吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

转染效率和细胞活力逐渐降低。结果表明，在第

3 代对梅花鹿耳成纤维细胞进行转染，细胞承受

脂质体毒性能力最强，转染效率和细胞活力

最高。

2. 6　细胞初始接种密度的优化

细胞初始接种密度对梅花鹿耳成纤维细胞的

影响结果见图6。由图6可见，当细胞初始接种密

度为 70% 时，细胞转染效率和细胞活力最高，分

别为（64.80±1.90）%和（90.47±2.39）%，显著高于

其他组（P<0.05），由此推测，最佳细胞初始接种密

度为70%。

2. 7　转染效果观测时间的优化

由图 7可见，当在细胞转染后 48 h 时进行观

察转染效率最高，为（64.93±2.19）%，显著高于

其他时间（P<0.05）；细胞活力随着观察转染效

果的时间的增加而下降，推测可能是由于转染

时间的增加，脂质体对细胞的毒性逐渐加大导

致。因此选择细胞转染后 48 h 时进行观察效果

最好。

A~E.第2~6代细胞GFP表达图（100×）；F.不同细胞代数的转染效率及细胞活力

图5　细胞传代次数对转染效果的影响

Fig. 5 Effect of number of cell passages on transfection efficiency

A~E.细胞初始接种密度分别为50%，60%，70%，80%，90%时细胞GFP表达图（100×）；F.不同细胞初始接种密度的转染效率及细胞活力

图6　细胞初始接种密度对转染效果的影响

Fig. 6 Effect of initial cell seeding density on transfection efficiency

320

高鹤轩，等：梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件优化

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3　讨　论

3. 1　梅花鹿耳成纤维细胞的体外培养

本试验从梅花鹿耳缘进行取材，采样量少，对

梅花鹿损伤较小［8］

，既提供了梅花鹿个体完整的

遗传物质，又对动物的存活和后续正常生长、繁殖

没有影响，此种取材方式比较理想［9］

。很多学者

都成功建立了不同鹿类的耳部成纤维细胞，如黇

鹿［10］

、梅花鹿［11］

、黑麂［12］

、麋鹿［13］

等，说明耳成纤

维细胞较为容易获得和培养，可行性较高。

原代细胞的分离培养方法主要有胰蛋白酶消

化法和组织块贴壁法［14］

。胰蛋白酶消化法是在

酶的作用下，促使细胞快速大量生长。此方法适

用于培养大量组织，原代细胞得率高，但易污染且

步骤繁琐。本研究采用组织块贴壁法成功获得梅

花鹿耳成纤维细胞。虽然组织块贴壁法获得传代

细胞所需的时间较长，但长出的细胞整齐且易于

选择，成纤维细胞与上皮样细胞分片生长，酶对

2 种细胞的消化时间不同，因此便于分离和收集

细胞，培养动物的成纤维细胞多采用这种方

法［15］

。波形蛋白（Vimentin）是细胞中的一种重要

的细胞骨架成分，其在成纤维细胞中大量表

达［16］

，因此波形蛋白可作为分离培养成纤维细胞

鉴定的标志之一。本试验对所建立的梅花鹿耳成

纤维细胞进行了波形蛋白表达的免疫荧光研究，

证实梅花鹿耳成纤维细胞呈现波形蛋白表达阳

性，结合细胞形态特征可初步判定细胞群体属于

成纤维细胞类型［17］

。

3. 2　梅花鹿耳成纤维细胞转染条件的优化

基因转染的方法很多，目前最常用的是脂质

体转染法［18-20］

。近年来，阳离子脂质体技术已经

越发成熟，形成了不同种类的商业化产品，尤其以

Invitrogen 公司为代表［21］

。该技术简单、容易操

作，重复性强且结果可靠，使其在体外转染真核细

胞的研究中应用最为广泛。但是转染率不高这一

缺点限制了该方法更为广泛的应用［22-23］

。优化转

染条件获得更高的转染效率在细胞转染研究中备

受关注［24-25］

。脂质体法最关键的因素是防止转染

毒性，决定转染成功与否的因素很多，包括质粒与

脂质体的比例、质粒DNA用量、细胞传代次数、细

胞初始接种密度、转染效果观测时间等［26-33］

。本

试验优化了脂质体 LipofectamineTM3000 介导转染

梅花鹿耳成纤维细胞的条件，结果表明，当质粒

DNA 用量、细胞代数及初始接种密度一定时，随

着脂质体用量的增加，转染效率先升高后降低，细

胞活力也随之降低，这一结果与刘伟等［34］

对猪耳

成纤维细胞的研究结果、崔奎青等［35］

对水牛胎儿

成纤维细胞的研究结果和邓廷贤［21］

对水牛肾脏

成纤维细胞的研究结果一致。原因可能是过量的

脂质体对梅花鹿耳成纤维细胞具有毒性。本试验

发现，当脂质体、细胞代数及初始接种密度一定

时，转染效率和细胞活力随着质粒DNA用量的增

加而升高，但质粒用量>1.5 μg 时，转染效率和细

胞活力反而下降，这一结果与邹娴等［36］

对鸡原始

A~E.转染后12,24,36,48,60 h时细胞GFP表达图（100×）；F.转染后不同观测时间的转染效率及细胞活力

图7　转染效果观测时间对转染效率和细胞活力的影响

Fig. 7 Effect of observation time of transfection effect on transfection efficiency

321

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

生殖细胞的研究结果一致。原因可能是 DNA 量

过多，能够与其结合的脂质体量不足，导致有一部

分DNA无法与脂质体结合，从而导致转染效率不

能继续升高［4］

。细胞传代次数也是影响细胞转染

效率的关键因素，本试验在第3代进行转染，细胞

分裂增殖代谢旺盛，容易接纳外源 DNA，对细胞

的毒性较小，细胞损伤后修复快，外源基因更有可

能被整合到细胞基因组的有效片段中，因此可以

取得较佳的转染效率。细胞汇合度也是影响转染

效率的因素之一［37］

，本试验结果显示，细胞接种

密度在 70% 时转染效率和细胞活力最佳，过高或

过低的接种密度都会导致细胞转染效率的下降。

本试验中，转染后48 h转染效率达最高，这一结果

与张锐虎［8］

转染 Neuro-2a 细胞的研究结果一致，

说明细胞汇合度达70%时适宜进行转染。

本研究成功分离培养并鉴定了梅花鹿耳成纤

维细胞，实现了在细胞水平上保存梅花鹿遗传资

源，同时筛选出梅花鹿耳成纤维细胞脂质体转染

的最佳条件：第3代细胞汇合度达70%时，质粒质

量与脂质体体积的最适比为 1.0∶2.0，质粒用量为

1.5 μg，且在转染后 48 h进行观测转染效率最高、

细胞活力最佳。此研究结果可为后续梅花鹿基因

工程的相关研究提供理论依据。

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高鹤轩，等：梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件优化

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（责任编辑：林海涛）

323

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（2）：324-328

Journal of Jilin Agricultural University

LEF1基因在鹅胚胎期皮肤毛囊中的表达*

孙 越，刘 静，刘 畅，王义冲，周宇轩，隋玉健，孙永峰**

吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118

摘 要：为了解 LEF1基因在鹅胚胎期皮肤毛囊发育过程中的作用，以胚胎期 12，18，28 d的吉林白鹅和胚胎

期13，18，28 d的卡洛斯鹅为试验动物。利用苏木精-伊红染色法（HE 染色）对皮肤组织进行组织形态学观察，

采用荧光定量PCR对LEF1基因在胚胎期鹅背部皮肤毛囊中的相对表达量进行检测及分析。结果表明：胚胎

期为鹅初级毛囊的原始发育期，卡洛斯鹅胚胎期毛囊发育快于吉林白鹅；LEF1基因在胚胎期吉林白鹅及卡洛

斯鹅的毛囊中均有表达，表达量在18 d时为高峰期。说明 LEF1基因可能在胚胎期吉林白鹅及卡洛斯鹅的毛

囊发育过程中发挥一定的作用。

关键词：LEF1；吉林白鹅；卡洛斯鹅；皮肤；毛囊

中图分类号：S835 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0324-05

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.5567

引用格式：孙越，刘静，刘畅，等 .LEF1 基因在鹅胚胎期皮肤毛囊中的表达［J］. 吉林农业大学学报，2024，46

（2）：324-328.

Expression of LEF1 mRNA in Feather Follicles during Goose Embry⁃

onic Period *

SUN Yue，LIU Jing，LIU Chang，WANG Yichong，ZHOU Yuxuan，SUI Yujian，SUN Yong⁃

feng**

College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China

Abstract：To understand the role of LEF1 gene on the development of feather follicle during goose

embryonic period, Jilin white goose at E12, 18 and 28 and Carlos goose at E13, 18 and 28 were used

as experimental animals. The histological observation of skin tissues was conducted by hematoxylineosin (HE) staining method. Fluorescence quantitative PCR was used to detect and analyze the rela⁃

tive expression level of LEF1 gene in the back skin with feather follicle during goose embryonic pe⁃

riod. The results showed that the embryonic stage was the primary development stage of the primary

feather follicle in goose, and the developmental speed of feather follicle in Carlos goose was faster

than that in Jilin white goose. The LEF1 gene was expressed in the feather follicle during both Carlos

goose and Jilin white goose embryonic period, and reached the peak at E18, suggesting that LEF1

gene may play a role to some extend in the processing of Carlos goose and Jilin white goose embry⁃

onic feather follicle development.

