广西师范大学学报(自然科学版)2022年第2期

发布时间:2022-10-16 | 杂志分类:其他
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广西师范大学学报(自然科学版)2022年第2期

http:∥xuebao.gxnu.edu.cn[4] SUN Y G, MAYERS B T, XIA Y N. Template-engaged replacement reaction: a one-step approach to the large-scalesynthesis of metal nanostructures with hollow interiors[J]. Nano Letters, 2002, 2(5): 481-485.[5] LIU G L, FENG D Q, ZHENG W J, et al. An anti-galvanic replacement reaction of DNA templated silver nanoclustersmonitored by the light-scattering technique[J]. Chemical Communications, 2013, 49: 7941-7943.[6] BI Y P, YE J H. Heteroepitaxial growth of platinum nanocrys... [收起]
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广西师范大学学报(自然科学版)2022年第2期
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http:∥xuebao.gxnu.edu.cn

[4] SUN Y G, MAYERS B T, XIA Y N. Template-engaged replacement reaction: a one-step approach to the large-scale

synthesis of metal nanostructures with hollow interiors[J]. Nano Letters, 2002, 2(5): 481-485.

[5] LIU G L, FENG D Q, ZHENG W J, et al. An anti-galvanic replacement reaction of DNA templated silver nanoclusters

monitored by the light-scattering technique[J]. Chemical Communications, 2013, 49: 7941-7943.

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fluorescent probe: fluorescence turn-on

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147

第152页

广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

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and Fe

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Biomolecular Spectroscopy, 2021, 251: 119433-119438.

A New Strategy for the Determination of Trace Mercury by Resonance Rayleigh

Scattering Method Based on Nano-gold Catalytic Amplification and

Galvanic Replacement Reaction-phosphomolybdic Acid

LIU Qiwen

1,2

, LI Dan

1,2

,HUANG Xiaofang

1,2

, LIANG Aihui

1,2∗

, JIANG Zhiliang

1,2∗

(1. Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection (Guangxi Normal University),

Ministry of Education, Guilin Guangxi 541006, China; 2. Guangxi Key Laboratory of Environmental

Pollution Control Theory and Technology (Guangxi Normal University), Guilin Guangxi 541006, China)

Abstract: Phosphomolybdic acid particles have a resonance Rayleigh scattering (RRS) effect, which produces a

RRS peak at 450 nm. In the HCOOH-HCOONa buffer solution at pH = 3.1, gold nanoparticles (AuNPs) can

catalyze the reaction of phosphomolybdic acid-formic acid to produce phosphomolybdenum blue, making the RRS

intensity of phosphomolybdic acid linearly decrease at 450 nm. Hg

2+

can undergo a galvanic replacement reaction

with AuNPs, thereby inhibiting the catalytic effect of AuNPs. In the range of 2.5×10

-4 -3.5 μmol / L, as the

concentration of Hg

2+

increases, the catalytic effect of AuNPs gradually weakens, the color of the reaction

solution gradually changed from blue to colorless, and the resonance Rayleigh scattering peak of the system at

450 nm increases linearly. The regression equation is ΔI = 0.32C+46.1, and the detection limit is 0.18 nmol / L.

This method is used for the detection of Hg

2+

in wastewater, and the results are satisfactory.

Keywords: mercury; nano-gold catalytic; galvanic replacement; phosphorus molybdenum blue; resonance

Rayleigh scattering

(责任编辑 王龙杰)

148

第153页

第 40 卷 第 2 期

2022 年 3 月

广西师范大学学报(自然科学版)

Journal of Guangxi Normal University (Natural Science Edition)

Vol. 40 No. 2

Mar. 2022

DOI: 10.16088 / j.issn.1001-6600.2021021501 http: xuebao.gxnu.edu.cn

袁冬梅,齐跃明,黄光明,等. 基于水库调蓄和地灾协同控制的地下水资源高效利用研究[ J]. 广西师范大学学报(自然科学版), 2022, 40

(2): 149-157. YUAN D M, QI Y M, HUANG G M, et al. Efficient utilization of groundwater resources based on reservoir regulation and coordinated

control of geological disasters[J]. Journal of Guangxi Normal University (Natural Science Edition), 2022, 40(2): 149-157.

基于水库调蓄和地灾协同控制的地下水

资源高效利用研究

袁冬梅1,2

, 齐跃明1∗

, 黄光明3

, 王俊萍1

, 马仪鹏1

(1. 中国矿业大学 资源与地球科学学院, 江苏 徐州 221116; 2. 浙江省环境科技有限公司

嘉兴分公司, 浙江 嘉兴 314000; 3. 福建省煤田地质勘察院, 福建 福州 350005)

摘 要: 为高效利用福建永安-大湖盆地地下水资源, 运用现场调查、 资料分析、 数值模拟及水文分析等方法, 分析了

盆地水资源调蓄能力及开采时可能引起的环境地质问题。 考虑水库调蓄和环境地质问题协同控制约束, 圈划出了面积约

为 37.38 km

2 的适宜开采区, 计算出该区可利用库容为 1.362×10

7 m

3

, 可调蓄库容为 8.03×10

6 m

3

。 在此基础上, 运用数

值模拟和水文分析方法计算得出可开采资源量分别为 40 619.45 和 36 957.48 m

3

/ d。 提出采用分区开采、 分质供水、 雨洪

资源化、 节约用水 4 种途径提高永安-大湖盆地地下水资源利用率, 实现水资源综合配置平衡, 控制环境地质灾害。 本研

究为当地水资源高效利用提供依据, 又为同类地区水资源利用提供借鉴意义。

关键词: 地下水; 水库调蓄; 控灾开采; 可开采资源量; 高效利用

中图分类号: P641;X523 文献标志码: A 文章编号: 1001-6600(2022)02-0149-09

地下水是水资源的重要组成部分,是农业灌溉、工矿和城市用水的重要水源之一[1-2]

。 岩溶地区由于

生态环境脆弱、防污性能差,以往掠夺式开采的水资源开发利用方式往往会带来许多环境问题,无法满足

现代社会经济和生态环境的协调健康发展。 因而,岩溶地下水资源开发要从单目标的水库调度逐渐过渡

到多目标的地表水与地下水联合调度,从单纯追求经济效益到社会、经济和生态的综合效益[3-5]

。 利用地

下水库调蓄水资源,可以通过对含水层有计划地补给与回采,实现水资源的可持续利用,并有效改善生态

环境[6-11]

根据现场调查及以往资料[12-14]

,福建永安-大湖盆地受地层、构造控制,为一个相对独立的开放式岩溶

地下水库。 区内地下水开采源以碳酸盐岩类裂隙溶洞水为主,且地下水动态主要受降雨因素影响,具有明

显的季节性变化特征。 在岩溶地区地貌特点及其工程意义方面,前人做了较多的研究。 赵举兴[15]

、黄光

明等[16-17]依托福建三明城市地质调查项目,运用现场调查、微动探测等方法对永安-大湖盆地岩溶地貌特

征、双向演化过程及工程地质意义进行了研究;赵天石[8] 在地下水库调蓄问题的探讨中对环保型水资源

开发提出了前景;王从荣等[18]在地下水库研究的现状和展望中指出,地下水库的环境效益评价及地下水

库水质的污染防护是近几年地下水库研究的重要内容;肖飞鹏等[19]对漓江青狮潭水库提出了具体的生态

补偿方式和手段。 在地下水资源利用方面,陈洪元等[20]

、顾尚义等[21] 以贵州岩溶地下水库为背景,从岩

溶地质概况、成库条件、库容分析、降雨补给及工程效益方面,阐述利用雨水资源在岩溶山区进行地下水库

兴建运行的设想及可行性;齐跃明等[22]针对淄博农业、生活供水短缺,提出在抽水试验基础上,利用补偿

疏干法对岩溶地下水资源量进行评价。 在区域水资源规划利用方面,李世君等[23]结合水文地质条件和调

蓄条件,论述了北京利用地下水库调蓄功能建立应急水源地的必要性和可行性,对应急水源地的选址依据

收稿日期: 2021-02-15 修回日期: 2021-03-22

基金项目: 国家自然科学基金(41741020); 中国矿业大学未来杰出人才助力计划项目(2020WLJCRCZL003); 江苏

省研究生科研与实践创新计划(SJCX20_0814)

通信作者: 齐跃明(1977—), 男, 湖南长沙人, 中国矿业大学副教授, 博士。 E-mail: ym_qi@126.com

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广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

和规划建设进行了初步探讨;王浩等[24]从内在机制、实践进程和评价 3 方面系统评述了狭义流域水资源

合理配置研究进展;刘倞[25]针对我国地下水利用现状提出具体的地下水资源合理开发利用措施。

然而,现有研究中,既考虑地下水库调蓄能力,又考虑控制地下水开采所引起的环境地质问题的水资

源综合利用研究甚少,特别对于福建永安-大湖地区,类似的研究还未见报道。 显然,对于岩溶地区,如果

不考虑地下水库调蓄能力与环境地质问题协同控制的综合约束,就无法科学合理地评价地下水可开采资

源量,将导致区内水资源补采不平衡,甚至出现岩溶地面塌陷问题。

本文在区域水文地质调查的基础上,通过科学测算,基于水库调蓄和地灾协同控制综合约束,提出科

学控灾开采条件下的地表水-地下水联合调蓄方法进行水资源的高效利用。 通过分区控制性开采规避岩

溶塌陷,分质供水、雨洪资源化缓解水资源污染,市场调节、改进工艺、中水利用等节水手段实现水资源综

合配置平衡,抑制区域环境水文地质灾害,实现水资源的高效利用。 同时,研究也为解决福建三明永安地

区在地表水污染等紧急情况下的应急供水问题,保护区域地下水环境、保障供水安全提供科学决策依据,

为三明市整体社会经济可持续发展提供水资源基础保障。

1 研究区概况

永安-大湖盆地所处区域为福建省三明市重点开发建设区域,经济较发达,是新材料、竹产业、纺织等

产业基地,主要包括永安市城区及其附近的大湖镇和曹远镇,位于 117°17′ ~ 117°24′E、25°54′ ~ 26°05′N,

北起大湖镇岭岗村,南止洛溪村,东起益口,西止虾蛤,总面积 71.14 km

2

。 研究区属中亚热带季风气候,受

大陆性和海洋性季风的影响,形成气候温暖、潮湿、降水充沛、四季分明的特点。 多年平均温度 19.07 ℃ ,

多年平均降水量 1 683.9 mm,多年平均蒸发量 1 333.0 mm,降雨量大于蒸发量,为地下水提供了较丰富的

补给源。 中部和南部属河谷地貌,北部属低山丘陵地貌及岩溶地貌,地势中间低,南、北两侧高。 沙溪是研

究区内最大的地表径流,属雨水补给型河流,从中部贯穿全区,河水自西向东流,研究区南部的巴溪属沙溪

支流,河水自南向北汇入沙溪。

2 水文地质条件

永安-大湖盆地岩溶地下水成北西向展布,长条形,四面环山,巴溪-沙溪河贯穿南北,为一裸露-覆盖埋藏型为主的岩溶盆地。 其东西分水岭为地下水流动系统外围边界,南部一段为断层隔水边界,一段为河

流边界,北部为给定水头边界,基底为变质岩,区域内溶洞发育,在垂直方向上多呈层状分布,整体可看成

一个相对独立的开放式岩溶地下水库。

根据《福建省区域地质志》(2016 版)及现场调查,永安地区地层发育较全(表 1),地层自老至新有泥

盆系桃子坑组(D3

tz)、石炭系林地组(C1

l)、二叠系船山组(P1

c)、二叠系栖霞组(P2 q)、二叠系文笔山组

(P2w)、二叠系童子岩组(P2

t)、二叠系翠屏山组(P3

cp)、侏罗系长林组(J3

c)、侏罗系南园组(J3 n)、侏罗系

坂头组(J3 b)、白垩系沙县组(K2

s)、白垩系赤石群(K2

ch)、第四系(Q)。 区内无侵入岩体分布,地质构造

复杂,断裂纵横交错,主要分布有 3 条近平行的断裂,断裂走向北西-南东向,倾向北东,高倾角,区内延伸

长度 7~8 km,切割地层主要有二叠系童子岩组、文笔山组、栖霞组和石炭系林地组地层。

研究区地下水有松散岩类孔隙水、碎屑岩类孔隙裂隙水、基岩裂隙水、碳酸盐类裂隙岩溶水 4 种类型,

但前 3 种在研究区富水性贫乏,供水意义不大(图 1)。 后一种含水岩组主要包括二叠系船山组和二叠系

栖霞组灰岩等,根据出露条件又可分为裸露型、覆盖型和埋藏型 3 种类型。

裸露型碳酸盐岩类裂隙溶洞水主要分布于永安盆地的大湖-坑边一带,地貌形态多为孤峰或残丘,发

育有溶洞、溶沟、溶槽、石林、岩壁、漏斗等。 地下水赋存于裂隙溶洞中,以大气降水垂直入渗为主,临区基

岩裂隙水以侧向补给为辅,径流较短促,并以泉的形式就近排泄。 泉流量较大,多为 1 ~ 10 L / s,富水性丰

富-中等。

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表 1 地层一览表

Tab. 1 Stratigraphic chart

地层名称 符号 厚度/ m 岩性 分布范围

第四系冲洪积层

Q

ap1

h 5~ 60 上部粘土、粉质粘土,下部砂、砾 永安盆地一级阶地、河床

Q

ap1

p3 3~ 20 泥质砾卵石、含砾粘土、砂质粘土 永安盆地二级阶地

Q

ap1

p2 3~ 10 泥质砾卵石、泥质粗砂砾石、粘土 永安盆地二、三级阶地

白垩系赤石群 K2

ch 1 107 砾岩、砂砾岩、砂岩、粉砂岩 永安盆地城东

白垩系沙县 K2

s 1 181 粉砂岩、泥岩夹砂砾岩 永安盆地城南、城北

侏罗系坂头组 J3 b 688 流纹质晶屑凝灰岩、粉砂质泥岩、页岩 永安盆地东北侧

侏罗系南园组 J3 n 184~ 2 450 流纹质晶屑凝灰岩、凝灰熔岩 永安盆地中部

侏罗系长林组 J3

c 111~ 1 034 长石石英砂岩、凝灰岩、泥质粉砂岩 永安盆地北侧

二叠系翠屏山组 P3

cp 147~ 328 细粒石英砂岩、铁质泥岩、粉砂岩 陈大、前曹源一带

二疊系童子岩组 P2

t 555~ 8 172 炭质泥岩、炭泥质粗砂岩、硅质岩

二叠系文笔山组 P2w 71~ 310 粉砂质页岩、泥质页岩、泥质粉砂岩、硅质岩

永安盆地中部

永安盆地中部

二叠系栖霞组 P2 q 70~ 175 含燧石条带灰岩 永安盆地西北侧

二叠系船山组 P1

c 15~ 380 层状质纯灰岩夹白云质灰岩 岩前及大湖一带

石炭系林地组 C1

l 5~ 449 石英砂岩、砂砾岩 后底及大湖一带

泥盆系桃子坑组 D3

tz 759 灰白色石英砂砾岩、石英砾岩、砂岩 永安盆地西北侧

注:本图底图由福建省煤田地质局根据野外地质调查成果及钻孔资料绘制

图 1 研究区水文地质

Fig. 1 Hydrogeological map of the study area

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覆盖型碳酸盐岩类裂隙溶洞水分布于大湖、坑边、大源、增田等溶蚀洼地,隐伏于第四系地层之下,埋

