吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

3　讨论与结论

氮、磷、钾是植物体生长发育的三大营养元

素。合理施肥是提高中药材产量和改善药材品质

的重要农艺措施［10-14］

。本研究中，氮磷钾配施对

朝鲜淫羊藿不同的生育阶段叶产量的影响表明，

盛花期和初果期叶产量的影响次序表现为 P>N>

K，显示磷在促进早期根系的形成和生长，促使花

芽形成，并与氮协同，促进植株生长等方面发挥重

要作用，此时期需要更多的磷、氮施入才能获得较

高产量。影响果熟期叶产量的肥料种类次序为

N>P>K，此时期朝鲜淫羊藿即将由生殖生长阶段

转入绿叶期，朝鲜淫羊藿地上部分生长加快，氮肥

的作用更为突出。影响绿叶期叶片产量的肥料种

类次序为 K>P>N，显示此时期钾、磷肥的作用更

为重要，需要相对较多的钾、磷施入才能获得较高

产量。绿叶期气温高，水分蒸发量大，显示钾在促

进植株有效利用水分，并与磷协同增强植株的抗

逆性方面发挥了重要作用。氮、磷、钾合理配施能

有效提高朝鲜淫羊藿的叶产量，本研究结果与张

建海等［15］

对巫山淫羊藿施肥效果的研究较为一

致；与秦梦等［16］

研究的板蓝根产量主要受氮肥影

响，钾肥对大青叶产量影响较显著的研究结果有

一定的相似性。

极值判别分析可将三元肥效模型分为典型式

和非典型式。三元典型式肥效模型通常用导数法

求最佳施肥量，非典型式可用频率分析法求推荐

施肥量［17］

。本研究中，朝鲜淫羊藿叶产量与氮、

磷、钾施用量之间的回归模型属于典型式的三元

肥效模型，而对于淫羊藿苷和总黄酮含量与氮、

磷、钾施用量之间的回归模型则属于非典型式。

因此，本研究中朝鲜淫羊藿品质的最优施肥量的

确定使用频率分析法。从结果得出，绿叶期朝鲜

淫羊藿获得较高淫羊藿苷和总黄酮含量的肥料施

入量存在：K>P>N。本研究结果与苏文华等［18］

得

出的氮磷钾配施对灯盏花中灯盏花乙素和总咖啡

酸脂的含量影响结果一致。

氮素影响植株的氮代谢和蛋白质合成，蛋白

质合成与黄酮及酚类物质的代谢关系密切。相关

的研究普遍认为，增加施氮量使得植物体内黄酮

类成分含量呈下降趋势，如灯盏花、菊花、荞麦中

黄酮含量随施氮水平的提高而逐渐下降［19-21］

。产

生原因可能是植物合成黄酮途径中关键酶 PAL

活性受到了氮素的影响［22］

。本研究中，朝鲜淫羊

藿叶片总黄酮含量随施氮量的增加而下降，随施

钾量的增加而升高。施钾促进了糖的合成与运

输，糖是合成黄酮等酚类化合物的原料，从而提高

了黄酮的产量。相关的研究也表明，钾肥能提高

植物体内黄酮类化合物的含量［23-24］

。

综上，在朝鲜淫羊藿生产中既要重视产量又

要兼顾药材有效成分的含量，在本试验区的土

壤肥力状况下，朝鲜淫羊藿高产优质栽培最优

施氮量为 12.89~15.80 kg/667m2

、施磷量 16.45~

17.26 kg/667m2

、施 钾 量 17.24~19.25 kg/667m2

，

N∶P2O5

∶K2O的最优施肥量配比为1∶（1.04~1.34）∶

（1.34~1.49）。

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（责任编辑：王希）

271

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（2）：272-279

Journal of Jilin Agricultural University

精氨酸双糖苷对黑色素瘤 B16 细胞的作用及

其机制初步研究*

冯梓航，刘兴龙，赵迎春，陈雪艳，丁传波，刘文丛**

吉林农业大学中药材学院，长春 130118

摘 要：研究精氨酸双糖苷（Arginyl-Fructosyl-Glucose，AFG）抑制黑色素瘤B16细胞的增殖及诱导凋亡作用，

并初步探讨了其 Bcl-2、Caspase-3、Bax信号通路的作用机制。培养黑色素瘤 B16细胞，配制 1，2. 5，5，10，25，

50，75，100 μmol/L的精氨酸双糖苷作用于黑色素瘤B16细胞，48 h后利用CKK-8法检测精氨酸双糖苷对B16

细胞增殖影响；采用 LDH 检测给药后细胞乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）表达水平；用 Hoechst

33258荧光染色法观察精氨酸双糖苷对B16细胞凋亡形态的影响；采用RT-PCR和Western Blot法分析精氨酸

双糖苷对 B16细胞 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 和蛋白表达的影响。结果表明：随着给药浓度的增大和培养

时间的增加，精氨酸双糖苷对B16细胞的抑制率增加，48 h后抑制率达到平台期。50，75，100 μmol/L浓度的精

氨酸双糖苷抑制效果最佳，B16细胞存活率显著降低（P<0. 05，P<0. 01），可明显观察到B16细胞凋亡；RT-PCR

和 Western Blot 试验发现，精氨酸双糖苷 75，100 μmol/L 组 B16 细胞 Bcl-2 mRNA 和蛋白水平明显减少（P<

0. 01），Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白水平显著升高（P<0. 01）。精氨酸双糖苷可抑制黑色素瘤B16细胞增殖，

诱导其凋亡，其机制可能与上调Bcl-2、Caspase-3，下调Bax有关。

关键词：精氨酸双糖苷；黑色素瘤B16细胞；增殖凋亡；恶性肿瘤；人参

中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0272-08

DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5593

引用格式：冯梓航，刘兴龙，赵迎春，等.精氨酸双糖苷对黑色素瘤B16细胞的作用及其机制初步研究［J］.吉林

农业大学学报，2024，46（2）：272-279.

Effect of Arginyl-Fructosyl-Glucose on Melanoma B16 Cells and Its

Mechanism

FENG Zihang，LIU Xinglong，ZHAO Yingchun，CHEN Xueyan，DING Chuanbo，LIU Wen⁃

cong**

College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China

Abstract：To observe the inhibition of Arginyl-Fructosyl-Glucose (AFG) on the proliferation and

apoptosis of melanoma B16 cells, and discuss the mechanism of its Bcl-2, Caspase-3 and Bax signal⁃

ing pathways preliminarily， melanoma B16 cells were cultured. 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 75 and 100 mol/L

of Arginyl-Fructosyl-Glucose were prepared to act on melanoma B16 cells. CKK-8 method was

used to detect the effect of Arginyl-Fructosyl-Glucose on the proliferation of B16 cells after 48h;

The expression level of LDH was detected by LDH after treatment; The effect of Arginyl-FructosylGlucose on apoptosis of B16 cells was observed by Hoechst 33258 fluorescence staining; RT-PCR

and Western Blot were used to analyze the effect of Arginyl-Fructosyl-Glucose on the expression of

* 基金项目：吉林省科技发展计划项目（20180201070YY）

作者简介：冯梓航，男，在读硕士，研究方向：中药学。

收稿日期：2020-01-04

** 通信作者：刘文丛，E-mail：jwliuwencong@126.com

冯梓航，等：精氨酸双糖苷对黑色素瘤B16细胞的作用及其机制初步研究

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

Bcl-2, Caspase-3, Bax mRNA and protein in B16 cells.With the increase of drug concentration and

culture time, the inhibition rate of Arginyl-Fructosyl-Glucose on B16 cells increased, and the inhibi⁃

tion rate reached a plateau after 48 h. The inhibitory effect of Arginyl-Fructosyl-Glucose at 50, 75

and 100 mol/L concentrations was the best, and the survival rate of B16 cells was significantly re⁃

duced (P < 0.05, P < 0.01). RT-PCR and Western Blot assay showed that protein levels and Bcl-2

mRNA in B16 cells in the 75 and 100 mol/L groups significantly decreased (P < 0.01), and Caspase3 mRNA and protein levels significantly increased (P < 0.01). Arginyl-Fructosyl-Glucose can in⁃

hibit the proliferation of melanoma B16 cells and induce their apoptosis. The mechanism may be re⁃

lated to the upregulation of Bcl-2, Caspase-3 and the downregulation of Bax.

Key words：Arginyl-Fructosyl-Glucose； melanoma B16 cell； proliferation and apoptosis； malig⁃