Key words：LEF1； Jilin white goose； Carlos goose； skin； feather follicle

* 基金项目：吉林省重点科技研发项目（20180201034NY），吉林省畜禽品种培育项目（2019），吉林省现代农业产业技术示范推广

项目（吉牧201904）

作者简介：孙越，女，硕士研究生，研究方向：家禽育种与分子遗传。

收稿日期：2019-12-26

** 通信作者：孙永峰，E-mail：sunyongfeng1977@126.com

孙越，等：LEF1基因在鹅胚胎期皮肤毛囊中的表达

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

鹅作为水禽家族中的重要成员，具备肉用、蛋

用、绒用等多种重要经济价值。其中，鹅羽毛具有

柔软、保暖等特性，可作为保暖物品的填充物；翅

羽、饰毛可作为羽毛球、扇子等工艺品的制作材

料，具有极高的经济价值［1］

。此外，中国鹅绒具有

柔软、轻便、保暖、耐磨等特点，在国内和国际市场

需求量高，出口量在世界占比>70%，有广阔的市

场发展前景［1-2］

。

毛囊是羽毛羽绒生长发育的基础，在众多毛

囊发育有关的通路之中，Wnt/β-catenin/Lef-1

（淋巴增强因子1）信号通路是重要的通路之一［3］

，

参与了毛发、毛囊早期发育和产后毛发循环［4-6］ 。

其中，淋巴增强因子1（LEF1）是发育转录因子，可

以诱导毛囊在内的多种上皮源性器官形成。有研

究表明，在胚胎期毛囊的发育过程中，LEF1 在卵

泡外胚层、毛囊球、成体毛囊上皮轴和真皮乳头中

均存在诱导表达［4-6］

。

鹅毛囊的发育是从胚胎阶段开始，在胚胎的

第11~13天（E11~13），羽芽结构出现，此时为初级

毛囊发育的原始期；在胚胎的第 16~18 天（E16~

18），羽毛板在皮肤表面显示不均匀的图案，且观

察到背侧羽毛开始角化，为次级毛囊发育的原始

期；在胚胎的第26~29天（E26~29），鹅胚胎的体表

被黄色和黑色的毛囊覆盖，是次级羽毛毛囊发育

较快的时期［7-12］

。本试验对不同鹅种胚胎期背部

皮肤毛囊形态进行观察，研究 LEF1 基因表达规

律，为LEF1基因在鹅胚胎期毛囊发育过程中的机

理提供理论依据。

1　材料与方法

1. 1　材料

1. 1. 1 试验动物 本试验中所需试验材料均由

吉林农业大学鹅研中心提供。吉林白鹅绒用品系

具有羽毛绒朵大、弹性好等特点；卡洛斯鹅原产于

匈牙利，为肉绒兼用品系，具有羽毛生长速度快，

更换期短、品质优异等特点。随机选取 2 品种的

种蛋各40枚，于同一孵化器中进行孵化。

1. 1. 2 试验样品采集 随机选取胚胎期吉林白

鹅12，18，28 d（E12，E18，E28）和卡洛斯鹅13，18，

28 d（E13，E18，E28）各 12只，对其背侧皮肤中线

与两翼的交叉区域（约 1 cm2

）进行采样。每个阶

段选择 3 个样品进行总 RNA 提取，1 个样品用于

组织形态学观察。采样前所有药品、试剂均经

0.22 μm 细菌滤器过滤、灭菌或高温高压蒸汽灭

菌（115 ℃，15 min），耗材、器材利用75%乙醇进行

擦拭灭菌或高温高压蒸汽灭菌（121 ℃，30 min），

以保障采样过程中的无菌条件。

1. 1. 3 试验药品和仪器 PBS 缓冲液、氯仿、无

水乙醇、异丙醇、DEPC 处理水（上海生工生物工

程有限公司），研钵、研杵、HE 染色液（北京欣华

绿源），反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限

公司），qPCR 试剂盒（日本东洋纺品牌），石蜡

（Thermo）。组织切片机（Thermo），自动孵化一体

机（山东鹏达孵化设备有限公司），凝胶图像处理

系统（北京鼎昊源科技有限公司），电泳仪、水平摇

床（北京市六一仪器厂），PCR 仪（Applied Biosys⁃

tems公司），Agilent 2100（安捷伦），低温高速离心

机、荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems 公司），

显微镜及成像系统（OLYMPUS）。试验过程中所

有器械和仪器通过干热灭菌或高压蒸汽灭菌，所有

试剂均由超纯水配制。

1. 2　方法

1. 2. 1 组织形态学观察 组织切片的制作。将

4% 多聚甲醛固定好的皮肤样本取出、修块，放入

包埋盒中，利用乙醇溶液（70%，80%，90%，95%，

100%）浸泡，进行脱水，并用二甲苯溶液对组织进

行透明处理。用切片机进行切片（切片厚为

10 μm），平铺固定在黏附性载玻片上。

HE 染色。切片经二甲苯去蜡、乙醇溶液

（100%，95%，90%，80%，70%）以及蒸馏水复水。

苏木素染色，3%乙酸溶液分化，伊红染料染色，乙

醇溶液（70%，80%，90%，95%，100%）脱水，二甲

苯透明 15 min，最终使用中性树胶封片，进行观

察、拍照。

1. 2. 2 总RNA提取 采用Trizol法提取总RNA，

使用核酸浓度测定仪检测OD（260 nm/280 nm）值

和总 RNA 的浓度，用 1% 的琼脂糖凝胶电泳法验

证RNA完整性，并保存于-80 ℃冰箱中。

1. 2. 3 实时荧光定量PCR 引物设计。在NCBI

网 站 查 找 浙 东 白 鹅（XM_013184751.1 和 XM_

013185330.1）的核酸序列，并以其为模板，利用

Primer 5.0软件进行引物设计，由生物公司进行引

物合成，并将合成引物储存在-20 ℃冰箱，进行试验

前需利用TE缓冲液将其进行100倍稀释，稀释后的

引物稀释液保存条件为4 ℃。引物信息见表1。

325

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

PCR扩增验证反应条件。PCR扩增采用上海

生工生物工程股份有限公司提供的试剂盒，筛选

适宜反应条件，验证扩增条带是否与预期一致。

实时荧光定量PCR。使用北京全式金生物科

技有限公司生产的反转录试剂盒，进行RNA反转

录。以 42 ℃，30 min；85 ℃，5 s 为反转录反应条

件，得到 cDNA，并以其为反应模板进行 qPCR 反

应。qPCR过程中，分别对每个样本的cDNA模板，

以及每个基因作3组平行处理。qPCR反应条件：

94 ℃ 30 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，总计 40 次循环，

溶解曲线设置为65 ℃ 15 s，95 ℃ 0.5 s。空白对照

中以 0.4 μL的 ddH2O替代各个处理组中的 0.4 μL

cDNA。qPCR 反应组体系（20 μL）：SYBR 10 μL，

上 下 游 引 物 各 0.4 μL，cDNA 0.4 μL，ddH2O

8.8 μL。

1. 3　数据整理与分析

数据采用 2-ΔΔCt 法进行 qPCR 结果计算，在

SPSS19.0 中进行单因子水平方差分析，计算结果

以“平均值±标准误”表示，利用 Duncan 及 LSD 法

进行多重比较，且显著性标准为P<0.05。

2　结果与分析

2. 1　不同时期鹅皮肤毛囊发育情况

利用苏木素伊红染色（HE）的方法，分别对 6

个皮肤样本进行染色、观察（100×视野）。在不同

胚龄时，毛囊形态结构具有一定的差异，且随着日

龄的增长毛囊形态不断趋于完善，具体形态见图

1。本试验结果表明，E12（吉林白鹅）和E13（卡洛

斯鹅）时，可观察到生长中的羽芽结构，并且卡洛

斯鹅的羽芽明显长于吉林白鹅，此时毛囊开始发

育。在 E18 吉林白鹅的毛囊结构中，由于毛囊内

部结构还未发生分化，可观察到下陷的表皮形成

了充质均匀的腔状结构，且不存在毛囊的附属结

构。对比看来，这个阶段的卡洛斯鹅毛囊根部发

育比吉林白鹅成熟；在 E18 的卡洛斯鹅的毛囊结

构中，可观察到毛乳头等部位，而吉林白鹅的毛囊

发育处于毛囊腔刚发育完成状态。E28 时，毛囊

内部结构逐渐形成，此时卡洛斯鹅毛囊腔隙开始

逐渐减少甚至消失，可观测到少数的周围腺体；吉

林白鹅的毛囊腔隙仍然存在，发育程度相对卡洛

斯鹅较不完善。

2. 2　总 RNA提取结果

核酸浓度分析仪测定OD值（260 nm/280 nm）

显示，试验所得 RNA 全部符合试验要求，即 OD

值均在 1.8~2.0。证明得 到 的 RNA 纯 度 较 高 。

1.0% 琼脂糖凝胶电泳结果表明，吉林白鹅和卡

洛 斯 鹅 各 毛 囊 发 育 节 点 的 样 本 提 取 的 RNA，

经 电 泳 检 测 条 带 明 亮 清 晰 ，可 在 5S，18S，28S

观察到清晰、无拖尾的条带，说明 RNA 质量良

好（图2）。

表1 LEF1基因与β-actin目的片段引物信息

Table 1 LEF1 and β-actin gene fragment primer information

基因名称

LEF1

β-actin

引物序列

F: CACAGAACCTGCGATTT

R: CCACTGGGAGTCCGTAA

F:GCGGCATGCCACACCGTGCCCATCTATGAG

R:GCGAAGCTTGGCCATCTCCTGCTCGAAGT

片段长/bp

153

205

图1 HE染色结果

Fig. 1 HE dyeing test results

326

孙越，等：LEF1基因在鹅胚胎期皮肤毛囊中的表达

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3 PCR扩增

经筛选，59 ℃为 LEF1 基因和 β-actin 引物的

最适退火温度。同时利用 1% 琼脂糖凝胶电泳法

对 PCR 产物进行验证，结果显示，在预测目的条

带处只有唯一条带，且条带清晰明亮、无杂带，表

明可进行下一步试验。

2. 4　实时荧光定量PCR

利用 SYBR 探针荧光定量的方法进行 qPCR

试验，溶解曲线有且仅有一个吸收峰。可证明良

好的引物特异性，试验可以继续进行。通过qPCR

试验所获目的基因相对表达量，结果见表2。在2

品种鹅的胚胎期呈现动态的变化，吉林白鹅LEF1

基因 mRNA 相对表达量在 E12 显著低于 E18 和

E28（P<0.05），E18与 E28间无显著差异。卡洛斯

鹅 LEF1 基因 mRNA 相对表达量在 E13 显著低于

E18 和 E28（P<0.05），E18 的表达量显著高于 E13

和 E28（P<0.05），与吉林白鹅表达情况呈现不一

样的趋势。

3　讨 论

本研究通过 HE 染色观察了吉林白鹅和卡洛

斯鹅胎期 E12/E13，E18，E28皮肤毛囊发育情况，

利用荧光定量 PCR 技术检测了 LEF1基因在上述

时间节点的表达情况。有研究证明，鹅的毛囊具

有不同的时间、空间以及结构的差异，并可划分为

初级毛囊和次级毛囊［7］

。鹅初级毛囊的发育是从

胚胎阶段开始，并在胚胎阶段结束时完成，初级毛

囊会在后续的发育过程中形成正羽和翎羽［13］

。

并且不同物种的毛囊原始发生期有差异，赵辉玲

等［14］

对力克斯兔毛囊的研究表明，力克斯兔的初

级毛囊约在胚胎期的第16天发生，而在胚胎期的

第26天初级毛囊基本完成分化，此时可观察到毛

囊附属结构；Yu 等［15］

研究表明，鸡在胚胎期第

10 天开始形成羽芽结构；王功帅［16］

研究证明，鸭

的羽毛基板在胚胎期第8天开始发生，第9天羽芽

结构基本形成。本试验中，在 E12/E13 可清晰观

察到羽芽的形成，在 E28 时可清晰观察到初级毛

囊的形态，但不同品种的鹅毛囊发育情况有所差

异，卡洛斯鹅毛囊的发育比吉林白鹅快，这与前人

的研究相一致［7，17-20］

。

近年来，提高鹅羽绒生产性能成为行业生产

热点［21］

，而在鹅绒理化性质和发生发育规律方面

的研究较少［22-24］

。本研究通过研究毛囊的结构及

主效基因变化，诠释了毛囊形态变化。本试验

qPCR结果表明，随着胚胎发育，LEF1基因在吉林

白鹅胚胎期背部皮肤毛囊中的表达呈现先升高随

后稳定的表达趋势；而在卡洛斯鹅胚胎期的背部

皮肤中则呈现出倒“V”字，即先升高后降低的表

达趋势，其中 E28显著高于 E13（P>0.05）。2品种

胚胎期背部毛囊中LEF1基因随着毛囊的发育，表

达量呈现动态变化，且在吉林白鹅和卡洛斯鹅的

图2 Total RNA电泳结果

Fig. 2 Result of total RNA electrophoresis

表2　目的基因荧光定量PCR相对表达量

Table 2 Relative expression of target gene qPCR

品种

吉林白鹅

卡洛斯鹅

E12（E13）

0.19±0.01b

0.77±0.02c

E18

4.52±0.08a

8.49±0.30a

E28

4.06±0.14a

4.73±0.15b

注：同行相同小写字母间表示差异不显著，不同小写字母间表示差异显著（P<0.05）

327

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

胚胎期背部毛囊中的表达趋势存在差异。田晓

东［25］

研究发现，在鹅胚胎期皮肤毛囊中，LEF1 基

因 mRNA 呈现动态表达，同时对毛囊的发育具有

一定的影响，与本试验结果相似。

结合形态学和 LEF1基因表达变化，推测 E12

（吉林白鹅）和E13（卡洛斯鹅）为初级毛囊的初步

形成阶段，此时可观察到毛基板（毛囊的前身），加

之LEF1基因mRNA表达量较低，表明毛囊的发育

并未被完全激发；E18 时，吉林白鹅和卡洛斯鹅

LEF1基因mRNA表达量都处于最高表达水平，可

能是由于E18正处于毛囊发育的高峰期，LEF1基

因的参与促进此阶段毛囊的分化作用；E28 时，

LEF1基因mRNA表达量又处于正常水平，推进鹅

毛囊发育的循环渐进。

本研究结果表明，胚胎期为鹅初级毛囊的原

始发生期，卡洛斯鹅毛囊发育快于吉林白鹅。

LEF1 基因 mRNA 表达量随着毛囊的发育而呈现

动态变化，且在吉林白鹅和卡洛斯鹅的胚胎期背

部毛囊中的表达趋势存在差异，但高峰期均为

E18。推测 LEF1 基因在参与不同鹅种胚胎期毛

囊发育中存在表达差异特点。

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（责任编辑：林海涛）

328

吉林农业大学学报 2024，46（2）：329-334 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