深约 10 m。 岩溶发育,尤其与上部盖层接触界面最为强烈,溶洞高 1~3 m 居多,大多充填少量粘土、砂、碎

石等。 由于分布地形低缓,受裸露区岩溶水或其他基岩裂隙水的直接侧向补给和盖层孔隙水的垂向补给,

富水性丰富,单井涌水量一般大于 1 000 m

3

/ d。

埋藏型碳酸盐岩类裂隙溶洞水主要分布于益溪、东坡、埔岭、吉山甲等地,地下水赋存于裂隙溶洞中,

富水性丰富,具有较大的供水意义。

有地下水资源开发意义的地下水径流深度约 200 m。 根据勘探结果,研究区岩溶富水性可分为丰富

和中等 2 个片区。 西北部裸露区:石洞寒泉及湖峰-永安水泥厂一带为中等富水区,平均单井涌水量

505.38 m

3

/ d;其余为水量丰富区,地下水位埋深 1.02~19.98 m,平均单井涌水量 4 758.0 m

3

/ d。 埋藏区:大

致以虾蛤-城关为界,北部为浅埋水量丰富区,水位埋深 8.12~51.30 m,平均单井涌水量 3 158.86 m

3

/ d;南

部为深埋水量中等区,水位埋深 28.46~150.30 m,平均单井涌水量为 509.44 m

3

/ d。

地下水从周围丘陵低山区向盆地中央河谷区流动。 在同一水文地质单元中,径流方向大致为裸露区

→覆盖区→埋藏区,在适宜的地形或构造条件下以泉的形式排泄于地表。 规划区水文地质结构可看成上

覆松散岩类孔隙水,下伏碳酸盐岩岩溶裂隙水的双层含水层。 潜水位之上的上层孔隙水和部分岩溶发育

区域构成地表入渗的包气带,潜水位以下的构成地下水流动的饱和带,从而形成降雨-入渗-岩溶地下径流河流排泄(或人工开采)的地下水流动系统盆地水循环模式。

3 盆地水资源调蓄

由于北侧大湖盆地石灰岩裸露,防污性能弱,且易发生地面塌陷等环境地质灾害,故在考虑水资源利

用时,经过区域现场调查、地下水流动条件及环境问题分析,排除环境地质灾害易发区域而合理圈定适宜

开发利用的区域,平面面积为 37.38 km

2

,如图 2 所示。

图 2 盆地水资源调蓄范围

Fig. 2 Range of the basin water resources regulation and storage

152

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=! !*

S =!!F

G !!F

DL!F

RL\"B#=4

PK!=4F

P

R

G D S

图 3 地下水-地表水联合调度模型

Fig. 3 Groundwater-surface water joint

operation model

地下水和地表水联合运行是根据地下水和地表水的动态

特征,利用含水层空间的调蓄能力进行的。 永安-大湖盆地内

部残留十几座溶蚀残丘、孤峰,把盆地分割成相对独立的几个

溶蚀洼地,洼地局部发育为岩溶塌陷漏斗地形。 地下岩溶形

态主要有溶洞、埋藏石林和地下岩溶管道,局部发育有地下暗

河。 区内地表水资源相对丰富,地表水和地下水水力联系紧

密,具备地表水和地下水联合调蓄条件,且地下水库有较大的

可调蓄库容。 鉴于此,研究区水资源管理中可采用地下水-地

表水联合调蓄模型(图 3),充分利用地下水储存量和侧向径

流量部分,枯水期除正常开采外,还可通过应急开采,为城市供水。 在特殊条件下(如地表水污染等),还

可扩大开采,以弥补原来由地表水供水的份额,从而为城乡供水提供水资源保障。 地下水库合理开采后,

腾出地下储存空间,便于丰水季节接受降水或地表径流的有效回补,实现盆地水资源合理高效调蓄的

功能。

为便于计算,按地下水类型,在图 2 中进行富水性分区。 根据全区钻孔资料(表 2)各项水文地质参数

情况,重新规划的适宜开采区处于分区Ⅱ中。 按照开采区面积 37.38 km

2 与分区Ⅱ面积 47.79 km

2 比例得

到该岩溶区地下水库的有效库容为 1.362×10

7 m

3

,通过地下水位变化幅度、含水层分布面积及其给水度确

定可调蓄库容约为 8.03×10

6 m

3

。 应用 Visual Modflow 软件对圈定的适宜开采区进行数值模拟得到可开采

资源量为 40 619.45 m

3

/ d,年可开采资源量1.482 61×10

7 m

3

。 模拟区基本对应坑边、虾蛤、清水池计算区,

经水文分析方法计算可知,地下水可开采资源量 36 957.48 m

3

/ d(表 3),年度可开采资源量 1.348 95×10

7

m

3

。 综合考虑有效库容及调蓄库容,为安全保险起见,最终可开采量取相对小的水文分析结果,即

1.348 95×10

7 m

3

/ a。

表 2 研究区水文地质参数

Tab. 2 Regional hydrogeological parameters

分区 区域位置

区域面积

/ km

2

水位降

深1

/ m

疏干给水

率 μd

从含水层顶板起算的压

力水头高 H/ m

枯水期 丰水期

腾空库容2

/ m

3

调节水量3

/ m

3

Ⅰ 岭干 1.15 2.29 0.050 14.88 20.87 1.317×10

5

3.445×10

5

Ⅱ 大湖、坑边、虾蛤 49.79 10.93 0.033 28.17 34.61 1.814×10

7

1.069×10

7

Ⅲ 益口 1.73 6.57 0.050 12.20 15.20 5.683×10

5

2.595×10

5

Ⅳ 东坡 18.57 39.68 0.007 393.81 396.81 5.158×10

6

3.900×10

5

合计 71.24 2.400×10

7

1.168×10

7

1. 利用迭加原理计算水位降深值;2.腾空库容计算公式为∑μd FM,其中 M 为含水层平均厚度(m);3.调节水量计算公式为∑μd FΔH。

表 3 适宜开采区地下水可开采资源量

Tab. 3 Safety yield of groundwater in the suitable mining area

计算区

断面宽度 影响半径 涌水量 Q孔 地下水资源量 Q

1 已开采资源量

B/ m R/ m / (m

3·d

-1

) (m

3·d

-1

) (m

3·a

-1

) / (m

3·a

-1

)

坑边 2 200 120.95 1 296.00 11 786.69 4.302 2×10

6

2.285 4×10

6

虾蛤 1 500 521.59 14 440.90 20 764.73 7.579 1×10

6

清水池 800 149.87 1 650.84 4 406.06 1.608 2×10

6

2.018 5×10

6

合计 36 957.48 1.348 95×10

7

4.303 9×10

6

1.Q=BQ孔 / 2R+ ∑ Q泉 。

153

第158页

广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

由于永安-大湖地区以往存在的岩溶塌陷现象以及地下水污染问题,虾蛤地区水位最大允许降深为

10.91 m,超过此值,河水会倒灌污染地下水,其他地区水位降深不能超过既定井结构吸水管下置的最大深

度,据以往资料表明不超过 39.68 m。 据数值模拟结果,现有开采量不会对环境造成危害。 根据《城市居

民生活用水量标准》(GB / T 50331—2002),永安市地域分区为三,城市居民基本生活用水量标准为 120 ~

180 L / (人·d),釆用人均日用水量方法进行预测,可应急 30 万左右城市居民日需基本生活用水。 同时还

可通过人工回灌、雨洪资源化等方法增大地下水的可开采资源量,从而有力地保障当地社会经济环境的可

持续发展。

4 控灾科学开采

地下水资源的高效开采,不仅要考虑地下水资源量和调蓄空间的大小,还要考虑拟开采区环境地质灾

害的影响。 对于永安-大湖盆地而言,研究区部分地区地下水受到污染,地表防污性能弱,易发生地面塌陷

或已经存在岩溶塌陷等环境地质灾害。 为达到供水和环境的最佳效益,对永安-大湖盆地地下水资源进行

合理规划,提出集中科学开采方法,以实现水资源的协同高效开采。

4.1 分区开采

岩溶塌陷一般指岩溶地区土层的塌陷、基岩的塌陷和上覆土层同下伏基岩一起坍塌的统称。 岩溶地

面塌陷多在裸露型和第四系覆盖型岩溶区,但当覆盖层包含基岩和碳酸盐岩埋藏深度大于 15 m 时,岩溶

地面塌陷甚少发生。 据此,在碳酸盐岩埋藏深度大于 15 m 的地区,加大中深层含水层的开采量,避免浅层

含水层直接受扰动,从而避免岩溶地面塌陷等环境地质灾害,从而实现水资源的合理分区开采。

4.1.1 集中开釆区

把清水池-虾蛤、坑边地带定为集中开采区。 该地区大部分为埋藏型岩溶含水层,顶板厚度大,稳固性

好,不易产生地面塌陷等不良地质现象,地质环境好。 此外,岩溶裂隙较发育,水量丰富,单井出水量大于

500 m

3

/ d,可作中小型水源地,利于集中开采。

4.1.2 控制开釆区

把岭干、大湖地带定为控制开采区。 该区主要为覆盖型岩溶含水层分布区,较易产生岩溶塌陷,岩溶

区“通天”溶洞发育,富水性强,连通性好,岩性结构松散,粘结性和穏定性差。 在大量抽取地下水或者其

它人类活动的影响下,破坏了含水层的水力平衡和覆盖层岩性结构,局部已经产生岩溶塌陷。 上覆的松散

岩类孔隙水含水层易遭受生活垃圾、污水及施用化肥等污染,浅层地下水中的微生物及三氮含量较高。 因

此,在该区开采时要控制地下水开采量和下降速度,防止突然涌水,建立地面塌陷监测网,必要时可采取工

程手段,进行塌洞回填、局部灌浆等,同时开采时应防止上层水进入水井中造成污染。

4.1.3 分散开采区

大湖、坑边等地局部分布有泉水,可作为分散开采区,生活在该区的居民,生活用水可以引用泉水,有

条件的地段也可以打井抽取地下水。

4.2 分质供水

总体来说,永安-大湖盆地地下水水质较好,虽然局部地段水质变差,造成水质不好的原因主要在于

铁、锰、氟、氨氮等严重超标,铁、锰严重超标与地层形成的水文地质化学环境有关,氨氮、亚硝酸盐氮、高锰

酸盐指数等超标与人类活动有关,即地表水污染是主要原因之一。 因此,建议采用“分质供水”管理手段,

将Ⅱ类优质水源作为城市供水的水源,将Ⅲ、Ⅳ类水源提供工业用水、农业灌溉和城市绿化及消防用水,促

进水资源的高效利用。

154

第159页

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4.3 雨洪资源化

永安-大湖盆地年降水量丰富,呈季节变化,夏季降水丰富,冬季降水较少。 因而,可大力发展集雨工

程或人工蓄水塘,加大对地表径流的拦截,增加地表径流或蓄水塘以对流域地下水进行补给,增加地下水

储存资源,减少雨洪灾害和水污染。 开展雨水利用工作,收集的雨水可用于小区浇洒绿化、生活杂用水等。

4.4 节约用水

居民生活用水可通过合理调整水价、推广节水器具和设备实现节约用水。 工业节水可通过强化节水

技术、开发节水设备、调整产品结构、改进生产工艺达到节约用水。 农业节水可通过提高旱季农作物灌概

效率,进行限水灌溉、局部灌溉、控制性根系交替灌溉技术实现节水。 此外,还可进行污水再生利用、中水

回用、城市污水集中处理回用等,实现经济效益和环境效益双丰收。

5 讨论

水资源是经济社会发展的战略资源和经济资源,水资源对于经济社会发展起到重要作用。 永安-大湖

盆地水质较好,地下水资源丰富,因而是良好的地下水应急水源地。 利用地下水库对水资源进行调蓄,可

以调节河流的流量,控制地下水位,丰蓄枯采,最大限度利用水资源,通过优化水库调度还可以提高水库的

抗洪能力,兼顾防洪和兴利,维护社会安定,具有极大的社会环境效益。 地下水水位的控制有利于农作物

和植被的生长,可以防止水土流失、减少地下水污染现象,保持生态平衡。 合理规划、分区控灾科学开采,

可减少每年因岩溶塌陷现象而产生的 1 000~2 000 万元工程治理费用,除此之外,还可向工业企业和自来

水公司提供水资源,带来一定的经济效益。 根据三明市人民政府 2017 年公布的永安地区民用水价为1.4

元/ m

3

,参考往年开采量及地下水库调蓄量 8.03×10

6 m

3

/ a 计,每年可产生经济效益约 1 124.2 万元,大大

加快城市发展的进程。

本文以福建永安-大湖盆地为研究对象,对该地区作为应急水源地的可开采资源量进行计算,以解决

该地区因特殊干旱年、地表水受极端事件(如严重污染)影响等特殊条件下的应急供水水源问题。 数值模

拟法计算结果略大于水文分析法的原因在于区域划分时,数值模拟范围包括了计算区外的少量沙溪河南

部东坡区域。 2018 年度,适宜区开采量为 4.303 6×10

6 m

3

/ a,占可开采资源量的 31.90%。 据现有资料显

示,各水源地无超采现象,降落漏斗基本稳定,地下水尚有开釆潜力。

若日常生产、生活长期使用地下水资源是否适用未得到验证。 对于其他北方干旱岩溶地区是否可用

相同优化方法进行优化未做深入对比研究。

由于详细资料缺乏以及作者水平有限,在运用 Visual Modflow 软件的时候对边界水头、地下水补给来

源处理时做了简化处理,将沙溪河视为定水头边界处理,怱略了基岩裂隙水对地下水的补给,对计算结果

可能有一定的影响。

6 结论

本文研究了福建永安-大湖盆地地下水资源协同调度和高效利用,结论为:

1)永安-大湖盆地区域内溶洞发育,在垂直方向上多呈层状分布,地下水动态主要受降雨因素影响,具

有明显的季节性变化特征,可利用盆地内部溶洞联合地表径流对地下水进行储存调蓄,动态调节区域内地

下水位,同时改善地下水质。

2)研究区存在地下水污染、水土流失、岩溶塌陷等环境地质问题,为规避这些问题,将永安-大湖盆地

进行重新科学圈划适宜开采区。 工程地质调查结果表明,全区可利用库容为 2.400×10

7 m

3

,适宜开采区可

155

第160页

广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

利用库容为 1.362×10

7 m

3

;全区可调蓄水量为 1.168×10

7 m

3

,适宜开采区可调蓄水量为 8.03×10

6 m

3

。 数值

模拟计算得到适宜开采区可开采资源量约为 40 619.45 m

3

/ d,而水文分析方法的结果为 36 957.48 m

3

/ d,

两者基本一致。

3)据现场调查,分析已存在及潜在的环境地质问题,根据评价的岩溶地下水资源量和水质特征提出

了分区开采、分质供水、雨洪资源化、节约用水 4 种水资源高效利用方案,以最大化地实现社会经济及生态

环境的协调健康发展。

参 考 文 献

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Efficient Utilization of Groundwater Resources Based on Reservoir

Regulation and Coordinated Control of Geological Disasters

YUAN Dongmei

1,2

, QI Yueming

1∗

, HUANG Guangming

3

, WANG Junping

1

, MA Yipeng

1

(1. School of Resources and Geosciences, China University of Mining and Technology, Xuzhou Jiangsu 221116, China;

2. Zhejiang Environmental Technology Co., Ltd. Jiaxing Branch, Jiaxing Jiangsu 314000, China;

3. Fujian Exploration Institute of Coalfield Geology, Fuzhou Fujian 350005, China)

Abstract: In order to efficiently utilize the groundwater resources in the Yong ' an-Dahu Basin, Fujian, the

methods of field investigation, data analysis, numerical simulation and hydrological analysis were used to analyze

the basin's water storage capacity and possible environmental geological problems under exploitation conditions.

Considering the constraints of reservoir regulation and coordinated control of environmental and geological issues,

a suitable exploitation area was delineated with an area of about 37.38 km

2

. The available storage capacity of this

area was calculated to be 1.362×10

7 m

3

, and the adjustable storage capacity was 8.03×10

6 m

3

. On this basis,

numerical simulation and hydrological analysis methods were used to calculate that the allowable exploitation

quantity were 40 619.45 m

3

/ d and 36 957.48 m

3

/ d, respectively. Four ways (zoned mining, dual water supply,

rainwater resource utilization, and water saving) were proposed to improve the utilization rate of groundwater

resources realize the balance of comprehensive allocation of water resources, and control environmental geological

disasters in Yong'an-Dahu Basin. The research will provide a basis for the efficient use of local water resources,

and a reference for water resources exploitation in similar areas.

Keywords: groundwater; reservoir regulation and storage; groundwater exploitation with disaster control;

allowable exploitation quantity; efficient utilization

(责任编辑 王龙杰)

157

第162页

第 40 卷 第 2 期

2022 年 3 月

广西师范大学学报(自然科学版)

Journal of Guangxi Normal University (Natural Science Edition)

Vol. 40 No. 2

Mar. 2022

DOI: 10.16088 / j.issn.1001-6600.2021032201 http: xuebao.gxnu.edu.cn

任文文, 孙云泽, 李蓉. 裂解多糖单加氧酶纳米花固定化研究[J]. 广西师范大学学报(自然科学版), 2022, 40(2): 158-169. REN W W,

SUN Y Z, LI R. Study on lytic polysaccharide monooxygenase nanoflower for immobilization [ J]. Journal of Guangxi Normal University ( Natural

Science Edition), 2022, 40(2): 158-169.