nant tumor； ginseng

恶性肿瘤是如今最威胁人类健康的疾病之

一，其中由黑色细胞变异发育而来的是一种恶性

侵袭性肿瘤［1-2］

。其具有很强的转移力，虽及时手

术治疗可有效控制，但一旦发病，仍无药可救，是

最致命的皮肤癌之一［3-7］

。全球每年约有 13.2 万

例患者患上黑色素瘤，我国每年约增加 2 万例病

例［8-9］

。目前，对于黑色素瘤的主要治疗方法是手

术切除，但是，其具有创伤面积大、易复发，无法提

高病人存活率等缺点［10］

。晚期患者通过放疗、化

疗的方法治疗，但效果欠佳，对人体机体损伤严

重［11］

。现如今，治疗黑色素瘤最好的方法为免疫

治疗，常用药物有 PD-1、CTLA-4、IL-2

［12-13］

。但

是，免疫药物治疗价格昂贵，可用药物少，成为最

大阻碍。因此，寻找新型低毒性且治疗效果良好

的天然化学物质成为研究的新方向。

近年来，越来越多的中药被发现具有良好的

抗黑色素瘤作用。一味中药中的多种成分可以同

时对多个靶点、多个通路起到抗肿瘤的作用，并且

中药的副作用小，不易产生耐药性，能减小对机体

的损伤，这些优势说明了中药在抗黑色素瘤方面

具有很大的研究价值［14］

。人参作为“百草之王”，

其抗肿瘤活性也被广泛研究，研究表明，人参中多

种成分具有良好的抗肿瘤活性［15-18］

。其中，多种

人参成分对黑色素瘤具有良好的治疗效果［19-28］

。

精氨酸双糖苷（Arginyl-Fructosyl-Glucose，AFG）

是新鲜人参在炮制成红参过程中，由人参中的麦

芽糖和精氨酸发生梅拉德反应产生的［29］

，具有抗

疲劳、增强免疫功能、治疗糖尿病、肾病和急性肾

损伤、抗炎等多种良好的药理活性［30-42］

，说明AFG

具有抗黑色素瘤的潜在药理活性，但 AFG抗肿瘤

的研究鲜见报道。本研究选用小鼠 B16 细胞，对

AFG 抑制其增殖和凋亡效果作了初步研究，并考

察了AFG对B16细胞内凋亡因子Bal-2、Caspase3和Bax的影响，初步探索了AFG对黑色素B16细

胞的治疗机制，为进一步深入研究奠定基础。

1　材料与方法

1. 1　材料与仪器

1. 1. 1 试验药物 精氨酸双糖苷，由吉林农业

大学天然产物化学实验室自制［43］

。

1. 1. 2 试验材料 1640 培养基（货号：10491）、

青霉素和链霉素（货号：P1400）、0.25% 胰酶（货

号：T1350）、PBS磷酸缓冲盐溶液（货号：P1022）均

购自北京索莱宝公司；Clark 胎牛血清（货号：

FB15015）购自上海慧颖生物科技有限科技公司；

CCK-8 试剂盒（货号：CA1210）、Hoechst 33258 染

色液（货号：C0021）、乳酸脱氢酶（LDH）活性检测

试剂盒（货号：BC0685）、二甲基亚砜 DMSO （细胞

培养级）均购自上海索莱宝公司；Anti-Caspase-3

抗体（货号：ab13847）、重组 Anti-Bax 抗体［E63］

（货号：ab32503）、Anti-SLC27A5/BAL-2（货号：

ab74869）、重组 Anti-Actin 抗体［EPR16769］（货

号：ab179467）均购自 Camba 公司；BCA 蛋白浓度

测定试剂盒、RIPA裂解液（强）均购自上海碧云天

科 技 有 限 公 司 ；Tap PCR Master Mix（2X， with

Blue Dye）购自 TaKaRa 公司；UNIQ-10 柱式 Ttizol

总RNA提取试剂盒购自生工公司。

1. 1. 3 试验仪器 二氧化碳培养箱（美国西蒙

公司）；倒置显微镜（Olympus 公司）；Applied Bio⁃

systems®实时荧光定量 PCR 仪（美国 ABI 公司）；

电泳仪（北京六一公司）；D3024R台式高速冷冻型

微量离心机（北京大龙建设集团有限公司）；电子

273

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

天平（梅特勒-托利多仪器，上海）；MK3型酶标仪

（Thermo Electron公司，美国）；DK-98-1型电热恒

温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

1. 1. 4 试验细胞 小鼠黑色素瘤 B16 细胞，购

自中国科学院上海细胞库。

1. 2　试验方法

1. 2. 1 细胞培养 （1）B16细胞的复苏。先准备

适当的灭菌 15 mL 离心管 1 个，超净工作台提前

灭菌，提前将恒温水浴锅加热至37 ℃。待水浴锅

温度稳定，快速将冻存的 B16 细胞株从-80 ℃中

取出，放入液氮中。将细胞从液氮中取出，放入

37 ℃水浴锅来回晃动>1 min，待其完全溶解后，快

速擦拭干净，将其放至超净工作台。在离心管内

依次加入适量配置好的完全培养基，解冻后的B16

细胞。用移液枪快速吹打均匀后，1 000 r/min离心

4 min，弃去上清液。重新加入适量完全培养基，

充分混匀细胞，制成细胞悬液，加入到培养瓶中，

放入 CO2培养箱（37 ℃，5%CO2

）中培养。24 h 后

更换新的培养液，密切观察细胞状态。

（2）B16 细胞的换液体和传代。从培养箱中

取出细胞，轻轻晃动后，弃掉瓶中培养基。加入适

量PBS，左右晃动约3 min后将瓶中PBS全部弃去。

重复此过程 1 次，向瓶中再次加入适量完全培养

基，继续放入CO2培养箱（37 ℃，5%CO2

）中培养。

待细胞培养至融合率 90%~100% 后，将细胞

从培养箱中取出，弃去培养基，加入适量 PBS 清

洗，弃去 PBS，重复 1 次。吸取 500 μL 胰蛋白酶，

加入到培养瓶中混匀，90~120 s 后加入完全培养

基终止反应。轻轻吹打均匀后，1 000 r/min 离心

4 min。弃去上清，加入新的完全培养基，使细胞

重悬后，分装至 2~3个新培养瓶中，放入 CO2培养

箱（37 ℃，5%CO2

）中继续培养。

1. 2. 2 CCK-8 法 测 细 胞 增 殖 用 配 置 好 的

AFG 母液，分别配置出 1，2.5，5，10，25，50，75，

100 μmol/L的AFG药液。

取对数生长期的 B16 细胞，弃去培养基后用

PBS 清洗 2 遍，加入 500 μL 的胰蛋白酶，90~120 s

后加入完全培养基终止反应，1 000 r/min 离心

4 min，弃掉上清，加入完全培养基，重悬细胞。按

细胞浓度为 1×105

/孔接种于 96 孔板中，放入 CO2

培养箱（37 ℃，5%CO2

）中培养 48 h。取出 96 孔

板 ，分为 0（空白对照），1，2.5，5，10，25，50，75，

100，125，150 μmol/L AFG 给药组，每组设置 6 个

平行，分别给药。为防止边缘效应，96 孔板边缘

不设置试验组。继续放入 CO2 培养箱（37 ℃，

5%CO2

）中培养。观察细胞生长状态，培养 48 h

后，每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液，混匀后放入

CO2培养箱（37 ℃，5%CO2

）中孵育。2 h 后用酶标

仪测定各组在450 nm下的OD值。

1. 2. 3 B16 细胞中 LDH 的测定 取对数生长期

的 B16细胞，按细胞浓度为 1×105

/孔接种于 96孔

板中。培养至细胞贴壁，弃掉培养基，PBS 冲洗

3 次，加入新的完全培养基。将其分为空白对照

组，50，75，100 μmol/L AFG给药组，每组设置6个

平行，分别给药。给药培养16 h后每孔加入20 μL

的 LDH 释放剂，并吹打混匀。继续培养 2 h 后

1 万 r/min 离心 4 min，取每孔上清至新的 96 孔板

中，每孔加入60 μL LDH检测液，混匀。室温下避

光孵育30 min后，测定每孔在490 nm的吸光度值。

1. 2. 4 Hoechst 33258荧光染色法测细胞凋亡 将

对数生长期的B16细胞，按细胞浓度为1×105

/孔接

种于 6 孔板中。培养至细胞贴壁，弃掉培养基，

PBS 冲洗 3 次，更换培养液继续培养。将其分为

空白对照组，50，75，100 μmol/L AFG 给药组，每

组设置3个复孔，分别给药。继续培养48 h后，每

孔用 4% 多聚甲醛固定 10 min，用 PBS 洗 3 次，每

次 3 min。每孔加 200 μL 的 Hoechst 33258 染液，

避光染色 10 min，用 PBS清洗 3次，置于倒置显微

镜下观察细胞。

1. 2. 5 相关基因 mRNA 表达量检测 细胞的培

养，分组给药同本文“1.2.4”。给药培养 48 h 后，

PBS清洗3次，加入新的完全培养基，1万 r/min离

心 4 min，收集细胞。根据 UNIQ-10 柱式 Trizol 总

RNA 提取试剂盒说明书的操作方法提取肝脏组

织中的总 RNA。收集细胞后，加入适量 Trizol 裂

解 5~10 min 后，1.2 万 r/min 离心 10 min，取上清。

加0.2 mL氯仿，剧烈振荡30 s，室温静置3 min后，

1 200 r/min 离心 10 min，取上清液。加无水乙醇

混匀，移至装有吸附柱的收集管。静置2 min 后离

心 3 min，弃废液。加 500 μL RPE Solution，静置

2 min，1 万 r/min 离心 30 s，弃掉收集管中废液，

重复 2 次。加入 30 μL DEPC-treated H2O2 静置

5 min，1.2 万 r/min 离心 2 min。将收集到的 RNA

样品按每管10 μL分装，-80 ℃保存。

274

冯梓航，等：精氨酸双糖苷对黑色素瘤B16细胞的作用及其机制初步研究

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

取 1 μL 总 RNA 按 PrimiScriptTM RT Reagent

Kit with gRNA Eraser试剂盒进行反转录试验。根

据引物的说明书，将引物稀释成为保存液。取保

存液 5 μL，稀释 10 倍后备用。按 Taq PCR Master

Mix（2X，with Blue Dye）试剂盒说明书进行扩增。

最后按 SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒说明书

进行荧光定量RT-PCR分析。

1. 2. 6 Western Blot 检测蛋白 细胞的培养，分

组给药同本文“1.2.4”。给药培养 48 h后，加入新

的完全培养基，1 万 r/min 离心 4 min，收集细胞。

收集培养细胞，离心去除培养液，用 PBS 洗 2 遍。

用手指把细胞用力弹散，按每管细胞加入 200 μL

的比例加入裂解液，同时加入PMSF。用手指轻弹

管底以促进裂解液和细胞充分接触。1.2万 r/min

离心10 min，收集总蛋白。

经过电泳和传膜后，将封闭后的膜直接放入一抗

中，4 ℃反应过夜。用TBST 洗涤3次，每次10 min，

洗净未结合的一抗。将洗涤后的一抗反应膜放

入二抗中，室温、避光缓慢摇动作用 60 min。用

TBST 洗膜，洗涤3次，每次10 min，洗去游离二抗。

将适量的显色液均匀地涂抹于膜上方，避光

显色 1~3 min，待蛋白条显出后立即清洗掉显色

液，晾干拍照。

1. 3　统计学处理方法

试验数据用 -

x±S 表示，采用 SPSS22.0 统计软

件进行单因素方差分析且组间两两比较，采用t检

验，P<0.05表示差异显著，P<0.01为差异极显著。

2　结果与分析

2. 1 AFG对B16细胞增殖的影响

与空白对照组比较，50，75，100 μmol/L 3 组

的 OD 值明显降低。50 μmol/L 试验组 P<0.05，

75，100 μmol/L 试验组 P<0.01。3 组对 B16 细胞

48 h 存活率分别为 88.31%，67.61%，55.53%。同

时AFG对B16细胞增殖影响在浓度为100 μmol/L

时达到峰值。1，2.5，5，10，25 μmol/L 试验组对

B16 细胞抑制率较低，故后续试验选用 50，75，

100 μmol/L 试验组为研究对象，同时说明了 AFG

可以抑制B16细胞的增殖，结果见图1。

2. 2 AFG对B16细胞中LDH含量的影响

为检测 AFG 对 B16 细胞是否具有毒性，使

B16 细胞受损发生凋亡，检测了各组 B16 细胞中

LDH的含量，结果见图2。由试验结果可知，与对

照组相比，各个给药组 B16细胞的 LDH 都有所升

高，且呈剂量依赖性。其中，50 μmol/L组LDH含

量明显升高（P<0.05），75和100 μmol/L给药组B16

细胞 LDH 含量极显著升高（P<0.01），100 μmol/L

促进B16细胞的凋亡效果最好。说明AFG可以促

进 B16细胞凋亡，初步说明了 AFG 对黑色素瘤有

一定治疗效果。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因

Bcl-2

Caspase-3

Bax

上游

下游

上游

下游

上游

下游

引物序列

5′-AACATCGCCCTGTGGATGAC-3′

5′-GGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′

5′-CAGCTCATACCTGTGGCTGT-3′

5′-TTCCCTGAGGTTTGCTGCAT-3′

5′-GGCTGGACACTGGACTTCTT-3′

5′-GATGGTCACTGTCTGCCATGT-3′

图1　不同浓度AFG B16细胞的存活率

Fig. 1 Survival rate of B16 cells at each AFG concen⁃

tration

图2 AFG对B16细胞中LDH的影响

Fig. 2 Effect of AFG on LDH in B16 cells

275

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 3 AFG对B16细胞凋亡的影响

50，75，100 μmol/L的AFG作用B16细胞48 h

后， Hoechst 33258 荧光染色显示，随着 AFG 浓度

增加，B16 细胞内出现核浓染，固缩越发明显；在

75，100 μmol/L 试验组核碎裂和凋亡小体增加明

显，100 μmol/L效果最佳。初步证明了 AFG可以

促进B16细胞的凋亡，结果见图3。

2. 4 AFG对B16细胞mRNA表达水平的影响

与对照组比较，50，75，100 μmol/L 3 组 B16

细胞中的 Bcl-2 mRNA 水平都有所下降，其中

75，100 μmol/L 试验组极显著降低（P<0.01），而

50 μmol/L试验组影响不显著。50，75，100 μmol/L

3 组 B16 细胞中的 Caspase-3 和 Bax mRNA 表达

都有所提高，50 μmol/L 试验组影响不显著，75，

100 μmol/L 试 验 组 2 基 因 含 量 显 著 上 升（P<

0.01）。说明AFG可以通过调控B16细胞中Bcl-2、

Caspase-3 和 Bax mRNA 的表达量，起到治疗黑色

素瘤的作用，结果见图4。

2. 5 AFG对B16细胞蛋白表达水平的影响

与对照组比较，50，75，100 μmol/L 3组B16细胞

中的Bcl-2 蛋白表达水平下降，其中75，100 μmol/L

试验组极显著降低（P<0.01），而 50 μmol/L 试验

组影响不显著。50，75，100 μmol/L 3组 B16细胞

中的 Caspase-3 和 Bax 蛋白表达上升，50 μmol/L

A.空白对照组；B~D. AFG 50,70,100 μmol/L组

图3 AFG对B16细胞凋亡形态学的影响（×400）

Fig. 3 Effect of AFG on apoptosis morphology of B16

cells（×400）

图4 AFG对B16细胞中mRNA表达的影响

Fig. 4 Effect of AFG on mRNA expression in B16 cells

276

冯梓航，等：精氨酸双糖苷对黑色素瘤B16细胞的作用及其机制初步研究

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

试验组影响不显著，75，100 μmol/L 试验组蛋白

含量显著上升（P<0.01）。试验结果也和荧光定量

PCR 结果相互印证。说明了 AFG 可以通过调控

B16 细胞中 Bcl-2、Caspase-3 和 Bax 蛋白的表达

量，起到治疗黑色素瘤的作用，结果见图5。

3　讨 论

CCK-8 法是一种测定药物对细胞的毒性测

试和细胞增殖的方法，是高效准确，操作简便的比

色法［44］

，其重复性和误差都优于MTT法［45］

。本研

究利用 CCK-8 法检测了 AFG 对 B16 细胞的毒性

及对其增殖的影响。试验结果表明，AFG 给药组

在 50 μmol/L 时，对 B16 细胞的增殖有明显的抑

制作用（P<0.05），在75，100 μmol/L时对B16细胞

的增殖有极显著的抑制作用（P<0.01），初步说明

了 AFG 可以通过抑制 B16 细胞的增殖治疗黑色

素瘤。

乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）是

催化细胞内乳酸氧和丙酮酸相互转化的一种

酶［46］

。当细胞处于健康状态，LDH 在细胞胞液

中，当细胞受到损害时，LDH 就会被释放到细胞

外［47］

。所以采用 LDH 检测给药后细胞 LDH 表达

水平，可以快速直接地体现出细胞坏死和凋亡的

状况［48］

。本研究通过检测 B16 细胞的 LDH，发现

50，75，100 μmol/L 3 组 AFG 给药组的 LDH 含量

明显增加，说明AFG可以使B16细胞受损，加快其

凋亡，从而治疗黑色素瘤。

Hoechst 33258 是一种可以穿透细胞膜的蓝

色荧光染料，因此Hoechst 33258染色法常用于细

胞凋亡检测［49］

。因此，为了进一步证实AFG能诱

导 B16 细胞凋亡，本研究用 Hoechst 33258 染色

法，对各组进行染色观察。试验结果发现，随着

AFG 给药浓度的增加，各给药组中呈蓝白色荧光

的细胞明显增加，细胞破裂，核固缩等现象增多，

说明AFG可以诱导B16细胞凋亡，与LDH检测结

果相互印证。

诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的有效途径，

肿瘤细胞的凋亡涉及到一系列基因的表达调控，

一般由促凋亡因子和抗凋亡因子相互调节和制

约［52］

。在 Bcl-2 家族中，Bax 主要调控细胞凋亡，

Bcl-2 主要防止细胞凋亡。Bcl-2 存在于哺乳动

物线粒体上，可改变其通透性。减少 Bcl-2 含量

图5 AFG对B16细胞Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表达量的影响

Fig. 5 Effect of AFG on the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in B16 cells

277

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

可以使肿瘤细胞通透性增加，使凋亡因子更容易

进入肿瘤细胞促使其凋亡［53］

。Bax的过量表达可

以抑制 Bcl-2 对肿瘤细胞的保护机制，阻抑其表

达，从而使肿瘤细胞死亡［54］

。Caspase家族是促进

细胞凋亡的重要因子，而 Caspase-3 是重要的启

动因子和执行因子，在细胞凋亡中是不可或缺

的［55］

。活化后可使细胞内相关修复蛋白失活，从

而进入不可逆的凋亡状态。同时当Bax大量表达

时会激活Caspaes-3，启动Caspase级联反应，从而

进一步促进细胞凋亡［56-57］

。本研究中，通过荧光

定量 PCR 和 Western Blot 法分别检测了各组中

B16 细胞的 Bcl-2、Bax 和 Caspaes-3 的表达情况。

与空白对照组相比，50，75，100 μmol/L 给药组中

Bcl-2的 mRNA 和蛋白表达水平都下降，其中 75，

100 μmol/L 给 药 组 对 Bcl-2 有 显 著 影 响（P<

0.01）；各给药组中Bax和Caspaes-3 mRNA和蛋白

表达活性升高，其中75，100 μmol/L给药组对Bax

和Caspaes-3有极显著影响（P<0.01），进一步证实

了 AFG 可以诱导 B16细胞凋亡，其机制可能是通

过调节B16细胞中Bcl-2、Bax和Caspaes-3的表达

水平从而起到促进B16细胞凋亡。

综上，本研究初步证实了 AFG 对小鼠的 B16

细胞有抑制增殖和抑制作用，但还需进一步研究，

深入了解 AFG 治疗黑色素瘤的机制。同时本研

究首次证实了 AFG具有抗肿瘤活性，扩大了 AFG

药理活性的研究范围，为 AFG活性研究提供了理

论基础。

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（责任编辑：王希）

279

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E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（2）：280-289

Journal of Jilin Agricultural University

青风藤总生物碱提取工艺及抗痛风作用*

曹沛莹，陈维佳，宗 颖，时 坤，李建明，何忠梅**，杜 锐**

吉林农业大学中药材学院，长春 130118

摘 要：以比色法测得的青藤碱含量为评价指标，采用乙醇加热回流提取法，考察乙醇浓度、液料比、提取时

间和提取次数对青风藤生物碱得率的影响，用星点设计-响应面法分析从青风藤中提取青风藤总生物碱的最

佳提取工艺参数；采用氧嗪酸钾腹腔注射联合关节腔注射尿酸钠造成大鼠痛风模型，用ELISA 法测定青风藤

总生物碱对痛风模型大鼠血清尿酸（UA）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α

（TNF-α）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、胱抑素c（Cys-c）、谷丙转氨酶（ALT）含量以及关节

滑膜组织中UA，IL-1β，IL-6，TNF-α含量的影响；采用H&E染色法观察青风藤总生物碱对痛风模型大鼠的肾

脏保护作用。星点设计-响应面法分析得到青风藤总生物碱最佳提取工艺条件：10倍量 75%乙醇，加热回流

提取 3次，每次 1. 8 h；青风藤总生物碱可显著改善痛风大鼠关节炎导致的足肿胀，降低模型大鼠血清中 UA，

IL-1β，IL-6，TNF-α，XOD，BUN，Cr，Cys-c和ALT水平，显著降低大鼠关节滑膜组织中UA，IL-1β，IL-6，TNF-α

含量。HE染色结果表明，青风藤总生物碱可减轻痛风大鼠肾损伤，减少炎性浸润。上述研究结果表明，星点

设计-响应面法优化青风藤总生物碱乙醇提取工艺条件，方法简单可行，建立的数学模型预测性良好，青风藤

总生物碱具有显著的抗痛风作用。

关键词：青风藤；生物碱；痛风；星点设计-响应面法

中图分类号：S567 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0280-10

DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5628

引用格式：曹沛莹，陈维佳，宗颖，等.青风藤总生物碱提取工艺及抗痛风作用［J］.吉林农业大学学报，2024，46

（2）：280-289.

Extraction Process of Total Alkaloids from Sinomenii caulis and Its

Anti Gout Effect *

CAO Peiying，CHEN Weijia，ZONG Ying，SHI Kun，LI Jianming，HE Zhongmei**，DU Rui**

College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China

Abstract：Using sinomenine content measured by ultraviolet spectrophotometry as evaluation index,

ethanol heating reflux extraction method was adopted to investigate the effects of ethanol concentra⁃

tion, liquid-to-material ratio, extraction time and extraction times on the yield of Sinomenii caulis al⁃

kaloids. The optimal extraction process parameters for extracting total alkaloids from Sinomenii cau⁃

lis were analyzed using star point design-response surface method. Ethanol heating reflux and intra⁃

peritoneal injection of potassium oxyzinate combined with intra-articular injection of sodium urate

were used to create a rat model of gout. The effects of total alkaloids of Sinomenii caulis on the levels

of UA，IL-1β，IL-6，TNF-α，XOD,BUN,Cr,Cys-c and ALT in serum and the levels of UA，IL-1β，

IL-6 and TNF-α in synovial tissue of joint were detected by ELISA. HE staining was used to observe

* 基金项目：吉林省科技引导计划国际科技合作项目（20180414072GH）

作者简介：曹沛莹，女，硕士研究生，从事中药化学成分提取及作用机制研究。

收稿日期：2020-01-23

** 通信作者：何忠梅，E-mail：heather78@126.com；杜锐，E-mail：durui71@126.com

曹沛莹，等：青风藤总生物碱提取工艺及抗痛风作用

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

the protective effect of alkaloids from Sinomenii caulis on kidneys in rats with gout. The optimum ex⁃

traction conditions of alkaloids from Sinomenii caulis obtained by star point design-response surface

method were as follows: 10 times the amount of 75% ethanol, reflux extraction 3 times, 1.8 h each

time; The total alkaloids of Sinomenii caulis can significantly improve the paw swelling caused by

gout, reduce the levels of UA, IL-1β, IL-6, TNF-α, XOD, BUN, Cr, Cys-C and ALT in the serum of

the model rats, and significantly reduce the contents of UA, IL-1β, IL-6 and TNF- α in the

synovium of the rats. The results of HE staining showed that the total alkaloids can reduce kidney

damage and inflammatory infiltration in rats with gout. The above research results indicate that star

point design-response surface method is a simple and feasible method for optimizing the ethanol ex⁃

traction process of total alkaloids from Sinomenii caulis. The established mathematical model has

good predictive ability, and the total alkaloids from Sinomenii caulis have a significant anti gout ef⁃

fect.

Key words：Sinomenii caulis； alkaloid； gout； star point design-response surface method

痛风是一种由于嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减

少进而使单钠尿酸盐（MSU）沉积所导致的相关性

关节病，临床表现为高尿酸血症。痛风严重者可

出现关节破坏、肾功能损害，常伴发高脂血症、高

血压、糖尿病、动脉硬化及冠心病等［1-2］

。目前，临

床常使用秋水仙碱、非甾体抗炎药（NSAIDs）、肾

上腺皮质激素、抑制尿酸生成药（别嘌醇、非布司

他）和促进尿酸排出药（苯溴马隆、丙磺舒）等治疗

痛风。这些药物虽然抗炎止痛作用较强，起效较

快，但多数药物具有明显毒副作用［3-4］

。中药相比

西药而言，具有安全、疗效稳定、价格低等优点。

青风藤（Sinomenii caulis）为防己科植物青藤

［Sinomenium acutum （Thunb.）Rehd.et Wils.］或毛

青 藤［Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils.