LEC-5在秀丽线虫中的表达及亚细胞定位*

张 楠，程淑琴，宫鹏涛，李建华，王晓岑，李 新，张西臣**

吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所，人兽共患病研究教育部重点实验室，长春 130062

摘 要：采用gibson组装法构建带有lec-5启动子的lec-5p：：gfp：：lec-5：：lec-5 3′UTR目的质粒和带有肠道特

异性 vha-6 启动子的 vha-6p：：gfp：：lec-5：：lec-5 3′UTR 目的质粒，并通过显微注射方法获得游离型的 LEC5P：：GFP：：LEC-5荧光蛋白标记虫株和整合型的VHA-6P：：GFP：：LEC-5荧光蛋白标记虫株。利用激光共聚

焦显微镜观察LEC-5在秀丽线虫中的表达和亚细胞定位。结果表明：LEC-5在秀丽线虫的肌肉组织和表皮组

织中表达，并位于肠上皮细胞的顶端膜和胞质中的囊泡上。研究结果为进一步深入研究LEC-5在RAB-11介

导的上皮细胞极性调控中的作用提供试验依据。

关键词：秀丽线虫；LEC-5蛋白；GFP标记虫株构建；表达；亚细胞定位

中图分类号：S855. 91 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0329-06

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1491

引用格式：张楠，程淑琴，宫鹏涛，等.LEC-5在秀丽线虫中的表达及亚细胞定位［J］.吉林农业大学学报，2024，

46（2）：329-334.

Expression and Subcellular Localization of LEC-5 in Caenorhabditis

elegans *

ZHANG Nan，CHENG Shuqin，GONG Pengtao，LI Jianhua，WANG Xiaocen，LI Xin，

ZHANG Xichen**

Key Laboratory for Zoonosis Research of Ministry of Education，Zoonosis Institute of College of Veteri⁃

nary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China

Abstract：The lec-5p::gfp::lec-5::lec-5 3′UTR target plasmid with lec-5 promoter and the vha-6p::

gfp::lec-5::lec-5 3′UTR target plasmid with intestinal specific vha-6 promoter were constructed by

gibson assembly method. Then, the extrachromosomal strain LEC-5P:: GFP: LEC-5 and the inte⁃

grated strain VHA-6P::GFP::LEC-5 were obtained by microinjection. The expression and subcellu⁃

lar localization of LEC-5 in Caenorhabditis elegans were observed by confocal microscopy. The re⁃

sults showed that LEC-5 was expressed in muscle and epidermal cells of Caenorhabditis elegans and

was located at the apical membrane and cytoplasmic vesicles in the intestinal epithelial cells.These

results will lay foundation for further study of the role of LEC-5 in RAB-11-mediated epithelial

membrane polarity regulation.

Key words：Caenorhabditis elegans； LEC-5 protein； GFP-labeled strain construction； expression；

subcellular localization

* 基金项目：吉林省科技发展计划项目（20190103075JH）

作者简介：张楠，女，讲师，研究方向：细胞生物学。

收稿日期：2021-11-10

** 通信作者：张西臣，E-mail：xczhang@jlu.edu.cn

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

上皮细胞的细胞膜分为不对称的顶端膜结构

域和基底侧膜结构域，由不对称的顶端膜和基底

侧膜蛋白质和脂质构成，这种细胞膜的不对称性

称为上皮细胞膜极性［1］

。细胞膜极性的形成不仅

是上皮细胞执行多种重要生理功能的前提，也是

组织和器官发育的基础［2-4］

，而上皮细胞膜极性异

常与多种人类疾病密切相关，如癌症、多囊肾病和

微绒毛包涵体病等［5-7］

。上皮细胞膜极性受多种

因素调控，其中胞内囊泡运输在上皮细胞膜极性

建立和维持中均起重要作用［1，8-9］

。研究表明，在

上皮细胞膜极性建立和维持过程中，顶端膜蛋白

和基底侧膜蛋白经分选进入不同的运输囊泡中，

然后经胞内囊泡运输系统运输至相应的膜结构

域［1，10］

。然而，膜蛋白分选与胞内囊泡运输方向

之间的协调机制尚未见报道。据报道，Rab11 是

调控上皮细胞顶端囊泡运输的核心蛋白，在上皮

细胞膜结构域极性建立和维持过程中均发挥重要

作用［11］

。

秀丽线虫（Caenorhabditis elegans）是一种重

要的模式生物，其肠道具有结构简单、发育过程清

楚（细胞水平）和肠上皮细胞体积相对较大等优

势，使人们能在体内单细胞水平追踪上皮细胞膜

极性建立和胞内囊泡运输等过程［12-15］

。因此，秀

丽线虫的肠道可作为体内研究上皮细胞膜极性和

胞内囊泡运输的理想模型。秀丽线虫 RAB-11/

Rab11对肠上皮细胞极性调控至关重要。课题组

前期研究发现，秀丽线虫 LEC-5 是 RAB-11 的新

互作蛋白［16］

。但是，对秀丽线虫 LEC-5 的表达、

定位和功能及其与RAB-11结合的作用目前尚不

清楚。

本试验拟利用gibson组装法和线虫显微注射

法构建 LEC-5荧光蛋白标记虫株，并通过激光共

聚焦显微镜观察其在秀丽线虫中的表达和亚细胞

定位，以期为深入研究 LEC-5 在 RAB-11 介导的

顶端囊泡运输和上皮细胞极性调控中的作用，以

及膜蛋白分选和囊泡运输方向之间的协调机制奠

定基础。

1　材料与方法

1. 1　虫株

秀 丽 线 虫 N2 野 生 型 虫 株 购 自 CGC（Cae⁃

norhabditis Genetics Center）；PHX996 虫株由上源

生物科学技术有限公司提供。

1. 2　主要试剂与仪器

左旋咪唑（CAS#：14769-73-4），湖北宜来生

物科技有限公司产品。超净工作台，苏州净化设

备有限公司产品；体式显微镜，Olympus 公司产

品；激光共聚焦显微镜，ZEISS 公司产品；普通

PCR 仪、垂直蛋白电泳槽和转印仪，均为 Bio-Rad

公司产品。

1. 3　线虫的培养

采用标准秀丽线虫虫株培养方法，将秀丽线

虫置于 NGM 培养基［50 mmol/L NaCl，2.5 mg/L

蛋白胨，1.7% 琼脂，25 mmol/L K2HPO（4 pH 6.0），

1 mmol/L MgSO4，1 mmol/L CaCl2和 5 mg/L 胆固

醇］上，以 E.coli OP50 菌株为食，于室温下进行

培养。

1. 4　质粒的构建

1. 4. 1 线虫基因组 DNA的获取 用 M9收集 N2

野生型线虫，采用 Universal Genomic DNA 试剂盒

（CW2298M，康 为 世 纪 有 限 公 司）提 取 基 因 组

DNA，备用。

1. 4. 2 PCR 扩增目的片段 以秀丽线虫基因组

DNA为模板，利用Oligo7软件设计引物，PCR扩增

lec-5启动子序列、编码基因序列和3′UTR序列以

及vha-6启动子序列。引物由吉林省库美生物科

技有限公司合成。

1. 4. 3 质粒的构建 用 HindⅢ和 SpeⅠ（NEB公

司）酶切pPD49.78载体（Addgene公司），获得线性

载体。胶回收 PCR 扩增产物，通过 gibson 法将

PCR扩增片段和 pPD49.78载体连接，转化感受态

细胞 E.coli DH5α（DE3）中，涂板并 37 ℃培养过

夜。挑阳性单克隆菌斑，37 ℃孵育4 h，提取质粒，

PCR 扩增插入片段验证，并用 Hind Ⅲ和 SpeⅠ进

行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送吉林省库美生

物科技有限公司进行测序验证。测序引物序列

见表1。

1. 5　虫株的构建

1. 5. 1 LEC-5荧光蛋白标记虫株的构建 将构

建好的目的质粒 pPD49.78-lec-5p：：gfp-lec-5：：

lec-5 3′UTR（终质量浓度为 20 mg/L）与报告基因

质粒 pRF4 rol-6（su1006，终质量浓度为 50 mg/L，

上源生物科学技术有限公司提供）混合后，取

10 μL 对 N2 野生型秀丽线虫的性腺进行显微注

射，注射母系虫株数约30只。培育母系虫株数天

330

张楠，等：LEC-5在秀丽线虫中的表达及亚细胞定位

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

后，挑取F1代虫株转入多个NGM平板中进行单独

培养，待 F1产下后代后，筛选相对稳定遗传的 F1

代游离型转基因株系，并保存。

1. 5. 2 肠道特异性LEC-5荧光蛋白标记虫株的

构建 将构建好的目的质粒 pPD49.78-vha-6p：：

gfp：：lec-5：：lec-5 3′UTR（终质量浓度为25 mg/L）

与报告基因质粒 pCFJ350 Cb-unc-119（+）（终质

量浓度为 15 mg/L，上源生物科学技术有限公司

提供）混合后，取 10 μL对背景线虫 PHX996的性

腺进行显微注射，注射母系虫株数约 30 条。培

育母虫数天后，挑取 F1代虫株转入多个 NGM 平

板中单独培养。待 F1 产下后代后，筛选相对稳

定遗传的F1代游离型转基因株系。富集约200 只

相对稳定遗传的 L4 时期游离型转基因线虫到

1 个 NGM 平板上，对此 NGM 平板进行 X 射线照

射。待线虫恢复后，对照射后的线虫进行分板，

筛选 100% 整合率的转基因整合线虫株系，并

保存。

1. 6 LEC-5蛋白的表达和亚细胞定位观察

挑取荧光蛋白标记线虫，用 10 mmol/L 左旋

咪唑麻醉并固定到载玻片上，通过激光共聚焦显

微镜观察 LEC-5 在秀丽线虫中的表达和在肠道

细胞中的亚细胞定位。

2　结果与分析

2. 1　重组质粒的构建

2. 1. 1 LEC-5荧光蛋白标记质粒的构建 以秀

丽线虫基因组 DNA 为模板，分别 PCR 扩增 lec-5

的启动子序列（2 723 bp）、基因序列（867 bp）和

3′UTR 序列（73 bp），将 PCR 扩增产物经 gibson 组

装 连 接 插 入 pPD49.78 载 体 中 ，构 建 重 组 质 粒

pPD49.78-lec-5p：：gfp：：lec-5：：lec-5 3′UTR（X01）。

转化感受态细胞，挑取阳性单克隆菌斑，提取

质 粒 ，PCR 扩增插入片段，验证插入片段正确

（图 1-A）。 经 Hind Ⅲ 和 Stu Ⅰ 双 酶 切 ，得 到

5 079 bp 的目的片段和 2 500 bp 的载体片段，验

证重组质粒构建正确（图 1-B）。另外，经测序验

证质粒构建正确。

2. 1. 2 肠道特异性LEC-5荧光蛋白标记质粒的

构建 以秀丽线虫基因组DNA为模板，分别PCR

扩 增 lec-5 基 因 序 列（867 bp）和 3′UTR 序 列

（73 bp）以及vha-6启动子序列（2 029 bp），将PCR

扩增产物经 gibson 组装连接插入 pPD49.78 载体

中，构建重组质粒pPD49.78-vha-6p：：gfp：：lec-5：：

表1　引物序列

Table 1 Primer sequence

引物名称

X01-F11-A

X01-JC-S1

XN01-F3-A

XN01-JC-S4

X03-JC-S1

X03-JC-S3

X03-JC-S4

PHSP-S

GFP-N5R

GFP-3F

AD22-GFPS

OH23-F2-S

OH39-B-oligo2-S

引物序列（5′→3′）

CATGCTGACTTCTCTGTGGA

AGCTTGCCCATTCAAAACAC

AACTCCTGGAGCATCATTAA

AAAGCGTGTCAATGTCAACT

AGTTTACTACCATTCATTCG

TGATAACCAATACTTACGCT

AAAGCGTGTCAATGTCAACT

TCATTAATGCAGCTGGCACG

ACAGAAAGTAGTGACAAGTG

CCAGACAACCATTACCTGT

TTTCTGTCAGTGGAGAGGGT

AGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG

AATGGAATCAAAGTTGTAAG

A. X01质粒插入片段PCR扩增产物；B.X01重组质粒双酶切验证； M. DNA标志物；1. X01质粒；2. X01质粒未酶切；3. X01质粒酶切

图1 X01质粒插入片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析和重组质粒双酶切验证

Fig. 1 PCR amplification of insertion sequence and Endonuclease digestion of X01 plasmid

