热带作物学报 2023, 44(11): 21792187

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2023-02-02；修回日期 2023-02-17

基金项目 国家自然科学基金项目（No. 32260419）；研究生创新课题（No. 2022ZKY463）。

作者简介 臧 睿（1998—），女，硕士研究生，研究方向：分子植物育种。*通信作者（Corresponding author）：和凤美（HE Fengmei），

E-mail：hefengmei918@126.com。

mRNAs/microRNAs 调控网络探索石斛花型差异分子机理研究

臧 睿，陈 宇，赵 美，郝玉恒，敖 叠，李凯莉，方诗迪，赵奇明，

和凤美*

云南农业大学园林园艺学院，云南昆明 650201

摘 要：目前兰科植物花型多样性形成分子机理仍不清楚，本研究对铁皮石斛、美花石斛花器官进行转录组和 microRNA

测序，通过 cytoscape 构建 miRNA-mRNA 网络和靶基因蛋白互作网络并进行差异比较，以期在分子水平上探究 2 种石斛

花型差异分子机理。转录组研究结果表明，与花发育相关的 mRNAs 有 MADS-box AP3 基因、激素类基因等。miRNA-mRNA

网络分析表明，差异表达的 miRNAs、mRNAs 参与了花型差异形成，miR5179 与靶基因 AP3、miR160 与靶基因 ARFs、

miR164 与靶基因 NAC021、miR159 与靶基因 GAM1、bdi-miR159 与靶基因 CKX9、miR167b-3p 与靶基因 ANT 可能参与

花型形成，以上 miRNA 均在铁皮石斛中上调表达。蛋白互作通路表明，2 种石斛有 AP3 这一关键基因，美花石斛缺少

CUL1、TIR1、TIR1A、RBS 四个基因；2 种石斛的生长素反应互作通路中存在 2 个差异表达的 ARFs 基因，美花石斛缺失

1 个 ARFI 基因；美花石斛特异性地拥有由 NAC021 基因构成的生长素信号转导靶基因蛋白互作通路。铁皮石斛和美花石

斛花型差异表达 miRNAs/mRNAs 以及靶基因蛋白互作差异可能是导致 2 种石斛花型差异的主要机理。

关键词：铁皮石斛；美花石斛；花型；转录组；small RNA；调控网络

中图分类号：S682.31 文献标识码：A

Differential Molecular Mechanism of Dendrobium Flower Pattern

Using mRNAs/microRNAs Regulatory Network

ZANG Rui, CHEN Yu, ZHAO Mei, HAO Yuheng, AO Die, LI Kaili, FANG Shidi, ZHAO Qiming,

HE Fengmei*

College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China

Abstract: The molecular mechanism of the formation of flower diversity is still unclear. In this study, the transcriptome

and microRNA sequencing of Dendrobium officinale and D. loddigesii flower organs were performed, and the

miRNA-mRNA network and target protein interaction network were constructed by cytoscape and compared at the molecular level. The results of transcriptome studies showed that mRNAs related to flower development had MADS-box

AP3 gene, hormone genes, etc. The miRNA-mRNA network analysis showed that the differentially expressed miRNAs

and mRNAs were involved in the differential formation of floral pattern, and miR5179 and its target genes AP3, miR160

and their target genes ARFs, miR164 and its target genes NAC021, miR159 and the target genes GAM1, bdi-miR159 and

the target genes CKX9, miR167b-3p and the target genes ANT may be involved in floral pattern formation, and the above

miRNA was upregulated in D. officinale. The protein interaction pathway showed that two kinds of dendrobium had the

key gene of AP3, D. loddigesii lacked four genes: CUL1, TIR1, TIR1A and RBS; there weret wo differentially expressed

ARFs genes in the auxin response interaction pathway of two Dendrobium, and D. loddigesii lacked one ARFI gene; D.

loddigesii flora specifically possessed the protein interaction pathway of auxin signal transduction target genes constituted

by the NAC021 gene. Differential expression of miRNAs/mRNAs in D. officinale and D. loddigesii and protein interaction

of target genes may be the main mechanisms leading to the difference between the two Dendrobium flower types.

2180 热带作物学报 第 44 卷

Keywords: Dendrobium officinale; Dendrobium loddigesii; flower pattern; transcriptome; small RNA; regulatory network

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.005

MicroRNAs（miRNAs）是由单链前体（premiRNAs）自发配对形成发夹状结构，并在转录后

通过介导靶基因 RNA 的降解或抑制蛋白质的翻

译调控基因表达的非编码小 RNA（small RNAs,

sRNAs）。在植物叶和根的形态发生、花的诱导、

器官发生、繁殖和胁迫响应等逆向生物学过程中

发挥重要作用[1-3]。根据前人研究意大利兰的花序

中一个 MADS-box/DEF-like（AP3）转录本被

miR5179 同源物所切割[4]，在水稻中存在 miR5179

靶向调控 MADS-box 类基因[5]。AP3 基因有调控

多元化花被片和唇瓣的功能，表明在进化过程中

存 在 miRNA 介导的花发育调控机制。此外

miRNA172 作为 AP2 的负调控因子可抑制 AP2

基因表达，花期提前，使花瓣数目减少[6-7]。苹果、

拟南芥中均有 miR160-Auxin 响应因子（ARF）[8-9]。

miR164 家族（miR164a, miR164b, miR164c）与其

靶基因 NAC（CUC1 与 CUC2）间的关系决定了植

物花型的完整性 [10] 。在春兰中，

miR319/TCP4-miR396/GRF 联级调控多膜细胞增

殖发育[11]。

目前对花模式和花型发育的分子机制的了

解还很有限，兰科植物花器官高度特化，形态多

样，为花的形态调控分子机理的研究提供了素材

模式[12-13]。铁皮石斛（D. officinale）和美花石斛

（D. loddigesii）花器官迥异，唇瓣形态差异巨大，

铁皮石斛唇瓣为反折的卵状披针形，美花石斛的

唇瓣边缘具短流苏呈筒状向内翻卷的近圆形[14]，

是研究花器官形态差异分子机理的理想材料。本

研究通过高通量测序技术检测 2 种石斛的差异显

著的花器官，对 microRNA 和 mRNA 表达谱进行

分析，构建 miRNA-mRNA 调控网络，以期识别

对 2 种花型形成起到调控作用的差异 miRNAs 及

调控的靶点，以及靶基因互作差异，以期了解石

斛属植物负责调控花被表型及调控花形态发生的

分子调控机制，并为未来兰花分子植物育种提供

一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所采用的铁皮石斛、美花石斛组织培

养苗种植于云南农业大学园林园艺学院基地大

棚，开花时期采摘其花蕾放入液氮冻存。

1.2 方法

1.2.1 转录组及 micro RNA 文库的构建与测序

采用 Trizol 试剂分别提取铁皮石斛和美花石斛不

同大小花蕾总 RNA，cDNA 文库和小 RNAs 文库

构建和测序方法参考文献[15-19]，测序工作由上

海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2.2 转录组功能注释 使用 Diamond 软件在

NR、Swiss-Prot、COG 数据库进行序列比对，使

用 Blast2g、HMMER 软件分别在 GO、Pfam 数据

库比对，使用 KOBAS2.1 软件获得 KEGG

Orthology 结果。

1.2.3 miRNAs 鉴定 在 Illumina 测序平台进行

small RNA 测序。测序得到的原始数据经过滤后

得到有效序列，有效序列经比对和软件预测分别得

到铁皮石斛和美花石斛文库，以及保守 miRNAs 和

新 miRNAs，具体方法参考文献[20-21]。

1.2.4 DEGs 分析 利用 RSEM 分析表达水平，

定量指标为 TPM（transcripts per million reads）。

基于表达量定量结果，使用 DEGseq 进行组间差

异基因分析，对不同样品间的 raw counts 进行标

准化处理，|log2FC|≥1 & padjust<0.001 作为过滤

条件，筛选差异表达的 miRNAs 和 mRNAs，采

用 BH（fdr correction with Benjamini/Hochberg）

对 P-value 进行矫正。

1.2.5 miRNA- mRNA 调控网络的构建 使用

psRobot 预测 miRNAs 的靶基因，对 miRNA 与

mRNA 的表达量进行关联分析，获得表达相关性

（正调控或负调控），使用 Cytoscape 软件可视化。

设置 TSS 上游 5000 到下游 1000，P-value 阈值

（FIMO）为 0.000 05。

1.2.6 蛋白互作网络构建 使用 STRING 数据库

进行蛋白互作网络分析，获得蛋白互作关系

（protein-protein interaction, PPI），将所得结果导入

Cytoscape 软件中进行可视化处理，构建 PPI 网络。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛、美花石斛的花器官形态学特征

