退行性疾病、动脉粥样硬化、慢性肾衰竭等。在本

文中，我们构建了 HL-7702 细胞(正常肝细胞系)模型和 ICR 小鼠模型，研究了糠

氨酸、吡喃糖和 5-HMF 对体外细胞活力以及体内肝功能和肝脏病理状态的毒性

作用。此外，还评估了乳铁蛋白（LF）在减轻肝损伤以及调节坏死因子途径方面

的作用。

在本研究中，我们检测了包括奶粉、烘焙面包、咖啡和蜂蜜在内的几种食品

中糠氨酸、吡喃糖和 5-HMF 的含量，以验证这三种物质在常见食品中的含量。

此后，我们构建了 HL-7702 细胞(正常肝细胞系)模型和 ICR 小鼠模型，并研究了

糠氨酸、吡喃糖和 5-HMF 对体外细胞活力以及小鼠肝功能的毒性作用，探讨具

有呋喃环结构的化合物对肝组织的毒性机制，并通过蛋白质印迹法验证其相关蛋

白 RIPK-1、RIPK-3 的表达，以及乳铁蛋白在含呋喃环结构的化合物所致肝损伤

方面的保护作用。

首先，用 UHPLC 法检测了面包、奶粉、咖啡和蜂蜜中 MPRS 的含量，同时

将 HL-7702 细胞在 RPMI 1640 培养基中培养，将细胞接种至 96 孔板(104个细胞

/孔)，培养 24 h，将细胞分别暴露于糠氨酸、FL、CEL、CML、pyrraline、HMF

(0-1000 mg/L)和乳铁蛋白，共培养 48 h；然后用 CCK-8 试剂盒检测细胞活力。

考虑到安全性(存活率>80%)和效果(与对照组相比，P＜0.05)的原则，确定乳铁蛋

二、研究成果

130

白和 MRPs 的合适剂量。然后，测定乳铁蛋白(经 2 h 预处理)和敏感 MRP 组合的

细胞活力，以进一步观察乳铁蛋白的保护作用。

在急性毒性模型中，将 60 只 ICR 小鼠(20±2 g，雌性)随机分为 12 组(每组 5

只):对照组(未经任何处理)、ddH2O 处理组(0.20 mL/只，每天 1 次)、0.10 g/kg 糠

氨酸组、0.25 g/kg 糠氨酸组、0.50 g/kg 糠氨酸组；0.10 g/kg b.w.吡喃糖组、0.25

g/kg b.w.吡喃糖组、0.50 g/kg b.w.吡喃糖组；0.10 g/kg b.w.5-HMF 组、0.25 g/kg

b.w.5-HMF 组、0.50 g/kg b.w. 5-HMF 组和 0.25 g/kg b.w.乳铁蛋白组。给药前 1 h

禁食小鼠，试验期共 14 天，观察是否有任何毒性或死亡的临床症状。第 14 天结

束时，处死急性毒性模型中的活动物，选择 3 种化学物质的适当剂量(无明显症

状)用于进一步实验。

在慢性毒性模型中，将 45 只 ICR 小鼠(20±2g，雌性)随机分为 9 组(每组 5

只):对照组(未经任何处理)、ddH2O 处理组(0.20 mL/只，每天 1 次)、0.25 g/kg

b.w.乳铁蛋白组、0.10 g/kg b.w.糠氨酸组、0.10 g/kg b.w.吡喃糖组、0.10 g/kg

b.w.吡喃糖 5-HMF 组、乳铁蛋白+糠氨酸组、乳铁蛋白+吡喃糖组治疗组小鼠连

续 21 天每天灌胃给药 1 次(0.20 mL/只)。第 22 天处死小鼠，眼眶取血并采集肝

组织。

用 UHPLC 法检测面包、奶粉、咖啡和蜂蜜中 MPRS 的含量，发现糠氨