裂解多糖单加氧酶纳米花固定化研究

任文文, 孙云泽, 李 蓉∗

(大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116000)

摘 要: 本文利用新型无机晶体复合物磷酸铜作为载体, 对裂解多糖单加氧酶 cx-LPMO-B 进行固定化, 研究其固定化过

程的最适条件, 并对游离酶及固定化酶的酶学性质进行对比。 结果显示: 在搅拌条件下, 向含有裂解多糖单加氧酶 pH =

7.4 0.01 mol / L 的磷酸盐缓冲溶液中滴加硫酸铜, 可形成酶-磷酸铜纳米花, 即 cx-LPMO-B-NF; 在 25 ℃ 、 14 h、 酶含量

为 0.3 g / L 条件下制备得到的 cx-LPMO-B-NF 活性最高, 固定化酶重复使用 6 次后仍能保持 60%以上的酶活; 扫描电子显

微镜(SEM)及透射电子显微镜(TEM)发现 cx-LPMO-B-NF 结构呈现分散均匀且单一的盛开花朵状; 固定化酶最适反应

pH= 4.0, 最适反应温度 50 ℃ 。 固定化酶重复使用性显著增强, 花状结构增加了其表面积, 更加有利于对游离酶的固定

化, 反应条件较温和使其具有较高的工业化应用前景。

关键词: 固定化; 纳米花; 裂解多糖单加氧酶; 酶学性质; 无机晶体复合物

中图分类号: Q814.2 文献标志码: A 文章编号: 1001-6600(2022)02-0158-12

伴随着经济的高速发展,人们对能源的需求也在逐渐增加,可再生资源的利用成为目前研究热点。 木

质纤维素作为全球第一大可再生资源,对其进行高效的降解转化应用一直受到广泛的关注[1-2]

。 裂解多

糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)是一类新发现的铜离子依赖性的氧化酶,可以通

过氧化作用切断结晶纤维素链的糖苷键,在多糖链中产生一个新的断裂点,使纤维素酶降解纤维素效率提

高[3-6]

。 因此,利用 LPMO 协同纤维素酶高效降解纤维素在绿色能源工业上具有重要应用前景,但由于游

离酶进行催化反应存在着不稳定、难以重复利用等问题,限制了酶在工业生产中的应用。 为了将酶制剂应

用于工业化生产中,人们将酶固定于不溶于水的载体上,以克服游离酶在应用时所存在的缺陷。

一般情况下,根据酶与载体之间的相互作用,将酶的固定化从大方向上分为 2 种方法:物理法和化学

法。 其中物理法中最常见的是包埋法和吸附法,而化学法中最常见的是共价偶联法和交联法[7-10]

。 包埋

法将酶包裹在不溶性的载体中,其适用于大多数酶的固定化,但当底物与产物分子量较大时不适用[11-13]

;

吸附法是一种将载体与酶表面的次级键相连接从而实现固定化的方法,该方法具有条件温和、操作简单等

优点,但在高盐浓度、高底物浓度和高温下存在易解吸的缺点[14-16]

;共价偶联法将酶的非必需侧链基团和

载体功能基团通过共价键连接在一起,具有良好的稳定性,但在共价偶联处理载体时所用的试剂容易使酶

变性;交联法将载体与蛋白质通过化学键结合起来形成具有一定结构的高分子,通常为网状,虽然应用相

对广泛,但酶在交联过程中与交联剂是通过化学键连接的,因此酶的三级结构容易被破坏,交联过程中易

使酶失活[17]

。 因此,在对酶的固定化条件进行选择时需要考虑操作情况、造价以及是否会破坏酶活和稳

定性等方面。

随着对固定化技术的不断研究,一种以酶作为有机部分、金属磷酸盐作为无机部分形成“有机-无机”

杂化纳米花的固定化方法逐渐得到人们的关注[18-20]

。 Yin 等[21] 对 α-糜蛋白酶使用磷酸钙作为载体进行

收稿日期: 2021-03-22 修回日期: 2021-04-30

基金项目: 国家自然科学基金(31600640); 辽宁省教育厅科学研究项目(J2019015)

通信作者: 李蓉(1987—), 女, 浙江奉化人, 大连工业大学讲师, 博士。 E-mail: ryong_li@126.com

第163页

http:∥xuebao.gxnu.edu.cn

固定化,对形成的固定化酶活性进行计算,结果显示酶活性提高了 266%;Ge 等[22]首次在较温和的条件下

使用磷酸铜作为载体骨架,将漆酶作为该骨架上的有机组分,合成了纳米级晶体,即有机-无机杂化纳米花

状粒子,并发现该结构下的漆酶纳米花酶与游离酶相比活性提高了约 650%。 He 等[23]同样使用磷酸铜作

为无机部分,辣根过氧化物酶作为有机部分成功制备了 HRP-Cu3(PO4 )2 杂化纳米花。

本文以 Cu3(PO4 )2 作为载体骨架,裂解多糖单加氧酶 cx-LPMO-B 作为该骨架上的有机组分制备裂解

多糖单加氧酶-磷酸铜杂化纳米花(cx-LPMO-B-NF)。 通过优化试验条件得到最适固定化条件,并对制备

的固定化酶酶学性质进行表征鉴定。 实验结果表明本文所制备的固定化酶呈纳米级花状结构且具有较好

重复性。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

MD spectramax paradigm 酶标仪(美谷分子仪器(上海) 有限公司);JSM 6460 扫描电子显微镜、JEM

2100 透射电子显微镜(日本电子株式会社);摇床(伊孚森生物技术有限责任公司);DF-101S 集热式恒温

加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)。

1.2 实验材料与试剂

裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)来源于大连工业大学微生物资源与催

化实验室的纤维素降解菌 Arthrobotrys sp. CX1,重组表达菌株 pPICZαA-cx-LPMO-B 为实验室前期构建保

藏菌。

醋酸铵、硫酸铵、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、葡萄糖、3,5-二硝基水

杨酸、甘油均购自天津科密欧化学试剂有限责任公司;蛋白胨、酵母浸粉、无氮源酵母浸粉、牛血清蛋白

(BSA)、SDS、EDTA、咪唑、β-巯基乙醇等购自生工生物工程(上海)有限公司;五水硫酸铜购自百灵威科技

有限公司。 以上试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 cx-LPMO-B 的表达纯化

重组表达菌 pPICZαA-cx-LPMO-B 接种到 YPD 培养基中培养,将种子液按 1 ∶ 50 的比例扩培到 BMGY

培养基培养 12 h,转菌到 200 mL 大体系的培养基中继续培养 72 h,期间每隔 24 h 加体积比 1.5%的甲醇至

培养基中,最后收取上清。 使用 Ni 柱对其进行纯化,得到纯化的目的蛋白 cx-LPMO-B 用于固定化研究。

2.2 cx-LPMO-B 酶活的测定

cx-LPMO-B 酶活定义:以质量分数 1%的 PASC(磷酸溶胀纤维素)为底物,1 h 内转化生成 1 μmol 还

原糖所需的酶量定义为 1 U。

反应体系:以 200 μL 的 1% PASC 作为底物,与 200 μL 酶液反应,加入 6 μL 100 mmol / L 的 Vc 提供

反应所需要电子,补充加入 194 μL 醋酸铵缓冲溶液,得到总量为 600 μL 的反应体系,50 ℃ 下水浴 24 h,

使用 DNS 法测定产生的还原糖量,根据产生的还原糖量计算酶活及相对酶活。

2.3 cx-LPMO-B-NF 的制备

2.3.1 制备 cx-LPMO-B-NF 的最适条件

对制备 cx-LPMO-B-NF 最适条件即室温下搅拌和静置条件进行研究。 在 2 mL 浓度为 0.01 mol / L 的

PBS(pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液)中加入 0.3 g / L 400 μL cx-LPMO-B,再向溶液中缓慢滴加 500 μL 浓度为

120 mmol / L 的 CuSO4·5H2O,补充加入 1 100 μL 超纯水至总体积为 4 mL。 室温下静置、搅拌,每组做 3

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个平行实验。 每隔 2 h 取一次样,至 16 h 结束,离心取上清检测酶含量,计算酶固定率。

固定率的计算方法为

η =

(C2

-C1 )

C2

式中:η 为固定率;C1 为测得上清酶含量;C2 为原始酶含量。

2.3.2 制备 cx-LPMO-B-NF 的最适酶浓度

酶的添加量对纳米花的形状以及大小有着重要的影响,而金属离子无机载体负载量又是一定的,因此

酶的添加对纳米花的形成起着重要作用。 本文酶以 0.2、0.3、0.4、0.5 g / L 的添加量加入到固定化体系中,

测定其剩余酶浓度,确定最适酶浓度,每组做 3 个平行实验。

2.3.3 制备 cx-LPMO-B-NF 的最适温度

对制备 cx-LPMO-B-NF 最适温度进行研究。 在体系为 2 mL 浓度为 0.01 mol / L 的 PBS(pH 为 7.4 的磷

酸盐缓冲溶液)中加入 0.3 g / L 400 μL cx-LPMO-B,再向溶液中缓慢滴加 500 μL 浓度为 120 mmol / L 的

CuSO4·5H2O,补充加入 1 100 μL 超纯水至总体积为 4 mL,每组做 3 个平行实验。 分别在 4、16 和 25 ℃

搅拌反应,搅拌过程中分别在上述固定化条件下每隔 2 h 取一次样,直至 16 h 结束,离心取上清检测酶含

量计算酶固定率。

2.3.4 制备 cx-LPMO-B-NF 的最适 pH

对制备 cx-LPMO-B-NF 的最适 pH 进行研究。 调固定化所用的磷酸盐缓冲液的 pH 分别为 6.0、7.4、

8.0、9.0,对 cx-LPMO-B-NF 进行固定化,离心取上清检测酶含量计算酶固定率。 每组做 3 个平行实验。

2.4 纳米花形态表征

2.4.1 SEM

处理硅片:将硅片切割成约 1 cm×1 cm,在无水乙醇中超声处理 20 min 除去硅片上的杂质,取出后用

超纯水冲洗 3 次,滴加无水乙醇,室温干燥后即可使用。

处理样品:将经过液氮冷冻干燥后得到的纳米花颗粒使用少量无水乙醇润湿,缓慢滴加到硅片上,待

无水乙醇完全挥发后,将硅片用导电胶黏到载物台上。

2.4.2 TEM

样品处理方法与 SEM 基本相同。 将样品经过无水乙醇浸润后滴加到铜网膜上,使用透射电子显微镜

进行观察,当找到某一片样品位置后,将该位置进行放大,观察其细微结构。

2.5 cx-LPMO-B-NF 的酶学性质

2.5.1 cx-LPMO-B-NF 的最适温度

以 200 μL 1% PASC 作为底物,加入 200 μL cx-LPMO-B-NF(使用游离酶做对照组,相同体系),加入

6 μL浓度为 100 mmol / L Vc 提供反应所需要电子,最后补充 194 μL 浓度为 50 mmol / L 的醋酸铵缓冲溶

液,得到体积为 600 μL 的反应体系,于 30、40、50、60、70 ℃ 水浴反应 24 h,每组做 3 个平行实验。 使用

DNS 法测定产生的还原糖量,测定 OD540 ,根据产生的还原糖量计算酶活以及相对酶活。

2.5.2 cx-LPMO-B-NF 的最适 pH

以 200 μL 1% PASC 作为底物,加入 200 μL cx-LPMO-B-NF(使用游离酶做对照组,相同体系)、加入

6 μL浓度为 100 mmol / L Vc 提供反应所需要电子,加入 pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的 50 mmol / L 醋酸

铵缓冲溶液 194 μL,得到不同 pH 总体积均为 600 μL 的反应体系,50 ℃水浴反应 24 h,每组做 3 个平行实

验。 使用 DNS 法测定产生的还原糖量,测定 OD540 ,根据产生的还原糖量计算酶活以及相对酶活。

2.5.3 cx-LPMO-B-NF 的储存稳定性

将 cx-LPMO-B-NF 保存于磷酸盐缓冲溶液中,放置于 4 ℃冰箱,每 3 d 测定一次酶活直至 15 d,每组做

3 个平行实验。

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2.5.4 cx-LPMO-B-NF 的循环使用次数

以 200 μL 的 1% PASC 作为底物,加入 200 μL cx-LPMO-B-NF,加入 6 μL 100 mmol / L Vc 提供反应所

需要电子,最后补充加入 194 μL 醋酸铵缓冲溶液,得到总体积为 600 μL 的反应体系,50 ℃ 水浴反应 24

h,测定的酶活为 100%。 回收固定化酶并洗涤 3 次,重复反应 6 次,测定每次固定化酶的残余酶活力。 每

组做 3 个平行实验。

3 结果与分析

3.1 cx-LPMO-B 的表达纯化

通过对重组表达菌株 pPICZαA-cx-LPMO-B 进行表达,得到含有酶的发酵液,根据基因 cxLPMOB 片段

大小推测酶的相对分子质量理论值为 33 kDa,由于蛋白表达翻译后修饰的原因,酶实际相对分子质量变

大,如图 1 通过 Ni 柱纯化的方法对酶进行纯化,根据电泳结果确定酶相对分子质量大小约为 54 kDa。 后

续实验均采用此方法得到纯化后的酶。

1. cx-LPMO-B 粗酶液原液;2. 过 Ni 柱穿出液;3. Binding 平衡柱子;

4. Ni 柱纯化后酶液-1;5. Ni 柱纯化后酶液-2;M. Maker

图 1 纯化结果

Fig. 1 Purification results

3.2 cx-LPMO-B-NF 的制备条件

3.2.1 制备 cx-LPMO-B-NF 的最适条件

将纳米花的制备条件设为静止与搅拌 2 种(在搅拌条件下进行取样,因过程较剧烈,取样过程中会存

在微量误差),计算过程中将最高固定率设为 100%。 如图 2,在静止条件下 2 h 时固定化率约为 90%,随

着时间的延长固定化率逐渐降低,在 9 h 左右固定化率降低至约 30%。 分析认为是由于静止条件下滴入

Cu

2+时 cx-LPMO-B-NF 迅速产生,或者酶吸附于快速形成的结构上,而有机-无机纳米花的形成一般分为 3

步:首先是核的形成;其次是花的生长;最后是花的完成[17]

。 静止条件下由于纳米花快速形成,致使形成

过程中其结构和致密度不够,随着酶的堆积,形成的不太稳定的片段结构脱落,从而使固定化率降低。 搅

拌条件下 2 h 时固定化率约为 65%,随着时间的延长固定化率逐渐升高,在 16 h 左右固定化率升至约

95%。 分析认为当滴加 Cu

2+时,由于搅拌的原因使反应体系混合均匀,虽然前期酶固定化率低,但形成的

纳米化结构均匀致密,随着搅拌时间的延长,满足了形成纳米花的 3 个步骤,从而酶的固定化率逐渐升高,

在 16 h 时固定化率达到最高 95%左右。 综合时间成本考虑,将实验的条件选为搅拌 14 h 进行固定化。

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图 2 制备 Cu3(PO4 )2 纳米花的最适条件

Fig. 2 Optimal conditions for preparing Cu3(PO4 )2 nanoflowers

3.2.2 制备 cx-LPMO-B-NF 的最适酶浓度

酶的浓度对所形成的纳米花有着重要的影响。 如图 3 所示,当添加酶浓度为 0.3 g / L 进行固定化反应

时,固定上的酶浓度约为 0.19 g / L,约占总酶浓度的 66.7%,当添加酶浓度分别为 0.4、0.5 g / L 时,固定上的

酶浓度分别约为 0.17、0.16 g / L,随着酶添加量增多,固载量有微量下降。 因此,合适的酶浓度对固定化过

程十分重要,本文选取酶浓度为 0.3 g / L 对其进行固定化。

图 3 制备 Cu3(PO4 )2 纳米花的最适酶浓度

Fig. 3 Optimal protein concentration for preparing Cu3(PO4 )2 nanoflowers

3.2.3 制备 cx-LPMO-B-NF 的最适温度和最佳反应时间

制备 cx-LPMO-B-NF 的固定化率随温度的变化如图 4,由图可见,在 25 ℃固定化率最高。 图 5 为制备

Cu

2+纳米花时固定化率随时间和温度变化图,取最适反应时间 14 h 为截止点,可以看出不同温度下随着

制备时间的延长固定化率呈现逐渐上升的趋势,在 25 ℃时固定化率达到最高。 通过与 25 ℃ 不添加 Cu

2+

对照,发现在不添加 Cu

2+的情况下酶基本维持不变,进一步说明酶是通过形成的 Cu

2+纳米花被固定的。

分析认为在温度较低的情况下,cx-LPMO-B 与 Cu3(PO4 )2 结合缓慢,进而成花缓慢,且温度较低的情况下

纳米花的粘合度不够,形成散落的片状,不能很好地进行组装,从而使酶在其上的吸附量降低。 因此选取

25 ℃为最佳固定化温度。

3.2.4 制备 cx-LPMO-B-NF 的最适 pH

对固定化过程中磷酸盐缓冲溶液的最适 pH 进行考察,如图 6 所示,发现在磷酸盐缓冲溶液 pH 为 7.4

时固定化率达到最高 35%,而在 pH 分别为 6.0、8.0、9.0 时固定化率均达不到 25%,这与 He 等[23] 的结果

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一致。 因此在固定化过程中,选择磷酸盐缓冲溶液最适 pH 为 7.4 进行固定化反应。