比较分析

铁皮石斛与美花石斛花型有很高观赏价值，

其中唇瓣是主要观赏部位，表形差别最大。铁皮

第 11 期 臧 睿等：mRNAs/microRNAs 调控网络探索石斛花型差异分子机理研究 2181

石斛具长圆披针形萼片和花瓣，萼片长约 1.8 cm，

宽 4~5 mm，具 5 条脉；唇瓣基部具 1 个绿色或黄

色的胼胝体，卵状披针形，中部反折（图 1A）。

美花石斛花瓣与萼片近似呈卵状披针形，宽

8~9 mm；唇瓣近圆形，直径 1.7~2.0 cm，上面中

央金黄色，呈筒状向内翻卷，边缘具短流苏，两

面密布短柔毛（图 1B）。

图 1 铁皮石斛（A）和美花石斛（B）完全

开放的花器官

Fig. 1 Fully open floral organs of D. officinale

(A) and D. oddigesii (B)

2.2 转录组测序组装及分析

本研究检测到 2 种石斛的表达基因共 26 789

个。铁皮石斛 25 821 个，其中已知基因 21 169

个，新基因 4652 个；美花石斛 21 586 个，其中

已知基因 19 546 个，新基因 2040 个。共有 22 724

（88.01%）、21 058（97.55%）个序列得到注释。

2.3 花发育、激素反应相关基因分析

铁皮石斛中获得 92 个与花发育相关的基因，

根据功能注释和序列比对，其中 AP2 类基因 6 个，

MADS-box 家族基因 63 个，NAC 类基因 4 个，

MYB 类基因 3 个，TCP 家族基因 16 个（图 2）。

美花石斛中获得 69 个与花发育相关的基因，其中

AP2 类基因 6 个，MADS-box 家族基因 42 个，

NAC 类基因 5 个，MYB 类基因 2 个，TCP 家族

基因 14 个（图 3）。与激素反应（Auxin、GA、

CTK、ABA、BR）有关的基因，铁皮石斛中有

206 个，美花石斛中有 193 个。

2.4 miRNA 分析及靶基因预测

sRNA 统计中铁皮石斛、美花石斛的 miRNA

序列分别有 226 904、79 225 个。而 miRNA 成熟

体分别为 2755、2230 个，其中 2600、2185 个为

已知 miRNAs，155、45 个为未知 miRNAs。铁皮

石斛、美花石斛中表达量最高的是 miR319 家族，

此外，miR535、miR159 和 miR171 家族等也有高

丰度的表达。

图 2 铁皮石斛与花型发育有关基因统计

Fig. 2 Statistics of genes involved to floral

development in D. officinale

图 3 美花石斛与花型发育有关基因统计

Fig. 3 Statistics of genes involved to floral

development in D. loddigesii

铁皮石斛有 2496 个 miRNA 预测到了 1264

个靶基因，6 个未知 miRNAs；美花石斛有 2076

个 miRNA 预测到了 1609 个靶基因，2 个未知

miRNAs，根据其靶向关系，存在一个基因被多个

miRNA 靶向，一个 miRNA 靶向多个基因。这些

miRNA 的靶基因大多被归类为转录因子，如

MADS-box 转录因子（miR5179）、MYB 家族转

录因子（miR159、miR319）等。其他一些基因被

归类为功能性基因蛋白质，如 F-box 蛋 白

（ miR393、 miR394）、cytokinin dehydrogenase

4-like（miR159）等，均参与植物的代谢和环境刺

激反应。Novel miRNA 的靶基因大多归类为未知

功能基因。

2.5 与花型发育有关的 miRNA 及其靶基因

本项目拥有 2 个共表达的 miR5179 家族成员

osa-miR5179 和 bdi-miR5179，成熟序列相同

（UUUUGCUCAAGACCGCGCAAC），长度为

21 bp，且定位到参考基因组上，靶向 2 个差异表

达 的 AP3 基因，根据序列比对 MADS16

（LOC110093040）为 AP3-3 基因，MADS16

（LOC110103364）为 AP3-2 基因，它们可能是 2

种石斛花型形成的关键差异 miRNA 及靶基因。

miR319、miR159 共同调控 2 个参与花器官发育

2182 热带作物学报 第 44 卷

且为赤霉素转录激活因子（GAM1）的 MYB 类基

因，ath-miR5021 调控与花型发育有关的 4 个 TCP

家族基因；3 个 APETALA2-like 的基因与 miR172

相互作用，miR164 调控 2 个与花型发育相关的

NAC 家族基因；此外 miR167 与 2 个作为生长素

转录因子的基因（ARF）相互作用，bdi-miR159c

调控 1 个催化细胞分裂素的氧化基因（CKX9），

miR160 靶向 4 个作为生长素转录因子的基因

（ARF），miR167 靶向 ANT。另外，miR408、miR528

也调控生长素转录因子的表达。这与前人的研究

结果一致，因此，推测以上 miRNA 及其靶基因

为花型形成候选 miRNA 和靶基因。

2.6 miRNA-mRNA 调控网络构建

将表达 miRNA 及其靶标进行 miRNA-mRNA

关联分析，最后将数据导入 Cytosc-ape 软件对

miRNA-mRNA 调控网络进行可视化处理，筛选

与花型形成有关 miRNA 及其靶基因，得到 22

个共表达的靶基因及其相关 miRNA，和在铁皮

石斛中特异性表达的 vca-miR167b-3p 及其靶基

因（表 1）。

表 1 miRNA-mRNA 调控网络中与花型发育有关的 miRNA 及其靶基因统计

Tab. 1 Statistical of the miRNA and its target genes involved in floral pattern development in

miRNA-mRNA regulatory network

基因名称

Gene name

TP_1vsMH_2

(log2FC) miRNA TP_1vsMH_2

(log2FC)

Nr 注释

Nr description

MADS16

(LOC110106631)

‒0.768 830 261 30 osa-miR5179;

bdi-miR5179

‒1.622 324 615 93 MADS-box transcription factor 16-like [Dendrobium catenatum]

MADS16

(LOC110093040)

1.109 557 191 60 osa-miR5179;

bdi-miR5179

‒1.622 324 615 93 MADS-box transcription factor 16 [Dendrobium catenatum]

MADS16

(LOC110103364)

‒2.072 810 395 28 osa-miR5179;

bdi-miR5179

‒1.622 324 615 93 MADS-box transcription factor 16 [Dendrobium catenatum]

MADS16

(LOC110096227)

0.553 360 403 33 bdi-miR5179;

osa-miR5179

‒1.622 324 615 93 MADS-box transcription factor 16 [Dendrobium catenatum]

AP2-3

(LOC110107829)

‒0.786 369 378 60 miR172 ‒0.058 359 940 00 APETALA2-like protein 3 isoform X1 [Dendrobium catenatum]

AP2

(LOC110095317)

0.682 606 379 14 miR172 ‒0.058 359 940 00 AP2-like ethylene-responsive transcription factor TOE3

isoform X1 [Dendrobium catenatum]

AP2

(LOC110097153)

‒1.824 070 389 73 miR172 ‒0.058 359 940 00 AP2-like ethylene-responsive transcription factor TOE3

[Dendrobium catenatum]

NAC021

(LOC110116607)

2.926 867 836 60 miR164 ‒1.424 862 521 69 NAC domain-containing protein 21/22-like[Dendrobium

catenatum]

NAC021

(LOC110104882)

3.566 692 272 30 miR164 ‒1.424 862 521 69 NAC domain-containing protein 21/22[Dendrobium catenatum]

GAM1

(LOC110091872)

4.058 220 420 70 miR319/159 0.551 705 000 00/

‒1.113 824 573 00

transcription factor GAMYB isoform X1 [Dendrobium catenatum]

GAM1

(LOC110114505)

1.515 427 374 20 miR319/159 0.551 705 000 00/

‒1.113 824 573 00

transcription factor GAMYB isoform X1 [Dendrobium catenatum]

TCP2

(LOC110093292)

0.623 023 112 54 miR319/159 0.551 705 000 00/

‒1.113 824 573 00

transcription factor TCP2 [Dendrobium catenatum]

TCP24

(LOC110114709)

‒0.043 670 325 15 miR319/159 0.551 705 000 00/

‒1.113 824 573 00

transcription factor TCP24-like [Dendrobium catenatum]

TCP2

(LOC110094248)

‒0.570 975 362 11 miR319/159 0.551 705 000 00/

‒1.113 824 573 00

transcription factor TCP24-like [Dendrobium catenatum]

TCP3

(LOC110094779)

‒0.192 780 588 84 miR319/159 0.551 705 000 00/

‒1.113 824 573 00

Transcription factor TCP3 [Dendrobium catenatum]

ANT

(LOC110101314)

‒1.132 614 587 44 vca-miR167b-3p ‒3.000 836 239 18 AP2-like ethylene-responsive transcription factor ANT

[Dendrobium catenatum]

CKX9

(LOC110102256)

‒2.019 303 535 24 bdi-miR159c ‒1.766 370 985 55 cytokinin dehydrogenase 4-like[Dendrobium catenatum]

ARF 12

(LOC110112646)

‒0.111 328 536 76 miR167 ‒0.522 373 360 00 auxin response factor 12 isoform X1 [Dendrobium catenatum]

ARF 17

(LOC110104921)

0.474 397 750 04 miR167 ‒0.522 373 360 00 auxin response factor 17-like [Dendrobium catenatum]