酸、5-HMF 和吡喃糖的含量在这几种物质中都有存在（图 1）。

二、研究成果

131

图 1 奶粉、烘焙面包、咖啡、蜂蜜中糠氨酸、吡喃糖和 5-HMF 的检测。

将 3 种 MRPS 以及 LF 分别作用于 HL-7702 细胞，通过 CCK-8 检测细胞活

力，进一步证明 3 种 MRPS 对 HL-7702 细胞的体外存活有明显的抑制作用（图

2A），并且 LF 能有效能减轻细胞的损伤，筛选出 100mg/L 的 LF 作为合适的

剂量（图 2B、2C）。

二、研究成果

132

图 2 CCK-8 试剂盒检测 MRP、乳铁蛋白和联合作用对 HL-7702 细胞活力的

影响

ICR 小鼠的肝组织的 HE 染色结果显示，3 种 MRP(0.10 g/kg b.w.)可引起肝

组织细胞形态改变和轻微的水肿（图 3）。

二、研究成果

133

图 3 小鼠肝组织的 HE 染色病理检测

用 Elisa 试剂盒测定乳铁蛋白、3 种 MRP 及其组合对小鼠血清和肝组织生

化指标(ALT、AST、ALP、γ-GT、TNFα 和 IL1β)的影响，发现乳铁蛋白(0.25

g/kg b.w.)具有保护肝损伤的作用（图 4）。

二、研究成果

134

图 4 乳铁蛋白、MRP 以及二者联合对 ICR 小鼠血清及肝脏组织生化指标

的影响

在免疫印迹法中，蛋白质印迹法研究乳铁蛋白、3 种 MRP 及其组合对

RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL、肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素-1β 的调

控。与对照组相比，MRPs 显著上调 RIPK1、RIPK3、p-MLKL、肿瘤坏死因子α 和白细胞介素-1β，而 LF 能显著下调这些蛋白的表达（图 5）。

二、研究成果

135

图 5 HL-7702 细胞和小鼠肝脏组织中 RIPK1/RIPK3 相关通路蛋白表达水

平。A. HL-7702 细胞中的蛋白质条带。B. 小鼠肝组织中的蛋白质带。C. HL7702 细胞中蛋白质的定量。D. 小鼠肝组织中蛋白质的定量。

结论：乳铁蛋白对呋喃环结构的 MRPs 所致的肝损伤具有保护作用，主要

通过激活 RIPK1/RIPK3/p-MLKL 坏死因子途径，进而调控下游炎症反应实现。

该部分研究成果已被《Food science and nutrition》杂志接收，由现代农业

产业技术体系资金（CARS-36）和中国农业科学院科技创新工程（ASTIPIAS12）资助。范琳琳和王峰恩为第一作者，李慧颖和郑楠为通讯作者。

——Linlin Fan, Fengen Wang, Qianqian Yao, Haoming Wu, Fang Wen, Jiaqi

Wang, Huiying Li, Nan Zheng. Lactoferrin could alleviate liver injury caused by

Maillard reaction products with furan ring through regulating necroptosis pathway.

Food science and nutrition. Accepted.