var.cinereum Rehd.et Wils.］的干燥藤茎，别名寻风

藤、清风藤、扶风藤，气微、性平、味苦、辛，归肝经、

脾经，具有祛风湿、通经络、利小便等功效，始载于

宋代《图经本草》，李时珍在《本草纲目》中又称青

风藤为青藤、寻风藤，该书载：治风湿流注，历节鹤

膝，麻痹瘙痒，损伤疮肿。现收载于2015年版《中

国药典》［5］

。青风藤主要含有生物碱、甾醇类成

分，其中生物碱成分以青藤碱、双青藤碱、木兰花

碱 和 尖 防 己 碱 为 代 表 ，青 藤 碱 占 总 生 物 碱

80%［6-9］

。青风藤主要活性成分是生物碱类成分，

药理活性显著，对多类炎症均具有抗炎作用［10-15］

，

具有显著的镇静、镇痛、降压、抑制免疫、抗肿瘤、

保护脏器损伤等作用［16-21］

，而有关青风藤总生物

碱抗痛风作用研究较少。

为进一步开发利用青风藤，以青风藤碱的含

量为评价指标，研究从青风藤药材中提取青风藤

总生物碱的提取条件，针对其提取方法，分别比较

了超声波提取、浸渍法和回流提取法，最终确定采

用乙醇回流提取法，利用星点设计-响应面法优

化提取工艺，确定其工艺参数，考察了青风藤总生

物碱对氧嗪酸钾腹腔注射联合关节腔注射尿酸钠

造成大鼠痛风模型的影响，为青风藤总生物碱的

工业化生产以及抗痛风五类新药开发提供理论和

科学依据。

1　材料与方法

1. 1　试验动物、试剂及仪器

试验动物：SD 雄性大鼠 60 只，体质量（200±

20）g，试验前大鼠适应性饲养7 d，自由饮食，饲养

环境干净、安静，每组大鼠自由摄食、饮水。

试剂：青风藤药材购自江苏省，经吉林农业

大学中药材学院张连学教授鉴定为防己科植物

青藤［Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils.］

的干燥藤茎，研磨成粉，备用；青藤碱对照品（批号

R14A8F41701，质 量 分 数 ≥98%），尿 酸 钠（批 号

S16N8I46625），氧嗪酸钾（批号：B22D9D78194，纯

度≥99.7%）均购自上海源叶生物有限公司；秋水

仙碱（西双版纳版纳药业有限责任公司，批号：

181002）；UA、IL-1β、IL-6、TNF- α、XOD、BUN、

Cr、Cys-c 及 ALT 酶联免疫吸附反应（ELISA）试

剂盒（R&D 公司）。

仪器：UV-6100 紫外-可见分光光度计，KH300DB 型数控超声波清洗器，XMTD-204 数显恒

温水浴锅，BS210S 电子天平，离心机，酶标分析

281

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

仪，显微镜。

1. 2　方法

1. 2. 1 青风藤总生物碱含量测定及对照品和供

试品溶液配制 含量测定：甲醇为空白溶液，于

262 nm 处测定溶液吸光度（A）值，按标准曲线

法求出其含量。

对照品溶液：精密称取 5.00 mg 青藤碱标准

品，加甲醇定容于50 mL量瓶中，配制成0.1 mg/mL

的标准品溶液，分别稀释至10~275 μg/mL，摇匀，

备用。

供试品溶液：取提取后干燥粉末 80.00 mg 置

于 50 mL 量瓶中，加甲醇 20 mL，超声 3 min，加甲

醇至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液

5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，备用。

1. 2. 2 方法学考察 线性关系考察。精密吸取

配制好的青藤碱对照品溶液，以甲醇溶液为空白

溶液，于 262 nm 处测定其 A 值。以 A 值为纵坐

标，青藤碱对照品溶液质量浓度 C（μg/mL）为横

坐标。计算青藤碱的回归方程为 A = 0.013 1C +

0.038 1（R2

= 0.999 8），表明青藤碱质量浓度在10~

275 μg/mL呈良好的线性关系。

精密度试验。取同一对照品溶液适量，按照

本文“1.2.1”的方法测定A值，连续测定6次，结果

测得青藤碱的 RSD 值为 0.52%，表明仪器精密度

良好。

重复性试验。取青风藤药材粉末，精密称取

6 份，平行提取 6 次，按照本文“1.2.1”方法制备成

6份供试品溶液，并进行测定，测得青藤碱的 RSD

值为2.26%，表明该方法重复性良好。

稳定性试验。取同一供试品溶液适量，在 0，

4，6，12，24，48 h 进行测定，测得青藤碱的 RSD 值

为1.43%，表明溶液在48 h内稳定。

加样回收率试验。精密称取青风藤总生物碱

含 量 已 知 的 供 试 品 溶 液 6 份 ，分 别 按 照 本 文

“1.2.1”方法制备的同一对照品溶液测定，测得青

藤碱的平均回收率为99.21%，RSD值为0.91%，表

明该方法回收率良好。

1. 2. 3 单因素试验 乙醇质量分数。精密称取

青风藤药材粉末 5.00 g，分别用 50%，60%，70%，

80%，90% 的 10倍量乙醇为溶剂，加热回流提取，

提取1次，每次2 h，抽滤后倒于蒸发皿内，蒸发干

燥，得青风藤提取物粉末，测定其A值。

液料比。精密称取青风藤药材粉末 5.00 g，

以70%乙醇为溶剂，分别用为6，8，10，12，14倍量

的乙醇，加热回流提取，提取 1 次，每次 2 h，同上

得青风藤提取物粉末，测定其A值。

提取时间。精密称取青风藤药材粉末5.00 g，

以10倍量，70%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取

1次，每次分别提取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，同上得

青风藤提取物粉末，测定其A值。

提取次数。精密称取青风藤药材粉末5.00 g，

以10倍量，70%乙醇为溶剂，加热回流提取，分别

提取 1，2，3，4，5 次，每次 2 h，同上得青风藤提取

物粉末，测定其A值。

1. 2. 4 星点设计-响应面试验 结合单因素试

验结果，以青藤碱含量为指标，采用 CCD 响应面

法进行试验设计，以乙醇质量分数（X1

）、液料比

（X2

）和提取时间（X3

）为 3 个因素，建立三因素五

水平试验，见表1。

1. 2. 5 青风藤生物碱抗痛风试验 尿酸钠晶体

制备：将200 mg尿酸钠和10 mL生理盐水，配制成

20 mg/mL 溶液，超声振荡充分溶解，使用前

180 ℃下灭菌2 h，即得。

试验动物分组与模型建立：取雄性大鼠60只，

随机分为6组，即空白组、模型组、阳性组（秋水仙碱

0.30 g/kg）、青风藤总生物碱高剂量组（3.50 g/kg）、

中剂量组（1.75 g/kg）、低剂量组（0.875 g/kg），每

组10只。上午除空白组外，模型组与各给药组腹

腔注射氧嗪酸钾溶液（0.3 g/kg）；下午各给药组

大鼠每天给予相应药物，空白组与模型组给予生

理盐水，依照 10 mL/kg体积灌胃，每日 1次，连续

14 d。第12天给药1 h后，除空白组外，各组大鼠

表1　青风藤总生物碱提取工艺的中心组合试验设计因

素与水平

Table 1 Design factors and levels of central combina⁃

tion experiment for total alkaloids from

S. caulis

水平

-1.682

-1

0

1

1.682

因素

乙醇质量分数/%

X1

60.0

66.1

75.0

83.9

90.0

液料比

X2

8∶1

9∶1

10∶1

11∶1

12∶1

提取时间/h

X3

1.0

1.3

1.8

2.2

2.5

282

曹沛莹，等：青风藤总生物碱提取工艺及抗痛风作用

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

选取右侧关节进行造模，找到髌骨外侧缘与股骨

外侧踝之间的髌骨关节间隙，用 1 mL 注射器缓

慢进针，有脱空感后注入 0.2 mL尿酸钠溶液，以

关节腔对侧鼓起为注射成功标准，诱导急性关节

炎模型，正常组大鼠对应位置注入相同体积生理

盐水。

检测指标。踝关节肿胀度：急性关节炎模型

造模24，48 h后，用绕线法测关节周径，重复3次，

取平均值。第 14 天，造模 4 h 后，大鼠眼眶取血

4 mL，室温放置 30 min，4 000 r/min 离心 15 min，

取血清分装于离心管中；ELISA 法测定血清中

IL-1β，IL-6，TNF-α，UA，XOD，BUN，Cr，Cys-c 及

ALT 含量。取大鼠右后足踝关节滑膜组织，置于

离心管中，ELISA 法测定关节滑膜组织中 IL-1β，

IL-6，TNF-α 及 UA 含量。取肾脏，将其置于 4%

多聚甲醛中固定。各组脏器均用石蜡包埋、切片、

HE染色后观察其病理改变。

1. 2. 6 统计学分析 数据处理采用SPSS 20.0统

计软件，数据以平均数±标准差（xˉ±S）表示，比较

用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果与分析

2. 1　青风藤总生物碱提取的单因素试验结果

由表2可知，当乙醇质量分数为80%时，青风

藤总生物碱含量最高，因此将乙醇质量分数设在

60%~90%。当液料比达到10∶1时，青风藤总生物

碱含量最高，因此将液料比设在8∶1~12∶1。青风

藤在提取2 h 时，青风藤总生物碱含量最高，因此

将提取时间设在 1.0~2.5 h。当加热回流提取 3次

时，青风藤总生物碱含量明显高于其他提取次数，

因此提取次数设为3次。

2. 2　青风藤总生物碱提取工艺的星点设计-响

应面试验结果

采用 SAS（9.4）软件对青风藤总生物碱的

含量进行响应面分析（表 3），得到回归方程：

Y=-1 582.078+18.285X1+167.713X2+190.471X3-

0.114X1

2

-0.082X1X2-7.623X2

2

-0.018X1X3-

5.089X2X3-40.168X3

2

。显著性检验结果见表4。

回归模型的方差分析见表5，线性项（P<0.05）

说明对青风藤总生物碱含量具有显著影响，而总

模型和二次项（P<0.01）对青风藤总生物碱含量具

有极显著影响，总模型相关系数 R2

=0.822 4。失

拟项（P>0.05）表明回归方程对本试验拟合程度较

好，与实测值拟合较好。

岭脊回归分析结果见表 6，由回归方程预测

得到的青风藤总生物碱最佳提取工艺：10 倍量

76.5% 乙醇加热回流提取 3 次，每次提取 1.75 h。

在此条件下，青藤碱含量约为125.92 mg/g。

表2 青风藤总生物碱提取的单因素试验结果

Table 2 Single factor test results of total alkaloids from S. caulis

因素

乙醇

浓度/%

液料比

（mL∶g）

水平

50

60

70

80

90

6∶1

8∶1

10∶1

12∶1

14∶1

w （青风藤生物碱）/

（mg·g

-1

）

79.04

96.6

108.38

117.02

86.09

94.03

102.88

113.8

96.67

94.09

青风藤生物碱占比/%

40.74

45.43

52.19

56.73

45.13

48.47

51.96

54.19

50.35

47.05

因素

提取

时间/h

提取

次数

水平

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

1

2

3

4

5

w （青风藤生物碱）/

（mg·g

-1

）

95.52

99.45

119.22

101.21

100.65

106.22

103.00

131.34

109.53

100.57

青风藤生物碱占比/%

51.91

51.26

54.19

51.64

51.83

54.19

53.65

59.17

52.16

51.84

283

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

表3 青风藤总生物碱提取的星点设计-响应面试验结果

Table 3 Star point design-response surface experiment results for the extraction of total alkaloids from S. caulis

试验序号

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

S11

S12

S13

S14

S15

S16

S17

S18

S19

S20

乙醇质量分数X1

-1

1

-1

1

-1

1

-1

1

-1.682

1.682

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

液料比X2

-1

-1

1

1

-1

-1

1

1

0

0

-1.682

1.682

0

0

0

0

0

0

0

0

提取时间X3

-1

-1

-1

-1

1

1

1

1

0

0

0

0

-1.682

1.682

0

0

0

0

0

0

w（生物碱）（/ mg·g

-1

）

97.47

111.64

102.71

115.41

96.69

114.16

94.13

107.20

96.05

91.99

90.55

91.12

91.17

102.92

125.73

124.34

126.19

123.90

126.43

124.90

表4 青风藤总生物碱提取工艺回归模型参数的显著性检验

Table 4 Significance test of regression model parameters for S. caulis total alkaloid extraction process

参数

截距

X1

X2

X3

X2

1

X2

X1

X2

2

X3

X1

X3

X2

X2

3

自由度

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

预测值

-1 582.078 0

18.285 1

167.713 3

190.471 3

-0.113 9

-0.082 3

-7.623 3

0.018 1

-5.088 6

-40.167 8

标准差

371.609 7

5.307 1

41.301 2

90.766 0

0.026 9

0.320 0

1.581 7

0.709 1

6.307 6

10.798 7

t值

-4.26

3.45

4.06

2.10

-4.23

-0.26

-4.82

0.03

-0.81

-3.72

P值

0.001 7

0.006 3**

0.002 3**

0.062 2

0.001 7**

0.802 1

0.000 7**

0.980 1

0.438 6

0.004**

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。表5同

表5 青风藤总生物碱提取工艺回归模型的方差分析

Table 5 Variance analysis of regression model for S. caulis total alkaloid extraction process

项目

总模型

线性项

二次项

失拟项

自由度

9

3

3

5

总离差平方和

3 003.965 1

193.630 7

2 763.789 4

643.235 9

相关系数

0.822 4

0.053 0

0.756 7

F值

5.15

1.00

14.21

121.93

P值

0.008 6**

0.034 3*

0.000 6**

0.056 8

284

曹沛莹，等：青风藤总生物碱提取工艺及抗痛风作用

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

根据青风藤生物碱含量的二次回归模型，以

其中乙醇质量分数、料液比和提取时间中的一个

影响因素为中心值（编码水平为 0），绘制三维空

间图，观察另2个因素对青风藤总生物碱含量的影

响。由图 1可见，乙醇质量分数（X1

）、液料比（X2

）

和提取时间（X3

）3 个因素对青风藤总生物碱含量

均具有一定的影响。3个响应面图重叠可得青风藤总

生物碱含量的最佳提取工艺条件：乙醇质量分数（X1

）

69.5%～83.75%，液料比（X2

）9.1∶1~10.9∶1，提取

时间（X3

）1.3～2.1 h。为了降低耗能，节约成本，

考虑其实际可操作性，最终确定最佳提取工艺

条件：乙醇质量分数 75%，液料比 10∶1，回流提取

3次，每次1.8 h。

最佳工艺验证：精密称取青风藤药材粗粉

末 5.00 g，按最佳提取条件，平行提取 3 次，得到

青风藤总生物碱的含量分别为 126.39，124.58，

125.38 mg/g，平均含量为 125.45 mg/g，与预测值

（125.92 mg/g）接近，说明所建立模型可信度高。

为验证大量提取情况下所建立模型依然可信，

称取青风藤药材粗粉末 50.00 g，以上述提取条

件平行提取 3 次，所得青风藤总生物碱的含量

分别为 126.73，128.19，126.43 mg/g，平均含量为

127.12 mg/g，与预测值（125.92 mg/g）接近。

2. 3　青风藤总生物碱抗痛风试验结果

2. 3. 1 青风藤总生物碱对大鼠关节肿胀的影

响 由表7可知，与空白组相比，模型组与低剂量

组在造模 24，48 h 后关节肿胀均有显著作用（P<

0.05或P<0.01）；与模型组相比，阳性组、青风藤总

生物碱组在造模 48 h后，关节肿胀度极显著下降

（P<0.01）。

表6　青风藤总生物碱提取工艺模型的岭脊回归分析

Table 6 Ridge regression analysis of S. caulis total alkaloid extraction process model

编码半径

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

响应预测值/

(mg·g

-1

)

125.557 3

125.924 5

125.780 7

125.129 5

123.976 5

122.331 8

120.212 4

117.637 8

114.622 8

111.175 8

107.301 4

标准差

3.309 8

3.295 9

3.261 7

3.225 6

3.219 1

3.287 4

3.487 2

3.873 4

4.474 2

5.288 0

6.299 0

因素预测值

乙醇质量分数/%

X1

75.000 0

76.498 0

77.990 8

79.462 5

80.876 5

82.149 7

83.173 9

83.932 1

84.500 3

84.952 4

85.333 2

液料比

X2

10.000 0

10.001 3

9.987 0

9.957 9

9.911 4

9.842 9

9.754 0

9.655 8

9.557 3

9.461 6

9.368 8

提取时间/h

X3

1.750 0

1.753 7

1.760 6

1.774 3

1.800 6

1.846 7

1.914 2

1.994 0

2.076 8

2.159 0

2.239 4

表7　青风藤总生物碱对大鼠关节肿胀的影响（n=10）

Table 7 Effect of total alkaloids from S. caulis on joint swelling in rats（n=10）

处理

空白组

模型组

阳性组

低剂量组

中剂量组

高剂量组

剂量（/ g·kg-1

）

0.300

0.875

1.750

3.500

肿胀度/cm

24 h

3.00±0.30

3.51±0.50△

3.15±0.18

3.36±0.11△

3.26±0.13

3.12±0.19

48 h

3.00±0.35

3.70±0.17△△

3.05±0.19**

3.32±0.15△**

3.14±0.15**

2.96±0.46**

注：与模型组比较，“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01；与空白组比较，“△”表示P<0.05；“△△”表示P<0.01。下表同

285

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 3. 2 青风藤总生物碱对大鼠血清生化指标的

影响 由表8可知，模型组大鼠血清中UA，IL-1β，

IL-6，TNF-α 浓度均显著高于空白组（P<0.01）；

与模型组相比，阳性组与青风藤总生物碱组大鼠

经治疗，血清中 UA，IL-1β，IL-6，TNF-α 浓度显

著降低（P<0.05或P<0.01），说明青风藤总生物碱

不仅能降低痛风模型大鼠的尿酸值，还能抑制炎

症因子的生成。由表 9 可知，模型组大鼠血清中

ALT，Cys-c，BUN，XOD，Cr含量均高于空白组，差

异极显著（P<0.01），说明痛风模型可使大鼠的肝

脏、肾脏均有不同程度的损伤。与模型组相比

较，阳性组与青风藤总生物碱组大鼠经治疗，

血清中 ALT，Cys-c，BUN，XOD，Cr 含量显著降低

（P<0.05 或 P<0.01），且呈剂量依赖性。说明青风

藤总生物碱通过降低这些血清生化指标，起到一

定的保护作用。

2. 3. 3 青风藤总生物碱对大鼠关节滑膜组织生

化指标的影响 由表10可知，模型组大鼠关节滑

膜组织中 UA，IL-1β，IL-6，TNF-α 浓度均显著高

于空白组（P<0.01）；与模型组比较，阳性组与青

图1　两两因素交互作用对青风藤总生物碱含量影响的响应面图

Fig. 1 Response surface diagram the effect of interaction between two factors on total alkaloid content of S. caulis

表8 青风藤总生物碱对模型大鼠血清UA，IL-1β，IL-6及TNF-α水平的影响（n=10）

Table 8 Effect of total alkaloids from S. caulis on levels of UA， IL-1β， IL-6 and TNF-α in serum of model rats

（n=10）

处理

空白组

模型组

阳性组

低剂量组

中剂量组

高剂量组

剂量（/ g·kg-1

）

0.300

0.875

1.750

3.500

UA/（μmol·L-1

）

107.97±7.03

186.87±21.01△△

125.52±5.65*

151.20±12.51

139.82±21.80*

119.10±7.98**

IL-1β（/ pg·mL-1

）

21.76±2.78

53.84±2.64△△

21.83±0.95**

42.05±0.96*

34.60±3.10**

20.70±1.83**

IL-6（/ pg·mL-1

）

120.19±10.77

356.57±21.13△△

124.07±11.53**

245.49±23.98*

170.07±9.06**

126.55±10.10**

TNF-α（/ pg·mL-1

）

129.01±1.32

343.86±26.48△△

132.45±11.70**

241.59±31.86*

197.23±14.41*

131.86±11.10**

286

曹沛莹，等：青风藤总生物碱提取工艺及抗痛风作用

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

风藤总生物碱组大鼠经治疗，关节滑膜组织中

UA，IL-1β，IL-6，TNF-α浓度显著降低（P<0.05或

P<0.01）。上述结果表明，青风藤总生物碱可减轻

尿酸钠导致大鼠急性痛风引发的机体炎症反应。

2. 3. 4 青风藤总生物碱对大鼠肾脏的影响 由

图2可见，对照组大鼠肾组织结构正常，无炎性浸

润。模型组大鼠肾组织有明显的炎性浸润，肾小

管扩张，排列紊乱，细胞核流出。阳性组和青风藤

总生物碱干预后，大鼠肾组织炎性浸润明显减少，

肾小管扩张数减少，排列相对整齐，但低剂量组炎

性浸润现象仍较严重，阳性组与高剂量组治疗效

果明显。

表10 青风藤总生物碱对模型大鼠关节滑膜组织UA，IL-1β，IL-6及TNF-α水平的影响（n =10）

Table 10 Effect of total alkaloids from S. caulis on levels of UA， IL-1β， IL-6 and TNF-α in synovium of model rats

（n=10）

处理

空白组

模型组

阳性组

低剂量组

中剂量组

高剂量组

剂量（/ g·kg-1

）

0.300

0.875

1.750

3.500

UA/（μmol·L-1

）

57.64±1.44

141.65±6.74△△

58.82±2.66**

107.51±4.05*

85.10±3.05**

58.96±2.19**

IL-1β（/ pg·mL-1

）

83.08±1.99

157.44±3.34△△

84.31±2.89**

127.05±0.96*

105.53±3.54**

79.48±1.62**

IL-6（/ pg·mL-1

）

136.80±5.19

346.21±7.11△△

139.13±3.47**

292.38±4.31*

200.94±8.12**

139.21±8.58**

TNF-α（/ pg·mL-1

）

234.80±10.99

447.64±11.63△△

236.05±13.50**

344.20±21.47*

297.65±11.37**

235.84±10.74**

表9 青风藤总生物碱对模型大鼠血清ALT，XOD，Cys-c，BUN，Cr水平的影响（n=10）

Table 9 Effect of total alkaloids from S. caulis on levels of ALT，Cys-c，BUN， XOD and Cr in serum of model rats

（n=10）

处理

空白组

模型组

阳性组

低剂量组

中剂量组

高剂量组

剂量（/ g·kg-1

）

0.300

0.875

1.750

3.500

ALT/（U·L-1

）

35.45±3.27

57.04±4.81△△

40.62±3.52*

48.18±0.39

42.68±1.90*

36.98±3.44**

XOD/（U·L-1

）

25.08±4.01

48.20±2.09△△

29.68±0.62**

45.11±1.30*

30.00±1.58**

25.97±0.85**

Cys-c/(ng·mL-1

)

89.47±0.90

149.23±1.80△△

104.27±2.55**

137.18±0.39

112.68±1.90*

92.23±2.45**

BUN/(mmol·L-1

)