ARF18

(LOC110109117)

4.009 699 676 01 miR160 0.745 670 000 00 auxin response factor 18 isoform X1 [Dendrobium catenatum]

AFR18

(LOC110102977)

1.303 956 073 39 miR160 0.745 670 000 00 auxin response factor 18 [Dendrobium catenatum]

AFR17

(LOC110112371)

2.057 551 206 44 miR160 0.745 670 000 00 auxin response factor 17 isoform X1 [Dendrobium catenatum]

AFR18

(LOC110091857)

‒0.093 840 471 84 miR160 0.745 670 000 00 LOW QUALITY PROTEIN: auxin response factor 18-like

[Dendrobium catenatum]

第 11 期 臧 睿等：mRNAs/microRNAs 调控网络探索石斛花型差异分子机理研究 2183

将关联分析得到与花型形成有关的共表达

miRNA 及其靶基因进行差异分析，删除无显著差

异靶点，得到 6 个与花型形成有关的关联网络（图

4~图 6）。铁皮石斛特异表达的 vca-miR167b-3p

作用靶基因为 ANT（图 4A）；2 个 miR160 负向调

控生长素反应因子（ARFs）ARF18(LOC110109117)、

ARF18（LOC110102977），其中 miR160 在铁皮石

斛中上调表达，2 个靶基因在美花石斛中上调表达

（图 4B）；在铁皮石斛中上调表达的 2 个 miR5179

正向调控 2 个差异表达的 AP3 类靶基因，MADS16

（ LOC110093040 ）在美花石斛中上调表达，

MADS16（LOC110103364）在铁皮石斛中上调表达

（图 4C）；bdi-miR159c 及其靶基因 CKX9 在铁皮石

斛中上调表达（图 4D）；88 个 miR164 在铁皮石斛

中上调表达负向调控 2 个 NAC 家族基因，NAC021

（LOC110104882）被 88 个 miR164 靶向，NAC021

（LOC110116607）被 87 个 miR164 靶向，2 个靶基

因在美花石斛中上调表达（图 5）；44 个 miR159 在

铁皮石斛中上调表达，2 个 MYB 家族靶基因在美

花石斛中上调表达并呈负调控关系（图 6）。

图 4 miR167（A）、miR160（B）、miR5179（C）、miR159（D）调控网络

Fig. 4 miR167 (A), miR160 (B), miR5179 (C), miR159 (D) regulatory network

图 5 miR164 调控网络

Fig. 5 miR164 regulatory network

2184 热带作物学报 第 44 卷

图 6 miR159 调控网络

Fig. 6 miR159 regulatory network

2.7 靶基因 PPI 网络

借助 STRING 数据库和 Cytoscape 软件对 2

种石斛构建 PPI 网络，在可视化网络筛选关联分

析得到的靶基因。铁皮石斛与美花石斛花发育相

关的蛋白互作通路和生长素反应互作通路各不相

同。铁皮石斛花发育互作通路中 AP3-2

（LOC110103364）基因表达量远高于美花石斛，

AP3-3（LOC110093040）基因表达量远底于美花

石斛，美花石斛缺少 CUL1、TIR1、TIR1A、RBS

四个节点基因。生长素反应互作通路中 ARFs 在

铁皮石斛中表达量高于美花石斛，美花石斛缺失

ARF18（LOC110110803）节点基因，而且特异性

拥有一条 NAC 基因组成的生长素信号转导靶基

因蛋白互作通路（图 7，图 8）。

A：与花型形成（MADS-box）、生长素、乙烯反应有关蛋白互作通路；B：与生长素反应有关通路。

A: Protein interaction pathways related to floral type formation (MADS-box) and auxin response;

B: Protein interaction pathways related to the auxin response.

图 7 铁皮石斛靶基因蛋白互作通路图

Fig. 7 Diagram of target gene protein interaction pathways in D. officinale

第 11 期 臧 睿等：mRNAs/microRNAs 调控网络探索石斛花型差异分子机理研究 2185

A：与花型形成（MADS-box）有关基因蛋白互作通路；B：与生长素反应有关通路；C：与生长素（NAC）有关通路。

A: Protein interaction pathways related to floral type formation (MADS-box) and auxin response;

B: Protein interaction pathways related to the auxin response; C: Pathways related to auxin.