二、研究成果

136

乳铁蛋白通过调控 TLR4 相关通路抑制脂多糖诱导的肺部炎症

急性肺炎(ALI)具有较高的发病率和死亡率，其主要病理生理表现是炎症、

氧化应激和肺泡屏障功能障碍。革兰氏阴性菌产生的脂多糖（LPS）是引起 ALI

的常见原因。肺细胞识别 LPS 后，引起机体保护性免疫反应，包括上皮细胞释放

炎症介质、中性粒细胞募集到感染部位、自然杀伤细胞数量的增加和吞噬作用的

增强等。牛奶作为主要的膳食食物之一，不仅提供必要的能量和营养物质，而且

在免疫功能、肠道微生态和营养平衡方面发挥着重要作用。乳铁蛋白是奶中的一

种重要活性蛋白。我们前期研究表明，乳铁蛋白可调节缺血/再灌注处理下 PC-12

细胞中 TLR4 炎症通路。因此，我们进一步探究乳铁蛋白是否也对肺细胞内 LPS

激活的 TLR4 相关信号通路有显著影响，并可能控制炎症细胞因子的产生。此外，

乳铁蛋白是一种热敏性蛋白，在热处理条件下很容易变性。因此，研究热处理对

乳铁蛋白抗炎生物活性的影响具有重要意义，可指导乳铁蛋白在实际生产中加工

工艺。

试验采用人肺癌细胞（A549）。使用 RPMI-1640 培养基、且在 95% N2-5%

CO2条件下培养细胞，待细胞长到 90%汇合度时接种到 6 孔板中，用不同浓度乳

铁蛋白处理组（0、0.1、1.0、10、20 和 30 mg/mL）处理 48 h，CCK-8 法检测细

胞活力，选择乳铁蛋白最佳作用浓度。

将 A549 细胞接种到 6 孔板中，采用 1 μg/mL LPS 处理细胞构建炎症模型，

采用 ELISA 法测定 TNF-α 和 IL-1β 炎症因子水平；在乳铁蛋白处理组中，首先

将 A549 细胞接种到 6 孔板中，采用 10 mg/mL 乳铁蛋白处理 4 h 后，用 1 μg/mL

LPS 处理构建细胞炎症模型。

为探究热处理对乳铁蛋白活性的影响，将乳铁蛋白溶液分别在 50 ℃或 100 ℃

加热 3 min 后加入细胞培养基中，培养结束后收取细胞样品。

对以上不同组别的 A549 细胞，裂解并提取总蛋白，并采用 western blot 方法

检测细胞裂解液中 TLR-4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β 的蛋白表达量。

二、研究成果

137

试验采用 40 只 CD-1 雌鼠，分为 4 组：对照组、LPS 组、乳铁蛋白组、LPS+

乳铁蛋白组。该试验的空白对照组为正常饲养的小鼠；小鼠气管腔注射 50 μL LPS

溶液(终浓度为 10 mg/kg BW)，乳铁蛋白组将乳铁蛋白粉溶于 PBS 中，浓度为 10

mg/mL，LPS 处理前 6 h，每只小鼠腹腔注射乳铁蛋白溶液 0.2 mL。LPS 处理 48

h 后，断颈处死小鼠，取左肺叶进行进一步的组织病理学检查，并对肺部组织 TNFα、IL-1β 因子基因和蛋白表达进行定量分析。

试验结果：

结果表明，与对照组相比，乳铁蛋白浓度为 10 mg/mL 时，开始对 A549 细

胞的活力有显著的抑制作用(94.1%±1.2% vs 99.5%±0.3%，P<0.05，图 1)。乳铁蛋

白浓度提高时会进一步降低 A549 细胞的活力。因此在本研究中，选择 10 mg /mL

乳铁蛋白进行后续实验。

图 1 CCK8 法检测不同浓度乳铁蛋白对 A549 细胞活力的影响

与对照组相比，乳铁蛋白处理组 TLR4、Myd88、IRAK1、TRAF6、NF-κB、

TNF-α 和 IL-1β 的表达在 mRNA 和蛋白水平上均无明显变化，而 LPS 处理组均

显著上调（P<0.05）。LPS+LF 联合组 TLR4 相关通路较 LPS 单独组明显受到抑

制（P<0.05）。LPS 刺激后 A549 细胞培养液中 TNF-α 和 IL-1β 的浓度显著升高，

而乳铁蛋白预处理降低了这两种细胞因子的释放(P<0.05)。与对照组相比，LPS

组 miR-146a 的基因表没有明显改变，但乳铁蛋白组 miR-146a 表达显著升高，二

者联合作用组 miR-146a 表达虽然降低但仍显著低于对照组(P<0.05)。