图 4 制备 Cu3(PO4 )2 纳米花的最适反应温度

Fig. 4 Optimum temperature for preparing Cu3(PO4 )2 nanoflowers

图 5 制备 Cu3(PO4 )2 纳米花不同温度下最适反应时间

Fig. 5 Optimum time for preparing Cu3(PO4 )2 nanoflowers at different temperatures

图 6 制备 Cu3(PO4 )2 纳米花最适 pH

Fig. 6 Optimum pH for preparing Cu3(PO4 )2 nanoflowers

3.3 最适条件制备的 cx-LPMO-B-NF 酶活的测定

根据前面实验得到的最适反应条件制备得到 cx-LPMO-B-NF,测定其酶活,最高可达 28.266 U/ mg。

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图 7 为固定化酶与游离酶的酶活,由图可见,两者基本相同,但固定化酶由于具有稳定性好、可重复使用等

优点,在工业生产中更加具有优势。

图 7 游离酶和固定化酶酶活比较

Fig. 7 Comparison of enzyme activities

3.4 纳米花形态表征

通过 SEM 对最适反应条件制得的 cx-LPMO-B-NF 结构进行表征,如图 8 所示,Cu

2+纳米花颗粒大小均

匀,分散性好,形状呈盛开状,花瓣分散状态较好,该结构可增加酶固定化的表面积,进而提高酶的固载量,

同时花瓣状的结构可以将酶更好地包裹,使酶不受外界因素的干扰,提高酶的稳定性[24]

。 利用 cx-LPMOB-NF 作用底物时可增大酶与底物的接触面积,从而促进反应的进行。

图 8 SEM 表征纳米花结构

Fig. 8 SEM characterization of nanoflower structure

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如图 9 所示,通过 TEM 分析制备得到的 cx-LPMO-B-NF,结果发现“花瓣”状结构不是紧密连接在一起

的,中间存在许多缝隙,可以使其更好地与酶进行结合,提高酶与底物的结合面积,进一步提高酶的催化

活性。

图 9 TEM 表征纳米花结构

Fig. 9 TEM characterization of nanoflower structure

3.5 cx-LPMO-B-NF 的酶学性质

3.5.1 cx-LPMO-B-NF 的最适温度

固定化技术一般可以增大酶的最适温度范围。 如图 10 所示,游离酶的最适温度为 60~70 ℃ ,其在 40

℃时相对酶活仅为 65%;固定化酶最适温度为 50 ~ 60 ℃ ,其在 40 ℃ 时相对酶活仍达到 85%,表明磷酸铜

杂化纳米花固定化能增大 cx-LPMO-B 酶的最适温度范围。 但由于纳米材料不耐高温,当温度过高时,固

定化酶的酶活会快速降低,如在 70 ℃时相对酶活迅速降低至 55%左右。

图 10 cx-LPMO-B-NF 的最适温度

Fig. 10 Optimum temperature for cx-LPMO-B-NF to act on the substrate

3.5.2 cx-LPMO-B-NF 的最适 pH

cx-LPMO-B-NF 在不同 pH 时的酶活如图 11 所示,固定化酶较游离酶的 pH 稳定性窄一些,在 pH 为

4.0时达到最高酶活,随后迅速降低,在 pH 为 7.0 时固定化酶相对酶活降至 65%左右。 说明 pH 对纳米花

的影响较大。

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广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

图 11 cx-LPMO-B-NF 的最适 pH

Fig. 11 Optimum pH for cx-LPMO-B-NF to act on the substrate

3.5.3 cx-LPMO-B-NF 的储存稳定性

如图 12 所示,游离酶在放置 6 d 后只保留 50%左右的酶活,9 d 后则酶失活。 而固定化酶 cx-LPMOB-NF 随着储存时间的延长酶活有微量增加,可能是由于无机晶体磷酸铜纳米花在 4 ℃ 条件下,长时间储

存时有少量固定的 cx-LPMO-B 酶分子从载体上脱落,造成酶活有所提高。 相比较游离酶,cx-LPMO-B-NF

具有较好的储存稳定性,储存 15 d 后仍表现出较高的酶活,这是由于纳米花多孔结构保护了酶分子,使其

在储藏过程中不易发生结构的改变,从而提高了酶的稳定性。

图 12 cx-LPMO-B-NF 储存稳定性

Fig. 12 cx-LPMO-B-NF storage stability

3.5.4 cx-LPMO-B-NF 的循环使用次数

如图 13 所示,随着循环次数的增加酶活逐渐降低。 第 1 次使用时,酶活为 100%;第 2 次重复使用后

酶活迅速降低,约为 75%;而之后的重复使用过程中酶活虽然一直降低,但降低速度比较缓慢。 分析认

为,在重复使用过程中,由于需要反复冲洗使部分固定不牢固的酶脱落,首次使用后的脱落情况最为严重,

但剩余纳米花上的酶较稳定,因此经过 6 次循环利用后相对酶活仍然可达到 60%左右,具有较高的工业应

用潜力。

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图 13 cx-LPMO-B-NF 的循环使用次数

Fig. 13 Number of cycles of cx-LPMO-B-NF

4 讨论

自 2021 年 LPMO 被发现以来,研究人员一直围绕着开发新来源酶以及研究其协同降解纤维素的作用

机制进行研究,但目前很少有针对 LPMO 固定化的报道。 本文首次利用金属离子在盐溶液中配位沉淀一

步制得酶无机杂化纳米花的方法,将 LPMO 固定于无机载体 Cu3(PO4 )2 上形成杂化纳米花固定化酶,从

而解决酶的重复利用率低、难以回收等问题,使该酶制剂应用于工业生产中成为可能。 同时该方法制备过

程简单易操作、绿色环保且耗能低,更有利于在工业中生产固定化酶[25]

利用纳米花状粒子作为载体固定酶分子,其比表面积大,有利于吸附更多酶分子,并可提高其固定化

酶的酶活,同时花瓣状结构对固定上的酶有很好的保护,提高固定化酶的稳定性及重复利用性。 本文研究

中固定化酶量随着酶浓度增加而增加,但当饱和后固定化酶量则会有少量的下降。 酶浓度对无机杂化纳

米花固定化过程十分重要,Wang 等[26]研究发现加入不同淀粉酶量,对固定化酶纳米花生成形态有影响,

酶浓度为 0.2 g / L 时,固定化酶呈现纳米花状,但当酶浓度为 2 g / L 时,固定化酶的形态则呈平行六面体

状;王宏[27]对二鸟苷酸环化酶进行固定化研究发现,当固定酶量未达到载体的饱和量时,固定化酶量随着

酶量的增加而增加,但是当酶量达到载体的饱和量时,结合位点饱和,继续增加酶量会导致酶与载体亲和

力下降,影响酶与载体的有效结合。 朱衡等[28] 使用羧基载体 LX-1000IDA 对脂肪酶进行固定化,在重复

催化 4 次后剩余 50%左右的酶活。 彭开敏等[29]以猪肝酯酶作为有机部分,以磷酸钙作为固定化载体进行

固定化,所得固定化酶重复使用 6 次后其活性仅为 10%左右,重复利用性大大低于本文制备的固定化酶。

由此可见,“有机-无机”杂化纳米花的固定化方法可作为一种绿色易操作的固定化方法进行酶的工业固

定化,同时通过此固定化方法固定 LPMO,可提高其重复利用性,为 LPMO 在工业生产中的应用提供更多

的可能性。

5 结论

本实验通过向含有裂解多糖单加氧酶 cx-LPMO-B 的磷酸盐缓冲溶液中滴加金属离子制备得到杂化

cx-LPMO-B-金属纳米花固定化酶。 最佳制备条件为:pH 7.4 的磷酸缓冲液、25 ℃ 、搅拌反应 14 h、蛋白酶

添加量为 0.3 g / L,所制备的裂解多糖单加氧酶 cx-LPMO-B-NF 活性最高。 对纳米花进行 SEM 扫描电子显

微镜以及 TEM 透射电子显微镜观察发现,纳米花结构为盛开的花朵状,花朵之间留有缝隙,并非紧密地包

裹在一起,为酶的固定化留有空间。 固定化酶最适反应 pH 为 4.0,最佳反应温度为 50 ℃ 。 cx-LPMO-B-NF

具有一定的储存稳定性,但较长时间储存过程中存在酶轻微脱落的现象,原因有待进一步研究。 在经过 6

次重复利用后相对酶活仍可达到 60%左右,因此在进一步提高重复利用性以及储存稳定性后,其在工业

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广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

应用上具有巨大潜力。

参 考 文 献

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Study on Lytic Polysaccharide Monooxygenase Nanoflower for Immobilization

REN Wenwen, SUN Yunze, LI Rong

(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian Liaoning 116000, China)

Abstract: In this paper, a novel inorganic crystal complex copper phosphate was used as a carrier to immobilize

the lytic polysaccharide monooxygenase (cx-LPMO-B), the optimal conditions for immobilization of cx-LPMO-B

was investigated, and the enzymatic properties were compared with the free and immobilization of cx-LPMO-B.

The results showed that, copper sulfate was added to the pH = 7.4 and 0.01 mol / L phosphate buffer solution

containing the cx-LPMO-B to form immobilized cx-LPMO-B-copper phosphate nanoflowers, namely cx-LPMO-BNF. The cx-LPMO-B-NF reached the highest immobilized yield at 25 ℃ for 14 h with the 0.3 g / L cx-LPMO-B.

The immobilized cx-LPMO-B-NF retained a residual activity of approximately 60% after 6 cycles reaction. The

nano structure of the immobilized cx-LPMO-B-NF was characterized with scanning electron microscope ( SEM)

and transmission electron microscope ( TEM). It was performed that the immobilized cx-LPMO-B-NF was

uniformly dispersed and single blooming flower shape. The optimal pH and temperature for immobilized cxLPMO-B-NF were pH = 4. 0 and 50 ℃ , respectively. The nano flower structure increased surface area of

immobilized carrier to enhance cx-LPMO-B immobilization. Moreover, the reusability of immobilized cx-LPMOB-NF was significantly enhanced. Therefore, the immobilized cx-LPMO-B-NF can promote advantages for cxLPMO-B industrial application.

Keywords: immobilization; nanoflower; lysing polysaccharide monooxygenase; enzymatic properties; inorganic

crystal complex

(责任编辑 王龙杰)

169

第174页

第 40 卷 第 2 期

2022 年 3 月

广西师范大学学报(自然科学版)

Journal of Guangxi Normal University (Natural Science Edition)

Vol. 40 No. 2

Mar. 2022

DOI: 10.16088 / j.issn.1001-6600.2021032203 http: xuebao.gxnu.edu.cn

毛政利,赵华美. 华南西部土壤 Cd、Pb 地球化学基线研究及评价[J]. 广西师范大学学报(自然科学版), 2022, 40(2): 170-181. MAO Z L,

ZHAO H M. Study on geochemical baseline and pollution assessment of heavy metals Cd and Pb in soil of Western South China[J]. Journal of Guangxi

Normal University(Natural Science Edition), 2022, 40(2): 170-181.

华南西部土壤 Cd、 Pb 地球化学基线研究及评价

毛政利1,2∗

, 赵华美3

(1. 百色学院 土木建筑工程学院, 广西 百色 533000; 2. 广西高校桂西生态环境分析和

污染控制重点实验室 (百色学院), 广西 百色 533000; 3. 百色学院 图书馆, 广西 百色 533000)

摘 要: 在华南西部的右江河谷地区按照 10 km×3 km 的网度采集 71 个浅层土壤样品, 分析测试样品中 Cd 和 Pb 的含

量, 应用累积频率法和分形分析方法分析计算其环境地球化学基线值, 以此为评价标准对本地区浅层土壤的 Cd、 Pb 污

染进行评价。 结果表明: 2 种分析计算方法所得到的环境地球化学基线值相差不大, 其中 Cd 的基线上限相差 10.3%, 基

线值相差 9.4%, Pb 的基线上限相差 3.6%, 基线值相差 6.7%, 说明 2 种方法的计算结果都合理, 本文取 2 种方法的算术

平均值作为其环境地球化学基线值, 即 Pb 为 25.44 mg / kg, Cd 为 0.304 mg / kg。 Cd 的单因子污染评价结果显示轻度污染

占 67.61%、 中度污染占 23. 94%、 重度污染占 5. 63%, Pb 的单因子污染评价显示轻度污染占 53. 52%、 中度污染占

25.35%、 重度污染占 11.27%; 内梅罗综合污染评价显示轻度污染占 52.11%、 中度污染占 33.88%、 重度污染占 8.45%,

显示出本区以轻度污染为主, 中度污染次之, 少数地区达到了重度污染, 且中、 重度污染区主要分布在研究区东南部和

西北部, 在中西部地区有一个中度污染点。 大多数样品 Cd 和 Pb 的地累积指数小于 1, 说明本区 Cd 和 Pb 的累积效应不

很明显, 但在研究区的东南部 Cd 和 Pb 的地累积指数以及中北部 Pb 的地累积指数达到了中度污染水平。 这些均说明研

究区以东铝土资源开发和研究区中部火电厂的生产活动对该区 Cd、 Pb 污染有较大的影响。

关键词: 环境地球化学基线; 分形分析; 污染评价; Cd; Pb; 右江河谷

中图分类号: X53;X825 文献标志码: A 文章编号: 1001-6600(2022)02-0170-12

重金属元素在土壤中具有持久性、富集性和不可逆性,而且不能降解,极易通过地下水、呼吸、皮肤接

触和食物链等进入人体,严重影响了人类的身体健康[1-6]

,因此,土壤重金属的污染评价研究成为土壤生

态环境的研究热点之一[7-14]

。 在我国,目前土壤重金属的污染评价大多采用指数法,以生态环境部和国家

市场监督管理总局 2018 年颁布的《土壤环境质量-农用地土壤污染风险管控标准(试行)》中的风险筛选

值作为评价标准进行评价,这种评价方法在评价土壤重金属对人类身体健康威胁方面具有重要意义,但是

在刻画土壤重金属污染及其累积特征上略显不足。

自 20 世纪 70 年代开展环境地球化学基线研究以来,以重金属地球化学基线作为评价标准的土壤重

金属污染评价研究越来越多[15-20]

。 环境地球化学基线值不同于地球化学背景值[21]

,它是地球表层土壤中

元素浓度的自然变化[22]和即时浓度[23]

。 目前确定元素环境地球化学基线值主要有标准化方法和累计频

率等方法。 标准化方法是建立惰性元素和活性元素的线性回归方程,即基线模型[24-25]

,根据基线模型和

惰性元素含量即可计算出活性元素的基线值。 累积频率法根据累积频率和元素含量直角坐标系中点分布

的趋势来确定元素的环境地球化学基线。 Zhang 等[26]采用累积频率曲线法和参考金属归一化法等方法,

确定了阜新市表层土壤重金属地球化学基线;孙厚云等[27]运用基于参比元素的标准化方法和累积频率曲

线法确定了承德市滦河流域 12 种重金属元素的地球化学基线值,并研究了它们的累积特征。

分形理论在土壤重金属污染方面的研究较少,主要围绕土壤颗粒粒径分形分布特征及其与重金属污

收稿日期: 2021-03-22 修回日期: 2021-05-15

基金项目: 广西自然科学基金(2017GXNSFAA198146)

通信作者: 毛政利(1967—), 男, 湖南武冈人, 百色学院教授, 博士。 E-mail: zhlmao@163.com

第175页

http:∥xuebao.gxnu.edu.cn

染之间的关系,根据土壤重金属元素的多维分形频谱图的特征分析土壤中重金属是否有人为源[28-30]