图 8 美花石斛靶基因蛋白互作通路图

Fig. 8 Diagram of target gene protein interaction pathways in D. loddigesii

3 讨论

根据前人研究，MADS-box 家族基因在调控

花型形成中发挥重要作用，其中 AP3 亚家族作为

ABCDE 模型的 B 类基因具有调控多元化花被片

和唇瓣的功能[22]，包括 AP3-1、AP3-2 和 AP3-3

等 3 个进化枝，AP3-3 通常只在花瓣中特异性高

表达并作为身份特征基因，是石斛兰的花器官发

育的重要基因[23]。根据转录组数据分析显示，一

个在美花石斛中上调表达的 AP3-3 基因和在铁皮

石斛中上调表达的 AP3-2 基因或许是致使 2 种石

斛花型和唇瓣结构差异的关键基因。此外已有研

究表明，意大利兰和水稻的花序中 miR5179 同源

物靶向 AP3 转录本[4-5]，表明在花器官发育过程中

存在 miRNA 介导的 AP3 花发育调控机制，且在

miRNA-mRNA 调控网络中，miR5179 在铁皮石斛

上调表达并靶向 MADS-box B 类基因 AP3-3、

AP3-2，因此认为 AP3 的差异表达可能与 miR5179

的差异调控有关，说明石斛兰中同样存在 miR5179

靶向 AP3 基因表达的现象，miR5179 可能是石斛

花型发育的关键差异调控分子，miR5179-AP3 花

型发育调控机制可能是石斛兰花型形成 mRNAs/

microRNAs 调控网络的重要组成部分。

ANT 作为一个 A 类 AP2 同源基因可促进花瓣

细胞的特性，参与花器官的起始和发育，维持细

胞的分生组织能力，在器官发生过程中维持细胞

周期调节因子的表达，从而通过控制细胞数量调

控花器官大小，参与花器官发育调节 INO 的自诱

导和表达模式调节花器官发育，并介导花模型 2

轮中的 AG 基因的下调[24]。本研究中一个在铁皮

石斛特异性表达的 miR167 靶向差异显著基因

ANT，表明 2 种石斛 ANT 的差异表达可能与该

miRNA 的缺失有关，因此认为 miR167-ANT 可能

是花器官发育的关键通路。

此外部分激素有关基因也与花型形成有关。

NAC 基因具有调控生长素合成的作用，本研究中

存在差异表达的 NAC021，是生长素信号转导转

录激活因子，在拟南芥 NAC1 转导 TIR1（生长素

受体蛋白）下游的生长素信号，可激活 2 个下游

生长素应答基因 DBP 和 AIR3 的表达[25]。在铁皮

石斛的 PPI 网络中 TIR1 与 UFO（花叶分生组织

特性因子）互作，而 UFO 与 4 个 AP3 基因互作，

包括差异表达的 AP3-2、AP3-3，所以 NAC021 基

因作为生长素调控通路的关键基因可能间接影响

了 AP3 基因的表达，从而在 2 种石斛花型形成过

程发挥作用。已知在核桃等其他园艺植物中

miR164 靶向 NAC 家族基因的表达[26]，本研究

miRNA-mRNA 调控网络中差异表达的 miR164 靶

向 NAC021 基因，表明在兰科植物中同样存在

miR164-NAC 调控机制。

MYB 家族基因 GAM1 为大麦 GAMYB 同源

转录因子，是糊粉蛋白细胞中赤霉素依赖性淀粉

酶表达的转录激活因子，可能与淀粉酶启动子的

5'-TAACAAA-3' box 结合参与花粉和花器官的发

育[27]。miR159 是植物中一类古老保守的 microRNA，

其靶基因主要是一类编码 R2R3 MYB 转录因子的

GAMYB-like 基因。miR159-GAMYB 途径高度保

守，miR159 通过转录后调控 GAMYB 在植物花

器官发育中发挥着重要作用[28]。本研究中差异表

达的 miR159 靶向调控了 2 个差异显著的 GAM1，

说明 2 种石斛中存在 miR159-GAMYB 花器官发

育调控机制，miR159 可能通过靶向 GAM1 的表达

从而调控石斛兰的花器官发育，影响花型形成。

细胞分裂素脱氢酶（CKX）对 CK 具有强底

物专一性，是目前已知的唯一参与 CK 降解过程

2186 热带作物学报 第 44 卷

的酶，已有研究表明，CKX 在植物体内以多基因

家族的形式存在，在系统进化树上可分为 4 组，

但不同的 CKX 基因家族成员都包含 FAD 和

Cytokinine 两个保守的结合域[29]，在本研究关联

分析中差异表达的 bdi-miR159c 靶向 CKX9，使该

基因在铁皮石斛中上调表达。生长素响应因子参

与的 TIR1/AFB-Aux/IAA-ARF 信号通路是植物体

内最重要的信号通路之一，ARF 家族成员在信号

通路中的表达可以调控植物体内如花器官发育等

多种生物学过程[30]，参与花器官的发育差异表达

的 miR160-ARF（Auxin 响应因子），在苹果、拟

南芥中均有体现[8-9]，这与本研究结果一致。

MADS-box 蛋白互作差异可能导致石斛兰花

型差异的关键，2 种石斛中均存在 4 个 B 类（AP3）

花同源性基因 MAD16 并与花叶分生组织特性因

子（UFO）互作，其中存在差异表达的节点 AP3-3、

AP3-2，且这 2 个节点在 miRNA-mRNA 调控网络

中被 miR5179 靶向。研究表明许多激素信号通路

直接或间接参与花器官发育调控，目前研究发现

多种激素都是 MADS-box 的潜在靶点，直接或者

间接参与植物生长发育、花器官形态建成等过程。

在铁皮石斛中存在花模式和激素反应有关基因构

成的调控网络，CUL1 可与 F-box 蛋白形成 SCF

复合物，该复合物在花器官发育和生长素反应过

程中发挥调控作用[31]，且在铁皮石斛 PPI 互作网

络中 F-box 蛋白 UFO 和 TIR1（生长素受体蛋白）

与 CUL1 为互作关系。SCF（CUL1-UFO）复合物

正向调控 B 类（AP3）花同源性基因，SCF（CUL1-

TIR1）复合物作为生长素受体介导 Aux/IAA 蛋白

的蛋白酶降解和调控生长素因子的转录，这与本

研究结果一致，美花石斛 PII 网络中则缺少 CUL1、

TIR1、TIR1A、RBS 基因，这可能是其花型存在差

异的原因之一。此外 ARFs 互作通路中美花石斛

缺少节点 ARF18（LOC110110803），铁皮石斛则

缺少 NAC 互作通路，PPI 网络中 AP3、ARFs、

NAC021 等节点均在 mRNA-miRNA 调控网络显

示。

综上所述，本研究借助生物信息学成功筛选

并构建了 2 种石斛的 miRNA-mRNA 网络和 PPI

网络，发现 2 种石斛与花型形成有关的关联网络

和蛋白互作关系，探讨了可能与花型形成有关的

分子发育机制，为今后阐明石斛属植物花型形成

的分子调控机制提供重要的线索，为分子植物育

种提供数据支撑和参考依据。此外本研究存在一

些不足，由于筛选条件的限制，只能根据前人研

究对关键 mRNA 和 miRNA 进行分析，研究结果

具有局限性；缺乏证明 miRNA-mRNA 调控网络

中靶向关系验证实验。在后续的研究中应通过相

关实验进一步讨论和验证本研究的预测。

4 结论

从铁皮石斛、美花石斛分析发现的 miR5179-

AP3 、 miR167-ANT 、 miR164-NAC 、 miR159-

GAMYB、miR159-CKX、miR160-ARF 关联通路可

能是石斛属植物花型差异的关键 miRNA-mRNA 通

路。其通路中的部分基因如 AP3、ARF、NAC 则是

PPI 网络中的关键节点。以上 miRNA、mRNA 共同

构成分子调控网络调控石斛的花型差异。

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Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-06-05；修回日期 2022-09-15

基金项目 福建省自然科学基金项目（No. 2023J01283）；福建农林大学优秀硕士论文基金项目（No. 1122YS01009）。

作者简介 章杨婷（1998—），女，硕士研究生，研究方向：园林植物与应用。*通信作者（Corresponding author）：周育真（ZHOU

Yuzhen），E-mail：zhouyuzhen@163.com。

一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因 RT-qPCR 内参

基因筛选

章杨婷1

，张燕萍1

，黄静妍1

，王文君1

，童 妍1

，赵 凯2

，周育真1*

1. 福建农林大学风景园林与艺术学院/兰科植物保护与利用国家林业和草原局重点实验室，福建福州 350002；2. 福建师范

大学生命科学学院，福建福州 350117

摘 要：一心维纳斯蝴蝶兰（Phalaenopsis I-Hsin Venus）花型优雅、花期持久、花香馥郁，是优良的香花品种，具有

较高的园林观赏价值和经济价值。为筛选适用于一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因表达分析的内参基因，本研

究以一心维纳斯蝴蝶兰不同花期（中蕾期、初开期、盛开前期、盛开中期、盛开后期、衰败期）的转录组数据为基础，

选取了 ACT1、ACT2、ACT3、GAPDH、EF1α、TUA、TUB 和 Ubi 共 8 个管家基因作为候选内参基因，利用实时荧光

定量 PCR（RT-qPCR）技术检测候选内参基因在花朵不同发育时期的表达情况，并利用 geNorm、NormFinder、BestKeeper

三个内参基因稳定性分析软件对候选内参基因进行分析。综合分析结果表明，ACT1 的稳定性最高，可作为一心维纳斯

蝴蝶兰相关基因表达分析的最适内参基因。

关键词：一心维纳斯蝴蝶兰；内参基因；实时荧光定量 PCR；表达稳定性

中图分类号：S682.31 文献标识码：A

Selection of Suitable RT-qPCR Reference Genes for Floral Scent

Biosynthesis in Phalaenopsis I-Hsin Venus

ZHANG Yangting1

, ZHANG Yanping1

, HUANG Jingyan1

, WANG Wenjun1

, TONG Yan1

, ZHAO Kai2

,

ZHOU Yuzhen1*

1. College of Landscape Architecture and Art, Fujian Agricultural and Forestry University / Key Laboratory of National Forestry and

Grassland Administration for Orchid Protection and Utilization, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. College of Life Sciences, Fujian

Normal University, Fuzhou, Fujian 350117, China

Abstract: Phalaenopsis I-Hsin Venus is an excellent variety of fragrant flowers, with elegant flower types, long flowering period and rich floral fragrance, which has high garden ornamental value. ACT1, ACT2, ACT3, GAPDH, EF1α, TUA,

TUB and Ubi, were selected as the candidate internal reference genes based on the transcriptome data of different flower

development stages in Phal. I-Hsin Venus to select the appropriate reference genes for RT-qPCR analysis of the correlated genes in the biosynthesis pathway of the floral scent in Phalaenopsis I-Hsin Venus. The expression of the candidate internal reference genes in inflorescences at different stages was detected by RT-qPCR. The candidate internal parameter genes were analyzed by combining three internal parameter gene stability analysis software: geNorm, NormFinder and BestKeeper. The results of comprehensive analysis showed that ACT1 was the most stable and could be used

as the best internal reference gene for the expression analysis of Phal. I-Hsin Venus.

Keywords: Phalaenopsis I-Hsin Venus; reference genes; RT-qPCR; expression stability

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.006

第 11 期 章杨婷等：一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因 RT-qPCR 内参基因筛选 2189