331

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

lec-5 3′UTR（X02）。转化感受态细胞，挑取阳性

单克隆菌斑，提取质粒，PCR 扩增插入片段，验证

插入片段正确（图 2-A）。经 HindⅢ和 StuⅠ双酶

切，得到4 380 bp的目的片段和2 500 bp的载体片

段，重组质粒构建正确（图2-B）。同时，测序验证

质粒构建正确。

2. 2 LEC-5荧光蛋白标记虫株的构建

2. 2. 1 LEC-5荧光蛋白标记虫株的构建 将构

建好的重组质粒 pPD49.78-lec-5p：：gfp：：lec-5：：

lec-5 3′UTR 经显微注射 N2 野生型线虫的性腺，

获得游离型的 LEC-5P：：GFP：：LEC-5 荧光蛋白

标记虫株（基因型为 Ex［lec-5p：：gfp：：lec-5：：lec5 3′UTR， pRF4］）。

2. 2. 2 肠道特异性LEC-5荧光蛋白标记虫株的

构建 将构建好的重组质粒 pPD49.78-vha-6p：：

gfp：：lec-5：：lec-5 3′UTR 经显微注射 PHX996 线

虫的性腺，获得游离型的VHA-6P：：GFP：：LEC-5

荧光蛋白标记虫株。经X射线照射，筛选100%整

合率的转基因整合线虫株系，获得整合型的VHA6P：：GFP：：LEC-5荧光蛋白标记虫株（基因型为Is

［vha-6p：：gfp：：lec-5：：lec-5 3′UTR，PCFJ350］）。

2. 3 LEC-5蛋白的表达

挑取带荧光标记的 LEC-5P：：GFP：：LEC-5

线虫，经激光共聚焦显微镜观察 LEC-5 蛋白在

秀丽线虫的表皮组织（图3-A）和肌肉组织中表达

（图3-B）。

2. 4 LEC-5蛋白的亚细胞定位

经激光共聚焦显微镜观察带有肠道特异性启

动子 vha-6p 的整合型 VHA-6P：：GFP：：LEC-5 荧

光蛋白标记虫株，发现 LEC-5蛋白位于秀丽线虫

肠上皮细胞的顶端膜（图 4，短箭头所示）和胞质

中的囊泡上（图4，长箭头所示）。

A.X02质粒插入片段PCR扩增产物；B.X02重组质粒双酶切验证。M.DNA标志物；1.X02质粒；2. X02质粒未酶切；3. X02质粒酶切

图2 X02质粒插入片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析和重组质粒双酶切验证

Fig. 2 PCR amplification of insertion sequence and Endonuclease digestion of X02 plasmid

A.GFP::LEC-5位于表皮组织中; B.GFP::LEC-5位于肌肉组织中

图3 LEC-5蛋白的表达

Fig. 3 Expression of LEC-5 protein

332

张楠，等：LEC-5在秀丽线虫中的表达及亚细胞定位

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3　讨　论

胞内囊泡运输是上皮细胞膜极性建立和维持

的重要调控因素，然而，目前对上皮细胞膜极性调

控过程中膜蛋白分选与囊泡运输方向之间的协调

机制仍不清楚。Rab11是调控上皮细胞顶端膜结

构域极性建立和维持的关键蛋白，介导顶端囊泡

运输［11，17-18］

。课题组前期研究发现，RAB-11在秀

丽线虫肠上皮细胞极性调控中起重要作用，并且

通过酵母双杂交筛选发现LEC-5与RAB-11存在

相互作用［12］

。LEC-5是哺乳动物 Galectin-9的同

源蛋白。但是，目前对LEC-5与RAB-11的互作，

以及LEC-5的表达、定位和功能尚不清楚。

为探究 LEC-5在秀丽线虫中的表达，本试验

构建带有 2 723 bp 的 lec-5 启动子序列的 LEC-5

荧光蛋白标记虫株，观察发现其在秀丽线虫的表

皮组织和肌肉组织中表达。由于启动子序列长短

的选择可能会影响蛋白在秀丽线虫中的表达，因

此，不能排除 LEC-5在肠道等其他组织中也存在

表达。另外，由于 LEC-5在肌肉组织中存在较强

的表达，因此可能会干扰对肠道中 LEC-5微弱表

达的观察。

LEC-5 的哺乳动物同源蛋白 Galectin-9 通过

调控脂质筏依赖的顶端膜蛋白分选进而调控上皮

细胞极性［19］

。LEC-5 是秀丽线虫中唯一一个在

N 端带有信号肽的秀丽线虫半乳凝集素蛋白［20］

。

Rao等［21］

通过蛋白质组学方法研究秀丽线虫的脂

质筏组成成分，发现 LEC-5 是脂质筏结合蛋白。

由于脂质筏在上皮细胞顶端膜极性建立过程中调

控顶端膜蛋白和脂质的分选，因此秀丽线虫

LEC-5可能也参与调控顶端分选。为探究LEC-5

是否也具有调控顶端膜蛋白分选的作用，本试验

利用肠道特异性启动子 vha-6p 使 LEC-5 在秀丽

线虫肠上皮细胞中表达，结果发现 LEC-5位于肠

上皮细胞的顶端膜及胞质中的囊泡上。LEC-5的

这一亚细胞定位与其哺乳动物同源蛋白 Galec⁃

tin-9的亚细胞定位相类似，表明LEC-5可能也位

于顶端运输囊泡上调控顶端膜蛋白分选，这为下

一步深入研究LEC-5的功能及其在RAB-11介导

上皮细胞膜极性调控中的作用奠定基础，同时也

能为研究癌症等与上皮细胞极性缺陷有关疾病的

发病机理提供参考。

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图4 LEC-5蛋白在秀丽线虫肠上皮细胞中的亚细胞定位

Fig. 4 Subcellular localization of LEC-5 in C.elegans intestinal epithelial cells

333

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

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（责任编辑：林海涛）

334

吉林农业大学学报 2024，46（2）：335-341 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

银耳五谷粉糊化特性、流变特性及其挤压米品

质*

曹宸瑀，杨嘉丹，刘鸿铖，邹 岩，同政泉，王大为**

吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118

摘 要：根据五谷原料氨基酸评分（EAAI值）得出最佳五谷粉配方，在此基础上研究银耳添加量对银耳五谷粉

糊化特性、流变特性的影响，进而通过挤压膨化技术生产银耳五谷米，研究银耳添加量对米粒蒸煮特性、质构

特性的影响。结果表明：随着银耳添加量的增加，银耳五谷粉的最终黏度升高，凝胶性增强。银耳添加量为

8%~12%时，与糯米粉糊化特性相近。动态流变结果显示，银耳五谷粉的弹性模量和黏性模量随银耳添加量

的增加而增加，当银耳添加量为10%~12%时，银耳五谷粉的回生特性良好。蒸煮试验结果表明，银耳添加量

在8%~10%时，银耳五谷米的吸水率、膨胀率得到明显改善。质构分析表明，银耳添加量为10%时，银耳五谷

米具有更好的黏性和弹性，分别为（146. 12±5. 50） g和（8. 31±0. 40）%。综合考虑，选取银耳添加量为10%，此

时所制备的银耳五谷米黏弹性优良，营养价值高，为进一步开发食用菌糯性产品提供理论基础。

关键词：银耳；五谷；流变特性；糊化特性；挤压技术

中图分类号：S567. 34 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0335-07

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.5112

引用格式：曹宸瑀，杨嘉丹，刘鸿铖，等.银耳五谷粉糊化特性、流变特性及其挤压米品质［J］.吉林农业大学学

报，2024，46（2）：335-341.

Gelatinization Characteristics, Rheological Properties and Extruded

Rice Quality of Tremella-multigrain Flour *

CAO Chenyu，YANG Jiadan，LIU Hongcheng，ZOU Yan，TONG Zhengquan，WANG Da⁃

wei**

College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China

Abstract：Based on the EAAI value (amino acid score) of each grain material, the optimal formula of

the multigrain flour was obtained. On this basis, the effects of the addition of tremella powder on the

gelatinization and rheological properties of the tremella multigrain flour was studied, and then tre⁃

mella multigrain rice was produced with extrusion technology. The effects of tremella powder on the

cooking and texture characteristics of rice grains were investigated. The results showed that with the

increase of the addition of tremella powder, the final viscosity of tremella multigrain flour increased

and the gelation enhanced. When the addition of tremella powder was 8%-12%, the gelatinization

properties of tremella multigrain flour were similar to that of glutinous rice flour. The results of dy⁃

namic rheological results showed that the elastic modulus and viscous modulus of tremella multigrain

flour increased with the increase of tremella powder. When the addition of tremella powder was

* 基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFD0400204）

作者简介：曹宸瑀，男，硕士研究生，研究方向：粮油植物蛋白工程与功能食品。

收稿日期：2019-03-26

** 通信作者：王大为，E-mail：wangdawei@jlau.edu.cn

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

10%-12%, the tremella multigrain flour had good retrogradation characteristics. The results of cook⁃

ing test showed that the water absorption and expansion ratio of tremella multigrain rice were signifi⁃

cantly improved when the addition of tremella powder was 8%-10%. Texture analysis showed that

tremella multigrain rice had better viscosity and elasticity when the addition of tremella powder was

10%, which were (146.12±5.50) g and (8.31±0.40)%, respectively. Considering comprehensively, a

10% addition of tremella powder was selected. At this time, the prepared tremella multigrain rice has

superior viscoelasticity and highnutritional value, which provides a theoretical basis for further devel⁃

opment of edible mushroom products.