。 姚

凌阳等[31]研究了重金属元素在欧洲表层和深层土壤中的分布,认为其具有多重分形分布特征,且各元素

含量在多重分形频谱曲线上均显示连续的多重分形分布;郗伟华等[32] 研究认为,干旱风沙区路域土壤粒

径较小的黏粒更容易吸附重金属,土壤分形维数变化能够反映该区土壤理化性状的变化特征;宋书巧

等[33]利用 C-A 分形模型讨论分析土壤重金属地球化学异常下限等。 但应用分形理论方法确定重金属环

境地球化学基线值的研究目前鲜有报道。

为此,本文以华南西部的右江河谷为例,应用分形理论研究分析其浅层土壤重金属 Cd、Pb 的环境地

球化学基线,为重金属环境地球化学基线的确定提供一种简便有效的方法,并在此基础上对本地区土壤重

金属 Cd、Pb 污染进行评价,为本地区生态农业、特别是大健康产业可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于华南西部的广西百色地区,横跨右江区、田阳区、田东县和平果市,为一近似东西方向展布

的狭长地带,长约 120 km,宽 2~20 km 不等,河谷南北西 3 个方向均为山地,河谷和山地的分界明显,东部

经一宽约 2 km 的狭窄出口与平果铝土矿产区相连。 右江在河谷中部自西向东穿流而过。 河谷东部地形

较为平坦,西部地形稍显复杂,农作物以芒果树为主,另外还有水稻和玉米。 地理位置为北纬 23°22′~ 23°

54′,东经 106°34′~107°25′,高程 95~321 m,地处低纬度亚热带季风气候区,以东南季风为主,气候湿润,

年平均气温 20.5 ℃ ,年平均降雨量 1 053 mm。

1.2 样品采集

根据研究区具有长条形的形状特征,沿河谷延伸方向(东偏南方向)以大致 10 km 的间距布置 11 条

采样线,在河谷中部每条采样线原则上以 3 km 的间距均匀布样,在河谷南北边缘原则上分别在山脚、山腰

和山顶布置采样点,在不具备采样条件的地点酌情移动采样点位置。 在野外调研采样之前进行样品点的

布置设计,按照采样点的布设设计进行野外实地采样,具体按照约 10 m×10 m 的正方形 4 个顶点和中心

共 5 个点各采集 500 g 的浅层(10~20 cm)土壤,混合均匀后按四分法每个样品保留 500 g,同时使用手持

GPS 定位仪定位记录采样中心点的坐标和高程数据,共采集土壤样品 71 个,采样点分布见图 1。

委托青岛衡立检测有限公司检测样品的 Cd、Pb 含量,样品的制备和 Cd、Pb 含量的测定按照土壤质量

铅镉测定的萃取火焰原子吸收分光光度法国家标准(GB / T 17140-1997)执行。 Cd 检出限 0.05 mg / kg,定

量限 0.15 mg / kg,线性范围 0.15~2.0 mg / L,相关系数 r 为 0.999 7,线性方程为 Y = 0.303 5X-0.002 7;Pb 检

出限 0.20 mg / kg,定量限 0.60 mg / kg,线性范围 0.6 ~ 200 mg / L,相关系数 r 为 0.999 0,线性方程为 Y =

0.021 4X-0.001 3;均采用由北京普析通用仪器有限责任公司生产的 TAS-986AFG 原子吸收分光光度计

测定。

1.3 数据处理

本文采用 Excel 对研究区样品的 Cd、Pb 含量和频数进行统计分析及污染评价指数的计算,利用

Grapher 10 绘制 Cd 和 Pb 的累积频率和含量-频数双对数分布图,在 Surfer 13 软件平台上绘制 Cd 和 Pb 的

单因子指数、内梅罗综合污染指数、潜在生态风险指数以及地累积指数空间分布图。

1.4 分析方法

1.4.1 地球化学基线确定

1.4.1.1 累积频率法

累积频率法是通过构建累积频率和元素含量的直角坐标分布图进行基线确定,应用线性回归分析原

理,从分布图左下角的点开始,依次计算各点与最左下角点之间拟合曲线的决定系数,当决定系数升至最

高点,这个点就是第一个拐点;从找到的拐点开始,再依次计算该拐点之后的点与该拐点之间拟合曲线的

决定系数,直到发现第二个拐点,同理确定第三个拐点。 分布图可能存在多个拐点,第一拐点为元素含量

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广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

较低的拐点,表示基线值的上限,低于此数据的样品含量的平均值或中值确定为基线值[34]

。 本文使用低

于第一个拐点含量的所有样品的含量平均值作为基线值。

图 1 采样点分布

Fig. 1 Distribution map of sampling point

1.4.1.2 分形分析方法

含量-频数分形分析模式是先根据样品中每种重金属的含量情况,将该元素的含量分为若干等级,再

统计含量高于某个等级(r)的样品数量(N(r)),如果满足

N(r≤v)∝r

-D1和 N(r≥v)∝r

-D2 , (1)

则认为该元素含量分布服从分形分布。 两边取对数

lgN(r≤v)∝-D1

lgr,lgN(r≥v)∝-D2

lgr, (2)

式中 D1 和 D2 为分维数。 显然,如果该元素含量服从分形分布,其 lgN(r)和 lgr 呈线性关系,ν 即为基线值

的上限。

1.4.2 污染评价方法

1.4.2.1 单因子污染指数法

单因子污染指数评价方法[35-36]是评价土壤中单个重金属元素的污染状况和土壤重金属污染评价方

法的基础工作。 单因子污染指数计算公式为

pi

=

Ci

Si

。 (3)

式中:pi 表示每个采样点重金属元素 i 的单项污染指数;Ci 表示每个采样点重金属元素 i 的实测值,单位

mg / kg;Si 表示重金属元素 i 的评价标准,单位 mg / kg。

1.4.2.2 内梅罗综合污染指数法

内梅罗综合指数法[37-38]是在土壤重金属单因子污染指数评价的基础上,从整体的角度评价土壤中重

金属的综合污染状况,并重点考虑含量高的重金属元素对土壤重金属污染的影响。 计算公式为

pj

= (p

2

jmax

+p

2

jave) / 2 。 (4)

式中:pj 表示采样点 j 的重金属元素综合污染指数;pjmax表示采样点 j 中所有重金属元素单因子污染指数中

的最大值;pjave表示采样点 j 的所有重金属元素单因子污染指数的平均值;式中各参数均无量纲。

172

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1.4.2.3 潜在生态风险评价法

潜在生态风险评价法[31]是在各重金属元素单因子污染指数评价方法基础上,从毒理学的角度考虑各

重金属元素在土壤中的毒性效应,引入重金属元素的毒性效应系数,从而将重金属污染效应与毒理学连接

起来,使评价结果更为全面。

单一重金属元素潜在生态风险指数计算公式为

Ei

= Ti

×Pi, (5)

式中:Ei 为每个采样点重金属元素 i 的单一潜在生态风险指数;Ti 为重金属元素 i 的毒性响应系数;pi 表

示每个采样点重金属元素 i 的单项污染指数。

每个采样点多种重金属元素综合潜在生态风险指数 RRI计算公式为

RRI

= ∑

n

i = 1

Ei。 (6)

1.4.2.4 地累积指数评价法

地累积指数评价法[39]和前面几个评价方法的不同之处在于,它充分考虑了自然地质过程之外的人类

活动对重金属污染的影响,不仅反映了重金属元素在自然条件下的变化,也可判断重金属元素在人为活动

中的影响,是区分重金属元素自然过程和人为活动影响的重要参数。 地累积指数计算方法为

Igeo

= log2(Cn

/ 1.5Bn )。 (7)

式中:Igeo为地累积指数;Cn 为污染物 n 的实测值,单位为 mg / kg;Bn 为污染物 n 的标准值,单位为 mg / kg,

本文采用元素基线值。

2 结果与分析

2.1 重金属 Cd、Pb 含量的统计分析

右江河谷重金属 Cd、Pb 含量统计值如表 1,从表 1 可以看出,本区土壤重金属元素 Cd 和 Pb 含量的平

均值分别为 0.55 和 49.4 mg / kg,其中 Cd 平均含量超出了 GB 5618—2018 标准的风险筛选值,但未达到风

险管控值,与广西土壤背景值[40]

(0.267 mg / kg)相比,是背景值的 206%,说明研究区土壤重金属 Cd 的富

集趋势比较明显,可能受到人类活动或者矿产资源分布和开发利用方面的影响较大;变异系数为 45%,属

于高度变异,说明 Cd 的空间分布受到了人类的生产活动影响。 Pb 的平均含量未超过 GB 5618—2018 标

准的风险筛选值,但与百色地区土壤背景平均值(24 mg / kg)相比,也是背景值的 206%,说明研究区重金

属 Pb 的富集趋势也比较明显,变异系数高于 Cd,为 52%,说明在本区 Pb 受到的人类活动的影响要强

于 Cd。

表 1 右江河谷地区土壤重金属 Cd、Pb 含量统计表

Tab. 1 Statistical table of heavy metals Cd,Pb contents in soils of Youjiang River Valley

元素

最大值/

(mg·kg

-1

)

最小值/

(mg·kg

-1

)

中位数/

(mg·kg

-1

)

平均值/

(mg·kg

-1

)

标准差

变异

系数

GB 5618—2018

风险筛选值/ (mg·kg

-1

)

(水田/ 其他)

风险管控值/

(mg·kg

-1

)

Cd 1.85 0.19 0.50 0.55 0.25 0.45 0.4 / 0.3 2.0

Pb 174 14.1 43.3 49.4 25.5 0.52 100 / 90 500

2.2 地球化学基线确定

图 2 是研究区 Cd 和 Pb 的含量累积频率分布图,从图中可以看出,Cd 和 Pb 的累积频率分布图有很好

的相似性,均有 3 个拐点,其中 Pb 的第一个拐点对应的含量是 35 mg / kg,Cd 的第一个拐点对应的含量是

0.35 mg / kg,以此分别作为它们基线值的上限,计算低于此数据的样品含量平均值作为基线值,得到 Pb 的

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广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

环境地球化学基线值为 24.56 mg / kg,Cd 的环境地球化学基线值为 0.289 mg / kg。

图 2 Cd、Pb 含量累积频率分布

Fig. 2 Cumulative frequency distribution of Cd and Pb content

利用研究区样品点的含量、频数做双对数坐标图如图 3 所示,Pb 的基线值上限为 36.3 mg / kg,Cd 的

基线值上限为 0.39 mg / kg,据此计算 Pb 的环境地球化学基线值为 26.32 mg / kg,Cd 的环境地球化学基线

值为 0.319 mg / kg。

上述 2 种方法所得到的基线值上限和环境地球化学基线值相差不大,其中 Cd 的差别稍大一些,其基

线上限相差 10.3%,基线值相差 9.4%;Pb 的基线上限相差 3.6%,基线值相差 6.7%,说明 2 种方法的计算

结果合理。 本次研究以 2 种方法计算所得的环境地球化学基线值的算术平均值作为其环境地球化学基线

值,即 Pb 的环境地球化学基线值为 25.44 mg / kg,Cd 的环境地球化学基线值为 0.304 mg / kg。

图 3 Cd、Pb 含量-频数分形分布

Fig. 3 Content-frequency fractal distribution of Cd and Pb

2.3 单因子污染指数评价

从研究区各样品点单因子污染指数值在各污染等级中所占的比例(见表 2)可以看出,本区浅层土壤

Cd 和 Pb 的污染程度相近,均以轻度污染为主,中度污染次之,未污染样品所占比例较小。 图 4 是 Cd、Pb

单因子指数平面分布图,由图可见,研究区中西部以轻度污染为主,Cd 和 Pb 的重度污染区主要分布在研

究区的东南部,显示出铝土矿产区对本区 Cd 和 Pb 污染的影响;中度污染区主要分布在与重度污染区相

邻区域及河谷中东部的两缘、百色市主城区及百矿电厂-新山工业园区,表明火力发电、铝加工和人口聚集

对本区 Cd 和 Pb 的累积有一定的贡献。

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2.4 内梅罗综合污染指数评价

在应用内梅罗综合污染指数进行污染评价时,需要根据内梅罗污泥指数进行污染分级,分级标准根据

农田土壤环境质量监测技术规范(NY/ 395-2000)制定。 内梅罗污染指数计算及污染分级见表 3,由表可

见,研究区 Cd 和 Pb 的综合污染较轻,以轻度污染为主,中度污染次之,少量样品达到了重度污染,污染形

式较为严峻。

表 2 右江河谷土壤重金属 Cd、Pb 单因子污染指数

Tab. 2 Single factor pollution index of Cd and Pb in soil of Youjiang River basin

评价指数 污染等级

各污染等级样品点比/ %

Cd Pb

P≤1.0 未污染 2.82 9.86

1.0<P≤2.0 轻度污染 67.61 53.52

2.0<P≤3.0 中度污染 23.94 25.35

P>3.0 重度污染 5.63 11.27

图 4 右江河谷土壤重金属 Cd、Pb 单项污染指数分布

Fig. 4 Distribution map of single pollution index of Cd and Pbin soil of Youjiang River basin

表 3 右江河谷土壤重金属 Cd、Pb 内梅罗综合污染指数

Tab. 3 Nemero comprehensive pollution index of Cd and Pb in soil of Youjiang River basin

等级 评价指数 污染等级 各污染等级样品点比/ %

1 P≤0.7 安全 1.41

2 0.7<P≤1.0 警戒线 4.23

3 1.0<P≤2.0 轻度污染 52.11

4 2.0<P≤3.0 中度污染 33.80

5 P>3.0 重度污染 8.45

图 5 是本区 Cd 和 Pb 的内梅罗综合污染指数空间分布图,内梅罗综合污染指数空间分布特征和 Cd

的单因子污染指数空间分布基本相似,中度污染和重度污染区域分布在研究区东南部和西北部,在中西部

地区有一个重度污染点,也反映了铝的开发利用、人类集聚和火力电厂对本地区重金属污染的贡献。

2.5 潜在生态风险评价

单一潜在生态风险指数是在单因子污染指数的基础上,考虑重金属元素的毒性反应系数计算得到的,

Cd 和 Pb 的毒性反应系数分别为 30 和 5

[29]

,研究区 Cd 和 Pb 的单一潜在生态风险指数计算结果如表 4。

从表 4 可知,研究区所有样品点 Pb 均处在轻微生态危害范围内,说明本地区铅污染潜在生态风险极小,

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Cd 以中等生态危害为主,但强生态危害和很强生态危害超过了 10%,说明研究区 Cd 的潜在生态风险较

强,远大于 Pb 的潜在生态风险。 图 6 是本区 Cd 的单一潜在风险指数分布图,图中显示,本地区 Cd 的强

生态危害区主要分布在东南部,在西北部的百色主域区局部达到强生态危害,这些区域受到铝矿资源开发

以及人口集聚的影响,存在较大的重金属 Cd 的潜在生态风险。

图 5 右江河谷重金属 Cd-Pb 内梅罗综合污染指数分布

Fig. 5 Distribution map of Nemero composite pollution index of Cd and Pb in Youjiang River basin

表 4 右江河谷土壤重金属 Cd、Pb 单一潜在生态风险指数

Tab. 4 Single potential ecological risk index of Cd and Pb in soil of Youjiang River basin

评价指数 风险等级

各风险等级样品点比例/ %

Cd Pb

E<40 轻微生态危害 15.49 100

40≤E<80 中等生态危害 73.24 —

80≤E<160 强生态危害 9.86 —

160≤E<320 很强生态危害 1.41 —

E≥320 极强生态危害 — —

图 6 右江河谷土壤重金属 Cd 单一潜在风险指数分布

Fig. 6 Distribution map of single potential risk index of Cd in soil of Youjiang River basin

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Cd、Pb 综合潜在生态风险指数计算结果(表 5)显示,绝大多数样品点处于轻微生态危害,只有极少数

样品点处于中等生态危害,说明研究区重金属综合潜在生态风险小。 从图 7 可以看到,中等生态危害分布

于研究区的东南端,说明本区重金属生态危害的主要来源是其以东的大型铝资源开发。

表 5 右江河谷土壤重金属 Cd、Pb 综合潜在生态风险指数

Tab. 5 Comprehensive potential ecological risk index of Cd and Pb in soil of Youjiang River basin

评价指数 风险等级 各风险等级样品点比/ %

RRI<150 轻微生态危害 95.77

150≤RRI<300 中等生态危害 4.23

300≤RRI<600 强生态危害 —

RRI≥600 很强生态危害 —

2.6 地累积指数评价

地累积指数反映了人类活动对重金属累计效应的影响,表 6 是研究区地累积指数计算和污染等级分

级表,从表 6 中可以看出,在所有样品中,污染等级最高的达到中度污染,但所占比例极小,大多数样品点

的地累积指数小于 1,说明本区所遭受到的人类活动引起的 Cd 和 Pb 的累积效应不是很明显;各污染等级

的 Cd 和 Pb 的样品点所占比例基本相近,说明本区人类活动对 Cd 和 Pb 的累积效应基本相同,可能也揭

示了本区 Cd 和 Pb 来源上的一致性。 Cd 和 Pb 的地累积指数空间分布(图 8)也佐证了这一认识,图 8 显

示,研究区 Cd 和 Pb 各污染等级分布区域基本一致,Pb 的偏中度污染区比 Cd 的稍大,在研究区中部北侧

出现有 Pb 的偏中度污染,但是 Cd 在这一区域为轻度污染区。

图 7 右江河谷土壤重金属 Cd、Pb 综合潜在风险指数分布

Fig. 7 Distribution map of comprehensive potential risk index of Cd and Pb in soil of Youjiang River basin