实时荧光定量 PCR 技术（ quantitative

real-time PCR, RT-qPCR）是指在 PCR 反应体系中

添加荧光基团（探针或者染料），在 PCR 扩增进

程中借助荧光信号的积累进行实时监测 [1]。

RT-qPCR 目前已普遍应用于分子生物学研究和医

学研究等领域[2]。因 RT-qPCR 的特异性强、无污

染性和准确性高，其被广泛应用于基因表达验证

方面的研究[3]。但是，RNA 的质量或试验操作的

偏差等因素会影响最终结果的精准度[4]。使用内

参基因对结果进行校对并纠正，可以大大降低目

标基因与数据表达水平之间的差异，从而提高试

验的准确性。

内参基因通常选用管家基因，这类基因以稳

定表达著称，但目前并没有哪个内参基因能确保

在所有情况下都能稳定表达[5]。理想的内参基因

在不同条件不同组织中均会稳定表达，而试验研

究中内参基因的恒定表达仅仅是在一定的试验环

境下和一定的组织中才会实现[6]。在特定试验条

件下或给特定组织或品种进行 RT-qPCR 表达稳定

分析前，应该选择合适的内参基因。目前常用的

内参基因主要包括肌动蛋白基因（ACT）、18S 核

糖体 RNA（18SrRNA）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因

（GAPDH）、转录延伸因子基因（EF1α）、多聚泛

素酶基因（UBQ）、α 微管和 β 微管蛋白基因（TUA、

TUB）以及亲环蛋白基因（CYP）等。

蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）因花朵形态像蝴

蝶而得名，又称蝶兰，其花色艳丽，花姿娇俏，

花期长，广泛分布于中国、泰国、菲律宾、马来

西亚等地，属热带亚热带气生兰，被称为“兰花

皇后”。蝴蝶兰的原生种数量少，市场上广泛栽培

与应用的品种部分是杂交种，在花卉市场上颇受

欢迎[7]。随着市场的不断变化和消费者需求的多

样化，品种的不断创新及改良是必要手段，蝴蝶

兰香花品种的培育是目前重要的育种目标之一。

一心维纳斯蝴蝶兰（Phal. I-Hsin Venus）是以金

龙蝴蝶兰（Phal. Dragon’s Gold）和 Phal. I-Hsin

Viola Tria 为亲本杂交选育而成的香花品种，具有

花香浓郁、花色绚丽多彩、花型轻盈、花期持久

等特性，是研究蝴蝶兰花香的理想材料。前期研

究表明，一心维纳斯蝴蝶兰随着花朵开放，花香

物质逐渐增加而产生花香，其香气成分主要为萜

类物质，且成分复杂。目前还需对其花香合成与

释放相关的分子机制进行更深入地挖掘。

本研究基于蝴蝶兰一心维纳斯品种的花朵转

录组数据，筛选出 ACT1、ACT2、ACT3、GAPDH、

EF1α、TUA、TUB 和 Ubi 这 8 个候选内参基因，

分别对其进行引物设计，并通过 RT-qPCR 得到在

蝴蝶兰 6 个不同花期中的表达量。利用软件评估

内参基因的稳定性，筛选出理想的内参基因。为

后期开展一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成和释放

相关功能基因研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以福建农林大学森林兰苑温室大棚中

的蝴蝶兰一心维纳斯品种的花朵为材料，于 2021

年 3—6 月花朵集中开放时期的 10：00—14：00

采集，采集包括中蕾期（ZL）、初开期（CK，0 d）、

盛开前期（S7，7 d）、盛开中期（S15，15 d）、盛

开后期（S30，30 d）、衰败期（SB，45 d 及以上）

6 个时期，设置 3 个生物学重复。采集后的样品

迅速放入液氮中，迅速转移至‒80 ℃冰箱里备用。

1.2 方法

1.2.1 总 RNA 提取与 cDNA 合成 使用 RNA 提

取试剂盒（Plant RNA Kit, OMEGA）提取一心维

纳斯蝴蝶兰不同花期的总 RNA。使用 1%的琼脂

糖凝胶电泳检测提取 RNA 的完整性，超微量紫外

分光光度计检测 RNA 的浓度和纯度。使用反转录

试剂盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA

Eraser 试剂盒，TaKaRa）将检测合格的样品 RNA

反转录成 cDNA，将得到的 cDNA 样品放于-20 ℃

冰箱备用。

1.2.2 候选内参基因筛选 根据已测序完成的一

心维纳斯蝴蝶兰不同花期的转录组数据（未发

表），FPKM 值为 92.61 以上并且各基因样品表达

量较为一致的情况下[8]，通过网站（http://orchidbase.itps.ncku.edu.tw/）[9]查找小兰屿蝴蝶兰（Phal.

equestris）基因组数据进入 NCBI 的 Blast P 程序进

行同源基因比对，初步筛选出 8 个内参基因（表 1）。

1.2.3 RT-qPCR 通过 Primer 3（https://primer3.ut.

ee/）在线网站和 DNAMAN 9.0 软件，基于已知

的内参基因的核苷酸序列来设计引物（表 2），引

物由福州白鲸生物科技有限公司合成。使用 TB

Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒（TaKaRa 公司）

进行 RT-qPCR，反应体系为：10 μL TB Green

Premix Ex TaqⅡ、正反引物各 0.8 μL、0.4 μL ROX

Reference DyeⅡ、6 μL 灭菌水、2 μL cDNA 溶液，

反应程序为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，

2190 热带作物学报 第 44 卷

表 1 根据 FPKM 值及 Blast P 比对筛选到的 8 个候选内参基因

Tab. 1 FPKM values and Blast P results of eight reference genes

基因 FPKM 值 FPKM value ID

Gene ID ZL CK S7 S15 S30 SB

比对结果

Blast result

基因

Gene

Cluster-12453.29110 154.95 245.18 151.11 185.91 187.15 200.06 Actin [Phal. equestris](XP_020579615.1) ACT1

Cluster-12453.26608 137.23 131.98 112.97 104.18 110.05 92.61 Actin [Phal. equestris]( XP_020579615.1) ACT2

Cluster-12453.24947 438.96 493.51 485.79 412.00 441.05 381.22 Actin [Phal. equestris](XP_020592572.1) ACT3

Cluster-12453.34291 920.55 942.18 865.43 1211.37 986.25 992.34 EF-1-alpha [Phal. equestris](XP_020578237.1)EF1α

Cluster-12453.24701 622.49 970.93 1704.86 1031.90 1014.65 743.37 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2,

cytosolic [Phal. equestris](XP_020593213.1) GAPDH

Cluster-12453.24761 735.44 798.77 675.91 252.96 532.77 203.12 Tubulin alpha-3 chain [Phal. equestris]

(XP_020585177.1) TUA

Cluster-12453.24914 791.45 488.23 203.63 142.16 335.64 155.48 Tubulin beta chain-like [Phal. equestris]

(XP_020586293.1) TUB

Cluster-12453.26344 1274.65 1548.93 4773.55 1304.54 1307.18 1103.33 Ubiquitin; Flags: Precursor [Phal. equestris]

(XP_020591356.1) Ubi

表 2 候选内参基因的引物序列

Tab. 2 Primer sequences for internal control genes

基因名称

Gene name

正向引物序列（5'‒3'）

Forward primer sequence (5'‒3')

反向引物序列（5'‒3'）

Reverse primer sequence (5'‒3')

产物长度

Product size/bp

ACT1 ATGCCATCCTTCGTTTGG GCTATTCTTCGCAGTCTCCAG 182

ACT2 GTGTTTGGATTGGAGGCTC GACGATTGAAGGACCAGATTC 98

ACT3 TGGATTTGCTGGAGATGATG CTTTGATTGAGCCTCGTCC 127

EF1α TGAAGATGATTCCCACGAAG TTGGCAGCAGATTTGGTAAC 166

GAPDH ATTGCTTGGCTCCTCTTGC TCCAGTCCTTGCTTGATGG 126

TUA TGCCAAGTGATACGACTGTG CTGGATGAAAGAGTTGCCTG 107

TUB ATACCGAGGGTGCTGAACTC TGGCATACTTGGAATCCTTG 94

Ubi CGTACCCTCGCCGATTACAA CACTTTCCCAGAGTCGCCAA 183

60 ℃退火延伸 30 s，40 个循环。溶解曲线温度设

置为 60~95 ℃，升温速度为 0.2 ℃/s。每个基因每

个时期 3 次技术重复，得出的数据计算△Ct 值后

使用 2‒△△Ct 公式运算。

1.3 数据处理

将一心维纳斯蝴蝶兰 6 个花期的 cDNA 等量

混合，设置 5 个浓度梯度（5‒1

、5‒2

、5‒3

、5‒4

、

5‒5

），每个浓度梯度设置 3 个重复，对样品进行

RT-qPCR。以获得的 5 个梯度下各个内参基因的

Ct 值为纵坐标，稀释倍数的对数值为横坐标制作

标准曲线，并利用公式计算各候选内参基因的扩

增效率（E）[10]，E=(10‒1/k

‒1)100%。

参考当前已有的试验中对内参基因稳定性的

分析方法 [11] ，通过 geNorm 、 NormFinder 和

BestKeeper 三个分析软件对各候选内参基因在一

心维纳斯蝴蝶兰 6 个不同花期中的稳定性进行分

析，综合 3 个软件得出的稳定性排名，筛选出最

适的内参基因。

2 结果与分析

2.1 内参基因 RT-qPCR 分析

RT-qPCR 分析得出的结果如图 1 所示，溶解

曲线均仅出现单一峰，表明 8 个内参基因均未出

现引物二聚体。引物二聚体会产生荧光信号，干

扰到目的基因的定量[12]，无引物二聚体，说明引

物的特异性较好，满足 RT-qPCR 下一步试验的

条件。

以一心维纳斯蝴蝶兰不同发育阶段的 cDNA

为模板进行 RT-qPCR 扩增，根据标准曲线得到的

斜率（K）、相关系数（R2

），计算引物扩增效率（E）。

结果表明（表 3），ACT1 和 ACT3 扩增效率分别

为 121.95%和 112.23%，高于 110%。其余的 6 个

候选内参基因的扩增效率均在 90%~110%之间，

且 8 个候选内参基因相关系数（R²）在 0.9826~

0.9998 之间，表明特异性及扩增效率良好，满足

RT-qPCR 操作。

第 11 期 章杨婷等：一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因 RT-qPCR 内参基因筛选 2191