7.64±0.45

9.30±0.30△△

7.96±0.10*

8.78±0.86

8.07±0.93*

7.66±0.34**

Cr/（μmol·L-1

）

39.84±2.36

50.58±2.84△△

41.39±1.55*

46.64±2.17

42.35±2.29*

39.82±1.97**

a.空白对照组；b.模型组；c.阳性组;d.高剂量；e.中剂量；f.低剂量。▲炎性浸润；●细胞核流出；■肾小管扩张，排列紊乱

图2　大鼠肾组织病理切片HE染色（×200）

Fig. 2 HE staining in pathological sections of kidney of rats （×200）

287

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

3　讨 论

青风藤药材中青藤碱含量较高，其基本母核

为吗啡烷，具有较好的脂溶性［22］

。在同一批样品，

相同前处理时间内，乙醇加热回流法比超声法样品

含量更高。且相较于超声法，本试验提取完成后的

乙醇可再次回收，减少试剂消耗。本研究以青藤

碱的含量为指标，采用星点设计-响应面法优化从

青风藤药材中提取总生物碱的工艺参数，该方法相

较于正交试验设计更能直观地找到最佳提取工艺条

件，且精确度更高，预测性准，适于工业化大生产。

痛风是一种由于嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减

少所引起的疾病，临床表现为单钠尿酸盐沉积和高

尿酸血症。高尿酸血症是痛风的发病基础，当肝脏

代谢的尿酸过多，或者肾脏排出的尿酸减少，都会

使尿酸沉积，当尿酸沉积到一定浓度时就是高尿酸

血症［23-24］

。黄嘌呤氧化酶是尿酸合成关键酶，多存

在于肝脏和小肠，在高尿酸血症的发病中有着重

要的地位［25］

。尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾腹腔注射，

通过抑制大鼠体内尿酸分解，使尿酸不能转化为

水溶性的尿囊素排出体外，造成尿酸沉积［26］

；用

尿酸钠晶体注入大鼠关节腔，可产生与急性痛风

性关节炎相同的症状，并且与急性痛风性关节炎

的发病诱因相同，因此，用此方法作为大鼠急性痛

风性关节炎模型［27-28］

。本试验采用氧嗪酸钾腹腔

注射联合关节腔注射尿酸钠造成大鼠痛风模型，

与临床急性痛风模型症状相符。UA 的测定是痛

风的临床诊断指标之一［29-31］

。与对照组比较，模

型组大鼠血清以及关节滑膜组织中 UA含量明显

升高，说明大鼠痛风模型建立成功，其中高剂量组

治疗效果尤其明显。模型组大鼠血清中 XOD 和

ALT含量与空白组比较明显升高。经过青风藤总

生物碱的治疗，大鼠血清中 ALT、XOD 含量显著

降低，表明模型大鼠的肝脏损伤均有不同程度的

改善。青风藤总生物碱高、中、低剂量组能降低模

型大鼠血清中 BUN，Cr，Cys-c 含量，大鼠肾组织

病理切片 HE 染色中可发现肾小管扩张数减少，

炎性浸润程度明显减轻，改善由于痛风模型造成

的肾损伤，其中高剂量组治疗效果尤其明显。

古书记载青风藤用于风湿痹痛，关节肿胀，麻

痹瘙痒等，如今因为临床和治疗效果好及副作用

小，已被广泛用于治疗自身免疫性疾病，尤其是类

风湿性关节炎，这归因于对细胞因子和促炎因子的

调节。在急性痛风性关节炎发生发展中，TNF-α，

IL-1，IL-6 等炎症因子的分泌发挥着重要作用。

血清 IL-1β 是最重要的炎症细胞因子之一， IL1β的大量聚集有明显的致炎作用。在关节部位，

IL-1β可刺激TNF-α等炎症细胞因子的分泌［32-37］

。

本研究成功建立大鼠痛风模型，ELISA 法测定大

鼠血清以及关节滑膜组织中IL-1β，IL-6和TNF-α

含量，发现经过青风藤总生物碱的干预，血清和关

节滑膜组织中炎症因子的水平显著低于模型组，

其中高剂量组治疗效果最为明显。

本研究发现，青风藤总生物碱还能显著改善

大鼠痛风性关节炎的足肿胀，降低痛风大鼠血清

与 关 节 滑 膜 组 织 中 UA，IL-1β，IL-6，TNF- α，

XOD，BUN，Cr，Cys-c，ALT水平，以及大鼠关节滑

膜组织中UA，IL-1β，IL-6和TNF-α含量，抑制尿

酸形成，对肝肾起保护作用，表现出显著的抗痛风

作用。综上，本研究可为青风藤总生物碱的工业

化生产和抗痛风五类新药开发提供试验基础和理

论依据，具有开发和应用前景。

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（责任编辑：林海涛）

289

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（2）：290-296

Journal of Jilin Agricultural University

复合微生物菌剂在苏打盐碱土改良中的应用*

庞 宁，张 雪，刘俊清，胡琦琳，张建峰**

吉林农业大学生命科学学院，秸秆生物学与利用教育部重点实验室，长春 130118

摘 要：为探究复合菌剂对盐碱土改良的影响，在分离筛选耐盐碱固氮菌寡养单胞菌属（Oligotrophomonas）和

农杆菌属（Agrobacterium）基础上，与实验室现有的溶磷菌、纤维素降解菌进行组合，并通过水稻盆栽试验，验证

了复合微生物菌剂在土壤理化性质、水稻形态及生理指标的作用效果。结果表明：不同处理均与对照（未处理

盐碱土）差异显著（P<0. 05），复合菌肥组土壤 pH下降了 0. 92个单位，复合菌剂组电导率下降 27. 0%，生物炭

基复合菌剂组HCO3含量下降54. 1%；生物炭基复合菌剂组有机质、速效氮磷钾等指标均明显增加；生物炭基

复合菌剂组水稻的株高、根长、鲜质量、干质量分别比对照提高了391. 5%，215. 5%，1 203. 8%，1 235. 7%；生物

炭基复合菌剂组水稻的 SPAD、可溶性蛋白、SOD、根系活力等指标比对照分别增加了 262. 6%，138. 3%，

269. 8%，298. 7%，MDA 下降了 35. 6%。总体来看，复合菌剂对苏打盐碱土有一定的改良效果，优于市面出售

的菌剂，其与生物炭配施效果最佳，为苏打盐碱地的修复和改良提供技术支持。

关键词：复合菌剂；水稻；盐碱地；生物炭

中图分类号：S156. 4 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0290-07

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1252

引用格式：庞宁，张雪，刘俊清，等.复合微生物菌剂在苏打盐碱土改良中的应用［J］.吉林农业大学学报，2024，

46（2）：290-296.

Application of Compound Microbial Agent in Improvement of Soda

Saline-alkali Soil *

PANG Ning，ZHANG Xue，LIU Junqing，HU Qilin，ZHANG Jianfeng**

College of Life Sciences， Jilin Agricultural University， Key Laboratory of Straw Biology and Utiliza⁃

tion of Ministry of Education， Changchun 130118，China

Abstract：To explore the effects of compound bacteria on the improvement of saline-alkali soil, Oli⁃

gotrophomonas and Agrobacterium with salt-resistant and alkali-resistant nitrogen-fixed bacteria were

isolated and screened out for scientific and reasonable combination with existing phosphorus-soluble

bacteria and cellulose-degrading bacteria in laboratory. Soil physicochemical properties, rice mor⁃

phology, and physiological indexes were determined by pot experiment of rice. The results showed

that there were significant differences among all different treatments and the control (untreated

saline-alkali soil) (P<0.05). The soil pH value of compound bacterial fertilizer group decreased by

0.92 units, and the electrical conductivity of compound bacterial agent group decreased by 27.0%.

The contents of organic matter, available phosphorus and other nutrients in the compound bacteria

biochar group were significantly increased, and the content of HCO3 decreased by about 54.1%. The

plant height, root length, fresh weight and dry weight of the compound bacteria biochar group were in⁃

* 基金项目：吉林省科技发展计划项目（20190303070SF），国家自然科学基金国际合作与交流项目（41920104008）

作者简介：庞宁，女，硕士研究生，研究方向：微生物资源应用。

收稿日期：2021-05-07

** 通信作者：张建峰，E-mail：zhangjianfeng06@tsinghua.org.cn

庞宁，等：复合微生物菌剂在苏打盐碱土改良中的应用

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

creased by 391.5%, 215.5%, 1 203.8% and 1 235.7% respectively compared to the control group.

The SPAD, soluble protein, SOD, and root activity in rice were increased by 262.6%, 138.3%,

269.8%, 298.7%, respectively, and MDA in the compound bacteria biochar group was decreased by

35.6%. In general, the compound bacterial agent developed in the laboratory has a certain improve⁃

ment effect on soda saline-alkali soil, which is better than the bacterial agent sold in the market. The

combined application of bacterial agent with biochar has the most significant effect, providing techni⁃

cal support for the repair and improvement of soda saline-alkali soil.

Key words：compound bacterial agent； rice； saline-alkali land； biochar

中国分布着不同类型的盐碱地，盐碱化程度

十分严重［1］

，影响经济作物的生长，研究和改良盐

碱地对确保我国生态安全，尤其是保证耕地总量

平衡具有重要意义［2］

。吉林省西部的盐碱地属于

苏打盐碱土，含有大量的 HCO3

-

、CO3

2-

和交换性钠

离子［3］

，加大了改良的难度［4］

。盐碱度过高会增

加对植物的胁迫作用，影响植物生长［5-6］

，危害人

体健康，破坏生态环境［7］

。因此，改良吉林省西部

的苏打盐碱地已经成为专家们的研究热点。目

前，土壤改良方法分为物理法、化学法和生物

法［8-9］

。物理和化学改良虽有成效，但存在工程量

大、成本过高、范围有限、容易反盐等问题，生物改

良已成为最热门的研究方法，包括种植耐盐碱植

物和微生物改良。

水稻是全球主要粮食作物之一，其需求量随

人口增长不断增加［10］

，耐盐碱水稻具有抗盐碱，

增加土壤有机质、有效氮磷钾，降低可交换性钠离

子、全盐量、pH 等特点，利用盐碱地种植水稻，以

稻治碱，可以增加粮食产量，改善盐碱土壤质

量［11］

，是一种有前景、环境友好的方法［12］

。微生

物改良土壤是有效且绿色友好的措施，是未来的

新方法、新趋势［13］

，Li 等［14］

证明了从植物根际分

离、鉴定的1株具有磷酸盐增溶、ACC脱氨酶活性

的克雷伯菌PD3，可提高水稻的各项生理指标，有

望成为与水稻根际互作的新型土壤改良细菌，并

投入土壤改良中。微生物复合菌剂通常由不同

的、互相不产生拮抗作用的 2 种或更多功能有益

微生物组成，应对土壤元素缺失的情况，在现代盐

碱地改良中应用广泛［15］

。赵思崎等［16］

利用7种不

同的植物促生细菌按照生物量1∶1的比例复配成

微生物复合菌剂，发现可显著提高水稻的生长指

标。从长远来看，复合菌剂比单菌株更能够长期

发挥作用且效果稳定，可分泌不同的活性物质，增

加作物产量［17］

。刘畅等［18］

研制出1种对根际有促

生功能的复合菌剂，可降低土壤盐碱毒害，增加土

壤中的营养元素。此外，各种农用残留物，如生物

炭，秸秆等均可通过合理分配，作为微生物菌剂的

载体，既可以废物利用，增加肥料养分，又可以减

少化肥使用量，降低环境污染。添加秸秆也可较

好地控制土壤次生盐渍化，与一些微生物菌剂联

合施用可显著降低土壤 pH、电导率等指标，增加

土壤孔隙率［19］

。Ali 等［20］

研究发现，稻草生物炭

和 PSB 配施不同水平的磷肥，对缺磷碱性土壤中

玉米植株的生长和养分吸收有显著影响，联合比

单独施用效果更明显。He等［21］

发现，适量生物炭

可以改善土壤物理、化学、生物性质，调节土壤渗

透压，并且促进芒属植物的生长，在改良盐碱地方

面有巨大潜力。

虽然国内外市场上销售的菌肥、菌剂种类繁

多，但针对盐碱地改良的高效菌肥、菌剂较少，适

用于苏打盐碱地修复的微生物产品更是匮乏，并

且如何将耐盐碱水稻与复合菌剂联合应用改良盐

碱地的研究也较少。本研究旨在以微生物复合菌

剂为原料，秸秆肥、生物炭为载体，通过水稻盆栽

试验验证复合菌剂结合适当载体，在改善土壤理

化性质、提高水稻的形态及生理生化指标等方面

的作用，积极推进盐碱地资源的生态利用与产业

化开发，为修复苏打盐碱地提供技术支持。

1　材料与方法

1. 1　材料

菌种：从大豆、玉米根际筛选分离的自生固氮

菌，编号为N13，N14；从农安采集土壤中筛选分离

溶磷菌，编号为 PPN2；从生物质资源开发与利用

实验室获得 1 株高效溶磷真菌 P1（Penicillium fu⁃

niculosum）［22］

和 1 株纤维素降解菌 N\"-1（Pseudo⁃

monas mendocina）［23］

。由河南省沃宝生物科技有

限公司提供市售微生物固体菌剂，主要包含枯草、

291

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

地衣、乳酸菌等微生物，有益菌含量≥100亿/g。

供试土壤：盐碱土采自吉林省长春市农安县刘家

盐碱地（东经44°13′59.559\"，北纬125°6′41.349\"），

采样时土壤表面布满白色碱斑，采样深 0~10 cm。

黑土采自吉林农业大学试验田。采集后将2种土

样以2∶1的比例均匀混合后，装入自封袋，带回实

验室，于4 ℃冰箱保存。

菌剂载体：秸秆肥由吉林农业大学秸秆平台通

过玉米秸秆+10%牛粪自主堆腐而成，pH为 7.45，

EC 为 5.07 mS/cm，有 机 质 210.83 g/kg，速 效 磷

420.31 mg/kg，有效氮371.00 mg/kg；生物炭购自天

津亚德尔生物质科技股份有限公司，原材料为稻壳，

pH 为 9.64，EC 为 2.13 mS/cm，有机质 25.43 g/kg，

速效磷76.95 mg/kg，有效氮87.65 mg/kg。

供试作物：耐盐碱水稻“长白9号”，来自吉林

农业大学农学院。

1. 2　培养基

PDA培养基，LB培养基，NBRIP培养基（解磷

培养基），阿须贝培养基（固氮培养基）［24］

。

1. 3　拮抗试验

挑取 N13，N14，PPN2，P1，N\"-1 的单菌落，两

两一组进行生长对峙的拮抗试验，以适当距离放

入 2 个菌饼，于 28 ℃恒温培养箱中培养 2~5 d，

3 次重复，每天观察菌落形成及划线交叉点处的

细菌生长情况，判断菌株间是否存在拮抗，若交叉

点处2菌均有生长，则说明菌间不拮抗，或彼此有

促进作用；反之，则存在拮抗。

1. 4　构建复合菌剂

根据拮抗试验结果，选择互相没有拮抗作

用的菌株，活化后摇至对数期，制成浓度约为

108

CFU/mL种子液，参照赵思崎等［16］

和周静等［25］

方法，进行同等比例混合，构建成复合菌剂。

1. 5　水稻盆栽验证试验

水稻种子进行晒种、烘干、消毒、萌发。试验

共设置 8 组处理，分别为盐碱土（ck1）、市售菌剂

（ck2）、秸秆肥（SF）、复合菌剂（CMA）、复合菌+秸

秆 肥（CMF）、生 物 炭（BA）、复 合 菌 + 生 物 炭

（BCMA）、黑土（ck3）。育苗盆规格为高 110 mm，

口径180 mm，每盆约1 kg土，秸秆肥、生物炭用量

分别为盐碱土的 10% 和 6%，与土壤混合均匀后，

装入盆中。土壤浇约 50 mL 水，确保有一定的湿

度，在含有复合菌剂的处理组中将准备好的复合

菌剂均匀倒入土壤中，混合均匀，空白对照（ck1）

组及其他不加菌组倒入等量无菌水。放置 3 d以

等待水稻播种。

花盆中浇足量的水，梅花形点种，每盆播种

4 颗种子，注意根向下，上方覆盖薄土，浇水。将

水稻放入人工气候培养箱中，设置参数为 16 h光

照/28 ℃，8 h黑暗/20 ℃，含水量70%，每组3次重

复。每 2 d 浇水 100 mL，以种子播种到土壤中为

起始时间，45 d后测定相应指标。

1. 5. 1 土壤理化性质的测定 用电位法测定土

壤的pH，电导法测定土壤的电导率，HCO3

-

含量的

测定采用中和滴定法，有机质的测定采用水合热

法，速效磷的测定采用 NaHCO3浸提-钼锑抗比色

法，碱解氮的测定采用碱解扩散法，速效钾的测定

采用火焰光度法，土壤全氮测定采用凯氏定氮法，

土壤全磷测定采用硫酸、高氯酸溶-钼锑抗比

色法［26］

。

1. 5. 2 水稻形态指标的测定 水稻株高用直尺

测量水稻根颈部到水稻顶部的距离；根长用直尺

测量根颈部到根底端之间长度；电子天平测量植

株鲜质量及干质量［27］

。

1. 5. 3 水 稻 生 理 指 标 的 测 定 用 叶 绿 素 仪

SPAD-520 Plus测定水稻叶片的 SPAD 值，水稻超

氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑光化

还原法，过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木

酚法，水稻丙二醛含量参照 Wang 等［28］

的方法测

定，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，根

系活力的测定采用TTC法。

1. 6　统计分析

试 验 数 据 采 用 Origin2018 绘 制 图 表 。 使

用 IBM SPSS Statistics26 进 行 差 异 显 著 性 分 析

（P<0.05）。

2　结果与分析

2. 1　复合菌剂的制备

溶磷菌 PPN2 与 N13，N14，N\"-1 均产生拮抗

作用（表 1），但是其他 4 株菌之间无拮抗作用，因

此，选择这 4 株菌构建复合菌剂。盆栽土中加入

秸秆肥和生物炭，混合均匀后加入复合菌剂，用于

后续盆栽试验，验证其对苏打盐碱地的改良

效果。

292

庞宁，等：复合微生物菌剂在苏打盐碱土改良中的应用

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 2　复合菌剂对土壤理化性质的影响

东北苏打盐碱土中的HCO3

-

、CO3

2-

等属于缓冲

物质，会增大土壤盐碱度，并且由于缓冲性的存在

加大了改良苏打盐碱土的难度［29］

。不同处理盆

栽土壤的理化性质结果见表 2，土壤的各项指标

与对照盐碱土壤相比均表现出显著性差异（P<

0.05），pH均有不同程度降低，降低最明显的为复

合菌肥组，比 ck1 降低了 0.92 个单位；除秸秆肥

以外，其他处理的电导率均比 ck1 降低，降低幅

度最大的依次为市售菌剂（39.2%）和复合菌剂

（27.0%），这与 Zhao 等［30］

的研究结果相似。不同

处理组土壤中的HCO3

-

含量均有不同程度下降，生

物炭基复合菌剂比ck1下降了54.1%。不同处理中

有机质含量比ck1均有不同程度的提高（P<0.05），

生物炭基复合菌剂提高了 67.9%；土壤中有效的

氮磷钾对植物的生长至关重要［31］

，生物炭基复

合菌剂组速效磷含量及全磷含量分别比ck1增加

了 113.8% 和 18.2%；生物炭基复合菌剂组的碱解

氮及全氮含量比ck1提高了11.6%和11.3%；生物

炭基复合菌剂组速效钾含量提高了 142.7%。复

合菌肥和秸秆肥组中有机质、氮磷钾含量虽然明

显高于其他组（表 2），但水稻长势较差（图 1），可

能由于秸秆肥中含有较高含量的有害离子，提高

了土壤电导率，导致植物在盐碱条件下抗逆性低，

并没有全部吸收土壤中的养分。

2种载体比较发现，生物炭具有多孔性、高比

表面积和强的羟基吸附能力［32］

，可增加盐和钠的

浸出，提高土壤缓冲能力［33-34］

，这些均可能导致土

壤中的酸碱度降低。生物炭作为载体时能够促进

复合菌剂发挥作用，对改良盐碱地有正相叠加作

用，改善土壤的贫瘠条件，降低HCO3

-

含量。同时，

生物炭极慢地分解可维持有机质含量，保持土壤

肥效［35］

，也作为氮磷钾等营养物质的直接来源

或改变营养物质的可利用性，改善植物的生长和

产量［36］

。He 等［21］

掺入生物炭显著改善了盐渍土

壤中盐分对马铃薯生长和产量的不利影响。Wei

等［37］

联合应用生物炭和解磷细菌增加了堆肥中

植物可利用的无机磷成分。

2. 3　复合菌剂对水稻形态指标的影响

水稻的生长情况见图 1，生物炭基复合菌剂

组水稻长势最佳，植株高大，色泽鲜绿，好于黑土

处理。不同处理中植物的形态指标见表 3，各处

理与 ck1存在显著性差异（P<0.05），水稻株高、根

长、鲜质量、干质量均有不同水平的提高，提高最

明显的是生物炭基复合菌剂组，株高比 ck1 提高

了391.5%，比黑土提高了1.28%，说明通过复合菌

剂配施生物炭后水稻的生长状况可好于正常的生

长条件。根长比ck1提高了215.5%，鲜质量、干质

量分别比ck1提高1 203.8%，1 235.7%。复合菌剂

单独添加时，株高比 ck1 提高了 36.3%，根长提高

表1 不同菌种之间的拮抗结果

Table 1 Antagonistic results among different strains

菌株

P1

N13

N14

N\"-1

PPN2

P1

-

-

-

-

N13

-

-

-

+

N14

-

-

-

+

N\"-1

-

-

-

+

PPN2

-

+

+

+

注：“+”表示有拮抗，“-”表示无拮抗

表2 不同处理组盆栽土壤的理化性质

Table 2 Physical and chemical properties of potted soil in different treatment groups