Key words：tremella； multigrain； rheological property； gelatinization property； extrusion technology

银耳又名雪耳，主要含有蛋白质、碳水化合物

和多种氨基酸及矿物质等，是一种经济价值高，营

养丰富的药食两用菌［1］

，具有滋补生津、润肺养

胃、抗肿瘤、抗氧化、降低血脂、增强免疫力等功

效［2］

。近年来，其功能特性越来越受到关注。祁

营利［3］

证实银耳多糖具有增稠、乳化等作用，并以

此研制出银耳莲子饮料；杜国军［4］

通过银耳粉与

魔芋粉在碱性条件下加热形成不可逆凝胶的原理，

研制出银耳粉丝；Zhang等［5］

研究了银耳多糖和肌

源纤维蛋白的相互作用，发现银耳多糖在低脂肪

肉制品加工中具有广阔的应用前景。

谷物是人类最基本的食物资源，作为膳食金

字塔的基础，能够提供人类大部分营养素［6］

，多种

谷物混合使用可弥补营养不全面的缺点。本研究

选用银耳和 5 种谷物混合搭配，采用挤压膨化技

术制备银耳五谷米，使其氨基酸组成接近联合国

粮食与农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）提

出的合理膳食标准模式。在此基础上，研究银耳

对五谷粉的糊化特性、流变特性的影响及银耳对

挤压米的蒸煮、质构特性等影响，为食用菌糯性产

品的工业化生产提供理论指导。

1　材料与方法

1. 1　供试材料

银耳、糯米、玉米、荞麦、红豆、薏米均为市售。

1. 2　仪器与设备

JC-60 单螺杆挤压机（长春盛达食品工业研

究所）；高速多功能粉碎机（长春冰都电器有限公

司）；EX-224电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公

司］；101-2E电热鼓风干燥箱（上海实验仪器有限

公司）；TU-1901型紫外-可见分光光度计（北京普

析通用仪器有限公司）；TA.XT plus 质构仪（英国

Stable Micro Systems 公司）；RVA-Tec MasterTM 快

速黏度分析仪（澳大利亚 Perten 公司）；DHR-3流

变仪（美国TA公司）。

1. 3　方法

1. 3. 1 五谷粉配方筛选 各原料粉碎至0.12 mm

（120 目）过筛，以 EAAI 值为评价指标，使其氨基

酸组分接近 FAO/WHO 标准模式，并筛选出最佳

配方。

必需氨基酸指数（EAAI）按下式计算：

EAAI = 100a

A

×

100b

B

×

100c

C

× … ×

100h

H

n

，

式中：a，b，c…h 分别为各粉体蛋白质中的必需氨

基酸，即 EAA；A，B，C…H分别为鸡蛋蛋白质中的

EAA［7］

。

FAO/WHO标准氨基酸含量见表1。

五谷配方设计：为了使银耳五谷米表现出良

好的糯性，除糯米以外其他 4 种谷物总添加量<

40%；提高混合粉的 EAAI 值，并且使五谷粉的氨

基酸组成接近FAO/WHO标准模式。各原料的必

需氨基酸组分见表2。

表1 FAO/WHO标准氨基酸和鸡蛋蛋白质氨基酸含量表

Table 1 Standard amino acids content of FAO/WHO and amino acids content of egg protein g/100g

品种

标准氨基酸

鸡蛋蛋白质

异亮氨酸

0.40

0.54

亮氨酸

0.70

0.86

赖氨酸

0.55

0.70

蛋氨酸+胱氨酸

0.35

0.57

苯丙氨酸+酪氨酸

0.60

0.93

苏氨酸

0.40

0.47

缬氨酸

0.50

0.66

色氨酸

0.10

0.17

336

曹宸瑀，等：银耳五谷粉糊化特性、流变特性及其挤压米品质

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

1. 3. 2 样品的制备 综合以上条件，得出五谷

配方：玉米粉添加量 7%，荞麦粉添加量 9%，红豆

粉添加量11%，薏米粉添加量12%，糯米粉添加量

61%。以五谷粉 100 g 计，按照一定比例（0，4%，

6%，8%，10%，12%）将银耳粉和五谷粉充分混合

均匀，备用，糯米粉作为对照组。

1. 3. 3 糊化特性的测定 准确称取（3.50±0.01） g

样品，样品水分基准为 14%，加入蒸馏水（25.00±

0.01）mL，于 RVA 专用铝盒中混合，试验重复

3 次。具体测试程序：50 ℃保持 1 min，然后以

12 ℃/min的速率升温至 95 ℃（3.75 min），95 ℃保

持 25 min，再 以 12 ℃/min 的 速 率 降 温 至 50 ℃

（3.75 min），50 ℃保持 1 min。测定过程中搅拌器

960 r/min保持10 s，其他时间均保持在160 r/min。

1. 3. 4 流变特性的测定 样品糊的制备：准确

称取（3.50±0.01） g样品，样品水分基准为14%，加

入蒸馏水（25.00±0.01） mL，恒温水浴 75 ℃加热

5 min。

动态流变性能测定：使用流变仪，平板直径为

40 mm，平板间距 1 mm。测试温度为 90 ℃，应变

为 0.5%，频率变化范围为 0.1~20 Hz，测定样品储

能模量（G′）、损耗模量（G″）的变化。

动态时间扫描：取制备好的样品糊，平板直径

为 40 mm，平板间距 1 mm，测试温度为 4 ℃，应变

为 0.5%，频率为 0.5 Hz，测试时间 1.5 h，测定样品

G′，G″的变化。

1. 3. 5 银耳-五谷米的制备 采用 JC-60 单螺

杆挤压机制备银耳五谷米，挤压参数设定：一道挤

出温度 170 ℃，二道挤出温度 140 ℃，切刀转速

800 r/min，水分添加量 26%，待挤压机运行稳定

后，按照设定条件对混合样品进行试验。

1. 3. 6 银耳-五谷米品质测定 （1）米粒蒸煮损

失率测定。称取 10 g样品记为 M0，测定干物质质

量 M2，然后放入 250 mL 沸腾的蒸馏水中，加热

20 min，中途不断补充沸腾蒸馏水，以保证蒸馏水

量为 250 mL，样品煮好后滤去水分，并在常压

105 ℃条件下烘干 4 h，测得干物质质量 M1，计算

耐煮性。重复操作3次，取平均值。

蒸煮损失率 = (M2 - M1 )/M0 × 100%。

（2）米粒吸水率测定。称取 M（1 g）样品置于

烧杯中，加入5倍沸水轻微搅拌，使米粒表面与沸

水充分接触，保鲜膜封 5 min后将样品取出，用滤

纸吸干表面水分，称重M（2 g），计算吸水率，公式：

吸水率 = M2 /M1 × 100%。

（3）米粒膨胀率测定。将一定量的样品做成

米饭 M（g），从中取 50 g放入 100 mL量筒内，注入

50 mL 水后测定体积（V1

），则 50 g 米饭的体积为

V2= V1-50（mL），米饭总体积 V3=V2×（M/50），按照

同样的方法测定原料米的总体积（V0

），则：

膨胀率 = (V3 - V0 )/V0 × 100%。

（4）米粒质构测定。采用质构仪测定不同挤

压米的质构特性。测试条件：P/36 圆柱形探头，

测试前、测试、测试后速度均为1.00 mm/s，触发力

5.0 g，形变量50%。

1. 3. 7 数据处理 试验数据采用Origin 7.5进行

绘图，SPSS 16.0进行统计分析。

表2 各原料的必需氨基酸组分

Table 2 Essential amino acid components of each feedstock g/100g

必需氨基酸

异亮氨酸

亮氨酸

赖氨酸

蛋氨酸+胱氨酸

苯丙氨酸+酪氨酸

苏氨酸

缬氨酸

色氨酸

EAA

EAAI

糯米

0.32

0.63

0.30

0.32

0.79

0.27

0.46

0.13

3.22

63.18

玉米

0.29

0.94

0.24

0.36

0.66

0.25

0.41

0.07

3.22

58.07

荞麦

0.32

0.64

0.57

0.55

0.99

0.30

0.43

0.18

3.98

79.52

薏米

0.51

1.78

0.23

0.35

1.15

0.24

0.78

0.06

5.1

108.13

红豆

0.84

1.53

1.41

0.50

1.62

0.64

0.92

0.17

7.63

141.96

337

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2　结果与分析

2. 1　银耳五谷粉糊化特性分析

糊化特性是淀粉在食品应用中的重要衡量指

标［8］

。由表 3可知，银耳五谷粉的峰值黏度、谷值

黏度、最终黏度、回生值随着银耳添加量的增加呈

递增趋势，银耳的添加对糊化温度的影响不显著。

添加银耳后，银耳五谷粉最终黏度明显增加，且与

糯米粉相比差异不明显，在添加 12% 银耳粉时，

最终黏度相较于五谷粉增加了9.5%，说明在总淀

粉含量减少的情况下，银耳特有的凝胶特性为银

耳五谷粉提供了一定的黏度支撑。崩解值相较于

糯米粉降低了55.9%，说明其热稳定性、抗剪切力

和耐搅拌力明显提高［9］

。回生值是淀粉冷却后的

重新排列，与产品的老化程度有关，回生值越高，

产品越容易老化［10］

。可以看出银耳五谷粉的回

生值比糯米粉略高，可能是银耳五谷粉中蛋白质

及其糊化温度高于糯米粉。陶倩等［11］

研究发现，

原料中蛋白含量、糊化温度越高，糊化之后越容易

老化，这与本研究结果一致。当银耳添加量为

8%~12% 时，银耳五谷粉的糊化特性与糯米粉接

近，表明银耳的添加对银耳五谷粉的糊化特性有

显著影响。

2. 2　银耳五谷粉的动态流变学特性

动态流变学可用来测定不同样品的黏弹性，

对其加工特性和质量控制具有应用价值。储能模

量（G′）代表能量贮存而可恢复的弹性性质，损耗

模量（G″）代表能量消散的黏性性质；tanδ 为 G″与

G′的比值［12］

。

图1为不同频率下银耳五谷粉的动态流变学

图谱。由图1可见，银耳五谷粉的弹性模量（G′）>

黏性模量（G″），且 G′与 G″均随频率增加而上升，

呈现出频率依赖性，表现为典型的弱凝胶动态流

变学图谱［13］

。此外，银耳-五谷粉的 G″，G′明显

高于五谷粉，说明银耳的添加对混合粉体系的黏

弹性有显著影响。当银耳的添加量为 10%~12%

时，银耳五谷粉的 G′，G″高于糯米粉，且频率依

赖性随之降低。G′的增加表明银耳的添加使五

谷粉与银耳体系内部的分子链之间的缠结点

增多，凝胶体系网络结构加强，说明银耳五谷

粉体系形成了一种比纯糯米粉体系更强的三维

网状结构［14-15］

；G″的增加表明银耳多糖的增稠性

质提高了银耳五谷粉体系中连续相的黏弹性，说

明银耳对银耳五谷粉流变学性质起到决定性

作用。

tanδ为 G″与 G′的比值，tanδ越大，表明体系的

黏性比例越大，流动性越强，反之则弹性比较

大［12］

。由图 1 可见，银耳五谷粉的 tanδ 值随银耳

粉添加量的增加而减小，说明随着银耳加入，银耳

五谷粉体系呈现出更强的弹性性质，这可能是由

于随着银耳添加量的增加，在水中溶出的银耳多

糖增加，多糖与淀粉分子间作用力增强，形成多

糖-淀粉凝胶网络结构，银耳五谷粉体系的弹性、

刚性随之增强。

2. 3　银耳五谷混合粉的动态时间流变学性能

图2为1.5 h内银耳五谷粉的动态时间流变学

性能图。淀粉的回生是一种非平衡热可逆的再结

晶过程，分为短期回生和长期回生。在老化过程

中，直链淀粉通过结晶负责凝胶结构的短期回生，

而支链淀粉负责长期重排，是一个相对缓慢长期

的过程［16］

。

表3 银耳添加量对银耳五谷粉糊化特性的影响

Table 3 Effect of addition of tremella powder on gelatinization characteristics of tremalla multigrain flour

样品

五谷粉

4%银耳粉+五谷粉

6%银耳粉+五谷粉

8%银耳粉+五谷粉

10%银耳粉+五谷粉

12%银耳粉+五谷粉

糯米粉

峰值黏度/

（Pa·s)

2 282.00±2.65g

2 338.00±2.65f

2 369.67±4.58e

2 478.67±2.08d

2 547.67±3.51c

2 743.33±3.06b

3 317.33±2.08a

谷值黏度/

（Pa·s)

1 844.67±0.58g

1 874.00±2.65f

1 887.67±3.06e

1 974.67±3.21d

2 029.33±4.04c

2 226.33±4.04a

2 155.33±1.53b

崩解值/

（Pa·s)

521.67±2.31b

514.67±1.53c

511.67±0.58c

511.67±3.06c

514.67±1.16c

514.67±1.17c

1 166.00±0.58a

最终黏度/

（Pa·s)

2 997.67±1.53g

3 116.70±3.21f

3 136.67±2.52e

3 151.67±2.87d

3 246.00±4.36b

3 522.67±2.08a

3 214.00±2.65c

回生值/

（Pa·s)