表 6 右江河谷土壤重金属 Cd、Pb 地累积指数

Tab. 6 Accumulation index of Cd and Pb in soil of Youjiang River basin

污染等级 地累积指数 污染程度

各污染等级样品点比例%

Cd Pb

0 Igeo≤0 清洁 29.58 23.94

1 0<Igeo≤1 轻度污染 64.79 63.38

2 1<Igeo≤2 偏中度污染 4.23 11.27

3 2<Igeo≤3 中度污染 1.41 1.41

4 3<Igeo≤4 偏重污染 — —

5 4<Igeo≤5 重污染 — —

6 Igeo>5 严重污染 — —

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图 8 右江河谷土壤重金属 Cd、Pb 地累积指数分布

Fig. 8 Distribution map of accumulation index of Cd and Pb in soil of Youjiang River basin

3 讨论

目前,应用分形方法研究确定重金属环境地球化学基线的报道很少,有些学者应用该方法研究土壤重

金属的异常下限值[33]

。 在重金属环境地球化学基线研究中应用较多的是累积频率法、标准化方法以及 2

种方法的综合应用。 李樋等[41]

、高杨等[17]应用 2 种方法所得到的重金属地球化学基线值十分接近,说明

标准化方法和累积频率方法都是合理的。 本文采用累积频率和分形分析 2 种方法计算确定研究区土壤重

金属 Cd 和 Pb 的环境地球化学基线,2 种方法计算所得到的基线值和基线上限值相差不大,说明应用分形

分析方法计算确定重金属环境地球化学基线是合理的,而且分形分析方法较之标准化方法更加方便和直

观。 为了更加合理地描述 Cd 和 Pb 的环境地球化学基线,本文采用这 2 种方法的算术平均值作为它们的

基线值。

本文计算所得的浅层土壤重金属 Cd 和 Pb 的环境地球化学基线值与《土壤环境质量-农用地土壤污

染风险管控标准(试行)》 (GB 5618-2018)中的风险筛选值相比,Cd 相差不大,基线值比风险筛选值大

0.004 mg / kg;Pb 的数据相差比较大,风险筛选值是基线值的 3.5 倍。 但与广西土壤背景值(Cd:0.267 mg /

kg,Pb:24 mg / kg)

[40]相比较,本文计算的基线值与其非常接近,说明采用本文计算所得的基线值作为本地

区土壤环境质量评价标准是合理的,能很好地反映本区土壤中重金属的累积趋势及其给土壤环境质量带

的风险,能有效避免本区重金属污染状况被忽略而出现“欠保护”现象[42-43]

本文以分形分析和累积频率 2 种方法确定本区重金属 Cd 和 Pb 的环境地球化学基线,并以其地球化

学基线作为评价标准开展土壤重金属污染评价,很好地刻画了重金属的累积效应给土壤环境质量带来的

风险,但也存在一些不足,主要在于参与评价的重金属元素数量不多,在综合评价上的结论欠全面。

4 结论

本文应用分形分析和累积频率 2 种方法,综合计算分析了右江河谷土壤重金属 Cd 和 Pb 的环境地球

化学基线,并以此为评价标准对本区土壤重金属 Cd 和 Pb 的污染进行评价,主要得到以下结论:

1)由累积频率法和分形分析方法所计算确定的 Cd 和 Pb 的环境地球化学基线值相近,说明应用分形

分析方法计算确定重金属环境地球化学基线值是可行的。

2)Cd 和 Pb 的单因子污染指数和内梅罗综合污染指数均显示出本区以轻度污染为主,中度污染次

之,少量样品达到了重度污染,且中、重度污染区主要分布在研究区东南部和西北部,在中西部地区有一个

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第183页

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重度污染点,说明东部铝土资源开发、西部主城区的人口集聚和中部火电厂的生产活动是本区 Cd 和 Pb

污染的主要来源。

3)大多数样品 Cd 和 Pb 的地累积指数小于 1,说明本区 Cd 和 Pb 的累积效应不很明显,但在研究区

的东南部 Cd 和 Pb 的地累积指数以及中北部 Pb 的地累积指数达到了中度污染水平,进一步说明研究区

以东铝土资源开发和研究区中部火电厂的生产活动对该区 Cd、Pb 污染的影响。

参 考 文 献

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180

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Study on Geochemical Baseline and Pollution Assessment of Heavy

Metals Cd and Pb in Soil of Western South China

MAO Zhengli

1,2∗

, ZHAO Huamei

2

(1. School of Civil Engineering and Architecture, Baise University, Guangxi Baise 533000, China;

2. Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Regional Environments Analysis and

Pollution Control of West Guangxi (Baise University), Guangxi Baise 533000, China;

3. Library of Baise University, Guangxi Baise 533000, China)

Abstract: In Youjiang River basin, 71 shallow soil samples were collected according to the network density of 10

km×3 km, and the contents of Cd and Pb were analyzed and tested. Cumulative frequency method and fractal

analysis method were used to analyze and calculate their environmental geochemical baseline values, so as to

assess the Cd and Pb pollution of shallow soil in this area. The results showed that, there was not much

difference between the environmental geochemical baseline obtained by the two methods, among which Cd had a

difference of 10.3% in upper limit of baseline, 9.4% in baseline value, Pb had a difference of 3.6% in upper

limit of baseline, 6. 7% in baseline value, indicating that the calculation results of the two methods were

reasonable. In this study, the arithmetic average of the two methods was taken as the environmental geochemical

baseline values, that was, Pb was 25. 44 mg / kg, and Cd was 0. 304 mg / kg. The single factor pollution

assessment results of Cd showed that the light pollution, intermediate pollution and heavy pollution accounted for

67.61%, 23.94% and 5.63%, respectively, while the single factor pollution assessment of Pb showed that the

light pollution, intermediate pollution and heavy pollution accounted for 53. 52%, 25. 35% and 11. 27%,

respectively. Nemerow comprehensive pollution assessment showed that light pollution, intermediate polltuion and

heavy pollution accounted for 52.11%, 33.88% and 8.45%, respectively. This showed that the pollution in this

area was dominated by light pollution, followed by moderate pollution, only a small number of samples were

severely polluted. Moderate and severe pollution areas were mainly distributed in the southeast and northwest of

the study area, and there was a moderate pollution point in the central and western regions. The geoaccumulation

index of Cd and Pb of most samples was less than 1, indicating that the accumulation effect of Cd and Pb in this

area was not obvious. However, the geoaccumulation index of Cd and Pb in the southeastern part of the study

area and the north-central part of the study area reached the level of moderate pollution. All these indicated that

the development of bauxite resources in the east area and the production activities of the thermal power plant in

the middle area had a great impact on the pollution of Cd and Pb in the area.

Keywords: environmental geochemical baseline; fractal analysis; pollution assessment; Cd; Pb; Youjiang

River basin

(责任编辑 王龙杰)

181

第186页

第 40 卷 第 2 期

2022 年 3 月

广西师范大学学报(自然科学版)

Journal of Guangxi Normal University (Natural Science Edition)

Vol. 40 No. 2

Mar. 2022

DOI: 10.16088 / j.issn.1001-6600.2021070901 http: xuebao.gxnu.edu.cn

魏世勋,何成达,张淼. 缺氧生物膜法处理光伏高硝态氮废水研究[J]. 广西师范大学学报(自然科学版), 2022, 40(2): 182-190. WEI S X,

HE C D, ZHANG M. Treatment of photovoltaic high nitrate wastewater by anoxic biofilm process[J]. Journal of Guangxi Normal University (Natural

Science Edition), 2022, 40(2): 182-190.

缺氧生物膜法处理光伏高硝态氮废水研究

魏世勋, 何成达∗

, 张 淼

(扬州大学 环境科学与工程学院, 江苏 扬州 225127)

摘 要: 针对光伏废水中含有的高浓度硝态氮(高于 600 mg / L), 采用连续流生物膜法对污水进行反硝化处理, 并设置

连续流活性污泥法作为对比; 优化连续流反硝化的运行工况, 研究不同碳氮质量比(分别为 3 ∶ 1、 3.5 ∶ 1 和 4 ∶ 1) 和水

力停留时间(8、 10 和 12 h) 对于反硝化的影响; 考察进水硝态氮浓度对反硝化的影响。 结果表明: 通过连续流反硝化

方式降解高浓度硝态氮废水的最佳运行工况是碳氮质量比为 3.5 ∶ 1、 水力停留时间为 12 h, 降解进水硝态氮浓度为 600、

1 200 和 1 500 mg / L 的废水总氮去除率分别达到 96.69%、 92.95%和 90.93%; 与连续流活性污泥法相比, 连续流生物膜

法对于处理高硝态氮废水有着更高的总氮去除率和更低的亚硝态氮积累率, 为优化处理含高浓度硝态氮光伏废水提供基

础性数据。

关键词: 高硝态氮; 光伏废水; 生物膜法; 活性污泥法; 连续流; 最佳工况

中图分类号: X703.1 文献标志码: A 文章编号: 1001-6600(2022)02-0182-09

光伏企业在生产过程中需使用大量硝酸对硅片进行处理[1]

,产生的废水中含有大量硝态氮等污染物

质,直接排放会对生态环境造成巨大损害[2-3]

,因此需对光伏企业废水进行处理。 针对此种低 pH、高硝态

氮、高 COD 的光伏废水,广泛采用预处理+pH 调节+生化处理+深度处理的工艺流程[4]

。 其中预处理主要

是降低废水硬度,提高可生化性,通常采用“过滤+超滤+反渗透”等膜技术[5] 与钙盐沉淀法[6] 软化废水。

在生化处理中则采用较为常见的生物脱氮方法,如 AO 法、AAO 法等[7]

传统生化处理方法对低浓度硝态氮废水有稳定的效果,但对于水中硝态氮浓度达到 600 mg / L 及以上

的高硝态氮废水效果不理想[8]

,出水总氮容易超标,不能作为光伏废水处理的普遍手段。 国内外对于废

水中硝态氮的去除研究较多,如:Cheng 等[9] 控制 Fe / N 质量比来调节硝酸盐的降解与 N2O 的排放;

Benekos 等[10]利用电凝与电化学氧化联合处理的方式将氮去除率提高到 96.3%。 但对于硝态氮浓度高达

1 200 mg / L 的光伏废水的处理研究甚少,如:吴新忠[11]处理光伏废水时采用序批式活性污泥法取得了较

好的效果,但反应装置复杂,运行多有不便。

基于此,本研究采用连续流生物膜法处理高硝态氮废水,并与连续流活性污泥法进行对比实验。 引入

生物膜改善反硝化菌的生存环境,有针对性地进行反硝化处理,找出影响处理效果的最佳碳氮质量比(C /

N)与水力停留时间(HRT),再提高进水硝态氮浓度。 本实验无需搅拌、沉淀设备,装置简单经济,能大幅

去除水中高硝态氮与 COD,出水能达到污水处理厂接收企业废水的标准,为光伏废水进入污水处理厂深

度处理前做好先行处理。

收稿日期: 2021-07-09 修回日期: 2021-08-11

基金项目: 国家自然科学基金(51808482)

通信作者: 何成达(1962—), 男, 江苏扬州人, 扬州大学教授, 博士。 E-mail: hcd@yzu.edu.cn

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1 材料与方法

1.1 实验装置

本实验采用连续流生物膜法与连续流活性污泥法进行高硝态氮废水处理对照实验,实验装置如图 1。

图 1 实验装置

Fig. 1 Experimental device

实验装置包括反应柱、蠕动泵、生物填料、慢速搅拌机及乳胶管管道等。 图 1(a)由 1 根有效水深 100

cm,直径 10 cm 的有机玻璃柱组成,生物填料选用粒径约为 10 mm 的齿面型 K1 填料[12]

,填充至距上部出

水口 10 cm 处,蠕动泵在下部进水口连续均匀进水。 图 1(b)由 2 根有效水深 100 cm,直径 10 cm 的有机

玻璃柱组成,分别为反应柱与沉淀柱,反应柱由蠕动泵均匀连续进水,慢速搅拌机叶片直径为 8 cm,连续

运行对泥水进行混合,沉淀柱下部污泥由蠕动泵送回反应柱中,污泥回流比为 100%。 进出水管道材质均

为乳胶,连接口管件材质为铜质,连接方式为直插连接,经试运行检查不漏水后投入实验运行。

两组试验装置均采用下进上出式厌氧连续流运行模式,碳源投加量与水力停留时间均相同。 图 1(a)

由蠕动泵均匀进水,经过生物膜处理后由出水口自然溢出,无需搅拌。 图 1(b)由蠕动泵向反应柱内均匀

进水,与反应柱中活性污泥通过搅拌机充分混合反应后由上方出水口自然溢出,出水进入沉淀柱自然沉

淀,上方澄清液为实验出水,下方活性污泥沉淀经过蠕动泵缓慢回流至反应柱。 实验过程中控制搅拌速度

为 50 r/ min,反应柱中污泥浓度为 3 500 mg / L 左右。

1.2 实验仪器与材料

BT100-2J 蠕动泵(保定格兰恒流泵有限公司);HBJ-1 型精密搅拌机(扬州海博环保设备有限公司)。

本实验选用无水乙酸钠作为控制碳氮比额外投加的碳源,用以提供电子供体。 实验过程中需加入由

蒸馏水与分析纯化学药剂配制而成的营养液,以维持装置中常量元素与微量元素的平衡[13-14]

,各主要营

养成分浓度见表 1。 实验中接种的污泥来自扬州市汤汪污水处理厂的生物曝气池,理化性质见表 2。 实验

处理所用废水来自晶澳(扬州)太阳能科技有限公司,该公司主要生产太阳能电池片,生产废水中主要水

质指标见表 3。

表 1 主要营养物质浓度

Tab. 1 Concentration of main nutrients

成分 浓度/ (mg·L

-1

) 成分 浓度/ (mg·L

-1

)

FeCl

3·6H2O 1.3 ZnSO4·7H2O 0.2

NaMoO4·2H2O 0.7 CuSO4·2H2O 0.2

MgSO4·7H2O 0.3 CoCl

2·6H2O 0.2

CaCl

2·2H2O 0.2 MnCl

4·4H2O 0.1

183

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广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

表 2 接种污泥性质

Tab. 2 Properties of inoculated sludge

污泥浓度 SS

/ (mg·L

-1

)

污泥沉降比

SV30

/ %

污泥体积指数 SVI

/ (mg·L

-1

)

可挥发性悬浮物

浓度 VSS / (mg·L

-1

)

可挥发性悬浮物

比例(VSS / SS) / %

3 500 28 70.1 2 758 78.8

表 3 原水主要水质指标

Tab. 3 Main water quality indexes of raw water

硝态氮/ (mg·L

-1

) 亚硝态氮/ (mg·L

-1

) COD/ (mg·L

-1

)

1 510 51.8 160

1.3 实验方法

自污水厂取来的污泥中含有较多的好氧菌,为了提高装置的实验效率,需对污泥进行驯化培养提高厌

氧反硝化能力。 首先对取来的活性污泥静置 24 h,利用微生物本身的内源呼吸作用消耗部分营养物质;然

后将污泥分别接种到两套有机玻璃装置中,将生物膜与污泥共同驯化培养;再以连续流的方式通入稀释后

的硝态氮浓度为 300 mg / L 的光伏废水,设置初始碳氮质量比为 3 ∶ 1,水力停留时间为 20 h,控制污泥浓

度为 3 500 mg / L,温度维持在 25 ℃ ,pH 为 7 左右。 经过 25 d 活性污泥的培养驯化,图 1(a)中活性污泥已

完全附着于生物膜上,无跑泥剥落现象;图 1(b)中污泥由取来时的深褐色转变为黄褐色,并具有良好的絮

凝性。 两组装置出水硝态氮、COD 去除率均高于 90%,至此污泥培养驯化完成。

培养驯化活性污泥后,考察进水硝态氮浓度为 300 mg / L 时两组装置在不同 C / N 和不同 HRT 条件下

的反硝化处理效果,寻找最优工况条件。

在保持最优工况运行的条件下,逐步提高进水硝态氮浓度到 600、1 200、1 500 mg / L,考察连续流生物

膜法与连续流活性污泥反硝化法对不同浓度硝态氮处理效果。

1.4 分析项目与测定方法

硝态氮浓度采用紫外分光光度法测定;亚硝态氮浓度采用 N-(1-萘-基)-乙二胺分光光度法测定;COD

采用快速测定法;污泥浓度采用重量法测定;pH 采用便携式 pH 计测定。

2 结果与分析

2.1 碳氮质量比对于连续流反硝化的影响

当 C / N 过小时,碳源无法提供足够的电子供体,硝态氮、亚硝态氮反硝化不完全;当 C / N 过大时,出水

中残余大量未利用的有机物,造成 COD 污染,同时造成药品浪费。 本实验处理废水为稀释后硝态氮浓度

为 300 mg / L,亚硝态氮浓度为 10 mg / L 的废水,实验 3 个阶段通过投加分析纯乙酸钠保证进水 C / N 分别

为 3 ∶ 1、3.5 ∶ 1 和 4 ∶ 1(对应 COD 分别为 930、1 085 和 1 240 mg / L)。 两组实验在同一 C / N 条件下各运