处理

ck1

ck2

SF

CMA

CMF

BA

BCMA

ck3

pH

8.98±0.02a

8.95±0.02a

8.87±0.02b

8.30±0.05d

8.06±0.04e

8.90±0.02b

8.48±0.05c

6.93±0.02f

电导率/

（mS·cm-1

）

0.74±0.04c

0.45±0.01f

0.82±0.02b

0.54±0.06e

1.25±0.03a

0.60±0.03d

0.66±0.15de

0.08±0.01g

w（HCO3

- ）/

（mg·kg-1

）

13.43±1.20a

12.33±0.42b

9.18±0.07c

7.64±0.09d

3.08±0.04f

9.12±0.08c

6.17±0.11e

1.54±0.01g

w（有机质）/

（g·kg-1

）

15.90±1.07g

19.07±0.74f

43.11±1.68b

19.61±0.72ef

53.70±1.76a

21.16±0.28e

26.69±1.35c

23.89±0.40d

w（碱解氮）/

（mg·kg-1

）

75.93±1.79d

91.67±7.09c

113.33±5.51b

84.50±2.49cd

186.67±10.69a

62.17±2.84e

84.77±1.08cd

55.87±3.41e

w（速效磷）/

（mg·kg-1

）

15.21±0.46e

26.45±0.89d

188.14±1.61b

28.01±1.30d

203.79±5.28a

24.14±1.41d

32.52±1.18c

12.06±0.53e

w（速效钾）/

（mg·kg-1

）

167.59±5.52e

424.82±16.53c

674.26±5.51b

188.18±9.46e

709.34±11.02a

393.64±5.52d

406.66±12.89cd

179.29±11.02e

w（全氮）/

（g·kg-1

）

1.15±0.03d

1.17±0.02cd

1.30±0.02b

1.19±0.02cd

1.36±0.01a

1.21±0.02c

1.28±0.05b

1.25±0.03b

w（全磷）/

（g·kg-1

）

0.33±0.01e

0.37±0.01c

0.40±0.02b

0.36±0.01cd

0.43±0.01a

0.34±0.01de

0.39±0.01b

0.34±0.02e

注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下表同

293

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

了 55.5%，鲜质量和干质量分别提高了 210.4%，

228.6%，比 Wang 等［38］

筛选的耐盐芽孢杆菌属菌

株 WU-5 在鲜质量（75.60%）、干质量（86.68%）、

茎长（12.12%）的提高更加显著。市售菌剂中，株

高、根长、鲜质量、干质量分别比对照提高19.7%，

15.3%，40.6%，50.0%。加入复合菌剂后植物整体

形态指标好于市售菌剂，本研究的复合菌剂中的

单个菌株功能均较强，混合后效果更好，因此，比

市面上研发的更有效果，配施生物炭后效果更显

著，好于黑土。

2. 4　复合菌剂对水稻生理指标的影响

叶绿素是反映植物光合作用的重要指标，其

含量能够反映水稻光合作用的强弱及叶片的生理

变化情况，可溶性蛋白是一种十分重要的渗透调

节物质和营养成分［39］

。不同处理植物的生理指

标见表 4。水稻叶片中的 SPAD 含量、可溶性蛋

白含量均有一定增长，效果最明显的是生物炭

基复合菌剂组（P<0.05），叶绿素比 ck1 含量提高

了 262.6%，可溶性蛋白比 ck1 增加 138.3%，这与

Wang等［38］

的研究结果一致。当植物处于逆境，会

发生过氧化反应，产生丙二醛等有害物质［40］

，水

稻会同时产生抗氧化物来应对这种毒害，抗氧化

酶主要包括 SOD，POD，CAT 等［41］

。Li 等［14］

接种

PD3菌株后，在胁迫条件下，水稻叶片丙二醛含量

降低 16.9%，本试验生物炭基复合菌剂组丙二醛

含量比 ck1 降低了 35.6%，降低效果更明显；在盐

碱条件下生物炭基复合菌剂可产生大量的SOD和

POD（P<0.05），比 ck1分别增加了 269.8%，69.7%；

植物的根系活力与 ck1 相比均有不同程度的增

加，生物炭基复合菌剂比ck1增加了298.7%，贾艳

艳等［42］

利用菌剂+麦秆处理显著提高了旱稻第30天

和第60天的根系活力，分别提高了33.81%，27.32%。

说明复合菌剂配施生物炭可提高水稻的抗逆性，

使其在盐碱条件下能够更好地应对极端条件。

图1　不同处理组水稻的生长情况

Fig. 1 Growth of rice in different treatment groups

表3 不同处理组水稻的形态学指标

Table 3 Morphological indexes of rice in different treatment groups

处理

ck1

ck2

SF

CMA

CMF

BA

BCMA

ck3

株高/cm

9.63±0.12e

11.53±3.03de

12.40±1.08de

13.13±3.35cd

15.87±1.72c

35.53±1.05b

47.33±0.15a

46.73±0.59a

根长/cm

3.73±0.31e

4.30±0.46e

4.73±0.31de

5.80±0.26d

7.90±0.10c

8.87±0.45c

11.77±1.45b

13.50±0.69a

鲜质量/g

0.106±0.010d

0.149±0.010d

0.297±0.010c

0.329±0.120c

0.328±0.010c

1.353±0.050a

1.382±0.090a

1.272±0.060b

干质量/g

0.014±0.001d

0.021±0.002d

0.039±0.001c

0.046±0.003c

0.047±0.004c

0.195±0.005a

0.187±0.004a

0.172±0.008b

294

庞宁，等：复合微生物菌剂在苏打盐碱土改良中的应用

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3　结 论

自制复合菌剂对苏打盐碱土壤的理化性质有

一定改善作用，优于市售菌剂。尤其配施一定基

质作用于盐碱土后，土壤的 pH、电导率、HCO3

-

等

分别比对照最大降低 0.92个单位，27.0%，54.1%，

盐碱程度显著降低，土壤中的营养物质也有一定

增加。此外，自制复合菌剂能促进耐盐碱水稻的

生长。因而，耐盐碱水稻配施自制菌剂，对盐碱地

高效利用有重要意义。

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表4 水稻的生理生化指标

Table 4 Physiological and biochemical indices of rice

处理

ck1

ck2

SF

CMA

CMF

BA

BCMA

ck3

SPAD

9.70±0.75

15.40±0.37

16.47±0.93

15.17±0.63

20.37±2.00

19.83±0.62

35.17±1.41

28.27±0.48

可溶性蛋白/

（mg·g

-1

）

2.51±0.01

3.23±0.09

3.46±0.01

4.64±0.02

3.60±0.20

3.47±0.04

5.98±0.08

3.49±0.01

超氧化物歧化酶/

（U·g

-1

）

228.56±1.53

283.13±3.08

495.76±8.75

601.65±3.37

643.68±1.84

778.97±1.46

845.15±1.45

773.33±2.62

过氧化物酶/

（U·g

-1

·min-1

）

162.67±3.30

206.15±1.60

168.00±2.94

218.32±6.35

203.83±3.48

186.67±15.28

275.98±47.36

255.67±32.72

丙二醛/

（nmol·g

-1

）

11.68±0.48

10.66±0.26

9.47±0.08

9.99±0.07

7.90±0.49

8.51±0.05

7.52±0.08

7.61±0.05

根系活力/

（mg·g

-1

·h-1

）

0.24±0.02

0.36±0.01

0.38±0.02

0.67±0.05

0.81±0.01

0.81±0.01

0.95±0.01

1.41±0.09

295

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

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（责任编辑：林海涛）

296

吉林农业大学学报 2024，46（2）：297-305 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

连续施用不同种类畜禽粪肥对土壤结合态腐殖

质组成的影响*

李晓航，吴景贵**，孟庆龙，陈晓东，朱文悦

吉林农业大学资源与环境学院，长春 130118

摘 要：为探究长期连续施用不同种类畜禽粪肥对土壤结合态腐殖质组成的影响，于2010年开始，在吉林农

业大学试验站进行了长期定位小区试验研究。试验共设置4种处理，分别为连续施用鸡粪处理（ChM）、连续施

用猪粪处理（PM）、连续施用牛粪处理（CM）以及单施化肥的空白对照（ck）。分别于施用后的 1年、3年、5年、

7 年的10月进行小区土壤采样，并进行分析，基于Anderson方法，将腐殖质分为松结态、联结态、稳结态、紧结

态腐殖质。结果表明：随着畜禽粪肥连续施用年限的延长，ck处理的松结态腐殖质含量无明显变化，而连续施

用畜禽粪肥处理的松结态腐殖含量随时间延长而升高。连续施用7年后，ChM处理的松结态腐殖质比对照增

加 107%，CM、PM 处理分别增加了 88. 1%，88. 8%。此外，ChM 处理松结合态腐殖质胡敏酸（HA）和富里酸

（FA）含量始终显著高于 ck，但胡富比（H/F）随着时间变化处理间差异不显著。对于联结态腐殖质，畜禽粪肥

处理腐殖质含量均高于 ck，但是，随着连续施用年限的延长各处理间差异不显著。连续施用 1，3 年后，PM、

ChM 处理含量最高。此外，ChM、CM、PM 处理间联结态 HA 含量差异不显著，但 ChM 处理 H/F 始终显著高于

ck，而FA含量则随时间延长而下降，其中PM、CM处理显著高于ck。稳结态腐殖质含量随连续施用时间延长

呈现逐步上升趋势，连续施用 5年后迅速上升，7年后各处理稳结态腐殖质含量达到最高值，ChM、PM处理与

ck相比差异显著。CM处理的H/F显著高于其他处理，连续施用5年后，与ck相比，ChM、PM、CM处理FA含量

处理分别升高了53. 3%，45. 8%，15. 0%。对于紧结态腐殖质，畜禽粪肥的连续施用提高了土壤紧结态腐殖质

含量，并且PM、ChM处理显著高于ck处理。

关键词：土壤；腐殖质；畜禽粪肥；连续施用；腐殖质结合形态

中图分类号：S153. 6 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0297-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5523

引用格式：李晓航，吴景贵，孟庆龙，等.连续施用不同种类畜禽粪肥对土壤结合态腐殖质组成的影响［J］.吉林

农业大学学报，2024，46（2）：297-305.

Effects of Various Livestock Manure under Continuous Application

on Composition of Soil Bound Humus *

LI Xiaohang，WU Jinggui**，MENG Qinglong，CHEN Xiaodong，ZHU Wenyue

College of Resources and Environment， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China

Abstract：In order to explore the effects of long-term continuous application of different kinds of

livestock manure on bound humus and its composition in soil, a long-term pilot study was conducted

in Jilin Agricultural University Experimental Station in 2010. Four treatments were set up in the ex⁃

periment, namely, continuous application of chicken manure (ChM), continuous application of pig

manure (PM), continuous application of cow manure (CM) and blank control (ck) with single applica⁃

* 基金项目：国家重点研发计划项目（2022YFD1500103），吉林省科技发展重点攻关项目（20190301018NY）

作者简介：李晓航，女，硕士研究生，研究方向：土壤有机碳，土壤腐殖质和废弃物循环利用。

收稿日期：2019-12-10

** 通信作者：吴景贵，E-mail：wujingguiok@163.com

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

tion of chemical fertilizer. Soil samples were collected and analyzed in October of the first year, the

third year, the fifth year and the seventh year after the experiment. Based on Anderson′s method, hu⁃

mus was divided into loose, connected, stable and tight humus. The results showed that with the ex⁃

tension of continuous application years of livestock manure, the loose humus content of ck treatment

had no obvious change, while the loose humus content of continuous application of livestock manure

treatment increased with the extension of time. After 7 years of continuous application, the loose hu⁃

mus treated by ChM increased by 107%, while the CM and PM treatments increased by 88.1% and

88.8%, respectively. In addition, the contents of humic acid (HA) and fulvic acid (FA) in loosely

bound humus treated with ChM were always significantly higher than ck, but the difference of Hu-Fu

ratio (H/F) with time was not significant. For bound humus, the content of humus treated with live⁃

stock manure was higher than ck. After continuous application for 1 or 3 years, the content of PM and

ChM treatment was the highest. However, with the extension of continuous application years, there

was no significant difference among the treatments. In addition, there was no significant difference

between ChM, CM and PM treatments in the content of bound HA, but the H/F of ChM treatment was

always significantly higher than ck, while the FA content decreased with the extension of time, with

PM and CM treatments significantly higher than ck. The content of stabilized humus showed a

gradual upward trend with the extension of continuous application time. After continuous application

for 5 years, it increased rapidly. After 7 years, the content of stabilized humus in each treatment

reached the highest value, with significant differences between ChM, PM treatments and ck. In addi⁃

tion, HA content of stabilized humus in each treatment with manure was higher than ck. H/F of CM

treatment was significantly higher than that of other treatments. After continuous application for

5 years, FA content of ChM, PM and CM treatments increased by 53.3%, 45.8% and 15.0% respec⁃

tively compared with ck. For compacted humus, continuous application of livestock manure in⁃

creased the content of compacted humus in soil, and PM and ChM treatments were significantly

higher than ck treatments.

Key words：soil； humus； livestock manure； continuous application； bound state of humus

土壤作为陆地生态系统中最大的碳库，其作

用至关重要，全球陆地生态系统超过 80% 的碳存

储于土壤中［1］

。土壤碳库既会通过供给植物生长

所需养分、改善土壤肥力、固定或分解污染物等方

式直接或间接影响全球粮食安全，也会因其增加

或减少引起大气 CO2浓度的剧烈变化，对全球碳

平衡以及气候环境产生深刻影响［2-3］

，土壤有机碳

的动态变化取决于外源碳输入和输出的平衡状

况［4］

，腐殖质是指植物和微生物遗骸在腐烂和转

化过程中形成的一系列高酸性、相对高分子量、黄

色至黑色的物质，在自然界中广泛存在。腐殖质

是陆地环境中最大的稳定有机碳库，是土壤的中

心特征［5］

，通常根据结合方式不同，分为松结态、

联结态、稳结态、紧结态 4 种结合形态的腐殖质，

不同结合形态的腐殖质极大地影响着土壤结构特

征及肥力状况［6］

，施入外源有机物料是提升土壤

有机碳最直接有效的办法，外源有机物料的施用，

使得陆地生态系统尤其是土壤中有机碳储量增

加，被认为是最环保有效的固碳途径，也是应对气

候变化的重要措施之一［7］

。

随着集约化农业和加工业发展进程的加快，

随之产生大量农业和加工业的固体有机废弃物，

而作物秸秆的焚烧、畜禽粪便的随意堆放，严重污

染环境［8］

。农业废弃物引起了一系列制约农业发

展的问题，因此，合理利用农业废弃物值得深入思

考。有研究显示，施用有机肥可以降低土壤容重，

同时增加土壤有机碳含量［9］

，改善土壤理化性质，

提高农作物产量和品质［10］

。同时，畜禽粪肥归还

土壤后创造了有利于微生物生存的环境，加速了

腐殖化过程，产生的腐殖质提高了土壤保水保肥

能力。还有研究表明，有机肥中有机质含量高，肥

效长，能够有效改善土壤结构，快速培肥［12］

。有

298

李晓航，等：连续施用不同种类畜禽粪肥对土壤结合态腐殖质组成的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