1 133.67±2.08d

1 144.00±2.00d

1 153.67±1.53d

1 181.33±3.06c

1 222.00±2.65b

1 275.33±6.27a

1 057.00±2.00e

峰值时间/

min

5.66±0.01c

5.88±0.01ab

5.83±0.06b

5.89±0.01a

5.67±0.02c

5.87±0.01ab

3.87±0.00d

糊化温度/

℃

67.67±0.01c

67.70±0.02bc

67.79±0.01a

66.88±0.02d

68.92±0.02d

67.71±0.03b

65.15±0.01e

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）

338

曹宸瑀，等：银耳五谷粉糊化特性、流变特性及其挤压米品质

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

由图 2 可见，随着银耳添加量的增加，G′，G″

呈上升趋势，说明银耳五谷粉体系的弹性、黏性增

加。从回生趋势来看，银耳五谷粉的G′，G″在1.5 h

内始终呈下降趋势，且随银耳添加量的增加其下

降速率变快，表明银耳的添加在一定程度上会影

响淀粉凝胶结构的形成，原因可能是由于银耳多

糖在低温时失去特有黏性，在淀粉糊内部与淀粉

分子间的氢键作用力减弱，并阻碍了淀粉分子间

的网状结构的形成。结果表明，银耳粉的添加量

在 10%~12% 时，银耳五谷粉与糯米粉的 G′，G″相

差较小，证明其回生特性良好。

2. 4　银耳五谷米的蒸煮特性

由表4可知，银耳添加量不同时，对银耳五谷

米的蒸煮特性有显著影响。蒸煮损失率的大小反

图2　银耳粉添加量对银耳五谷粉动态时间流变学性能

的影响

Fig. 2 Effect of addition of tremella powder on dy⁃

namic time rheological properties of tremella

multigrain flour

图1　银耳添加量对银耳五谷粉动态流变学性能的影响

Fig. 1 Effect of addition of tremella powder on dy⁃

namic rheological properties of tremella multi⁃

grain flour

339

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

映了蒸煮过程中米粒因为破碎而溶于水中的

量［17］

。在此方面，银耳五谷米相比于糯米蒸煮损

失率略高，原因可能是银耳五谷米属于挤压膨化

产品，原料在挤出腔内受到高温、高压、高剪切力

的作用而发生裂解，水溶性碳水化合物增加，导致

蒸煮损失率增加［18］

。米粒的吸水率在反映吸水量

多少的同时也反映吸水速率的快慢。米粒吸水率

快，在米饭蒸煮过程中，水分可以迅速地渗入到米

粒中，加快米饭的熟化速度，缩短蒸煮时间［17］

。

银耳五谷米的吸水率和膨胀率随银耳添加量的增

加而升高，且明显高于糯米。原因可能是银耳五

谷米的吸水率主要是由挤出温度和挤出物模口膨

化程度决定的。挤出温度高，物料完全糊化，淀粉

分子间的氢键断裂，形成了空间型气室结构，随

着挤出温度的升高，这种无序结构膨胀的程度越

大，当到达极限时就会塌陷，失去膨化。银耳五谷

米经过 2 次趋于极限的膨化，使淀粉内部空间变

大，进而明显提高了产品的吸水率和膨胀率。综合

考虑，银耳添加量在8%~10%时，米粒的蒸煮损失率

较低，吸水膨胀方面优良，具有良好的蒸煮品质。

2. 5　银耳五谷米的质构特性

国内外用 TPA 对普通米饭食用品质的研究

已经由来已久。Meullenet 等［19］

分析发现，黏性、

硬度、黏着性和咀嚼性可以较好地反映米饭的质

构特征；Sesmat 等［20］

对 TPA 预测米饭质构特性进

行研究，发现利用 TPA 得到的质构参数可以较好

地预测米饭的质地品质。

银耳的多糖含量>60%，其独特的凝胶特性使

银耳五谷米的黏度随着银耳粉的添加而升高。当

银耳添加量为 10%时，内部分子的断裂与重组及

可溶性成分增加，使其形成了立体交织网络结

构，同时持水性和保水性大大增强［21］

。银耳添加

量>10% 后，银耳五谷米的硬度、弹性、咀嚼性降

低，原因可能是溶于淀粉颗粒中的银耳多糖具有

高复水性，使淀粉颗粒胀破，导致煮熟的银耳五谷

米较软烂、塌陷，所以煮熟后的银耳五谷米的硬

度、弹性和咀嚼性有所下降。综上，银耳适宜添加

量为10%（表5）。

表4 银耳五谷米的蒸煮特性

Table 4 Cooking characteristics of tremella multigrain rice %

样品

五谷米

4%银耳粉+五谷粉

6%银耳粉+五谷粉

8%银耳粉+五谷粉

10%银耳粉+五谷粉

12%银耳粉+五谷粉

糯米

蒸煮损失率

6.00±0.15c

5.45±0.15c

5.65±0.20c

5.80±0.10c

7.00±0.50b

9.70±0.45a

3.18±0.30d

吸水率

165.50±4.20d

170.00±8.10d

182.00±4.00c

187.00±5.55c

201.00±8.00b

210.50±8.50a

59.50±3.00e

膨胀率

345.00±2.12c

348.55±2.20c

350.50±7.40c

375.50±9.35b

395.80±5.95a

399.00±3.30a

295.05±3.02d

表5 银耳五谷米的质构特性

Table 5 Texture characteristics of tremella multigrain rice

样品

五谷米

4%银耳粉+五谷粉

6%银耳粉+五谷粉

8%银耳粉+五谷粉

10%银耳粉+五谷粉

12%银耳粉+五谷粉

糯米

硬度/g

132.92±7.11e

155.42±6.92d

159.70±10.38d

177.96±5.54c

202.82±12.36b

160.65±9.99d

233.58±14.04a

黏性（/ g·s）

26.33±3.34g

57.40±4.23f

70.96±2.13e

88.11±4.10d

146.12±5.50c

169.15±3.94a

156.95±6.60b

弹性

4.49±0.21d

7.50±0.14c

7.87±0.21b

7.97±0.11b

8.31±0.40a

8.12±0.59b

7.85±0.18b

咀嚼性/g

709.63±29.79f

973.76±27.55e

977.07±30.33e

1 066.23±23.43d

1 475.52±16.35b

1 233.55±17.92c

1 662.10±39.08a

回复性

13.29±0.34b

11.79±0.20c

11.38±0.22c

10.31±0.24c

12.06±0.56a

12.91±0.44a

8.37±0.29d

340

曹宸瑀，等：银耳五谷粉糊化特性、流变特性及其挤压米品质

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3　结 论

随着银耳添加量的增加，银耳五谷粉糊化特

性、流变特性发生了显著变化，银耳五谷米的蒸煮

特性、质构特性得到改良。其中，银耳添加量为

8%~12% 时，银耳五谷粉的最终黏度高、凝胶性

强，且糊化特性与糯米粉接近。动态流变结果显

示，银耳添加量在 10%~12% 时，银耳五谷粉 G′、

G″增强，回生特性良好。蒸煮试验和质构分析表

明，银耳添加量在8%~10%时，米粒的蒸煮损失率

较低，吸水膨胀方面优良；当银耳添加量为 10%

时，银耳五谷米具有更好的硬度、弹性和咀嚼性。

本研究表明，在五谷粉基础上添加 10% 的银耳，

经挤压技术制作的银耳五谷米，其形态完整，口感

良好，不易老化回生，在保证米粒黏弹性的同时，

赋予了产品更高的营养价值。

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吉林农业大学学报，2002，24（6）：103-106.

（责任编辑：林海涛）

341

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E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（2）：342-348

Journal of Jilin Agricultural University

微波-高压蒸汽复合杀菌对鸡骨泥肝酱品质的

影响及营养分析*

唐 锐，刘学军**，靖玉林，刘 源，刘吉滨，纪 靖

吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118

摘 要：采用微波杀菌、高压蒸汽杀菌及二者复合杀菌，对骨泥肝酱杀菌后的品质影响进行研究。通过对杀

菌后产品的菌落总数、色泽及质构特性进行测定，确定了复合杀菌的最佳杀菌条件。结果表明：800 W微波杀

菌 120 s 后，再经 121 ℃高温杀菌 10 min，杀菌产品的菌落总数为 0。此时产品色差结果为 L 值 39. 16，a 值

9. 93，b 值 20. 27；质构结果为硬度值15. 78 N，黏着性39. 71 N，咀嚼性21. 26 N；理化指标及营养成分测定结果表

明，该产品水分活度为0. 90，pH 6. 88，水分57. 93%，灰分2. 93%，蛋白质8. 76%，脂肪28. 51%，钙246. 38 mg/100g，

产品中含有油酸36. 57%，亚油酸31. 41%，少量的棕榈酸和硬脂酸。

关键词：微波；高压蒸汽；灭菌；骨泥肝酱品质；营养成分

中图分类号：S831；TS295. 3 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0342-07

DOI：10.13327/j.jjlau.2020.4839

引用格式：唐锐，刘学军，靖玉林，等.微波-高压蒸汽复合杀菌对鸡骨泥肝酱品质的影响及营养分析［J］.吉林

农业大学学报，2024，46（2）：342-348.

Effects of Microwave and High Pressure Steam Compound Steriliza⁃

tion on Quality of Chicken Bone Liver Paste and Detection of Its Nu⁃

tritional Composition *

TANG Rui，LIU Xuejun**，JING Yulin，LIU Yuan，LIU Jibin，JI Jing

College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China

Abstract：The purpose of the present study was to investigate the effects of microwave sterilization,

high-pressure steam sterilization and compound sterilization on the quality of bone liver paste. After

sterilization in three ways, the total number of colonies, product color and texture characteristics of

the product were measured, and the optimal sterilization conditions for compound sterilization were

determined. When using 800 W microwave sterilization for 120 s, and then sterilizing at 121 °C for

10 minutes, the total number of colonies of the sterilized product is 0. At this time, the color differ⁃

ence of product was L value 39.16, a value 9.93, b value 20.27; texture results were as follow: hard⁃

ness value 15.78 N, adhesion value 39.71 N, chewiness value 21.26 N. The results of physicochemi⁃

cal indexes and nutritional indicators of the sterilized products showed that the pH was 6.88, the wa⁃

ter activity was 0.90, the moisture content was 57.93%, the ash content was 2.93%, the protein con⁃

tent was 8.76%, the fat content was 28.51%, and the calcium content was 246.38 mg/100g. Mean⁃

while, the product contains oleic acid 36.57%, linoleic acid 31.41%. and a small amount of palmitic

* 基金项目：吉林省科技发展计划项目（20140204010NY）

作者简介：唐锐，男，硕士研究生，研究方向：畜产品加工。

收稿日期：2019-11-18

** 通信作者：刘学军，E-mail：434200788@qq.com

唐锐，等：微波-高压蒸汽复合杀菌对鸡骨泥肝酱品质的影响及营养分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

acid and stearic acid. Through this process, the product achieves the requirements of a good taste

and high nutritional level.