行 7 d 至稳定后进入下一阶段,其余工况保持一致,实验运行结果如图 2、图 3 所示。

由图 2 可见,两组实验在不同 C / N 条件下,硝态氮去除率均稳步提高。 生物膜装置在 C / N 为 3 时处

理效果最差,C / N 为 3.5 时硝态氮去除效率为 93.82%,优于 C / N 为 4 时的去除率 91.31%。 活性污泥装置

与生物膜类似,在 C / N 为 3 时硝态氮去除率最低,为 87.31%,C / N 为 3.5 时的处理效果略优于 C / N 为 4

时。 在 C / N 变化时,两组实验均发生处理效果突然下降的现象,在运行一段时间后又趋于稳定,这说明活

性污泥需要时间适应新环境。 整体来看,生物膜去除硝态氮效果优于活性污泥,生物膜法在 C / N 为 3 ~ 4

184

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条件下去除硝态氮效果更好。

方月英等[15]在研究反硝化生物滤池的脱氮效率时发现,C / N 为 3.5 时能达到较好的脱氮效果,而C / N

为 5 时脱氮效率更高,与本实验有略微差别。 分析原因可能是方月英研究的是反硝化生物滤池在较宽泛

的流速范围内的结果,而本实验仅代表这一流速的反硝化特征。 张欣欣[16] 处理硝酸根甲醇废水研究表

明:在 C / N 为 3 时系统脱氮效果最好,总氮去除率在 84.3%左右;C / N 不变时,硝态氮/ 亚硝态氮越小反硝

化细菌的活性就越低。 本实验研究的废水中硝态氮占总氮 96%以上,反硝化细菌活力较高,因此需要较

高的碳源来保证细菌的生长繁殖和供给反硝化。

图 2 不同 C/ N 时硝态氮去除效果

Fig. 2 Removal efficiency of nitrate nitrogen with different C/ N ratios

图 3 不同 C/ N 时亚硝态氮去除效果

Fig. 3 Removal efficiency of nitrite nitrogen with different C/ N ratios

由图 3 可见,两组实验在不同 C / N 条件下,亚硝态氮去除率均稳定提高。 在 C / N 为 3 时 2 个装置去

除效果均最差,且去除率相近。 在 C / N 为 3.5 和 4 时,生物膜法初始亚硝态氮去除效果不如活性污泥法,

待试验运行一段时间后去除效率又超过活性污泥法。 同时,生物膜法在 C / N 为 3.5 和 4 时去除亚硝态氮

效果相近,均为 96%左右;活性污泥法在 C / N 为 3.5 和 4 时去除亚硝态氮效果相近,均为 94%左右。

185

第190页

广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

2.2 HRT 对于连续流反硝化的影响

反硝化 HRT 的长短决定了反硝化菌是否有足够的时间将硝态氮、亚硝态氮还原。 当 HRT 过短,反硝

化不彻底;当 HRT 过长,在实际污水处理中会造成时间成本浪费。 本实验处理废水为稀释后废水,其硝态

氮浓度为 300 mg / L,亚硝态氮浓度为 10 mg / L,实验 3 个阶段 HRT 分别为 8、10、12 h。 两组实验在同一

HRT、C / N 为 3.5 条件下各运行 7 d 至稳定后进入下一阶段,其余工况保持一致,实验运行结果如图 4、图 5

所示。

图 4 不同 HRT 硝态氮去除效果

Fig. 4 Removal efficiency of nitrate nitrogen with different HRT ratios

图 5 不同 HRT 亚硝态氮去除效果

Fig. 5 Removal efficiency of nitrite nitrogen with different HRT ratios

由图 4 可见,生物膜法在 HRT 为 8 h 时,反硝化不彻底,去除硝态氮效果最差,随着实验进行,去除效

率不断上升,一直到 HRT 为 12 h 时趋于稳定,去除率为 94.5%左右。 活性污泥法在 HRT 为 8 h 时,去除

硝态氮效果最差,在 HRT 为 10 h 时趋于稳定,与 HRT 为 12 h 时持平,去除效率在 93.0%左右。 生物膜法

在 HRT 为 8 h 和 12 h 时去除硝态氮效率均高于活性污泥法,在 HRT 为 10 h 时两组装置去除效率近似。

司圆圆等[17]研究发现脱氮副球菌的最佳反应时间为 18 h,但脱氮副球菌是一种好氧反硝化菌,在本实验

装置厌氧状态中,可能受到抑制。

186

第191页

http:∥xuebao.gxnu.edu.cn

由图 5 可见,生物膜法在 HRT 为 8 h 时,硝态氮去除率上升最快,但有较大波折,稳定后去除率并不

高,HRT 为 12 h 时处理效果优于 10 h 时。 活性污泥法在 HRT 为 8 h 时处理效果最差,在 10 h 和 12 h 时

处理效果持平。 在改变 HRT 时,2 种方法都出现了亚硝态氮处理效率下降的问题,这可能是硝态氮大量

还原成亚硝态氮,形成累积。 整体上生物膜法去除亚硝态氮效果优于活性污泥法。

2.3 进水硝态氮浓度对连续流反硝化的影响

在 C / N 为 3.5、HRT 为 12 h、pH 为 7 左右、温度为 25 ℃ 的条件下,逐步提高进水硝态氮浓度,考察高

硝态氮废水处理效果。 控制进水硝态氮浓度分别为 600、1 200、1 500 mg / L,对应亚硝态氮浓度分别为 20、

40、50 mg / L,分 3 批次进行实验。

2.3.1 硝态氮浓度为 600 mg / L 时处理效果

进水硝态氮浓度为 600 mg / L 时,两组装置均运行 10 d 且实验稳定后处理效果如图 6。

图 6 600 mg / L 进水硝态氮去除效果

Fig. 6 Removal efficiency of nitrate nitrogen for 600 mg / L influent

由图 6 可见,实验运行 1~4 d,两组装置初始硝态氮浓度都在下降,生物膜法下降更快;两组装置都存

在亚硝态氮积累,硝化过程不完全。 实验运行 5 ~ 10 d,两组装置硝态氮去除率都稳步提高,最终趋于稳

定;活性污泥法亚硝态氮积累从第 5 d 开始下降,并最终稳定,生物膜法出水中亚硝态氮浓度保持下降。

最终生物膜法出水硝态氮浓度为 8.71 mg / L,亚硝态氮浓度为 11.8 mg / L,总氮去除率为 96.69%;活性污泥

法出水硝态氮浓度为 117.71 mg / L,亚硝态氮浓度为 18.69 mg / L,总氮去除率为 80.00%。 生物膜法总氮去

除率比活性污泥法高 16.69 个百分点。

2.3.2 硝态氮浓度为 1 200 mg / L 时处理效果

进水硝态氮浓度为 1 200 mg / L 时,两组装置均运行 10 d 且实验稳定后处理效果如图 7。

由图 7 可见,全过程两组装置出水硝态氮浓度都不断下降,生物膜法初始出水硝态氮浓度更低,且出

水硝态氮浓度下降更快;两组装置都存在亚硝态氮积累,出水亚硝态氮浓度都下降,全过程生物膜法出水

亚硝态氮浓度高于活性污泥法。 最终生物膜法出水硝态氮浓度为 19.80 mg / L,亚硝态氮浓度为 67.55 mg /

L,总氮去除率为 92.95%;活性污泥法出水硝态氮浓度为 435.18 mg / L,亚硝态氮浓度为 39.31 mg / L,总氮

去除率为 61.73%。 生物膜法总氮去除率比活性污泥法高 31.22 个百分点。

187

第192页

广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

图 7 1 200 mg / L 进水硝态氮去除效果

Fig. 7 Removal efficiency of nitrate nitrogen from 1 200 mg / L influent

2.3.3 硝态氮浓度为 1 500 mg / L 时处理效果对比

进水硝态氮浓度为 1 500 mg / L 时,两组装置均运行 10 d 且实验稳定后处理效果如图 8。

图 8 1 500 mg / L 进水硝态氮去除效果

Fig. 8 Removal efficiency of nitrate nitrogen from 1 500 mg / L influent

由图 8 可见,全过程两组装置出水硝态氮浓度都不断下降,生物膜法初始出水硝态氮浓度更低,且出

水硝态氮浓度下降更快;两组装置都存在亚硝态氮积累,出水亚硝态氮浓度都下降,全过程生物膜法出水

亚硝态氮浓度高于活性污泥法,在第 10 天出水稳定时相差最小。 观察发现在 1 ~ 4 d 较 5 ~ 10 d 出水亚硝

态氮浓度下降更慢,这是因为 1~ 4 d 时硝态氮大量还原,造成亚硝态氮无法及时还原。 最终生物膜法出

水硝态氮浓度为 37.14 mg / L,亚硝态氮浓度为 103.48 mg / L,总氮去除率为 90.93%;活性污泥法出水硝态

氮浓度为 592.82 mg / L,亚硝态氮浓度为 97.31 mg / L,总氮去除率为 55.47%。 生物膜法总氮去除率比活性

污泥法高 35.46 个百分点。

188

第193页

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3 讨论

由以上分析可知,综合考虑同时去除硝态氮和亚硝态氮,当 C / N 为 3.5、HRT 为 12 h 时连续流生物膜

法反硝化对于高硝态氮废水具有良好的处理效果。

在不同进水硝态氮浓度的情况下,连续流生物膜法均比连续流活性污泥法有更优的硝态氮、亚硝态氮

去除效率,且当进水硝态氮浓度越高时,差距越明显。 张巧等[18] 处理生活废水时同样设置未添加生物填

料的装置作为对照,证明生物填料添加可强化反硝化能力。 作为微生物生长繁殖的重要载体,生物膜的齿

形结构有着较大的展开面积,能够提供充足的附着表面和内部空间,装置内产生的特殊流态也增加了微生

物与污水的接触,这是单纯的活性污泥法所不具备的,可以解释生物膜法较活性污泥法脱氮效率更高的

原因。

本实验中连续流生物膜法的运用无需额外的沉淀过程,占用空间少,基本忽略微量脱落的污泥,这一

点在王俊等[19]的研究中也有指出。 李仲伟[20]研究发现,在一定负荷范围内,硝酸盐浓度增加带来的负荷

变化,以及处理水量的增加对反应器脱氮效果的影响较小,可见生物脱氮工艺有着较高的盐度耐受和处理

上限。 丁兴辉[21]

、任争鸣等[22]采用多级反硝化生物脱氮工艺处理进水硝态氮浓度更高的废水,效果显

著,可以预想串联的几组厌氧反硝化装置能够进一步降低出水总氮,深度处理光伏废水。

4 结论

本文通过对比连续流生物膜法与连续流活性污泥法对光伏废水的处理效果,得出如下结论:

1)在 C / N 为 3.5、HRT 为 12 h 时,连续流生物膜法对于处理高硝态氮废水有着更优的反硝化效果,在

进水硝态氮浓度达到 1 500 mg / L 时,硝态氮去除率达到 97%以上,总氮去除率达 90%以上。

2)连续流生物膜法比连续流活性污泥法平均硝态氮去除率高约 30 个百分点,平均总氮去除率高 28

个百分点以上,且进水硝态氮浓度越高,处理效果差距越大。

参 考 文 献

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Treatment of Photovoltaic High Nitrate Wastewater by Anoxic Biofilm Process

WEI Shixun, HE Chengda

, ZHANG Miao

(School of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University,Yangzhou Jiangsu 225127,China)

Abstract: In view of the high concentration of nitrate nitrogen (higher than 600 mg / L) contained in photovoltaic

wastewater, continuous flow biofilm method was used for denitrification of wastewater, and continuous flow

activated sludge method was set as a comparison. Firstly, the operating conditions of continuous flow

denitrification were optimized. The effects of different carbon nitrogen ratios ( 3 ∶ 1, 3. 5 ∶ 1 and 4 ∶ 1) on

denitrification were studied by adjusting the carbon source, and the hydraulic retention time (8 h, 10 h and 12

h) of continuous flow was changed to find a sufficient effective reaction time. The ratio of carbon to nitrogen and

hydraulic retention time were kept, and the influent nitrate concentration was gradually increased under the

optimal operating conditions. The results showed that the best operating conditions of continuous flow

denitrification were C / N ratio of 3.5 and HRT of 12 hours. Under this operating condition, the total nitrogen

removal rate of wastewater with influent nitrate concentration of 600 mg / L, 1 200 mg / L and 1 500 mg / L reached

96.69%, 92.95% and 90. 93%, respectively. The experiment showed that compared with continuous flow

activated sludge process, continuous flow biofilm process had higher total nitrogen removal rate and lower nitrite

nitrogen accumulation rate for the treatment of wastewater with high nitrate concentration, which can provide not

only reference for the optimization of high concentration wastewater treatment, but also basic data for the

operation of photovoltaic wastewater with high concentration of nitrate nitrogen in the future.

Keywods: high nitrate nitrogen; photovoltaic wastewater; biofilm process; activated sludge process; continuous

flow; best working condition

(责任编辑 王龙杰)

190

第195页

第 40 卷 第 2 期

2022 年 3 月

广西师范大学学报(自然科学版)

Journal of Guangxi Normal University (Natural Science Edition)

Vol. 40 No. 2

Mar. 2022

DOI: 10.16088 / j.issn.1001-6600. 2021022202 http: xuebao.gxnu.edu.cn

周俊, 陈舒曼, 邢兵, 等. 正常来源 CD4

+CD25

+细胞在小鼠肺癌模型中的抗肿瘤作用[J]. 广西师范大学学报(自然科学版), 2022, 40(2):

191-199. ZHOU J, CHEN S M, XING B, et al. Antitumor effect of normal mice derived CD4

+CD25

+

cells in mice lung cancer model[J]. Journal of

Guangxi Normal University (Natural Science Edition), 2022, 40(2): 191-199.