图 1 候选内参基因溶解曲线

Fig. 1 Dissolution curve of each reference gene

表 3 8 种引物的相关系数与扩增效率

Tab. 3 Amplification efficiency and correlation

of eight candidate genes

基因

Gene

E/% R² K

ACT1 121.95 0.9983 ‒2.8881

ACT2 101.78 0.9976 ‒3.2799

ACT3 112.23 0.9996 ‒3.0599

EF1α 94.79 0.9826 ‒3.4535

GAPDH 96.99 0.9993 ‒3.3962

TUA 102.18 0.9997 ‒3.2708

TUB 104.57 0.9998 ‒3.2170

Ubi 105.92 0.9960 ‒3.1878

候选内参基因的 Ct 值越大，基因的表达量越

小；反之，候选内参基因的 Ct 值越小，基因的表

达量越大，且同一个候选内参基因 Ct 值的波动越

大，说明该基因的表达稳定性越小。对 8 个内参

基因在各样本中的表达水平（Ct 值）进行分析（表

4），在一心维纳斯蝴蝶兰 6 个花期中，各候选内

参基因在不同样本中的 Ct 平均值为 20.789~

27.735。其中 GAPDH 的平均 Ct 值最低，其表达

量最高；ACT1 的平均 Ct 值最高，其表达水平最

低；ACT1、ACT3、TUB、ACT2、TUA、Ubi、EF1α、

GAPDH 的平均表达水平依次升高。TUB 的 Ct 值

变化幅度最大，Ct 差值为 3.594；GAPDH 波动范

围最小，Ct 差值为 1.981。

表 4 8 个候选基因在 6 个样本中的 Ct 值

Tab. 4 Ct values of eight candidate reference genes in six samples

基因 Gene ZL CK S7 S15 S30 SB 平均值 Average

ACT1 27.245 26.739 26.862 27.786 29.026 28.749 27.735

ACT3 26.695 26.906 26.127 27.288 28.421 28.188 27.271

TUB 24.468 23.908 25.123 26.461 27.502 26.962 25.737

ACT2 23.744 23.829 23.711 24.622 25.793 25.766 24.578

TUA 24.449 23.717 23.122 24.892 25.720 25.477 24.563

Ubi 23.378 22.750 22.527 23.871 25.174 24.494 23.699

EF1α 20.757 22.439 19.893 20.849 22.492 21.975 21.401

GAPDH 20.749 20.326 19.878 20.513 21.859 21.411 20.789

2192 热带作物学报 第 44 卷

2.2 候选基因表达稳定性分析

2.2.1 geNorm 软件分析 通过 geNorm 软件计算

候选内参基因的表达稳定值 M（表 5），M 值与稳

定性呈负相关，M<1.5 时被认为是理想内参。在

本研究中，8 个候选内参基因在不同时期花序中

的 M 值均小于 0.7，表现出较高的稳定性。在不

同时期花序中，ACT1 和 ACT2 的 M 值最低

（0.207），稳定性最好，其次是 Ubi（0.257），而

相对来说，EF1α 表达最不稳定（M 值最高，为

0.663）。但由于 M<1.5 时就能被认为是理想内参，

则 8 个内参基因均有较为良好的稳定性，表达稳

定性由大到小排序为 ACT1=ACT2>Ubi>ACT3>

GAPDH>TUA>TUB>EF1α。

表 5 geNorm 分析候选基因的表达稳定性

Tab. 5 Expression stability of candidate genes

analyzed by geNorm

基因名称 Gene name M 排名 Rank

ACT1、ACT2 0.207 1

Ubi 0.257 2

ACT3 0.283 3

GAPDH 0.330 4

TUA 0.374 5

TUB 0.495 6

EF1α 0.663 7

2.2.2 NormFinder 软件分析 使用 NormFinder

软件计算出的表达稳定值 M 越小，说明该基因越

稳定，反之，M 值越大，该基因稳定性就越差。

如表 6 所示，在不同时期花序中，8 个内参基因

的稳定性依次为 Ubi>ACT1>ACT3>ACT2>TUA>

GAPDH>TUB>EF1α，其中，Ubi 表达稳定性最高，

EF1α 表达稳定性最低。

表 6 NormFinder 软件分析候选基因的表达稳定性

Tab. 6 Expression stability of candidate genes

analyzed by NormFinder

基因名称 Gene name M 排名 Rank

Ubi 0.011 1

ACT1 0.110 2

ACT3 0.136 3

ACT2 0.185 4

TUA 0.282 5

GAPDH 0.295 6

TUB 0.868 7

EF1α 1.109 8

2.2.3 BestKeeper 软件分析 使用 BestKeeper 软

件计算 Ct 值的标准偏差（stardand deviaton, SD）

及变异系数（coefficient of variation, CV）并比较

各值的大小，分析判断该内参基因的表达稳定性。

SD 和 CV 越小，稳定性越好。由表 7 可知，除了

TUB 之外的内参基因的 SD 值均小于 1，表达稳

定性依次为 GAPDH>ACT3>ACT1>TUA>Ubi>

ACT2>EF1α，其中 GAPDH 稳定性最好，EF1α 稳

定性较差。TUB 的 SD 值大于 1，说明稳定性较

差，相对来说，不适合作为内参基因。

表 7 BestKeeper 软件分析候选基因的表达稳定性

Tab. 7 Expression stability of candidate genes analyzed by

BestKeeper

基因名称

Gene name

标准偏差

SD

变异系数

CV

排名

Rank

GAPDH 0.56 2.71 1

ACT3 0.69 2.55 2

ACT1 0.79 2.84 3

TUA 0.80 3.26 4

Ubi 0.81 3.43 5

ACT2 0.82 3.32 6

EF1α 0.82 3.87 7

TUB 1.24 4.81 8

2.2.4 综合评价 上述 3 个分析结果表明，3 个

软件的结果存在相似之处，但同时也存在差异。

geNorm 软件分析结果表明，ACT1 和 ACT2 稳定

性最高；NormFinder 软件分析结果表明，Ubi 稳

定性最高；BestKeeper 软件分析结果表明，

GAPDH 稳定性最高。因此，对 3 个软件分析的结

果进行几何平均值计算并排名（表 8），排名越高，

几何平均值越小，该基因表达越稳定。在一心维

纳斯蝴蝶兰花朵不同发育时期中，ACT1 的表达

表 8 Excel 综合分析候选基因的表达稳定性排名

Tab. 8 Expression stability of candidate genes was ranked

by Excel comprehensive analysis

基因名称

Gene name

几何平均值

Geometric mean value

排名

Rank

ACT1 1.817 1

Ubi 2.154 2

ACT3 2.621 3

ACT2、GAPDH 2.884 4

TUA 4.642 5

TUB 6.952 6

EF1α 7.319 7

第 11 期 章杨婷等：一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因 RT-qPCR 内参基因筛选 2193

最稳定，是一心维纳斯蝴蝶兰花朵不同发育时期

中最理想的内参基因，其次是 Ubi；表达最不稳

定的是 EF1α，不合适用作内参基因。

3 讨论

RT-qPCR 技术是被广泛应用的基因表达分析

的主要技术手段，但其结果的准确性需依靠试验

所选出的对特定物种表达稳定性较高的内参基

因，未经试验证实而使用其他试验中发表的内参

基因可能会导致结果出现偏差[13]。因此，在进行

目的基因表达水平研究时，首先需要筛选在特定

条件下合适的内参基因。目前，多种观赏花卉的内

参筛选试验均有报道，如石蒜（Lycoris radiata）[14]、

萱草（Hemerocallis fulva）[10]、茉莉花（Jasminum

sambac）[15]等，大辣椒蝴蝶兰（Phal. Hybrid, Big

Chili）在低温胁迫条件下的内参基因研究已有报

道[16]，但还未见蝴蝶兰花香释放过程中相关内参

基因的筛选研究。

本研究通过 3 种软件分析了 8 个候选内参基

因在一心维纳斯蝴蝶兰花朵不同发育时期中的稳

定性情况。3 种分析软件得出的结果有所不同，

但表达比较稳定和最不稳定的候选内参基因基本

相同。geNorm 软件和 NormFinder 软件得出的结

果较为相似，BestKeeper 软件得出的结果相差较

大，可能是 BestKeeper 软件分析时直接使用 Ct

值这一原始数据，导致与 geNorm 和 NormFinder

软件比较差异性相对大。该分析结果在其他内参

基因筛选的报道中也常有出现，如曹映辉等[17]在

建兰（Cymbidium ensifolium）花香物质合成相关

基因内参基因筛选中，geNorm 和 NormFinder 软

件得出的结果一致性较高，均表明 TUB 与 CYP 表

达较为稳定，而 BestKeeper 却不同；齐香玉等[15]