二、研究成果

138

图 2 A549 细胞中 TLR4 相关通路因子基因和蛋白表达。A，Western blot 检

测各因子蛋白表达量；B，Western blot 结果定量分析；C，ELISA 试剂盒检测细

胞培养基中促炎因子(TNF-α 和 IL-1β)的浓度；D，实时荧光定量 PCR 检测 A549

细胞中 miR-146a、TLR4、Myd88、IRAK1、TRAF6、NF-κB、TNFA、IL-1β 的基

因表达。

二、研究成果

139

结果表明，与对照组相比，LPS 组小鼠肺组织中 TLR4、Myd88、IRAK1、

TRAF6、NFKB、TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白水平均上调(P<0.05)，乳铁蛋白可

不同程度地抑制这些因子的上调(P<0.05)。LPS 刺激后支气管肺泡灌洗液中 TNFα 和 IL-1β 的浓度显著升高，而乳铁蛋白预处理降低了这两种细胞因子的释放

(P<0.05)。同时，LPS 组小鼠肺组织中 miR-146a 基因表达量显著下调，乳铁蛋白

组其含量显著高于对照组(P<0.05)。此外，与单纯 LPS 组相比，LPS+LF 组 miR146a 基因表达量相对升高(P<0.05)。

采用苏木精和伊红染色观察肺组织病理情况，结果显示，对照组肺泡边界清

晰薄，肺组织结构整体规则；而 LPS 组肺泡间隔明显增厚，大量弥漫性炎症细胞

浸润间质。但与 LPS 组相比，LPS+LF 组的肺部炎症强度似乎有所减轻，浸润细

胞较少，出血程度较轻，说明乳铁蛋白在一定程度上减轻了 LPS 引起的肺组织

炎症损伤。

虽然天然乳铁蛋白有助于缓解 LPS 处理后 A549 细胞中促炎细胞因子表达

量升高，但尚不清楚实际生产中的热加工是否对这种生物活性有影响。与未加热

的乳铁蛋白相比，50 ℃加热 3 min 乳铁蛋白活性无显著变化；而 100℃加热 3

min，乳铁蛋白的抑制活性几乎消失，TNF-α 和 IL-1β 的含量在 100 ℃ LF+LPS

组和 LPS 组之间无统计学差异(P>0.05)。同时乳铁蛋白在 100℃下凝成白色的絮

状物，并且 SDS-PAGE 结合液相色谱-串联质谱分析表明，在天然乳铁蛋白上方

出现的较大的“新”条带实际上是蛋白质聚合物的一种形式。

二、研究成果

140

图 3 TLR4 相关通路因子在小鼠肺组织中的基因和蛋白表达。A，Western blot

检测各因子蛋白表达量；B，Western blot 结果定量分析；C，ELISA 试剂盒检测

细胞培养基中促炎因子(TNF-α 和 IL-1β)的浓度；D，实时荧光定量 PCR 检测小

鼠肺组织中 miR-146a、TLR4、MYD88、IRAK1、TRAF6、NF-κB、TNFA、IL1β 的基因表达。

二、研究成果

141

图 4 (A)苏木精和伊红染色的小鼠肺组织病理切片。(B)病理组织评分

图 5 （A）LPS 处理后的 A549 细胞进行代谢组学分析和特殊代谢物验证；

（B）加热后乳铁蛋白样品的 SDS-PAGE

结论：乳铁蛋白能够显著抑制由 LPS 诱导的细胞及肺组织炎症因子表达上

调。但是加热处理会一定程度减弱这种抑制活性。由于食品，如婴配粉、液态奶

等在加工过程中会受到一定的热负荷，因此需要控制热加工温度或对乳铁蛋白进

行理化保护，使其活性能够保留。

二、研究成果

142

研究成果已被《Journal of Dairy Science》杂志接收，该成果由中国农业科学

院农业科技创新工程重大产出科研选题(CAAS-ZDXT2019004)、现代农业产业技

术体系专项资金（CARS-36）、中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS12）

资助。李慧颖为第一作者，王加启和郑楠为通讯作者。

——H. Y. Li, H. G. Yang, H. M. Wu, Q. Q. Yao, Z. Y. Zhang, Q. S. Meng, L. L.