Key words：microwave； high-pressure steam； sterilization； quality of bone liver paste； nutritional

component

鸡骨泥是用新鲜的鸡骨架经处理后，利用骨

泥机进行研磨，使骨泥颗粒<70 μm；此时骨泥口

感细腻，含有人体所需要的蛋白质、脂肪、维生素、

骨胶原和软骨素等营养成分外，还含有丰富的

钙［1］

。鸡肝是我国禽产品加工业的主要副产物之

一，含有丰富的蛋白质、维生素 B 类和铁、锌等多

种矿物质，对营养缺乏人群来说是一种优质的营

养补充剂［2-3］

。

罐头类产品通常采用微波、高压蒸汽等方法

进行杀菌［4］

。微波杀菌是利用微波的热效应和非

热效应在短时间内迅速加热食品，使微生物内部

生理活性物质变性或被破坏，对食品的品质影响

较小，但通常杀菌不完全［5］

。高温蒸汽杀菌不仅

可以杀死真菌、细菌等微生物，还对芽孢、孢子等

具有杀灭效果，但高温杀菌时间较长，对产品色泽

质构的影响较大［6］

。二者复合杀菌可提高产品杀

菌效果，保持产品原有品质，提高杀菌效率［7］

。

本试验以鸡肝和鸡骨泥作为主要原料，经过

前处理、调配等工艺，加工成涂抹型骨泥肝酱罐头

类产品［8］

。通过研究其微波杀菌、高压蒸汽杀菌

及二者复合杀菌对产品的菌落总数、颜色及质构

特性的影响来确定最佳灭菌工艺，并对灭菌后的

产品进行营养成分分析，为鸡骨泥肝酱产品杀菌

提供理论依据。

1　材料与方法

1. 1　材料与试剂

鲜鸡肝、鲜鸡架、鸡脂肪购自吉林省德大生鲜

有限公司。玉米胚芽油购自山东西王食品有限公

司。抗氧化剂、食品添加剂、复合磷酸盐购自河南

恩苗食品有限公司。调味品购自吉盐，杞参，厨之

选等公司。以上产品均为食品级。

氯化钾、碘乙酸、乙醇、乙醚均购自北京化工

厂。琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限责

任公司。以上药品均为分析纯。

高温灭菌袋购自河北省石家庄市喜龙包装有

限公司，长×宽为7 cm×10 cm。

1. 2　仪器

骨泥机（廊坊市惠友机械有限公司），绞肉机

（广东省韶关市大金食品机械厂），高压灭菌锅

（2001R-92，诸城市金鼎食品公司），微波炉（EML530TB，合肥荣事达三洋电器股份有限公司），恒

温培养箱（SHP-250，上海精虹实验设备有限公

司），色差仪（CX2064，美国 Hunter Lab 公司），恒

温水浴锅（HH-4，金坛市科析仪器有限公司），电

热恒温鼓风干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅实

业有限公司医疗设备厂），食品物性仪（TA. XT.

plus，英国 Stable Micro System 公司），脂肪测定仪

（上海纤检仪器有限公司），原子吸收光谱仪（南京

科捷分析仪器有限公司），凯氏定氮仪（上海沛欧

分析仪器有限公司），马弗炉（郑州宏朗仪器设备

有限公司），菌落计数器（柯桥医疗器械厂），GCMS气相色谱质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公

司），pH 计（梅特勒-托利多仪器有限公司），水分

活度仪（瑞士罗卓尼克有限公司）。

1. 3　方法

1. 3. 1 骨泥肝酱的加工工艺 原料的选择及整

理→原料的预处理→称重→匀浆→包装→杀菌。

1. 3. 2 操作要点 原料的选择及整理。选择经

卫生检验合格的鲜鸡肝，清洗，去血管、筋腱和结

缔组织。将鸡肝清洗干净后控干水分备用；选择

经卫生检验合格的鲜鸡骨架，清洗干净，去除脂

肪、筋膜等结缔组织以及残留鸡肉，清洗干净后将

鸡骨架水分控干，置于-25 ℃冷库中冷冻 24 h，

备用［9］

。

原料预处理。鸡骨泥制备：将处理好的鸡骨

架解冻后分割成小块，放入骨泥机中研磨，骨泥颗

粒<70 μm；鸡肝熟制：将处理好的鸡肝放入 80 ℃

水中煮 9 min，V（水）∶m（鸡肝）=1.2∶1；鸡肝泥制

备：将熟制的鸡肝控干水分，放入绞肉机中搅碎；

鸡油糜制备：将洗干净的鸡油，去除鸡皮和杂质，

放入绞肉机中绞碎。

称重。将处理好的鸡肝泥、鸡骨泥、鸡油糜、

玉米油、调味料、冰水等按比例进行称重。

匀浆。将调味料水溶，与鸡骨泥，鸡肝泥，鸡

343

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

油糜等按比例放入料理机中进行匀浆处理，使产

品最终与调味料充分混合，呈黏稠状且具有良好

的涂抹性。

包装。将产品装入高温灭菌袋中，每包产品

净含量为（100±0.5）g，进行抽真空密封处理。

灭菌。将包装好的产品进行杀菌处理。

1. 3. 3 骨泥肝酱的杀菌工艺 骨泥肝酱高压蒸

汽杀菌工艺。将未杀菌的产品，放置于高压蒸汽

杀菌锅中，在 121 ℃ 0.1 MPa条件下，分别进行 5，

10，15，20，25 min杀菌处理。

骨泥肝酱微波杀菌工艺。将未杀菌的产品，

放置于微波炉内，在800 W的功率下分别进行30，

60，90，120，150 s 的杀菌处理，杀菌时间控制在

90 s 条件下分别进行 600，700，800，900，1 000 W

不同功率进行杀菌［10］

。

骨泥肝酱高压蒸汽及微波复合杀菌工艺。将

真空包装好的骨泥肝酱放置于微波炉内，并设置

好相应的微波功率和时间进行杀菌；再将微波杀

菌处理的样品放置于 121 ℃的高压蒸汽杀菌锅

中，进行二次杀菌。

1. 3. 4 菌落总数的测定 按照食品安全国家标

准 GB 4789.2—2016 对杀菌后的样品进行菌落总

数的测定。

1. 3. 5 骨泥肝酱色泽的测定 采用色差仪，对

待测定的样品分别进行90°，180°，270°测定，并记

录每次测定的数值，包括L值，a值，b值。其中，亮

度 L值代表样品偏白（+）或者偏黑（-）的程度，色

度 a 值代表样品偏红（+）或偏绿（-）的程度，色度

b值代表样品偏黄（+）或偏蓝（-）的程度［11］

。

1. 3. 6 骨泥肝酱质构特性的测定 利用质构仪

对肝酱的硬度、黏着性、胶黏性进行测定，采用

P0.5 探头，测试前速度为 200 mm/s，测试速度

1.00 mm/s，测试后速度2 mm/s，距离样品10.00 mm

处，发力为5.0 g，重复试验3次［12］

。

1. 3. 7 骨泥肝酱的水分含量的测定 参照 GB

5009.3—2016，直接干燥法。利用电热恒温鼓风

干燥箱对样品进行烘干，恒重后测定其前后水

分差。

1. 3. 8 骨泥肝酱的灰分含量的测定 参照 GB/

T 5009.4—2016，利用马弗炉对样品的灰分进行

测定。

1. 3. 9 骨泥肝酱脂肪含量测定 参照GB5009.6—

2016，采用索氏抽提法，利用脂肪测定仪对原材料

及产品进行总脂肪含量的测定。

1. 3. 10 骨泥肝酱蛋白质含量测定 参照 GB

5009.5—2016，采用凯氏定氮法，利用凯氏定氮仪

对原材料及产品进行总蛋白质含量的测定。

1. 3. 11 骨泥肝酱钙含量测定 参照GB5009.92

—2016，采用火焰原子吸收光谱法，利用原子吸收

光谱仪对原材料及产品进行钙含量的测定。

1. 3. 12 骨 泥 肝 酱 脂 肪 酸 的 测 定 参 照

GB5009.168—2016，采用GC-MS气相色谱质谱联

用仪对产品油脂中的脂肪酸进行定量及定性

分析。

1. 3. 13 骨 泥 肝 酱 pH 测 定 参 照 GB/T

5009.237—2016，对产品的pH进行测定。

1. 3. 14 骨泥肝酱水分活度测定 参照 GB/T

5009.238—2016，采用水分活度仪扩散法对产品

的水分活度进行测定。

1. 4　正交试验设计

对复合杀菌工艺进行正交优化试验，选取微波

杀菌时间A，微波杀菌功率B和高温121 ℃杀菌时

间C为试验因素，以产品杀菌后的菌落总数为指标。

1. 5　数据处理

试验重复3次，结果用“平均值±标准差”表示，

采用SPPS 17.0统计软件进行方差分析和相关性分

析（P<0.05表示差异显著），采用Duncan法进行多

重比较，利用Origin 8.0及Excel 2016软件制图。

2　结果与分析

2. 1　高压蒸汽杀菌对骨泥肝酱杀菌结果影响

在 121 ℃条件下，杀菌 5，10，15，20，25 min，

的菌落数分别为 3.60×105

，1.70×104

，5.6×103

，0，

0 CFU/g。结果表明，在 121 ℃的高温条件下，随

着杀菌时间的延长，杀菌后产品的菌落总数明显

减少。在121 ℃ 20 min的杀菌条件下菌落总数为

0。超过 20 min后，其菌落总数均为 0。说明杀菌

时间为20 min时产品的杀菌效果最好。

2. 2　高压蒸汽杀菌对骨泥肝酱色泽及质构特性

的影响

在 121 ℃分别杀菌 5，10，15，20，25 min 的产

品，进行颜色 L，a，b 值及硬度，黏着性，咀嚼性测

定，测定结果见表1。

344

唐锐，等：微波-高压蒸汽复合杀菌对鸡骨泥肝酱品质的影响及营养分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

根据产品的色泽和质构测定结果，杀菌时间

在5 min时对产品色泽及质构特性影响不大，但此

时产品的杀菌效果不好，产品中还存在大量的微

生物；随着杀菌时间的延长，产品的亮度明显下

降，颜色加深且产品的黏着性及咀嚼性均明显下

降，硬度变大，当时间>15 min时，对产品的品质造

成严重影响。因此，对肝酱 121 ℃高温杀菌的时

间选取进行调整，选取 5，10，15 min 为后续正交

试验中高温杀菌时间。

2. 3　微波杀菌对骨泥肝酱杀菌结果的影响

2. 3. 1 微波杀菌时间对产品菌落总数的影响 将

未杀菌的产品在微波功率800 W的条件下分别进行

30，60，90，120，150 s处理，菌落数分别为2.82×105

，

3.68×104

，5.62×103

，1.77×103

，3.21×102

CFU/g。结

果表明，在此条件下，随着微波杀菌时间延长，杀

菌后骨泥肝酱的菌落总数明显减少。当杀菌时间

为30 s时，该产品的菌落总数为2.8×105

CFU/g，杀

菌效果较差。>30 s，杀菌效果有所改善，当杀菌时

间为150 s时，产品的菌落总数仍有3.2×102

CFU/g，

原因可能为当杀菌功率为800 W，微波加热时间<

30 s 时，此时杀菌温度<40 ℃，且微波杀菌最终

温度是影响杀菌效果的关键因素，因此对腐败菌

的杀灭效果不明显；随着杀菌时间延长，微波内的

温度逐渐升高，产品经频率 2 450 MHz，功率为

800 W，杀菌时间为150 s处理后，虽可以杀死大部

分腐败菌，但仍有部分耐高温微生物可以存活，不

利于罐头类食品的贮藏［13］

。

2. 3. 2 微波杀菌功率对产品杀菌结果的影响 将

未杀菌的产品在杀菌时间为 90 s 的条件下，分别

在功率为 600，700，800，900，1 000 W 进行灭菌，

菌 落 总 数 分 别 为 2.41×105

，2.85×104

，7.64×103

，

3.89×103

，1.27×102

CFU/g。结果表明，杀菌时间

为90 s时，随着微波功率的增大，菌落总数明显减

少。相对在同一杀菌功率下不同杀菌时间杀菌后

产品的菌落数减少的趋势明显增大。说明微波杀

菌功率的大小对杀菌效果的影响更大，但杀菌后

的产品仍存在少量细菌，为使产品后期有更好的

贮藏特性，将采用微波与高压蒸汽复合杀菌工艺

对产品进行灭菌［14］

。

2. 4　微波杀菌对骨泥肝酱的色泽及质构特性的

影响

2. 4. 1 不同杀菌时间对产品的色泽及质构特性

的影响 将骨泥肝酱的微波杀菌功率恒定在

800 W的条件下分别进行 30，60，90，120，150 s处

理，对杀菌后的产品进行色差L，a，b值及硬度，黏

着性，咀嚼性测定，测定结果表 2。结果表明，随

着时间的延长，在电磁场的作用下，肝酱中的水、

蛋白质、脂肪、碳水化合物等发生了分子极的转

动，产生剧烈运动，造成分子间碰撞和摩擦，从而

使产品内部产生了热量。在加热过程中，水在肝

酱的内部迁移，挥发达到一定程度［15］

。因此，杀

菌后产品的硬度呈现上升趋势并趋于平缓。肝酱

的黏着性与咀嚼性均存在下降趋势，但变化范围很

小，结合感官评价，此时的骨泥肝酱在色泽与口感

上均达到理想状态，综合考虑骨泥肝酱杀菌前后的

产品特性以及菌落总数变化，选取 60，90，120 s 为

后续正交试验中微波杀菌时间的 3个水平值。

2. 4. 2 不同杀菌功率对产品的色泽及质构特性

的影响 将骨泥肝酱的杀菌时间在 90 s 的条件

下，分别进行 600，700，800，900，1 000 W 不同杀

菌功率处理，对杀菌后产品的色差 L，a，b 值及硬

度，黏着性，咀嚼性测定，测定结果见表 3。结果

表1　高压蒸汽杀菌不同杀菌时间对产品色泽及质构特性的影响

Table 1 Effect of different sterilization time on product color and texture characteristics under high-pressure steam