机肥制备原料丰富，制备成本低［11］

。在可持续农

业中，有机肥可以作为化学肥料的替代品［12］

。

目前关于对比不同畜禽粪肥还田对土壤肥力

性状的长期动态影响的研究较少，畜禽粪肥还田

利用率不高，且不同原料配制的有机肥对作物的

影响不同［13］

。本研究设置连续施用牛粪、鸡粪以

及猪粪 3 个处理，通过分析长期施用不同畜禽粪

肥对结合态腐殖质含量及组成的影响，为畜禽粪

有机培肥提供理论依据。本试验利用畜禽粪肥还

田既是农业自身物质和能量的循环，又是保护人

类环境、进行资源再利用的有效途径。

1　材料与方法

1. 1　供试材料

于2010年在吉林农业大学试验田（北纬43°48′，

东经 125°24′）开展长期定位试验，种植作物为大

豆，品种为“吉农40”。供试土壤为黑土，土壤基础肥

力指标：速效钾92.48 mg/kg，速效磷34.04 mg/kg，

碱解氮90.44 mg/kg，供试肥料腐熟鸡粪、牛粪、猪

粪取自吉林农业大学动物科学与技术学院及辽源

市鑫荣生物有机肥公司，基本性质见表1。

1. 2　试验设计

本试验为长期定位试验，小区采取随机排列，

每 小 区 8 垄 ，垄 宽 0.65 cm，垄 长 5 m，面 积 为

26 m2

。设置连续施用鸡粪处理（ChM）、连续施用

猪粪处理（PM）、连续施用牛粪处理（CM）、空白

对照（ck），每个处理 3 次重复。各处理小区施用

化肥磷酸二铵 0.48 kg，氯化钾 0.36 kg，同时根据

等碳原则连续施用畜禽粪肥（烘干重），鸡粪

（13.09 kg）、猪粪（11.64 kg）、牛粪（10.12 kg），空白

对照只施用化肥，于每年春种前施入土壤中，与表

土混合，覆盖薄土压实后种植。

1. 3　样品采集与测定

土壤样品于施用后的1，3，5，7年秋收后进行

土样采集，土层深为 0~20 cm，每小区取 5 个样品

进行混合，剔除作物残体及石粒，带回实验室自然

风干。土壤结合态腐殖质根据傅积平［14］

方法进

行分组，称取约相当于 100 mg 的碳于离心管中。

加入30 mL 0.1 mol/L氧化钠溶液，在50 ℃水浴中

保温 1 h后，进行离心，将溶液移入一定体积的容

量瓶中，反复用 0.1 mol/L 氢氧化钠提取，直至溶

液清亮，黄色消失为止，此溶液为松结态腐殖质

（为Ⅰ组），然后将 20 mL 0.1 mol/L 焦磷酸钠和

20 mL 0.1 mol/L 氢氧化钠加入残土中，重复Ⅰ组

的步骤，直至溶液清亮，黄色消失为止，此溶液为

联结态腐殖质，定容（为Ⅱ组）。继续加入同体积

的焦磷酸钠和氢氧化钠溶液，保温 1 h后，再将离

心管移入超声波发生器中，在 300 mA 30 Hz下超

声处理20 min，按此步骤反复处理，直至溶液变得

清亮为止，是为稳结态腐殖质，定容（为Ⅲ组）。最

后离心管中残余土样中的腐殖质为紧结态腐殖质

（Ⅳ组）。采用腐殖质组成修改法［15］

对不同形态

腐殖质定量分组，腐殖物质（HE）、HA 含碳量采用

重铬酸钾外加热法测定，FA 含碳量采用差减法得

到，即FA含碳量=HE 含碳量-HA 含碳量，基本理

化性质参考文献［16］进行测定。

1. 4　数据处理

数据处理利用 Excel2007 软件进行计算、制

图。通过 IBM SPSS Statistics 20 软件对数据进行

整合，采用 Duncan 法在 5% 水平的单因素差异显

著性分析，使用Origin2017软件进行制图。

2　结果与分析

2. 1　土壤松结态腐殖质

2. 1. 1 松结态腐殖质含量 松结态腐殖质是土

壤结合态腐殖质中最为活跃的有机质，其结构简

单，易被微生物分解、转化，对土壤养分的释放有

着积极作用。由图1可见，从总体上看，畜禽粪肥

的施用显著提高了松结态腐殖质含量，呈现逐步

上升的趋势。但不同处理及不同的年份间对松结

态腐殖质的影响有一定的差别。施用 1 年后，连

表1 畜禽粪肥的基本性质

Table 1 Basic properties of manure for experiment

有机物料

牛粪

猪粪

鸡粪

pH

7.25±0.3

7.04±0.3

8.06±0.4

w（有机碳）/

（g·kg-1

）

298.34±0.9

259.41±0.5

230.61±0.8

w（全氮）/

（g·kg-1

）

13.89±0.3

21.14±0.4

17.05±0.4

w（全磷）/

（g·kg-1

）

3.62±0.2

7.05±0.3

8.81±0.2

w（全钾）（/ g·kg-1

）

8.37±0.4

8.32±0.5

14.11±0.3

C/N

12.63±0.3

12.67±0.5

14.21±0.3

299

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

续施用鸡粪（ChM）处理松结态腐殖质含量最高，

与单施化肥的对照（ck）相比，增加了 35.4%，而连

续施用牛粪（CM）、连续施用猪粪（PM）处理松结

态腐殖质含量低于ck，分别降低了20.5%、15.0%；

连续施用3年后，PM处理的松结态腐殖质含量显

著高于对照处理，各处理间差异显著（P<0.05），表

现为 ChM>PM>ck>CM。连续施用 5 年后，各连续

施用粪肥处理间对松结态腐殖质的影响无显著

差异（P<0.05），但均显著高于对照处理。连续

施用 7 年后，与对照处理相比，ChM 处理松结态

腐殖质含量增加了 107%，CM，PM 处理分别增加

了 88.1%，88.8%。由此看来，长期连续施用畜禽

粪肥有效提高了松结态腐殖质含量，但在连续施

用的最初 3 年，对松结态腐殖质含量的增减作用

不同处理间是有明显差异的。

2. 1. 2 松结态腐殖质 HA、FA 含量 由表 2 可

知，施用 1年后，与 ck相比，ChM 处理显著提高了

胡敏酸（HA）、富里酸（FA）含量，并且 PM，CM 处

理 FA 含量也显著高于 ck；连续施用 5 年后，PM，

CM 处理 HA 含量也逐渐升高，较 ck 分别增加了

38% 和 23%。而施用粪肥的各处理 FA 含量达到

了最大值，ChM 处理增加了 96%，PM，CM 分别增

加了73%和62%；连续施用7年后，松结态腐殖质

HA 含量随着时间增长而增加，其中 PM 处理 HA

含量最高，与 ck比上升了 62%，ChM，CM 处理 HA

含量分别上升了 54%，30%。长期连续施畜禽粪

肥对土壤松结态腐殖质 HA、FA 含量产生不同的

影响，各处理随时间的延长而增加，其中 ChM 处

理始终最高。

2. 1. 3 松结态腐殖质 H/F 由图 2可见，随着时

间的推移，CM，PM 处理 H/F 呈现上升趋势，而

ChM，ck 处理则呈现相反的趋势，施用 1 年后，

ChM，CM，PM 处理 H/F 显著低于 ck；连续施用

3 年后，ChM 处理 H/F 值最大，显著高于 PM，CM

处理；连续施用7年后，施用畜禽粪肥的处理与ck

差异不显著。

2. 2　土壤联结态腐殖质

2. 2. 1 联结态腐殖质含量 长期施用不同种类

畜禽粪肥对土壤联结态腐殖质含量的影响见图

3，各处理联结态腐殖质含量呈现逐渐降低的趋

势。施用畜禽粪肥 1 年后，各处理提高了联结态

腐殖质含量，与ck相比，PM，ChM，CM处理分别增

加了81.6%，72.7%，56.4%。连续施用3年后，PM，

ChM，CM 处理联结态腐殖质含量达到最大值，排

序为 PM>ChM>CM>ck。施用 5 年后，PM，ChM 处

理联结态腐殖质含量下降，但 CM 处理较好地缓

解了联结态腐殖质含量的下降。连续施用 7 年

后，随着时间的延长，各处理联结态腐殖质含量趋

于稳定，处理间差异不显著（P<0.05）。在连续施

用前期，不同畜禽粪肥对联结态腐殖质含量影响

差异显著。

图1 畜禽粪肥对土壤松结态腐殖质含量的影响

Fig. 1 Effect of various livestock manure on content

of loose humus in soil

表2　不同种类畜禽粪肥对土壤松结态腐殖质HA、FA含量的影响

Table 2 Effect of various livestock manure on HA and FA contents of loose humus in soil g/kg

处理

ChM

CM

PM

ck

HA

1年

0.36a

0.18b

0.22b

0.25b

3年

0.31a

0.20b

0.23b

0.20b

5年

0.35a

0.26c

0.29b

0.21c

7年

0.40a

0.34b

0.42a

0.26c

FA

1年

0.32a

0.30a

0.33a

0.16b

3年

0.32a

0.36a

0.37a

0.24b

5年

0.51a

0.45ab

0.42b

0.26c

7年

0.44a

0.37b

0.41b

0.24c

注：不同小写字母表示同一年不同处理间差异显著（P<0.05）。下表同

300

李晓航，等：连续施用不同种类畜禽粪肥对土壤结合态腐殖质组成的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 2. 2 联结态腐殖质 HA、FA 含量 长期施用

不同畜禽粪肥对联结态腐殖质 HA、FA 含量的影

响见表 3，施肥的各处理均能显著提高 HA、FA 含

量，不同年限各处理变化不同。施用 1年后，PM，

CM，ChM处理胡敏酸含量均显著高于ck；FA含量

均在这一年达到最大值，PM>CM>ChM>ck；施用

5 年后，各处理联结态腐殖质 HA 含量达到最大

值，ChM，PM 处理显著高于 ck，分别增加了 87%，

78%。施用 7 年后，随着时间的延长，处理间 FA

含量逐渐降低，处理间差异不显著。

2. 2. 3 联结态腐殖质 H/F 施用畜禽粪肥不同

程度提高了联结态腐殖质 H/F，由图 4可见，施用

1年后，ChM处理联结态腐殖质H/F值最大，分别

比 CM，PM，ck 提高了 34.8%，25.7%，66.1%；连续

施用 3 年后，各处理土壤联结态腐殖质 H/F 表现

为 ChM>PM>CM>ck；连续施用 5 年后，各处理联

结态腐殖质 H/F 值达到最大值，CM 处理 H/F 低

于 ck；连续施用 7 年后，各处理 H/F 逐渐降低，畜

禽粪肥处理H/F均高于ck。

图2 畜禽粪肥对土壤松结态腐殖质 H/F 的影响

Fig. 2 Effect of various livestock manure on H/F of

loose humus in soil

图3 畜禽粪肥对土壤联结态腐殖质含量的影响

Fig. 3 Effect of various livestock manure on content

of bound humus in soil

表3　不同种类畜禽粪肥对土壤松结态腐殖质HA、FA含量的影响

Table 3 Effect of various livestock manure on HA and FA contents of bound humus in soil g/kg

处理

ChM

CM

PM

ck

HA

1年

0.33a

0.32a

0.36a

0.15b

3年

0.31a

0.33a

0.38a

0.14b

5年

0.47a

0.39ab

0.45a

0.25b

7年

0.28a

0.27a

0.38a

0.13b

FA

1年

0.41ab

0.51a

0.54a

0.26b

3年

0.38b

0.46a

0.52a

0.24b

5年

0.21ab

0.24a

0.25a

0.17b

7年

0.19a

0.27a

0.25a

0.16a

图4 畜禽粪肥对土壤联结态腐殖质 H/F 的影响

Fig. 4 Effect of various livestock manure on H/F of

bound humus in soil

301

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 3　土壤稳结态腐殖质

2. 3. 1 稳结态腐殖质含量 由图5可见，长期施

用畜禽粪肥显著提高了稳结态腐殖质含量，连续

施用3年后，ChM处理稳结态腐殖质含量最高，与

ck相比升高了 46.6%，PM，CM 处理间差异不显著

（P<0.05）；连续施用 5年后，施用粪肥的各处理稳

结态腐殖质含量均呈现上升的趋势，ChM，PM，

CM 处理比 3 年增加了 27.4%，16.9%，4.1%；连续

施用 7 年后，稳结态腐殖质含量处于稳定，ChM，

PM 处理显著高于 ck，比 ck 分别增加了 39.7% 和

30.1%，而 CM 处 理 与 ck 相 比 差 异 不 显 著（P>

0.05）。长期连续施用ChM处理，稳结态腐殖质含

量始终高于其他处理。

2. 3. 2 稳结态腐殖质 HA、FA 含量 由表 4 可

知，连续施用不同畜禽粪肥对稳结态腐殖质 HA、

FA含量产生不同影响。ChM，CM，PM处理HA含

量一直高于ck，但差异不显著，ChM，PM，CM在连

续施用 5 年后 FA 含量最高。施用 1 年后，ChM，

CM，PM处理胡敏酸含量高于ck，但未达到显著水

平，表现为 ChM>CM>PM>ck；但富里酸含量差异

显著，其中ChM效果最好；连续施用3年后，ChM，

CM，PM稳结态胡敏酸含量最高，与ck相比，ChM，

CM，PM 处理分别增加 56%，36%，28%，稳结态腐

殖质富里酸含量表现为ChM>PM>ck>CM；连续施

用5年后，与ck相比，ChM，PM，CM处理富里酸升

高了 53.3%，45.8%，15.0%；连续施用 7年后，各处

理均随着时间延长而下降，但 CM，PM 处理富里

酸比第1年增加了62%，30%。

图5 畜禽粪肥对土壤稳结态腐殖质含量的影响

Fig. 5 Effect of various livestock manure on content

of stabilized humus in soil

2. 3. 3 稳结态腐殖质 H/F 由图 6可见，连续施

用 CM处理土壤稳结态腐殖质 H/F始终显著高于

ck；施用 3年后，CM 处理 H/F比 ChM，PM，ck分别

增加了 89.8%，88.5%，83.2%；连续施用 5 年后，

ChM，PM处理H/F也高于ck；连续施用7年后，施

用畜禽粪肥的处理稳结态腐殖质 H/F 均显著高

于ck，各粪肥处理间H/F差异不显著。

2. 4　土壤紧结态腐殖质含量

紧结态腐殖质具有较强的稳定性，对土壤中

养分的储存、腐殖质的积累与土体结构的保持起

到重要作用。长期施用畜禽粪肥对紧结态腐殖质

含量影响见图 7，从整体来看，施用畜禽粪肥各处

理随时间延长均呈现逐步下降的趋势，PM，ChM

处理均高于 ck，施用 1年后，PM，ChM，CM 处理显

著均高于 ck（P<0.05），其中 PM 紧结态腐殖质含

量最高，增加了 48.2%，ChM，CM处理分别增加了

22.0%，16.3%；施用 3 年后，紧结态腐殖质含量

表现为 PM>ChM>CM>ck；连续施用 5 年后，紧结

态腐殖质含量达到最小值，仍高于 ck 处理，其中

PM 和 ChM 处理间差异不显著；连续施用 7 年

后，各处理紧结态腐殖质含量逐步提升，与 ck 相

比差异显著，PM，ChM，CM 处理间差异不显著

（P>0.05）。

表4　不同种类畜禽粪肥对土壤稳结态腐殖质HA、FA含量的影响

Table 4 Effect of various livestock manure on HA and FA contents of stabilized humus in soil g/kg

处理

ChM

CM

PM

ck

HA

1年

0.46a

0.38a

0.36a

0.31a

3年

0.48a

0.43a

0.40a

0.31a

5年

0.37a

0.36a

0.38a

0.24a

7年

0.36a

0.34a

0.40a

0.25a

FA

1年

0.33a

0.17c

0.25b

0.22bc

3年

0.35a

0.16d

0.29b

0.22c

5年

0.41a

0.30b

0.39a

0.26c

7年

0.33a

0.28b

0.32a

0.26c

302

李晓航，等：连续施用不同种类畜禽粪肥对土壤结合态腐殖质组成的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3　讨 论

松结态腐殖质结构简单，在土壤中分解转化

速率快，通常直接供给植物养分，同时也能促进土

壤肥力的提高［17］

。本试验结果表明，松结态腐殖

质含量随着畜禽粪便施用年限的增加呈现逐步上

升的趋势。施入畜禽粪肥 1 年后，ChM 处理松结

态腐殖质含量最高；连续施用 3 年后，CM 处理松

结态腐殖质含量与ck相比差异不显著，可能由于

CM 处理分解转化率、矿化率较低，有利于土壤中

有机碳向稳定态转化，使得前期松结态腐殖质含

量低［18］

；连续施用 7年后，ChM，CM，PM 处理松结

态腐殖质含量均比ck显著提高。有研究表明，施

用牛粪随着时间的延长使得松结态腐殖质及组成

含量均高于对照［19］

，这与本试验结果一致。对于

松结态腐殖质组成，本试验表明，施入不同畜禽粪

肥使得胡敏酸、富里酸含量逐步增加，但各处理

H/F均低于ck，施用1年后，ChM处理胡敏酸含量

和H/F高于PM，CM处理，PM，CM，ChM富里酸含

量均高于 ck。有研究表明，施用粪肥将为土壤微

生物提供更多的底物（如 C，N），从而增强微生物

活性，甚至对腐殖质的形成起到促进作用［20］

。同

时，本试验证明土壤腐殖质组成对于施用不同畜

禽粪肥有着不同的响应。

联结态土壤腐殖质介于松结态、紧结态之间，

其含量可以直接反映土壤腐殖质转化的进程［21］

。

对于联结态腐殖质，施用 1 年后，PM，ChM，CM 各

处理与ck比，腐殖质含量显著增加；连续施用3年

后PM处理联结态腐殖质含量最高；连续施用7年

后，PM，CM，ChM 处理间联结态腐殖质含量差异

不显著。由于PM，CM，ChM的组成、性质不同，在

不同年份对联结合态腐殖质含量产生了不同的影

响，有研究表明，有机肥对腐殖质影响取决于肥料

组成及施用量［22-25］

。联结态 HA 随年限的增加呈

现逐步上升的趋势，而 FA 则呈现相反的变化，施

用 1年后，各处理均显著提高联结态腐殖质 H/F，

并且 FA 含量达到最大值，其中 PM 处理最好；在

连续施用 5 年后，HA 含量和 H/F 均达到最大值，

PM，ChM处理显著高于ck，而FA含量则相反。曾

庆庆等［26］

研究得出，连续施用猪粪肥能有效提高

土壤有机质含量，还能增强耕层土壤的保肥与供

肥能力。

有机肥与无机肥配合施用下，稳结态腐殖质

含量相对稳定［27-30］

。连续施用 5 年后，稳结态腐

殖质含量大幅度升高，ChM，PM 处理显著高于其

他处理。Luan等［31］

研究认为，猪粪和鸡粪施肥促

进了生物活动，而生物聚集的速率取决于肥料提

供的碳输入。这说明随着时间的延长ChM，PM处

理积累了稳结态腐殖质。稳结态胡敏酸和富里酸

含量产生不同的变化趋势，ChM，PM，CM 处理都

提升了 HA 含量，但只有 CM 处理 H/F 始终高于

ck，在连续施用畜禽粪肥 5年后，ChM，PM 处理积

累了 FA 含量，H/F 降低。王莉等［32］

研究得出，大

豆重茬 3年稳结态富里酸的含量与重茬 1年和正

茬相比差异不显著，这说明添加不同畜禽粪肥改

变了土壤微生物环境，对稳结态富里酸产生了不

同的影响。

由于紧结态土壤腐殖质与矿质黏粒结合紧

密，且不易被土壤微生物分解，所以一般认为紧结

图7 畜禽粪肥对土壤紧结态腐殖质含量的影响

Fig. 7 Effect of various livestock manure on content

of compacted humus in soil

图6 畜禽粪肥对土壤稳结态腐殖质H/F的影响

Fig. 6 Effect of various livestock manure on H/F of

stabilized humus in soil

303

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

态腐殖质含量的多少影响着土壤养分保持与土壤

结构改善［33-34］

。本试验结果显示，各处理呈现相

同的变化趋势，前期施用畜禽粪肥的各处理紧结

态腐殖质含量逐渐降低，在连续施用5年后，各处

理均下降到最小值。连续施用 7 年后，各处理紧

结态腐殖质含量逐步回升，ChM，PM 处理效果较

好。畜禽粪肥本身含有大量的有机物质，还田施

用后随着腐解进程的深入，可以有效增加土壤紧

结态腐殖质含量，各处理间的差异性与物料本身

的结构以及性质有关，畜禽粪肥本身有机碳含量

的多少也影响着紧结态腐殖质的积累［28-29］

，畜禽

粪肥含碳量高低排序也与紧结态腐殖质积累排序

一致。

综上，连续施用畜禽粪肥显著提高了土壤松

结态、稳结态腐殖质含量，随着时间的增加呈现逐

步上升的趋势，在连续施用7年后达到最大值，其

中以连续施用鸡粪处理提升幅度最大。而联结

态、稳结态腐殖质含量呈现相反的变化趋势，在连

续施用最初3年，连续施用鸡粪、猪粪处理有利于

提高联结态、紧结态腐殖质含量。连续施用畜禽

粪肥不同程度提高了各结合态腐殖质胡敏酸、富

里酸含量以及胡富比，连续施用5~7年，不同处理

松结态胡敏酸、富里酸含量、胡富比显著提高，而

联结态、紧结态胡敏酸、富里酸在连续施用1~3后

含量较高，不同处理间差异显著，其中以鸡粪处理

效果最好。

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（责任编辑：林海涛）

305

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（2）：306-314

Journal of Jilin Agricultural University

东北典型黑土区积雪-冻融耦合作用下的包气

带水热运移模拟*

孙国静1，2

，卞建民1，2**，王 宇1，2

，阮冬梅1，2**，谷志琪1，2

1. 吉林大学地下水资源与环境教育部重点实验室，长春 130021；2. 吉林大学新能源与环境学

院，长春 130021

摘 要：积雪-冻融耦合作用可改变黑土内部水热分布，进而影响其营养组分。为探究典型黑土区积雪-冻融

条件下的水热运移规律，以吉林省公主岭市为例，基于野外原位观测试验，开展了典型黑土区积雪-冻融耦合

作用下的包气带水热运移模拟，利用 Morris筛选法进行了参数敏感性分析，并模拟分析了不同外界温度和积

雪覆盖情景对黑土水分运移的影响。结果表明：研究区春季融雪水可使深在20 cm以上的黑土含水率增加约

12%；基于野外观测构建的模型对60~80 cm的土层模拟效果最佳；敏感性分析的5个参数中残余土壤含水量θr

的敏感度最高，其灵敏度系数为2. 954 6；外界温度影响土壤含水率突降的时间，积雪覆盖条件主要影响含水

率大小及水分保持。

关键词：东北黑土区；积雪覆盖；冻融；水热特征；HYDRUS-1D模型；Morris筛选法；情景模拟

中图分类号：S152. 7 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0306-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2023.1991

引用格式：孙国静，卞建民，王宇，等.东北典型黑土区积雪-冻融耦合作用下的包气带水热运移模拟［J］.吉林

农业大学学报，2024，46（2）：306-314.