在茉莉（J. sambac）不同组织（含花朵）中内参

基因的筛选试验中表明，在 BestKeeper 中 Actin

的稳定性最好，但是其在 geNorm 和 NormFinder

中的稳定性却较差，反之 SAND 和 UPL7 在

BestKeeper 中的稳定性不好，但其在 geNorm 和

NormFinder 中的稳定性较好。因此，需要对 3 个

软件的最后结果进行几何平均数计算并分析排

名，降低误差，以提高结果的准确性，最后根据

综合分析得到最理想的内参基因。

Actin 基因参与真核生物细胞的许多重要生

命活动，如细胞形状的维持、胞质环流、细胞运

动、细胞分裂、细胞分化、细胞内的物质运输、

极性键成以及信号转导等[18]。在理想状态下，无

论是细胞类型或发育阶段不同，还是处理方法不

同，一个理想的内参基因都能稳定表达。由于

Actin 基因在个体各个生长阶段的大多数组织中

持续表达，变化小，序列高度保守，Actin 基因常

作为内参基因使用[19]。一心维纳斯蝴蝶兰花朵不

同发育时期的理想候选内参基因是 ACT1。在其他

物种的内参基因筛选报道中，也有 ACT 被选为理

想的内参基因的情况。李晗等[20]选择羽衣甘蓝

（Brassica oleracea var. acephala）不同发育时期

的柱头作为材料通过qRT-PCR对7个候选内参基因

进行筛选，筛选出 ACT 基因为最合适的内参基因。

ACT 在马铃薯（Solanum tuberosum）中也能稳定表

达[21]。Actin 在甘草干旱条件下[22]、板蓝根 ABA 处

理条件下及冬油菜低温胁迫条件下的表达均最为

稳定[23-24]。

EF1α 基因在一心维纳斯蝴蝶兰花朵不同时

期中表达的稳定性最差，而仇志浪等[25]在甜樱桃

（Prunus avium）花芽不同时期的内参基因筛选中

得出的最佳内参基因是 EF1α；NICOT 等[26]在马

铃薯植株不同胁迫条件下的内参基因筛选中得出

的最稳定基因也是 EF1α。说明并不存在理想的内

参基因适用于所有植物，在不同植物不同条件下，

需要根据实际情况筛选合适的内参基因。

在聚宝红玫瑰蝴蝶兰（Phal. cultivar, Jiuhbao

Red Rose）内参基因的研究中，基于 geNorm 和

NormFinder 分析，Actin 在蝴蝶兰的大多数测试样

本中表现出高度稳定性，表明 Actin 是蝴蝶兰

qRT-PCR分析的合适参考基因[27]。CHUANG等[28]

在研究贝丽娜蝴蝶兰（Phal. bellina）花香物质合

成相关功能基因时，选用 PbActin1 作为内参基因。

本研究则着重筛选出蝴蝶兰花朵花香释放时期所

适用的内参基因，为今后蝴蝶兰花香物质合成相

关基因功能及分子机制的研究提供更有针对性的

参考依据。

4 结论

本研究利用 qRT-PCR 技术，通过 3 个分析软

件（geNorm、NormFinder、BestKeeper）来分析

评估一心维纳斯蝴蝶兰的 8 个候选内参基因

（ACT1, ACT2, ACT3, EF1α, GAPDH, TUB, TUA,

Ubi）在不同花期中的稳定性，经过综合分析表明，

内参基因稳定性排序为 ACT1>Ubi>ACT3>ACT2=

GAPDH>TUA>TUB>EF1α，得出 ACT1 为最为理

2194 热带作物学报 第 44 卷

想的内参基因，Ubi 次之。在一心维纳斯蝴蝶兰

花香物质合成与释放的研究过程中，对相对基因

表达量进行分析时，可用 ACT1 基因作为内参基

因进行校正。

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热带作物学报 2023, 44(11): 21962198

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2023-07-25；修回日期 2023-09-13

基金项目 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项“藏东南（墨脱、察隅等）热带生物种质资源收集与保护”（No.

1630032022001）；海南省自然科学基金面上项目（No. 321MS088）。

作者简介 董 旭（1998—），女，硕士研究生，研究方向：兰科植物种质资源学。*通信作者（Corresponding author）：黄明忠

（HUANG Mingzhong），E-mail：hmz121@foxmail.com。

藏南蝴蝶兰——中国蝴蝶兰属一未详知种

董 旭1,2，徐世松1,3,4,5，杨虎彪1,3,4,5，王清隆1,3,4,5，袁浪兴1,3,4,5，刘 震6

，

王祝年1,3,4,5，杨光穗1,3,4,5，尹俊梅1,3,4,5，王家保1,3,4,5，黄明忠1,3,4,5*

1. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南海口 571101；2. 海南大学园艺学院，海南海口 570228；3. 农业

农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南儋州 571737；4. 海南省热带观赏植物种质创新利用工程技术研究

中心，海南儋州 571737；5. 海南省热带作物资源遗传改良与创新重点实验室，海南海口 570228；6. 墨脱县林业和草原

局，西藏林芝 860700

摘 要：本研究报道了中国兰科（Orchidaceae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis Blume）一未详知种——藏南蝴蝶兰（P.

arunachalensis），对其形态进行描述并提供照片。该种与红河蝴蝶兰（P. honghenensis）、华西蝴蝶兰（P. wilsonii）和

小尖囊蝴蝶兰（P. taenialis）相近，但该种具有向下弯曲的细距，侧裂片分离部分不及中裂片的一半以及侧裂片末端匕

状，这些可区别于其他物种。

关键词：蝴蝶兰属；植物分类；西藏

中图分类号：S682.31 文献标识码：A

Phalaenopsis arunachalensis, a Little Known Species of Phalaenopsis

in China

DONG Xu1,2, XU Shisong1,3,4,5, YANG Hubiao1,3,4,5, WANG Qinglong1,3,4,5, YUAN Langxing1,3,4,5,

LIU Zhen6

, WANG Zhunian1,3,4,5, YANG Guangsui1,3,4,5, YIN Junmei1,3,4,5, WANG Jiabao1,3,4,5,

HUANG Mingzhong1,3,4,5*

1. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China;

2. School of Horticulture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 3. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Danzhou, Hainan 571737, China; 4. Hainan Engineering Technology Research Center of Tropical Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Danzhou, Hainan

571737, China; 5. Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation of Hainan Province, Haikou, Hainan 570228, China; 6. Medog Forestry and Grassland Bureau, Linzhi, Tibet 860700, China

Abstract: Phalaenopsis arunachalensis K. Gogoi & Rinya is reported as a little known species from Medog, Tibet

Autonomous Region, China. The detailed morphological descriptions and photos are also provided. This species is

similar to P. honghenensis F. Y. Liu, P. wilsonii Rolfe and P. taenialis (Lindl.) Christenson & Pradhan. However, this

species has a minutely spurred that bends down, the free part of lateral lobes which are less than half length of the

mid-lobe, and dagger-like of lateral lobes ends, which can distinguish from other species.

Keywords: Phalaenopsis; plant taxonomy; Tibet

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.007

兰科是单子叶植物中最大的科，现有 736 属 约 28 000 种[1]。蝴蝶兰属（Phalaenopsis Blume）

第 11 期 董 旭等：藏南蝴蝶兰——中国蝴蝶兰属一未详知种 2197

全球约 80 种，分布于热带亚洲至澳大利亚。我国

有 22 种，主要产于秦岭以南[2-4]。近几年，蝴蝶

兰属新类群不断被报道[5-9]。

笔者在西藏墨脱的植物调查中发现了 1 种蝴

蝶兰属植物，通过查阅相关文献和标本解剖，确

定该种兰科植物为藏南蝴蝶兰（P. arunachalensis）[10]。凭证标本保存于中国热带农业科学院热

带作物品种资源研究所植物标本室（ATCH）。

藏南蝴蝶兰（新拟，图 1~图 2）

Phalaenopsis arunachalensis K. Gogoi &

Rinya, Lankesteriana. 2020, 20(3): 275-280.

Type: China. Tibet: Medog County, Lower

Subansiri, Ziro, 1400 m, 16 October 2019, fl. 15

April 2020, K. Gogoi and K. Rinya 00809 (Holotype: OHT; Isotypes: ASSAM, TOSEHIM).

附生草本，根丛生，扁平，表面多具疣状突

起。茎长 1 cm，具 2~3 片叶。叶斜椭圆形，长 5~

10 cm，宽 2.5~3.5 cm，先端尖，叶鞘宿存，有紫

红色斑点。花序近于垂直，总状花序，长 15~25 cm，

具 5~6 朵花。花苞片呈卵形，长约 6 mm。花朵直

径 3.0~3.2 cm，萼片和花瓣呈玫粉色，唇瓣紫色；

花梗和子房长 3.2~3.5 cm；中萼片长椭圆形，长

1.5~1.6 cm，宽 0.8 cm，先端钝；侧萼片斜椭圆卵

形，长 1.5 cm，宽 0.9 cm，先端钝；花瓣匙型，

长 1.5 cm，宽 0.8 cm，先端钝；唇瓣具距，3 裂；

侧裂片长圆形，长 9 mm，宽 2 mm，先端斜截形；

中裂片长圆形，长 9 mm，宽 4 mm，边缘向下弯

曲，先端稍钝而不裂，上面中央具 1 条纵向脊突；

距乳头状，长 2 mm；中裂片基部具 1 枚叉状附属

物；两侧裂片之间具 1 枚中部呈凹陷状的肉质胼

胝体。合蕊柱长 9 mm，具 2~3 mm 蕊柱足。药帽

短喙状，紫红色。花粉块 4 个，近球形。

图 1 藏南蝴蝶兰生境（晏启 摄）

Fig. 1 Habitat of Phalaenopsis arunachalensis

(Photo by Yanqi)

A：花朵；B：中萼片；C：侧萼片；D：花瓣；E：去除萼片和花瓣的花；F：唇瓣（左：正面；右：背面）；

G：花药和药帽（正面）；H：花药和药帽（背面）。

A: Flower; B: Dorsal sepal; C: Lateral sepal; D: Petal; E: Flowers without sepals and petals removed; F: Lip (left: front view; right: back

view); G: Pollinia and anther cap (front view); H: Pollinia and anther cap (back view).