sterilization

杀菌时间/min

0

5

10

15

20

25

L值

48.87±1.01f

44.63±0.94e

40.17±0.83d

36.26±0.22c

33.84±0.52b

29.12±1.10a

a值

7.20±0.54e

8.37±0.43d

8.64±0.61d

9.87±0.43c

10.96±0.31b

12.02±0.73a

b值

23.87±0.66f

18.16±0.43e

16.54±0.52d

13.57±0.62c

12.37±0.71b

11.04±0.34a

硬度/N

13.41±0.66d

14.37±0.50c

15.46±0.51b

16.13±0.98b

19.44±0.77a

20.87±0.68a

黏着性/N

46.43±2.34f

42.24±1.14d

35.16±2.39c

29.94±1.43c

24.32±1.74b

20.44±0.88a

咀嚼性/N

24.34±0.68f

23.21±1.39e

22.21±0.84d

19.62±0.76c

16.54±0.75b

14.21±0.51a

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下表同

345

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

表明，杀菌后肝酱 L值降低，a值升高，b值略微降

低，杀菌后产品的颜色加深，可能原因为肝酱随着

微波杀菌功率的增大，电磁场对产品的作用强度

也越大，分子构象可能出现变化，使产品中的氨基

酸与糖分加快发生美拉德反应，其焦糖化反应也

相比功率较低的其他组反应程度加剧，从而导致

产品的色泽逐渐加深［16］

。随着杀菌功率逐渐增

大，产品的黏着性和咀嚼性逐渐下降，硬度上升，

使得产品品质下降。综合考虑，虽然900，1 000 W

杀菌效果明显，但是杀菌后对产品色泽、质构影响

较大。因此，选取 600，700，800 W 作为后续正交

试验中微波杀菌功率的3个水平值。

2. 5　正交试验结果

试验确定微波杀菌时间，杀菌功率以及高压

杀菌时间的水平值，进行正交试验分析，确定最佳

杀菌工艺，产品经复合杀菌后，菌落总数见表 4。

结果表明，3 个因素对产品杀菌效果的影响次序

为高温 121 ℃杀菌时间（C）>微波杀菌功率（B）>

微波杀菌时间（A）。通过正交试验可知，最优组

合为 A3B3C3，但 A1B3C3 与 A3B3C2 试验组的菌

落总数均为 0，将通过对产品的质构与颜色测定

进行分析，确定试验的最佳组合，测定结果见表5。

结果表明，A3B3C2 比 A1B3C3 和 A3B3C3 的色泽

及质构特性好，即产品的最佳灭菌工艺为经微波

功率为 800 W 杀菌 120 s，再经高温 121 ℃杀菌

10 min。此时产品色泽光亮，颜色近棕红色，软硬

适中，有着良好的口感与涂抹性，水油结合效果

理想。

2. 6　营养指标测定

对灭菌后的产品及原材料进行营养指标测

定，结果见表6。

表2　微波杀菌时间对产品色泽及质构特性的影响

Table 2 Effect of different sterilization time on product color and texture characteristics

杀菌时间/s

0

30

60

90

120

150

L值

48.87±1.01e

48.57±1.21e

47.76±0.06d

46.13±0.71c

45.47±0.43b

42.32±0.51a

a值

7.20±0.54d

7.36±0.24d

7.99±0.57c

8.20±0.21c

9.10±0.79b

10.27±0.04a

b值

23.87±0.66e

23.57±0.76e

22.89±0.98d

21.67±0.24c

20.42±0.15b

18.31±1.26a

硬度/N

13.41±0.66c

13.98±0.32c

14.61±0.71b

15.77±0.21a

15.88±1.06a

16.01±0.88a

黏着性/N

46.43±2.34f

45.13±1.98e

44.32±0.04d

43.17±1.64c

42.42±1.30b

39.06±0.35a

咀嚼性/N

24.34±0.68e

23.64±0.52d

22.58±1.21c

21.36±0.85b

20.95±0.46b

19.36±1.56a

表3　微波杀菌功率对产品色泽及质构特性的影响

Table 3 Effect of different sterilization power on product color and texture characteristics

杀菌功率/W

0

600

700

800

900

1 000

L值

48.87±1.01e

47.57±0.71d

45.85±1.25c

45.03±1.45c

42.54±0.94b

39.72±1.37a

a值

7.20±0.54f

8.46±0.79e

9.93±0.83d

10.38±0.64c

11.74±0.89b

13.82±0.76a

b值

23.87±0.66e

21.69±0.78d

21.09±0.45d

20.71±0.75c

18.92±0.69b

16.74±1.02a

硬度/N

13.41±0.66e

13.91±0.97e

14.62±1.46d

15.88±1.51c

16.46±0.76b

17.91±0.83a

黏着性/N

46.43±2.3e

45.71±1.86d

42.76±1.63c

40.04±2.04b

38.45±0.98a

37.93±1.44a

咀嚼性/N

24.34±0.68f

23.09±1.34e

21.51±0.63d

20.92±0.75c

18.58±1.46b

17.52±1.38a

表4 正交试验结果

Table 4 Orthogonal test results

序号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

K1

K2

K3

k1

k2

k3

极差

A

1

1

1

2

2

2

3

3

3

9.84×103

2.01×103

1.00×103

3.28×103

0.67×103

0.33×103

2.95×103

B

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1.013×104

1.52 ×103

1.20×103

0.338×104

0.51×103

0.40×103

2.98×103

C

1

2

3

2

3

1

3

1

2

1.14×104

1.27×103

1.80×102

0.38×104

0.42×103

0.60×102

3.74×103

菌落总数/

（CFU·g

-1

）

9.3×103

5.4×102

0

7.3×102

8.0×101

1.2×103

1.0×102

9.0×102

0

346

唐锐，等：微波-高压蒸汽复合杀菌对鸡骨泥肝酱品质的影响及营养分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

结果表明，本产品钙含量丰富，是一种良好的

营养补充剂，产品脂肪含量为 28.51%，大量脂肪

让产品具有优质的口感及良好的涂抹性，并且可

以为营养缺乏人群提供能量，但大量饱和脂肪酸

的摄入使食用人群易产生高血脂，高胆固醇病等

风险［17］

，因此，对产品中脂肪酸的组成和含量进

行了测定分析，其中脂肪酸含量>1% 的脂肪酸种

类结果见表7。

结果表明，该产品中脂肪酸含量>1%的有4种，

分别为棕榈酸，硬脂酸，油酸和亚油酸，前 2 种为

饱和脂肪酸，后2种为不饱和脂肪酸，不饱和脂肪

酸的含量>67.98%，其中含量最高的脂肪酸是油

酸，为单不饱和脂肪酸，在人体中自身合成的油酸

不能满足人体需要，多从食物中摄取，油酸对软化

血管、促进体内新陈代谢有良好的作用［18］

，亚油

酸作为 ω-6多不饱和脂肪酸在人体内不能合成，

需要从外界食物中获取，亚油酸能降低血液中的

胆固醇，预防粥样动脉硬化。人体内如果缺乏亚

油酸，胆固醇会与一些饱和脂肪酸结合，在血管壁

上沉积下来，逐步形成堵塞甚至血栓［19］

。

2. 7　产品质量标准

2. 7. 1 感官指标 颜色：色泽光亮颜色近棕红

色；风味：口感细腻香嫩，软硬适中，风味独特；状

态：水油结合效果理想且具有良好的涂抹性。

2. 7. 2 理化指标 水分（57.93±0.38）％；灰分

（2.93±0.19）%；水分活度0.90±0.01；pH为6.88±0.04。

2. 7. 3 微生物指标 菌落总数0；大肠杆菌0；致

病菌为0。

本产品经感官品质、理化指标、微生物含量等

测定，结果表明，该产品为低酸性罐头类食品，且

符合商业无菌标准，口感细腻，风味独特，具有良

好的涂抹性，符合产品质量指标［20］

。

3　讨 论

通过单因素试验可以得到，高温蒸汽杀菌时

间、微波杀菌功率和微波杀菌时间对产品杀菌效

果存在显著影响。通过正交试验，表明高温微波

复合杀菌的最佳杀菌工艺：微波杀菌功率 800 W

杀菌 120 s 后，经 121 ℃高温杀菌 10 min，在此条

件下测得产品的菌落总数为 0；色差结果 L 值

39.16，a 值 9.93，b 值 20.27；质 构 结 果 硬 度 值

15.78 N，黏着性39.71 N，咀嚼性 21.26 N。虽然杀

菌后的产品色泽和质构发生改变，但经复合杀菌

后的产品总体比单因素杀菌所呈现出的结果有

表5　正交试验最优组合结果的颜色及质构特性

Table 5 Color and texture characteristics of the best combination result of orthogonal test

序号

未杀菌

A3B3C2

A1B3C3

A3B3C3

L值

48.87±1.01d

39.16±0.32c

36.47±0.24b

33.17±0.22a

a值

7.02±0.54d

9.93±0.29c

10.04±0.75c

11.27±0.23a

b值

23.87±0.66d

20.27±0.26c

17.86±0.36c

14.27±0.12a

硬度/N

13.41±0.66d

15.78±0.37c

16.72±0.57c

18.94±0.53a

黏着性/N

-46.43±2.34d

39.71±0.14c

35.62±1.21c

-32.91±0.14a

咀嚼性/N

24.34±0.68d

21.26±1.28c

20.04±0.67c

18.95±0.28a

表6　骨泥肝酱及原材料营养指标测定结果

Table 6 Determination results of nutritional indicators of bone paste and raw materials

项目

原材料鸡肝

原材料鸡骨架

骨泥肝酱

水分/%

70.81±0.63b

70.21±0.22b

57.93±0.38a

灰分/%

1.24±0.19c

5.74±0.11b

2.93±0.19a

蛋白质/%

19.13±0.83c

14.89±0.12b

8.76±0.12a

脂肪/%

7.72±0.21b

7.87±0.29b

28.51±0.43a

w（钙）（/ mg·100g

-1

）

6.80±0.40c

1 198.00±42.19b

246.38±3.56a

表7 骨泥肝酱的脂肪酸构成

Table 7 Fatty acid composition of bone paste

出峰时间/min

10.07

13.37

13.82

14.72

学名

十六碳酸甲酯

十八碳酸甲酯

顺9-十八碳-烯酸甲酯

顺，顺-9,12-十八碳二烯酸甲酯

名称

棕榈酸

硬脂酸

油酸

亚油酸

质量分数/%

18.57±0.57

2.97±0.02

36.57±1.43

31.41±2.21

种类

饱和脂肪酸

饱和脂肪酸

单不饱和脂肪酸

ω-6多不饱和脂肪酸

347

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

很大改善，且无杂菌。杀菌后的骨泥肝酱色泽

光亮，颜色近棕红色，口感细腻，具有良好的风

味与口感。对灭菌后的肝酱营养成分及理化指

标进行检测，检测结果：水分57.93%，灰分2.93%，

蛋白质 8.76%，脂肪 28.51%，钙 246.38 mg/100g，

水分活度 0.90，pH 6.88，且产品中含有大量不饱

和脂肪酸，如油酸，亚油酸等，该类不饱和脂肪酸

对人体软化血管及提高新陈代谢有显著作用。

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（责任编辑：林海涛）

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