Simulation of Water Heat Transfer in Aerated Zone under Coupling

Effect of Snow and Freeze-Thaw in Typical Black Earth Soil Region

of Northeast China *

SUN Guojing1，2

，BIAN Jianmin1，2**，WANG Yu1，2

，RUAN Dongmei1，2**，GU Zhiqi1，2

1. Key Laboratory of Groundwater Resources and Environment of the Ministry of Education，Jilin Uni⁃

versity，Changchun 130021，China；2. College of New Energy and Environment， Jilin University，

Changchun 130021， China

Abstract：The coupling effect of snow and freeze-thaw can change the distribution of water and heat

in black soil, and therefore affect soil fertility. To explore the laws of water and heat transfer under

snow and freeze-thaw conditions in typical black soil areas, taking Gongzhuling city of Jilin province

as an example, based on field in-situ observation tests, water and heat transfer simulation in aeration

zone under the coupling effect of snow freeze-thaw in typical black soil areas was carried out. The

Morris′s screening method was used to conduct parameter sensitivity analysis, and the effectst of dif⁃

ferent external temperatures and snow cover scenarios on water transfer in black soil were simulated

and analyzed. The results show that the snowmelt water in spring in the research area can increase

* 基金项目：国家自然科学基金项目（42272299），吉林省科技发展计划项目（20220101173JC）

作者简介：孙国静，女，硕士研究生，主要从事寒区冻土水分运移研究。

收稿日期：2022-10-23

** 通信作者：卞建民，E-mail：bianjm@jlu.edu.cn；阮冬梅，E-mail：ruan18188417591@126.com

孙国静，等：东北典型黑土区积雪-冻融耦合作用下的包气带水热运移模拟

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

the moisture content of black soil with a depth of more than 20 cm by about 12%; The model based

on field observation has the best simulation effect on the soil layer of 60-80 cm; Residual soil mois⁃

ture content in the five parameters of sensitivity analysis has the highest sensitivity, and its sensitiv⁃

ity coefficient reaches 2.954 6; The external temperature affects the time when the soil moisture con⁃

tent drops suddenly, and the snow cover conditions mainly affect the moisture content and water re⁃

tention.

Key words：Northeast black soil region； snow cover； freeze-thaw； water and heat characteristics；

HYDRUS-1D model； Morris′s screening method； scenario simulation

东北黑土区是我国重要的商品粮生产基

地［1］

，该区土壤在外界环境的影响下发生冬冻春

融，冻融作用改变了黑土水分运移过程并使其发

生重分布［2］

。冻土在寒区水文循环中扮演着重要

角色［3］

，冻结过程中，土壤水势梯度发生改变，致

使水分由未冻层向冻结层移动，冻土水分含量增

加；而在融化过程中，由于中间冻结层的阻塞，上

层水分难以向下移动，导致浅层土壤水增加［4］

。

此外，该区土壤冬季表面通常会有稳定的积雪层

覆盖，积雪具有的高反照率、低导热率和大热容量

等特性［5-6］

，会削弱地—气间的热量交换，影响下

伏土壤温度和冻融过程［7］

，改变冻土水分分布、迁

移过程与冻结速率等［8］

。因此，在进行冻土水热

分布与迁移规律的研究时，应将积雪-冻融耦合

作用综合考虑，近年来，国内外学者关于冻土水分

运移的研究较为详尽［9-10］

，但将积雪作为上边界

条件进行综合考虑的不多。积雪-冻融耦合作用

可通过改变黑土内部水热分布影响土壤有机碳矿

化［11-12］

，进而影响土壤肥力，探究其影响下的土壤

水热运移对研究区农业生产具有重要意义。

数值模拟是研究水分运移的重要工具，美国

农业部盐土实验室开发的一维水流和溶质运移模

拟软件——HYDRUS-1D 模型具有广泛的适用

性，该模型所需要的输入数据相对较少，模拟结果

较为可靠［13-15］

。为保证模拟结果的准确性需对模

型进行不确定性分析，模型不确定性的主要来源有

模型参数不确定性、模型结构不确定性和观测数据

不确定性，在利用HYDRUS-1D进行包气带水分运

移的模拟时，相关水力参数的确定至关重要［16-20］

。

参数敏感性分析属不确定性分析的一种，模型参

数的敏感性并非一成不变，随着时间和边界条件

的改变会有所不同［21］

，土壤质地也会影响参数的

敏感性分析结果［22］

。本试验采用的Morris筛选法

是目前常用的参数敏感性分析方法，该法通过对

可行域内随机取值大大降低了对初始值的依赖程

度，易于理解和实现，且结果易于解释。

本试验针对典型黑土区内部水热迁移等问

题，进行长期野外监测积雪覆盖条件下冻土内部

水热变化情况，结合 HYDRUS-1D 模型进行数值

模拟，选取Morris筛选法对VG模型的参数进行敏

感性分析，判断各个参数对冻土水热运移影响程

度的相对大小关系。基于模型进行不同情景预

测，探究了不同外界温度和积雪覆盖条件下冻土

内部水热特征变化规律。

1　材料与方法

1. 1　研究区概况

吉林省公主岭市属松辽平原黑土区，土壤以

黑钙土和薄层黑土为主，有机质含量高，是国家重

要的商品粮基地之一。区内整体地势北高南低，

中部松辽分水岭微高，多为平原，海拔约 200 m，

北部连接松花江平原，西南部为西辽河平原。该

区属温带湿润地区大陆性季风气候，年均气温

5.6 ℃，年平均降水量为 562 mm，冬季寒冷漫长，

积雪厚度大且积雪存在期长，主要存在期为11月

至翌年3月。

1. 2　数据获取

考虑到土壤温度是水分运动的重要影响因

素，水热运移具有高度的相关性，本次野外观测试

验仪器为南通华兴石油仪器公司制定的便携式多

参数水质分析仪，观测精度为 0.1，每隔 1 h 记录

1 次数据，可同步观测土壤不同层位温度和含水

率。所选观测点位远离城市，可长时间稳定观测

（东经 124°47′，北纬 43°24′），共观测 5 个不同深

度，分别为 20，40，60，80，100 cm，观测时间序列

较长，存在土壤的冻结与融化过程，在研究过程

中，选取所需时段数据进行分析，同时段所需降水

量、融雪量数据由WheatA软件获取。

307

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

1. 3　模型原理

HYDRUS-1D 模型采用 Richards 方程描述一

维非饱和土壤水流的运动，仅考虑一维垂向的土

壤水分运动［23］

，采用有限差分法对土壤水热运移

数学模型进行求解。模型为用户提供了5种土壤

水力模型，本次模拟选取目前使用最为广泛的单

孔隙模型中的 VG 模型，不考虑失水和脱水引起

的滞后现象，具体方程：

θ ( h) =

ì

í

î

ï

ï

ï

ï

θr +

θs - θr

[1 + | αh | ]

n m，h < 0

θs ，h ≥ 0

， （1）

K (h) = KsSl

e[1 - (1 - S1 m

e )

m

]

2

， （2）

Se = θ - θr

θs - θr

，m = 1 - 1

n

，n > 1， （3）

式中：θ (h) 为压力水头为 h 时的土壤体积含水率

（%）；θs为土壤饱和含水量（%）；θr为土壤残余含

水量（%）；α，m，n，l为经验参数；Se 为有效含水量

（%）；Ks为饱和导水率（L/T）；K (h) 为压力水头为

h时的非饱和导水率（L/T）。

1. 4　不确定性分析方法

进行包气带水分运移的研究与模拟时，参数

的准确与否是非常关键的影响因素，为保证模型

模拟的准确性，采用目前应用较为广泛的 Morris

筛选法对参数进行不确定性分析。

Morris 筛选法为全局敏感性分析方法，可确

定每个参数模型的总体意义，描述该参数对模型

输出结果的影响以及其他参数之间可能存在的非

线性关系。并将模型参数有效地分离为不同的

组［24］

，可高效处理包含多个输入因素的模型而不

依赖对模型的严格假设。其基本步骤见图1。

本试验在采用 Morris 筛选法的基础上，对其

进行了一定修正，按照固定步长进行参数值的改

变，使参数的变化在可控范围内，避免参数随机浮

动导致的过大或过小，以至于对输出结果造成影

响 。 敏 感 性 分 析 将 参 数 按 照 -20%，-10%，0，

10%，20%进行输入，然后查看输出结果的变化情

况，参数灵敏度取多次扰动的平均值，其计算

公式：

S = ∑i = 1

N - 1

é

ë

ê

ê

ê

ê

ê

ê

ê

ê Yi + 1 - Yi

Y0

Pi + 1 - Pi

P0

ù

û

ú

ú

ú

ú

ú

ú

ú

ú

/ (n - 1)， （4）

式中：S为参数灵敏度；N为模型运行次数；Yi为第

i次运行后模型的输出值；Yi + 1为第 i+1 次运行后

模型的输出值；Y0为模型计算结果的初始值；Pi为

模型第 i次运行时参数取值相对于初始值变化的

百分率；Pi + 1为模型第i+1次运行时参数取值相对

于初始值变化的百分率；P0为参数初始取值。灵

敏度分级标准见表1。

2　结果与分析

2. 1　自然条件下冻融过程中土壤水热特征

为对自然条件下冻土和积雪融化过程中土壤

水热情况进行分析，选取基于野外观测的2022年

2—6 月土壤不同层位含水率、温度数据，以及当

地降水、融雪量数据，变化情况见图2（图中1~5表

示土壤深依次为20，40，60，80，100 cm）。

研究区在3月气温>0 ℃，土壤温度随之升高，

在此之前越深层的土壤温度越高，此后越浅层的

土壤温度越高，雪层可缓冲大气温度对土壤温度

的影响。

3 月 27 日后土壤含水率开始增加，第 1 层

土壤 含 水 率 由 14.6% 增 至 19.7%，增 加 5.1%；

第 2 层 土 壤含水率由 17.4% 增至 19.8%，增加

2.4%；第 3 层土壤含水率由 14.7% 增至 16.5%，增

加为 1.8%；第 4 层和第 5 层的土壤含水率受外界

影响较小，处于稳定增加的状态。各个层位含水

率增加的时间存在先后顺序，增幅随深度增加而

减小。

图1 Morris筛选法基本步骤

Fig. 1 Basic steps of Morris′s screening method

表1 灵敏度分级标准

Table 1 Sensitivity classification standards

S值

∣S∣≥1

0.2≤∣S∣<1

0.05≤∣S∣<0.2

0≤∣S∣<0.05

敏感级别

1

2

3

4

敏感性

高灵敏度

灵敏

中度灵敏

不灵敏

308

孙国静，等：东北典型黑土区积雪-冻融耦合作用下的包气带水热运移模拟

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

温度升高使积雪融化，融雪水最先到达浅层

土壤，冻土内部冰晶也开始融化，致使土壤含水率

突增。雪水与浅层土壤自由水可在重力作用下向

土壤深层流动，但存在滞后效应，滞后效应随深度

的增加而变大，含水率对下渗融雪水的响应程度

随深度增加而减小。在 4—5 月，由于缺乏补给

源，且存在蒸发排泄，较浅层位的土壤含水率有所

下降，5 月 26 日之后有降水发生，土壤含水率升

高，变化较为显著的是浅层土壤。

2. 2　模型构建与验证

2. 2. 1 模拟单元划分 由图3可见，本次土壤模

拟剖面深为 100 cm，土壤均匀堆积，上下质地相

同。垂向一维土柱节点间距为 1 cm，被离散剖分

为 101 个节点，分别在 20，40，60，80，100 cm 处布

设观测点。模拟时长为 2022-01-04 至 2022-02-

15，共计 43 d，初始时间步长为 0.01 d，最小时间

步长为0.001 d，最大时间步长为5 d。

2. 2. 2 模型概化 使用 HYDRUS-1D 中的水分

运移与逆向求解两大模块，根据实际情况对模型

进行概化：土壤均匀堆积，下渗水分不会导致土壤

状况发生变化，忽略水分的水平和侧向流动，不考

虑土壤中的水汽运动，只考虑土壤水的运移，水流

模型概化为垂直方向的一维非稳定流，模型中时

间剖分方式采用变时间步长法，假设土壤是均匀

堆积的，侧边为无通量边界，上下边界条件见

图 3。蒸散发按照 HYDRUS-1D 内置的 PenmanMonteith 方程来确定，无植物根系吸水与蒸腾作

用，通过循环迭代计算获取稳定剖面含水率分布

作为初始条件。

初始土壤水力参数θs

、θr

、Ks

、α、n、l，基于土壤

干容重和砂粒、粉粒、黏粒含量，用模型内置的

Rosetta 函数进行预测，其中干容重、θs

、Ks 基于实

测值确定。

2. 2. 3 模型验证 为确保模型的正确性与适用

性，后续用整个时段的实测值对模型进行验证。

由模型剖面上 20，40，60，80，100 cm 深度位置上

的实测土壤温度与模拟值进行对比，见图 4，模拟

值与实测值拟合较好。

图中实线表示土壤含水率，虚线表示土壤温度

图2　降水量、融雪量与土壤含水率、温度变化

Fig. 2 Changes of precipitation， snowmelt， soil moisture and temperature

图3　模拟土柱

Fig. 3 Simulated soil column

309

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

HYDRUS-1D 内置的 Inverse Solution（参数反

演）模块对所建立模型的准确性进行评价，平均加

权误差 ME 为 0.159 0，平均加权绝对误差 MAE 为

0.159 0，均方根加权误差RMSE为0.173 8。

2. 3　参数敏感性分析

选定 20 cm 处土壤含水率作为响应值，来反

映 VG参数对较浅层的土壤含水率动态分布的影

响。按照固定步长改变残余含水量 θr

、饱和含水

量 θs

、经 验 参 数 α、n 以 及 饱 和 导 水 率 Ks

，结 果

见图5。

依据含水率曲线变化情况可知，残余土壤含

水量对该层位土壤含水率的影响主要体现在对含

水率初始值的改变上，土壤含水率初始值的变化

与该参数变化呈正相关关系，5 种情况下含水率

曲线的变化趋势一致。残余含水量为水分特征曲

线导数为0时的土壤含水量，对VG模型低含水率

段影响显著，在实际应用中，θr 值难以准确测得，

可将稳定枯竭点上的基质势（h=-15 000 cm）所对

应的含水量作为其取值［25］

。

孔隙尺寸分布指数n对土壤含水率的影响与

其变化呈负相关关系，即n值越大，土壤含水率下

降速度越快，曲线越陡峭。事实上，参数n控制着

S-P 曲线的坡度，该值与土壤粒径分布有关，n 越

大曲线坡度越平缓，相同毛细压力下，土壤水饱和

度更小，土壤排水速率越快。

含水率的变化与饱和含水量θs的扰动呈正相

关关系，θs代表着土壤的最大容水能力，对 VG 模

型曲线高、中、低吸力段均有影响，是底部通量的

关键性影响因素，θs可通过试验测定，模拟时应取

实测值。

土壤饱和导水率 Ks 决定土壤导水能力的强

弱，Ks越大，土壤含水率下降越快，该参数为土壤

重要的物理性质之一，其确定方法主要有3种：经

验计算法、实验室测定法和野外原位测定法［26］

。

图中第1层、第2层、第3层、第4层、第5层分别指土层深为20，40，60，80，100 cm

图4　不同层位温度拟合

Fig. 4 Temperature fitting in different layers

310

孙国静，等：东北典型黑土区积雪-冻融耦合作用下的包气带水热运移模拟

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

本次分析结果显示，进气吸力倒数 α 的扰动

对含水率的影响较小。该参数指饱和土壤脱水过

程中开始进入空气时的吸力值，当吸力提高，空气

进入土壤孔隙致使水分排出，相同饱和度下，α越

大毛细压力越小［27］

，在实际应用中，可提前给出

参数范围，后通过多次迭代拟合进行确定。

为定量评估参数扰动对于输出结果的影响以

及各参数的相对敏感程度，进一步计算了参数的

敏感性指数，结果见图 6。参数敏感度计算结果

显示，θr是高敏感参数，敏感指数为 2.954 6，其后

按敏感指数大小排序依次为 θs

，n，m，α。其中，n

和 m 的敏感性指数较为接近，这是由于二者存在

相关关系。据此，在利用 HYDRUS-1D 模型进行

土层水分运移模拟时，为了提高模拟的准确性，应

关注θr

，n，θs

，Ks的准确性。

以上参数代表土壤性质对水分运移的影响，

实际情况中，除土壤自身性质外，外界条件也是影

响土壤水分运移的重要因素，如大气温度、积雪覆

盖厚度等，为此，结合研究区实际的气候状况，设

置不同情景探究土壤水分运移规律。

2. 4　不同情景模拟

2. 4. 1 情景设置 大气温度对浅层土壤的影响

非常显著，随着深度的增加影响不断减小，滞后时

间随之延长，温度是导致土中水相变，制约冻土中

未冻水含量以及相应制约土水势的一个主导因

素。积雪的高反照率、低导热率等特性可为下伏

图5　土壤含水率随参数的变化

Fig. 5 Changes of soil moisture content with parameters

图6　不同参数灵敏度计算结果

Fig. 6 Sensitivity calculation results of different pa⁃

rameters

311

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

土壤提供良好的保护作用，在无其他因素影响下，

积雪厚度越大对土壤的保护作用越好。在室内土

柱冻融循环试验的基础上，本次情景模拟主要考

虑以上 2 个指标，具体情景设置结合实际监测及

研究区实际条件，见表2。

2. 4. 2 不同大气温度 依据所建立模型，不同

大气温度下土壤含水率变化见图 7。大气温度对

土壤温度的影响随深度增加而减弱［28］

，低温导致

浅层土壤冻结程度高，存在的部分液态水由于缺

乏可行的运移通道而滞留于孔隙内，3 种情景中

浅层土壤处的土层含水率没有大的起伏。

表2 不同情景设置

Table 2 Different scenario settings

项目

大气温度/°C

雪层覆盖/cm

情景编号

1

2

3

4

5

6

情景设置

-15 ~ -10

-10 ~ -5

-5 ~ 0

0

5

15

图7　不同情景下土壤含水率变化

Fig. 7 Changes of soil moisture content under different scenarios

312

孙国静，等：东北典型黑土区积雪-冻融耦合作用下的包气带水热运移模拟

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3种条件下，土壤含水率均在0.075~0.300，曲

线变化情况类似，其差异体现在含水率突降的时

间。情景1中，10 cm处的土壤含水率在11 h后开

始下降，下降速度较为剧烈，在 40 h 以后与 5 cm

处的土壤含水率持平，不再有大的起伏；20 cm 处

的土壤含水率只在最初有小幅度增加，此后便与

28 cm 处的土壤含水率同时缓慢下降，最终含水

率降至 20％。情景 2 与情景 3 水分运移情况类

似，在约32 h产生突降，各个层位的土壤含水率在

最后都趋近于一个相同的值。

2. 4. 3 不同积雪覆盖 不同积雪覆盖厚度下的

土壤含水率变化见图 8。雪层覆盖对土壤含水率

的影响主要体现在融雪水对下伏土壤含水量的补

给上，区别比较显著，融雪水可使土壤含水率比裸

地土壤含水率高15%。无积雪覆盖时土壤不同点

位含水率变化曲线彼此之间无交点，因为缺乏补

给来源，蒸发作用致使含水率持续降低，浅层土壤

含水率下降速度最快。5 cm 积雪覆盖，土壤含水

率在约 50 h升高至最大值，此后随着时间延长而

降低。融雪水下渗，最浅层土壤含水率增加最为

迅速，越往深层起始增加时间越晚且增加速度越缓

慢，土柱内水分自上而下运移，融雪水先到达表层，

在水力梯度与重力的作用下向下运移。浅层土壤

对积雪覆盖的响应程度较强，随深度的增加响应

程度减弱。本次模拟中，15 cm 覆盖的土壤，在约

60 h含水率达到最大值，后基本保持在这一水平。

3　结 论

（1）冬季研究区土壤表面的雪层可缓冲大气

低温对土壤温度的影响；春季融雪水对土壤水的

补给存在滞后延迟作用，含水率增幅随深度增加

而减小，其中<20 cm的浅层土壤含水率可增加约

12%。

（2）当以 15 cm 土层含水率值作为改变 VG

参数的响应值时，参数的敏感性按照从大到小

的顺序为 θr

，n，θs，Ks，α，主要影响土壤含水率的

初始值，土壤含水率曲线变化趋势一致。参数 n，

Ks 的变化与土壤含水率的变化呈负相关关系，θs

为正相关关系，θr 为高敏感参数，敏感指数为

2.954 6。

（3）不同大气温度条件下土壤含水率差异之

处在于其突降的时间，变化范围在 0.075~0.300。

融雪水可使土壤含水率增加15%。无积雪覆盖时

土壤不同点位含水率变化曲线彼此之间无交点；

5 cm 积雪覆盖，土壤含水率达到峰值后随着时间

增加而降低；15 cm 雪层可使土壤含水率达到峰

值后维持在这一水平。土壤对积雪的响应程度随

深度增加而减弱。

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图8　不同积雪覆盖条件下土壤含水率变化

Fig. 8 Changes of soil moisture content under different snow cover conditions

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（责任编辑：林海涛）

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吉林农业大学学报 2024，46（2）：315-323 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件