Fan, J. Q. Wang* and N Zheng*. 2021. Inhibitory effects of lactoferrin on pulmonary

inflammatory processes induced by lipopolysaccharide through modulating the TLR4-

related pathway. Journal of Dairy Science.

二、研究成果

143

乙酸、丙酸和丁酸对离体培养的胎鼠空肠和未成熟小肠细

胞的抗炎作用

坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种常见于早产儿的肠道疾病。由于 NEC 的

发病机制复杂，目前尚无治疗 NEC 的有效方法。因此，尽早采取有效的干预措

施是降低 NEC 发病率的关键。短链脂肪酸（SCFAs）是肠杆菌发酵的主要终产

物，其中乙酸、丙酸和丁酸的含量高达 95%。SCFAs 已被证明可以促进肠道完整

性，调节代谢紊乱，并调节免疫反应。在目前的研究中，SCFAs 对肠道炎症的保

护作用研究主要集中在成熟的小鼠结肠或人类结肠细胞系。然而，很少有研究关

注它们在未成熟小肠中的作用。为了验证 SCFAs 对未成熟小肠炎症是否具有保

护作用及相关机制，该研究通过 IL-1β 诱导的 ICR 胎鼠空肠离体培养物炎症模型

评估乙酸、丙酸和丁酸的抗炎作用，并通过转录组学探索潜在的抗炎调节通路，

然后用人类胎儿小肠上皮 FHs 74 Int 细胞进行体外验证。

试验首先进行了离体试验。将怀孕的 ICR 小鼠在特定的无病原体环境中饲

养，并自由进食和饮水。在怀孕 18.5 天时处死，通过剖腹产取出胎鼠。然后解剖

胎鼠，取出胎鼠空肠，切割成 3 mm 片段并保存在 37˚C 的器官培养基中。胎鼠

空肠培养物用或不用 20-40 mM 乙酸、丙酸或丁酸预处理 1h，然后与 IL-1β

（1ng/mL）共同培养 24h。将胎鼠空肠培养上清液通过 ELISA 法测定 CXCL2 浓

度，并提取胎鼠空肠 RNA 进行转录组学分析。离体试验完成后，进行体外试验。

将 FHs 74 Int 细胞用或不用乙酸、丙酸或丁酸（5-30mM）预处理 1h，然后与 IL1β（0.5ng/mL）共同孵育 24h。然后，通过 ELISA 和 qRT PCR 测定细胞中 IL-8

和 IL-6 的表达，并通过 Western Blot 测定炎症相关信号通路表达。

为了建立胎鼠空肠炎症模型，不同浓度的 IL-1β 用于处理胎鼠空肠培养物。

如图 1A 所示，经 1 ng/mL IL-1β 处理的胎鼠空肠培养物中 CXCL2 的产生显著增

加，表明胎鼠空肠炎症模型构建成功。乙酸、丙酸和丁酸在所有试验浓度（20-40

二、研究成果

144

mM）下处理均显著降低 IL-1β 诱导的胎鼠空肠培养物中 CXCL2 的表达（图 1B、

C 和 D）。

图 1 IL-1β 和 SCFAs 对胎鼠空肠培养物中 CXCL2 表达水平的影响

基于基因表达量信息，对各个处理组组内的 3 个生物学重复样品开展主成分

分析（PCA，Principal Component Analysis），以了解重复样本间的重复性与组间

样本的差异性。从图 2 可以看出各个处理组组内样品都有较好的重复性，对照组、

IL-1β 单独处理组和 SCFAs 与 IL-1β 共同处理组样品能够很好的分离。

图 2 各组样品主成分分析（PCA）