正常来源 CD4

+

CD25

+ 细胞在小鼠肺癌

模型中的抗肿瘤作用

周 俊1,2,3

, 陈舒曼1,2,3

, 邢 兵1

, 陈雅静1,2,3

, 李银玲1,2,3

, 何 柳1,2,3

, 周祖平1,2,3

, 蒲仕明1,2,3∗

(1. 广西师范大学 生命科学学院, 广西 桂林 541006; 2. 广西高校干细胞与医药生物技术重点实验室(广西师范大学),

广西 桂林 541004; 3. 广西师范大学 生物医学研究中心, 广西 桂林 541004)

摘 要: CD4

+

CD25

+细胞是一群具有免疫抑制活性的 T 细胞, 又称为调节性 T 细胞( regulatory T cells, Tregs)。 肿瘤发生

中 Tregs 会抑制 T 细胞的活化, 促进肿瘤的发生、 发展, 而正常生理来源的 Tregs 回输后产生的免疫调节作用是未知的。

为探讨正常生理状态下 Tregs 的免疫调节作用, 利用小鼠肺癌模型和细胞移植术, 比较正常和荷瘤小鼠 CD4

+

CD25

+细胞

移植对肿瘤生长、 受体小鼠 T 细胞产生以及肺部病变的影响。 结果显示: 与对照组相比, 移植正常 CD4

+

CD25

+细胞的小

鼠生存期延长、 肿瘤生长缓慢, 其外周血与脾脏中 T 细胞及其亚群含量增加, 小鼠肺部无明显病变; 而移植荷瘤

CD4

+

CD25

+细胞的小鼠生存期缩短、 肿瘤生长较快, 其外周血与脾脏中 T 细胞及其亚群含量显著下降, 肺部出现更严重

弥散灶性病变。 这些结果表明, 正常来源 CD4

+

CD25

+细胞在小鼠肺癌模型中具有抗肿瘤作用。

关键词: 肺癌; CD4

+

CD25

+细胞; 细胞移植; 肿瘤进程; 免疫调节

中图分类号: R734.2 文献标志码: A 文章编号: 1001-6600(2022)02-0191-09

肺癌是最常见的癌症类型,致死率居高不下的主要因素有遗传、环境以及肿瘤治疗产生的不良反

应[1-2]

。 肺癌是一种异质性疾病,包括多个具有病理和临床相关性的亚型,主要分为小细胞肺癌和非小细

胞肺癌[3]

。 肺癌的发生发展与机体的免疫系统密切相关,正常的免疫应答是机体抵抗肿瘤发生发展的重

要因素。 免疫系统和肿瘤细胞相互作用能够影响肿瘤的形成和进程[4]

。 在肿瘤组织中,肿瘤细胞、基质

细胞、免疫细胞等共同构成肿瘤微环境[5-6]

。 肿瘤微环境是一个复杂的细胞生态位,其免疫细胞能够在肿

瘤向恶性肿瘤转化的过程中与肿瘤细胞共同进化,并为肿瘤细胞提供支持,促进肿瘤的存活和进程。 研究

发现,肿瘤微环境中免疫细胞的种类和数量在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,其中骨髓来源的抑制

性细胞(myeloid derived suppressor cells)和 Treg 细胞的数量与肿瘤患者临床预后负相关[7]

。 CD4

+

CD25

+

细胞在抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。 CD4

+

CD25

+细胞是调节性 CD4

+

T 细胞亚群,可以被自身抗原

和非自身抗原激活,激活后非特异性抑制 T 细胞在维持机体免疫耐受和体内平衡中起重要作用[8]

。 目

前,肿瘤发生中 CD4

+

CD25

+免疫抑制机制已有初步研究结果:CD4

+

CD25

+细胞介导的抑制是通过一种独

立于细胞因子之外的未知的细胞接触依赖机制;而在体内,则可能存在多种抑制机制[9]

,一是 CD4

+

CD25

+

细胞的不同亚群通过细胞接触(例如表达机制性受体 CTLA-4 和 LAG-3

[10-11]

)或者多种细胞因子(例如 IL10、TGF-β、IL-35

[12-14]

)产生抑制,二是 CD4

+

CD25

+细胞可能被多种机制抑制。 然而在正常生理状态下,仍

有大量 Treg 细胞存在,可以抑制炎症并抑制许多自身免疫性疾病[15-16]

。 这些正常状态下的 Treg 细胞在肿

瘤环境中是否发挥着与肿瘤来源 Treg 细胞同样的免疫调节作用,还有待确认。

收稿日期: 2021-02-22 修回日期: 2021-04-26

基金项目: 国家自然科学基金(81972700, 61827819); 广西自然科学基金(2018GXNSFBA281115); 广西大学生创新

创业训练项目(202010602052)

通信作者: 蒲仕明(1987—), 男, 四川南充人, 广西师范大学助理研究员, 硕士。 E-mail: pushiming77@163.com

第196页

广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

本研究利用 Lewis 肺癌模型,探讨移植正常和荷瘤小鼠脾脏来源的 CD4

+

CD25

+细胞对荷瘤小鼠的免

疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级 C57BL / 6J 小鼠购自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司,在广西师范大学干细胞与医药生

物技术重点实验室实验动物中心饲养至 8 周,挑选体质量(22±0.5) g 健康小鼠用于实验。

1.1.2 实验仪器

流式细胞分选仪(FACS Aria SORP)和流式细胞分析仪(FACS Verse)购自 Becton Dickinson 公司;超

纯净去离子水组合系统(Nanopure Life Scientific) 和台式高速冷冻离心机( Labofuge400R) 购自 Thermo

Fisher 公司;超净工作台购自 ESCO 公司。

1.1.3 实验试剂

Anti-mouse CD3-PerCP-eFluor710、Anti-mouse CD25-APC、Anti-mouse CD4-FITC、Anti-mouse CD8-PECy7、7-AAD、DMEM 培养基购自 Thermo Fisher 公司;无钙镁 20×PBS 溶液购自上海生工生物工程有限公

司;青链霉素混合液、红细胞裂解液等购自 Solarbio 公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌小鼠模型构建

选择对数生长期的 LLC 细胞,消化后 PBS 重悬为 2.5×10

6个/ mL 单细胞悬液。 将单细胞悬液接种于

小鼠左腋皮下,每只小鼠接种 0.2 mL,对照组注射等体积的 PBS。 受体荷瘤小鼠分 3 组:1)移植正常小鼠

脾脏来源 CD4

+

CD25

+细胞的荷瘤小鼠(N-Treg-T);2)移植荷瘤小鼠脾脏来源 CD4

+

CD25

+细胞的荷瘤小鼠

(T-Treg-T);3)注射等体积 PBS 的荷瘤小鼠为对照组(PBS-T)。

1.2.2 流式细胞分选

T-Treg 细胞供体小鼠是接种 LLC 细胞 5 周后、肿瘤体积大于 2 cm

3 的小鼠;N-Treg 细胞供体小鼠是注

射等体积 PBS 5 周后的小鼠。 首先,在无菌条件下制备小鼠脾脏单细胞悬液,经红细胞裂解和细胞筛过滤

后,离心去上清并计数;接着,使用 7-AAD、Anti-mouse CD4-FITC、Anti-mouse CD25-APC 流式抗体4 ℃ 避光

孵育 30 min;然后,用 PBS 洗涤重悬,并进行流式细胞分选(或分析);最后,收集得到 CD4

+

CD25

+ 细胞,

备用。

1.2.3 细胞移植

将 PBS 重悬流式分选得到的正常和荷瘤小鼠脾脏来源的 CD4

+

CD25

+细胞调整为 1.25×10

5个/ mL 后,

于实验鼠接种 LLC 细胞当日,尾静脉移植 CD4

+

CD25

+细胞,每只小鼠注射约 0.2 mL。 对照组为尾静脉注

射等体积 PBS。

1.2.4 肿瘤体积测量

LLC 细胞接种 5 周后,用游标卡尺测量肿瘤的长径 a、短径 b,并计算肿瘤体积。

1.2.5 流式细胞分析

移植 CD4

+

CD25

+细胞 5 周后,处死小鼠,取外周血(眼球取血)、脾脏制备单细胞悬液。 悬液经红细胞

裂解和细胞筛过滤后,离心去上清;使用 Anti-mouse CD3-PerCP-eFluor710、Anti-mouse CD4-FITC、Antimouse CD8-PE-Cy7 流式抗体 4 ℃避光孵育 30 min,PBS 洗涤重悬后,进行流式分析 T 细胞及亚群的丰度。

1.2.6 数据统计

所有数据采用 GraphPad Prism 6 软件进行统计学分析;组间分析采用 t 检验,P<0.05 表示差异具有统

计学意义。

192

第197页

http:∥xuebao.gxnu.edu.cn

2 结果

2.1 正常/ 荷瘤小鼠脾脏中存在相当数量的 Treg 细胞

为确定在正常生理与病理(肿瘤)状态下 Treg 细胞的数量,本文利用流式细胞术分析 CD4

+

CD25

+细胞

在正常小鼠与肺癌荷瘤小鼠脾脏中的含量与绝对数量,结果如图 1 所示。 正常和荷瘤小鼠脾脏中,

CD4

+

CD25

+细胞分别约占总细胞数的 2.39%和 1.32%(图 1a),统计分析后发现两者之间存在显著性差异

(2.408±0.148 3 vs 1.347±0.187 9, P = 0.002 2)(图 1b)。 同时,我们发现肿瘤状态下,小鼠脾脏体积明显

增大(图 1c),随后对小鼠 CD4

+

CD25

+细胞的绝对数量进行统计分析,发现荷瘤小鼠脾脏 CD4

+

CD25

+细胞

的绝对数量显著高于对照组小鼠(8.246±1.018 vs 3.098±0.520 6, P = 0.002) (图 1d)。 肿瘤发生中,Treg

细胞数量明显上升,揭示了 Treg 细胞在肿瘤免疫调节(主要是免疫抑制)中的重要性。 然而,正常生理状

态下也存在大量的 Treg 细胞,那么正常生理状态下 Treg 细胞与肿瘤来源的 Treg 细胞是否具有同样的免

疫调节作用呢? 具体见下节。

∗表示 P<0.05;∗∗表示 P<0.01;∗∗∗表示 P<0.000 1,n = 5

图 1 正常和荷瘤小鼠脾脏大小和 CD4

+

CD25

+细胞的含量比较

Fig. 1 Comparison of spleen size and CD4

+

CD25

+

cell content in normal and tumor-bearing mice

2.2 正常来源 Treg 细胞较肿瘤来源 Treg 细胞具有相反的免疫调节作用

为检测正常生理状态下 Treg 细胞的免疫调节作用,在小鼠皮下接种 LLC 细胞当日,尾静脉注射正常

或荷瘤来源的 CD4

+

CD25

+细胞,对照组尾静脉注射等体积 PBS,观察 3 组小鼠肿瘤的生长情况,并于接种

后第 5 周统计肿瘤质量。 肿瘤大小直观图如图 2a 所示。 肿瘤大小统计分析结果显示,在接种 5 周后,移

植正常小鼠来源 CD4

+

CD25

+细胞的受体荷瘤小鼠的肿瘤质量显著小于对照组(5.328±0.501 1 vs 7.588±

0.655 5, P = 0.025 5),同时也显著小于移植荷瘤小鼠来源 CD4

+

CD25

+细胞的受体荷瘤小鼠的肿瘤质量

(5.328±0.501 1 vs 9.580±0.310 1, P<0.000 1);与之相反,移植肿瘤来源的 CD4

+

CD25

+细胞小鼠的肿瘤质

量显著大于对照组(9.580±0.310 1 vs 7.588±0.655 5, P = 0.025 2)(图 2b)。

193

第198页

广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

∗表示 P<0.05;∗∗表示 P<0.01;∗∗∗表示 P<0.000 1

图 2 荷瘤小鼠移植不同来源 CD4

+

CD25

+细胞 5 周后肿瘤生长情况

Fig. 2 Tumor growth of mice after 5 weeks of transplantation of CD4

+

CD25

+

cells from different sources in tumor-bearing mice

2.3 正常来源 Treg 细胞延长了荷瘤小鼠生存时间

为检验正常来源 Treg 细胞的免疫调节能力,记录了移植正常来源 Treg 细胞和肿瘤来源 Treg 细胞的

荷瘤小鼠生存情况,结果如图 3 所示。 与对照组相比,移植正常来源 CD4

+

CD25

+细胞组小鼠的生存期显

著性增长(P = 0.007 6),而移植荷瘤小鼠来源 CD4

+

CD25

+细胞的受体小鼠的生存期缩短(P = 0.026 3)。

上述结果表明,肿瘤来源的 Treg 细胞具有免疫抑制作用,而正常来源的 Treg 细胞抑制着肿瘤的生长,具有

免疫促进作用。

图 3 移植不同来源 CD4

+

CD25

+细胞后小鼠生存时间(n = 8)

Fig. 3 Survival time of mice after transplantation of CD4

+

CD25

+

cells from different sources (n = 8)

2.4 正常来源 Treg 细胞促进了荷瘤小鼠中 T 细胞增殖

为探索正常来源的 Treg 细胞对 T 细胞的免疫调节作用,在移植正常/ 肿瘤来源的 CD4

+

CD25

+细胞 5

周后,处死小鼠,利用流式细胞术分析小鼠外周血与脾脏中 CD3

+

T 细胞、CD3

+

CD4

+

T 细胞和 CD3

+

CD8

+

T

细胞的丰度,结果如图 4 所示。 与对照组相比,移植正常小鼠来源的 CD4

+

CD25

+细胞小鼠的脾脏中,CD3

+

T 细胞(21.81±0.628 9 vs 18.58±1.312, P = 0.043 1) (图 4A)、CD3

+

CD4

+

T 细胞(11.24±0.497 1 vs 8.935±

0.891 1, P = 0.040 1)(图 4B)、CD3

+

CD8

+

T 细胞(8.696±0.435 4 vs 7.073±0.543 8, P = 0.035 2)(图 4C)的

细胞丰度显著增加。

在外周血中也呈现相似差异,移植正常小鼠来源 CD4

+

CD25

+细胞小鼠的外周血中,CD3

+

T 细胞(21.73±

1.509 vs 15.78±0.367 3, P = 0.001 8) (图 5A)、CD3

+

CD4

+

T 细胞(8.811±0.749 9 vs 6.186±0.551 6, P =

0.013 6)(图 5B)、CD3

+

CD8

+

T 细胞(12.99±0.749 6 vs 9.451±0.782 3, P = 0.005 7)(图 5C)的细胞丰度显

著增加。 结果表明,移植正常来源的 Treg 细胞能促进 T 细胞的增殖,与移植肿瘤来源的 Treg 细胞具有相

反的调节 T 细胞增殖的能力。

194

第199页

http:∥xuebao.gxnu.edu.cn

A1、A2 为移植后小鼠脾脏 CD3

+

T 细胞的表达;B1、B2 为移植后小鼠脾脏 CD3

+CD4

+

T 细胞的表达;

C1、C2 为移植后小鼠脾脏 CD3

+CD8

+

T 细胞的表达。 ∗表示 P<0.05;∗∗表示 P<0.01;∗∗∗表示 P<0.000 1(n = 8)

图 4 移植不同来源 CD4

+

CD25

+细胞后小鼠脾脏 T 细胞及其亚群的表达情况

Fig. 4 Expression of splenic T cells and their subpopulations in mice after transplantation of

CD4

+

CD25

+

cells from different sources

2.5 正常来源 Treg 细胞减缓了荷瘤小鼠的肿瘤肺转移症状

为检验正常来源的 Treg 细胞在肿瘤转移的免疫调节能力,在移植正常/ 肿瘤来源的 CD4

+

CD25

+细胞 5

周后,处死小鼠,利用 HE 组织染色技术观察肺部病变情况,见图 6。 结果显示:对照组小鼠肺表面出现肺

转移情况,HE 组织染色显示,肺泡轮廓可见,肺泡壁细胞坏死,细胞核形状出现明显变化,有炎症细胞浸

润。 与对照组相比,移植正常小鼠来源的 CD4

+

CD25

+细胞小鼠的肺部外观正常,无明显转移现象,HE 组

织染色与外观结果相符合,无明显病变;而移植荷瘤小鼠来源的 CD4

+

CD25

+细胞小鼠的肺部外观出现更

明显的肺转移情况,肺部体积增大,HE 组织染色可见弥散的灶性病变,病灶内肺组织周围固有结构被破

坏。 结果表明,移植正常来源的 Treg 细胞能减缓肿瘤肺转移的速度,有助于维持肺部的正常形态和功能。

3 讨论

正常的免疫应答是机体抵抗肿瘤发生和发展的重要因素,其中 CD4

+

CD25

+细胞介导的细胞免疫应答

在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。 大量研究表明,肿瘤患者预后不良[17]

、生存率下降与 Treg 细胞高表达密

切相关,Treg 细胞能够引发免疫耐受[18]

。 但也有研究表明,Treg 细胞对多种炎症性疾病有治疗或预防效

果,例如:小鼠肺纤维化形成之前,移植正常来源 CD4

+

CD25

+细胞能够有效减轻其肺纤维化程度[19]

;白塞

195

第200页

广西师范大学学报(自然科学版),2022,40(2)

病小鼠移植正常来源 CD4

+

CD25

+细胞可改善其感染症状[20]

。 因此,本文利用肺癌皮下移植肿瘤模型小鼠

探究正常生理状态下 Treg 细胞的免疫调节作用。

A1、A2 为移植后小鼠外周血 CD3

+

T 细胞的表达;B1、B2 为移植后小鼠外周血 CD3

+CD4

+

T 细胞的表达;

C1、C2 为移植后小鼠外周血 CD3

+CD8

+

T 细胞的表达。 ∗表示 P<0.05;∗∗表示 P<0.01;∗∗∗表示 P<0.000 1(n = 8)

图 5 移植不同来源 CD4

+

CD25

+细胞后小鼠外周血 T 细胞及其亚群的表达情况

Fig. 5 Expression of peripheral blood T cells and their subpopulations in mice after

transplantation of CD4

+

CD25

+

cells from different sources

图 6 移植不同来源 CD4

+

CD25

+细胞后小鼠肺部组织及 HE 组织染色切片

Fig. 6 Lung tissue and HE tissue staining sections of mice after transplantation of CD4

+

CD25

+

cells from different sources

196

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