优化*

高鹤轩，荣 敏，刘汇涛，唐丽昕，周宏达，邢秀梅**

中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室，长春 130112

摘 要：为开展目标蛋白质在梅花鹿耳成纤维细胞的功能研究提供理论和技术依据，培养梅花鹿耳成纤维细

胞，优化脂质体转染梅花鹿耳成纤维细胞的条件，以获得最优质粒转染参数。采用组织块贴壁法和差速贴壁

法分离梅花鹿耳成纤维细胞，观察细胞基本形态特征变化，免疫荧光法鉴定波形蛋白（Vimentin）的表达；以增

强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为标记基因，利用 LipofectamineTM 3000介导外源 DNA转染梅花鹿耳成纤维细

胞，探讨质粒 DNA 与脂质体比例（1. 0∶1. 0，1. 0∶1. 5，1. 0∶2. 0，1. 0∶2. 5，1. 0∶3. 0）、质粒用量（0. 5，1. 0，1. 5，

2. 0，2. 5 μg）、细胞传代次数（第 2~6代）、细胞初始接种密度（50%，60%，70%，80%，90%）、转染效果观测时间

（12，24，36，48，60 h）对转染效率的影响。结果表明：组织块贴壁法培养的梅花鹿耳成纤维细胞在倒置荧光显

微镜下可见长梭形细胞生长，细胞免疫荧光检测波形蛋白（Vimentin）的表达结果为阳性；筛选的最佳转染条

件：当质粒 DNA与脂质体比例为 1. 0∶2. 0，质粒 DNA用量为 1. 5 μg，细胞传代次数为第 3代，细胞初始接种密

度为70%，转染后48 h进行观测时，即可获得较佳的转染效率。研究成功分离培养梅花鹿耳成纤维细胞，筛选

出了脂质体转染梅花鹿耳成纤维细胞的最佳条件，可为梅花鹿基因工程的相关研究提供参考依据。

关键词：梅花鹿；成纤维细胞；细胞培养；脂质体转染

中图分类号：S825 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0315-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1557

引用格式：高鹤轩，荣敏，刘汇涛，等.梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件优化［J］.吉林农业大学学报，

2024，46（2）：315-323.

In Vitro Culture and Optimization of Transfection Conditions of Sika

Deer Ear Fibroblasts *

GAO Hexuan，RONG Min，LIU Huitao，TANG Lixin，ZHOU Hongda，XING Xiumei**

Key Laboratory of Molecular Biology of Special Economic Animals， Institute of Special Animal and

Plant Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130112， China

Abstract：This study aims to cultivate sika deer ear fibroblasts,optimize the conditions for liposome

transfection of sika deer ear fibroblasts,and obtain the optimal plasmid transfection parameters, pro⁃

viding theoretical and technical basis for conducting functional research on target proteins in sika

deer ear fibroblasts.Sika deer ear fibroblasts were separated by tissue block attachment method and

differential attachment method, basic morphological characteristics of the cells were observed, and

expression of Vimentin was identified by immunofluorescence. Using enhanced green fluorescent pro⁃

tein(EGFP) gene as marker gene,exogenous DNA transfection was mediated into sika deer ear fibro⁃

blasts by LipofectamineTM 3000,to explore the effects of ratio of plasmid DNA to liposomes(1.0∶1.0,

* 基金项目：中国农业科技创新工程资助项目（CAAS-ASTIP-201X-ISAPS），特种动物种质资源库资助项目（TZDWZYK2020）

作者简介：高鹤轩，女，在读硕士研究生，研究方向：特种经济动物遗传资源学。

收稿日期：2021-12-22

** 通信作者：邢秀梅，E-mail：xingxiumei2004@126.com

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

1.0∶1.5,1.0∶2.0, 1.0∶2.5,1.0∶3.0),plasmid dosage (0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 μg), number of cell passages

(2nd-6th),initial cell seeding density (50%,60%,70%,80%,90%),and observation time of transfection

effect(12, 24, 36, 48, 60 h) on transfection efficiency. The results showed that the growth of long

spindle-shaped cells of sika deer ear fibroblasts cultured with tissue block adherence method could

be observed under inverted fluorescence microscope, and the result of immunofluorescence detection

of Vimentin expression was positive.The optimal transfection conditions for screening: When ratio of

plasmid DNA to liposomes was 1.0∶2.0, amount of plasmid DNA was 1.5 μg, number of cell passages

was the third generation, and initial cell inoculation density was 70%, and when observed 48 h after

transfection, better transfection efficiency could be achieved. In this study, sika deer ear fibroblasts

were successfully isolated and cultured, and the optimal conditions for liposome transfection of sika

deer ear fibroblasts were screened, which can provide important reference for related research on

sika deer genetic engineering.

Key words：sika deer； fibroblast； cell culture； liposome transfection

梅花鹿体细胞核含有梅花鹿的全部遗传信

息，是基因资源的重要组成部分，在体外也能稳定

遗传［1］

。与其他组织或细胞相比，成纤维细胞在

动物体内分布广泛，取材方便，采用组织块贴壁法

获得的成纤维细胞整齐且易于分离和收集，并且

遗传稳定，成为转基因克隆动物的首选核供体［2］

。

研究表明，体细胞保种可以为野生梅花鹿的研究

提供材料，避免因为濒危动物研究材料的稀缺而

造成研究不足，对野生梅花鹿生物遗传资源的保

护和利用具有重要意义［3］

。

细胞转染技术包括磷酸钙法、DEAE-右旋糖

苷法、电穿孔法、阳离子脂质体法、病毒介导感染

法、Biolistic颗粒传递法、显微注射法等［4］

，其中脂

质体转染法利用脂质体可以使不同载体物质携带

质粒直接穿膜或与细胞膜相融合的方式将外源基

因导入真核细胞，与其他转染方法相比，具有条件

易于控制、结果可靠、可重复性强、操作简单、安全

性好等优点［5-6］

。因此，提高转染效率、将目的基

因安全地导入靶细胞是转染技术的关键［7］

。

本研究以梅花鹿耳组织为材料，采用组织块

贴壁法对梅花鹿耳成纤维细胞进行制备，在细胞

水平上保存了梅花鹿遗传资源，并以梅花鹿耳成

纤维细胞为研究对象，采用脂质体法优化质粒与

脂质体比例、质粒DNA用量、传代次数、细胞初始

接种密度、转染效果观测时间对转染效率的影响，

初步建立适合梅花鹿耳成纤维细胞的脂质体转染

体系，为外源基因高效转染梅花鹿耳成纤维细胞

提供理论基础。

1　材料与方法

1. 1　主要试剂

增强性绿色荧光蛋白质粒pCDNA3.1-EGFP、

脂质体购自淼灵质粒平台；DMEM高糖培养液、胎

牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、双抗、Opti-MEM减

血 清 培 养 基 均 购 自 Gibco 公 司 ；二 甲 基 亚 砜

（DMSO）、DAPI购自 Sigma 公司；无内毒素大提质

粒试剂盒购自天根生化科技有限公司；大肠杆菌

DH5α 感受态细胞、Cy3 免疫荧光检测试剂盒（小

鼠）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；氨

苄青霉素购自全式金公司；脂质体 Lipofectami⁃

neTM 3000 购自 Invitrogen 公司；鼠抗波形蛋白一

抗、Triton X-100购自碧云天生物。

1. 2　样品采集

梅花鹿来自吉林省四平市种鹿场有限公司。

选择精神状态良好、生长发育正常的4月龄公鹿，

使用手术刀片刮净耳毛，碘酒消毒后用无菌剪刀

剪下耳缘约1 cm2

组织块，使用75%乙醇和PBS冲

洗2遍后，放入4 ℃含1%双抗的PBS溶液中储存，

立即带回实验室进行处理。

1. 3　梅花鹿耳成纤维细胞的分离培养及鉴定

1. 3. 1 梅花鹿耳成纤维细胞的分离培养 将

1 cm2

梅花鹿耳缘组织块放置于盛有 10 mL PBS

（1% 双抗）的培养皿中，刮净表面毛发，剪去边缘

部分和外层皮肤，然后将小块浸泡于完全培养液

（DMEM高糖培养液+10%胎牛血清+1%双抗）中，

完全剪碎后转移至 15 mL 离心管中，1 000 r/min

离心 4 min，弃上清，加入 10 mL 完全培养液吹打

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高鹤轩，等：梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件优化

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

洗涤组织后转移至 15 mL 离心管中，1 000 r/min

离心 4 min，弃上清，加入适量完全培养液使组织

混合均匀，移至 T25 细胞培养瓶后平铺于培养瓶

生长面，将培养瓶倒置，使组织块与培养液分离，

放入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养6 h，使组织

块贴壁，加入5 mL完全培养液，轻缓翻瓶，继续放

于培养箱中培养，3 d 后观察细胞生长情况并换

液，此后隔天更换培养液。待细胞融合度达到

80% 后，弃掉培养液，用 2 mL PBS 洗去残留培养

基，洗 2 次，加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶进行消化，

显微镜下观察到大部分细胞收缩变圆后，立即加

入5 mL培养液（10% FBS）终止消化，吹打混匀，将

培养瓶内液体转移至15 mL离心管中，1 000 r/min

离心 4 min，弃上清，加入 15 mL 完全培养基并吹

打混匀，按照1∶3比例传代继续培养。

1. 3. 2 细胞形态学观察 原代及第 2，3 代成纤

维细胞融合度达到 80% 传代时，使用倒置荧光显

微镜观察并拍照，并采用全自动细胞计数仪（Bod⁃

Boge）检测细胞活力。

1. 3. 3 特异性标记物鉴定 取第 3 代细胞接种

于 6 孔板上，每孔 1×105 细胞。待细胞长至 60%~

70% 汇合时，用 PBS 洗 3 次，加入预冷的 4% 多聚

甲醛，室温固定 15 min，PBS 洗 3 次，Triton X-100

室温通透 10 min，PBS 洗 3 次，封闭液室温封闭

45 min，加入鼠抗波形蛋白（Vimentin，1∶100），

4 ℃孵育过夜，次日室温孵育 60 min，PBS洗 3次，

加入 Cy3 标记的山羊抗小鼠二抗（1∶500）避光孵

育60 min，PBS避光洗3次，加入DAPI室温复染细

胞核 5 min，PBS 洗 3 次，抗荧光淬灭封片液封片，

荧光显微镜下观察并拍照，并用Image J 1.51j8图

像处理工具进行阳性率统计。

1. 4　质粒DNA提取

取出-80 ℃保存的 pCDNA3.1-EGFP 质粒的

甘油菌，涂布于含氨苄青霉素的 LB 固体培养基

上，待长出阳性菌落后，挑单菌落加入含有氨苄青

霉素的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min 过夜摇

菌培养。按质粒大提试剂盒说明书进行质粒

DNA 的提取，使用酶标仪（Synergy H1，BioTek）测

定质粒浓度。

1. 5　转染

按照 LipofectamineTM 3000转染试剂说明书操

作，将长势良好的细胞在转染前 1 d 接种于 12 孔

板，待细胞融合度达到所需程度时，更换新鲜培养

液后进行转染。转染前，将质粒和脂质体分别用

50 μL Opti-MEM 减血清培养基稀释，并充分混

匀，再将稀释的质粒与脂质体充分混合后室温下

静置10~15 min，将质粒与脂质体混合物分别逐滴

加入孔中，放于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，6 h

后更换完全培养基继续培养。

1. 6　转染条件的优化

1. 6. 1 质粒质量与脂质体体积比优化 选择生

长状态较好的第 3 代细胞，12 孔板中挑选细胞融

合度达到 70% 的孔，分别以质粒质量与脂质体体

积比为 1.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0，1.0∶2.5，1.0∶3.0

进行转染，每组质粒用量均为 1.5 μg，每组设计

3 个复孔。于转染后 48 h，在倒置荧光显微镜

470~490 nm 下观察梅花鹿耳组织成纤维细胞中

增强型绿色荧光蛋白（Enhanced fluorescence pro⁃

tein， EGFP）的表达情况并拍照分析。每孔随机

取 5 个不同视野进行细胞总数及 EGFP 荧光阳性

细胞数的计数，并计算平均值，进行3次生物学重

复，采用全自动细胞计数仪（BodBoge）检测细胞活

力，以此评价转染效率。转染效率=荧光细胞数/

EGFP荧光阳性细胞数×100%。

1. 6. 2 质粒DNA用量的优化 选择生长状态较

好的第 3 代细胞，12 孔板中挑选细胞融合度达到

70% 的孔，每孔分别采用 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μg

5 个梯度质粒 DNA 的量进行转染，质粒质量与脂

质体体积比为 1.0∶2.0，每组设计 3 个复孔。于转

染后48 h在倒置荧光显微镜下观察梅花鹿耳组织

成纤维细胞中 EGFP 的表达情况并拍照分析，具

体方法同本文“1.6.1”。

1. 6. 3 细胞传代次数的优化 选择第 2~6 代细

胞进行转染，12孔板中挑选细胞融合度达到 70%

的孔，每孔中所加的质粒DNA量为1.5 μg、脂质体

用量为 3 μL，每组设计 3 个复孔。于转染后 48 h

在倒置荧光显微镜下观察梅花鹿耳组织成纤维细

胞中 EGFP 的表达情况并拍照分析，具体方法同

本文“1.6.1”。

1. 6. 4 细胞初始接种密度的优化 选择生长状

态较好的第 3 代细胞，以相同密度（1×105

/孔）接

种细胞，分别于细胞达到 50%，60%，70%，80%，

90%融合时进行转染，每孔中所加的质粒DNA量

为 1.5 μg、脂质体用量为 3 μL，每组设计 3 个复

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孔。于转染后48 h在倒置荧光显微镜下观察梅花

鹿耳组织成纤维细胞中 EGFP的表达情况并拍照

分析，具体方法同本文“1.6.1”。

1. 6. 5 转染效果观测时间的优化 选择生长状

态较好的第 3 代细胞，以相同密度（1×105

/孔）将

细胞接种于12孔板中，当细胞融合度达到70%时

进行转染，每孔中所加的质粒DNA量为1.5 μg、脂

质体用量为 3 μL，每组设计 3 个复孔。分别于转

染后 12，24，36，48，60 h，在倒置荧光显微镜下观

察梅花鹿耳组织成纤维细胞中 EGFP的表达情况

并拍照分析，具体方法同本文“1.6.1”。

1. 7　统计学处理

使用 Excel 2019 进行试验所得数据的整理，

使用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，结果以

“平均值±标准差”表示，以 P<0.05 为差异显著性

判断标准。使用GraphPad Prism 9.2.0软件绘图。

2　结果与分析

2. 1　梅花鹿耳成纤维细胞的形态学观察

由图1可见，组织块贴壁7~12 d之后，可见大

量细胞在组织块周围生长，其中包括成纤维细胞

和上皮细胞，之后细胞向外快速扩散，铺满瓶底需

要 2~5 d。成纤维细胞的生长随着 2~3 次传代后

占优势，上皮细胞被排除，得到纯化的成纤维细

胞。正常光下，传代后的细胞形态基本正常，为典

型的成纤维细胞形态，呈长梭形，细胞胞质丰满，

核仁清晰可见，密集排列呈漩涡状，细胞活力维持

在约96%。

2. 2　梅花鹿耳成纤维细胞特异性标记物检测

由图 2 可见，鼠抗波形蛋白表达为阳性，Im⁃

age J统计结果显示阳性率>95%，说明所分离的梅

花鹿耳成纤维细胞纯度较高。

2. 3　质粒质量与脂质体体积比的优化

由图 3 可见，当质粒质量与脂质体体积比为

1.0∶2.0 时，转染效率和细胞活力最高，分别为

（64.47±2.00）%和（89.40±2.29）%，随着脂质体的

增加，发荧光的细胞数显著减少，同时细胞计数仪

检测其细胞活性也显著降低，且差异具有统计学

意义（P<0.05）。因此，选择最佳质粒质量与脂质

体体积比为1.0∶2.0。

A.原代细胞（7 d）；B.第2代细胞；C.第3代细胞

图1　组织块贴壁法培养的梅花鹿耳成纤维细胞（40×）

Fig. 1 Sika deer ear fibroblasts cultured by tissue block adherence method（40×）

图2　梅花鹿耳成纤维细胞免疫荧光鉴定（200×）

Fig. 2 Immunofluorescence identification of sika deer ear fibroblasts（200×）

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高鹤轩，等：梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件优化

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2. 4　质粒DNA用量的优化

质粒用量对梅花鹿耳成纤维细胞的影响结果

见图 4。由图 4 可见，当质粒用量为 0.5~1.5 μg

时，转染效率和细胞活力随质粒用量的增加而增

加；当质粒用量为1.5 μg时，转染效率和细胞活力

最高，分别为（65.40±1.12）%和（88.80±2.86）%，显

著高于其他组（P<0.05）；而当质粒用量>1.5 μg

时，转染效率和细胞活力随 DNA 用量的增加而

下降。由此推断，应选择质粒用量为 1.5 μg 进行

转染。

2. 5　细胞传代次数的优化

由图5可见，当在细胞为第2代和第3代时进

行 转 染 ，细 胞 转 染 效 率 较 高 ，分 别 为（65.27±

1.33）%和（66.33±2.19）%，其差异不具有显著性

（P>0.05），但是细胞活力第 3 代细胞显著高于第

2 代细胞（P<0.05），随着传代次数的增加，细胞

A~E. 质粒质量与脂质体体积比分别为 1.0∶1.0,1.0∶1.5,1.0∶2.0,1.0∶2.5,1.0∶3.0 时细胞 GFP 表达图（100×）；F. 质粒质量与脂质体体积比

不同时的转染效率及细胞活力。肩标不同大写字母表示转染效率差异显著（P<0.05）；肩标不同小写字母表示细胞活力差异显著

（P<0.05）；肩标相同字母表示差异不显著（P>0.05）。下图同

图3　质粒与脂质体比例对转染效果的影响

Fig. 3 Effect of ratio of plasmid to liposome on transfection efficiency

A~E.质粒DNA用量分别为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 μg时细胞GFP表达图（100×）；F.质粒DNA用量不同时的转染效率及细胞活力

图4　质粒DNA用量对转染效果的影响

Fig. 4 Effect of plasmid DNA dosage on transfection efficiency

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