图 2 藏南蝴蝶兰

Fig. 2 Phalaenopsis arunachalensis

花期：3—4 月。

生境：海拔 800~1700 m 的高大乔木上。

分布：中国西藏墨脱。

凭证标本： Tibet (西 藏 ), Medog (墨 脱 ),

Beibeng (背崩). elev. 1610 m, 2022-05-14, Huang

220524015 (ATCH), Primary andsecondary

broad-leaved forests.

讨论：该种模式产地为我国藏南地区，原文

献记载该物种为常绿类型。而据我们的野外观察，

在水分充足的地方不落叶，当环境较干旱时也会

出现落叶现象，符合落叶蝴蝶兰组（ Sect.

Aphyllae ）的习性。该种与红河蝴蝶兰（ P.

honghenensis）、华西蝴蝶兰（P. wilsonii）和小尖

囊蝴蝶兰（P. taenialis）相似，如图 3[10-11]和图 4。

藏南蝴蝶兰与红河蝴蝶兰均具有明显的距，但前

者侧裂片为匕状且分离部分的长度不及中裂片的

2198 热带作物学报 第 44 卷

一半；与小尖囊蝴蝶兰区别在于后者具粗距且中

裂片末端平展；与华西蝴蝶兰区别于后者不具明

显的距，仅为不足 1 mm 的突起，并且唇基具爪，

侧裂片为镰刀状。

A：藏南蝴蝶兰[10]；B：华西蝴蝶兰[11]；

C：红河蝴蝶兰[11]；D：小尖囊蝴蝶兰[11]。

A: P. arunachalensis; B: P. wilsonii; C: P. honghenensis;

D: P. taenialis.

图 3 藏南蝴蝶兰及其近缘种的唇瓣侧视图比较

Fig. 3 Side view comparison of the lip of Phalaenopsis

arunachalensis and its relative species

A： 藏南蝴蝶兰；B：华西蝴蝶兰；C：红河蝴蝶兰。

A: P. arunachalensis; B: P. wilsonii; C: P. honghenensis.

图 4 藏南蝴蝶兰及其近缘种的花朵正视图

Fig. 4 Front view of the flower of Phalaenopsis

arunachalensis and its relative species

致谢 感谢武汉市伊美净科技发展有限公司晏启工

程师提供精美的生境照片。在本研究过程中，承蒙西藏农

牧学院的陈学达和李孟凯，墨脱县背崩乡小学的白玛措姆

校长，中国热带农业科学院的刘国道副院长、丰明处长和

秦晓威主任，中国热带农业科学院香料饮料研究所的苏凡

和吉训志，中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

的覃星导副所长和董建琪等同志在野外考察中的指导与

帮助，谨以致谢！

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热带作物学报 2023, 44(11): 21992207

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-09-08；修回日期 2022-11-07

基金项目 格西沟国家级自然保护区兰科资源调查项目（No. 0703-1941CNIITC2027）；雅江县生物物种（植物）调查评估服

务项目（No. N5133112022000016）；四川水利职业技术学院科研项目（No. 2021SCSZYD-04）。

作者简介 郑 炜（1985—），女，博士，教授，研究方向：植物资源调查与生态环境保护。*通信作者（Corresponding author）：

刘胜祥（LIU Shengxiang），E-mail：1612066112@qq.com。

四川格西沟国家级自然保护区兰科植物多样性与分布格局研究

郑 炜1

，晏 启2

，施要强1

，伍小刚3

，李 刚4

，刘胜祥5*，李八斤4

，张 惠4

，

谢贵模2

，杨绍平1

1. 四川水利职业技术学院资源环境工程学院，四川成都 611231；2. 武汉市伊美净科技发展有限公司，湖北武汉

430070；3. 中国科学院成都生物研究所，四川成都 610041；4. 雅江县林业和草原局，四川雅江 627450；5. 华中

师范大学，湖北武汉 430079

摘 要：为了解四川格西沟国家级自然保护区兰科植物多样性与分布特征，于 2020 和 2021 年采用样线样方结合法，

在保护区内进行系统性调查，共设置了 17 条总长 95 km 的样线，涵盖保护区各功能区、生境类型以及海拔范围。结果

表明：（1）保护区内调查到兰科植物 20 属 34 种。其中珍稀濒危物种有 10 种，包括 5 种国家二级保护野生种类；四川

省新记录种 2 种[褐花羊耳蒜（Liparis brunnea）、齿突羊耳蒜（L. rostrata）]；生活型以地生兰为主，属的地理成分以

北温带分布占绝对优势。（2）34 种兰科植物共调查到 6703 株，分布于 290 个点位，以二叶盔花兰（Galearis spathulata）

数量最多，大花鸟巢兰（Neottia megalochila）最少，火烧兰（Epipactis helleborine）分布点位最多。紫点杓兰（Cypripedium

guttatum）植株高度与海拨呈极显著负相关性，其余种类在同物候期的种间高度变化轻微。（3）保护区 3100~3300 m 内

的兰科植物种属数最多，其次是 2900~3100 m 区间，3900~4100 m 内的兰科植物数量最多。（4）头蕊兰（Cephalanthera

longifolia）数量与坡度因子呈显著的中度正相关，二叶盔花兰数量与海拔呈显著的强正相关，叉唇角盘兰（Herminium

lanceum）数量与植被呈显著的强正相关，角盘兰属（Herminium）数量与海拨呈显著的中度负相关。综上，在四川省

内，格西沟自然保护区的兰科植物资源相对丰富，分布格局符合“中间高度膨胀型”，大部分种类的数量与环境因子不

显著相关，与历史上对该保护区的调查相比，本次调查到的兰科植物种属数量大幅增加，但有 3 种国家重点保护且观

赏价值高的杓兰属植物未调查到，1 种杓兰属植物在调查期间种群数量下降。因此，对保护区的兰科植物保护、宣传、

执法等刻不容缓。

关键词：兰科；数量；分布；环境

中图分类号：Q948 文献标识码：A

Diversity and Distribution Pattern of Orchids in Gexigou National

Nature Reserve, Sichuan, China

ZHENG Wei1

, YAN Qi2

, SHI Yaoqiang1

, WU Xiaogang3

, LI Gang4

, LIU Shengxiang5*, LI Bajin4

, ZHANG Hui4

,

XIE Guimo2

, YANG Shaoping1

1. College of Resources and Environment, Sichuan Water Conservancy College, Chengdu, Sichuan 611231, China; 2. Wuhan

Imagination Science and Technology Development Co. Ltd., Wuhan, Hubei 430070, China; 3. Chengdu Institute of Biology, Chinese

Academy of Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, China; 4. Yajiang County Forestry and Grassland Administration, Yajiang, Sichuan 627450, China; 5. Central China Normal University, Wuhan , Hubei 430079, China

Abstract: In order to understand the diversity and distribution characteristics of orchids in Gexigou National Nature

Reserve in Sichuan province, a systematic survey was conducted using the line transect combined with sample sampling

method from 2020 to 2021. A total length of 95 km including 17 lines were set up, covering various function, habitat and

2200 热带作物学报 第 44 卷

elevation of the reserve. 34 species of Orchidaceae in 20 genera were investigated. Among them, 10 were rare and endangered species, five were wild species under second-class national protection; and two (Liparis brunnea and L. rostrate)

were new record species in Sichuan province. Most of them were mainly in terrestrial orchid of life type and absolutely

dominant in north temperate zone of geographical. A total of 6703 orchids of 34 species were investigated and distributed in 290 sites. Galearis spathulata and Neottia megalochila were the most and least abundant species respectively,

and Epipactis helleborine was the most widely-distributed. Among them, the height of Cypripedium guttatum showed a

significant negative correlation with elevation, while there was a slightly correlation in other species. Most of Orchidaceae genera were distributed in 3100-3300 m, followed by 2900-3100 m, while the maximum number of individuals

were distributed in 3900-4100 m. The number of Cephalanthera longifolia was positively correlated with slope significantly, the number of Galearis spathulata was positively correlated with elevation significantly, the number of Herminium

lanceum was positively correlated with vegetation significantly, the number of whole genus of Herminium was positively

correlated with elevation moderately. In general, the orchid resources in Gexigou Nature Reserve are relatively rich, and

more distribute in the middle elevation. The number of some species is significantly correlated with environmental factors.

Compared with the previous investigations in this reserve, the number of orchid species is significantly increased. However,

three national protected species of Cypripedium with high ornamental value were not found, and the population of one

species of Cypripedium decreased. Therefore, it is urgent to protect, publicize and enforce the law on orchids in the reserve.

Keywords: Orchidaceae; quantity; distribution; environment

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.008

兰科是世界上被子植物中的第三大的科[1]，全

世界兰科植物约有 736 属 28 000 种[2]。《中国植物

志》中共收录中国野生兰科植物 171 属 1247 种[3]；

2000—2019 年间，研究人员发现并正式发表中国兰

科植物共 376 种，使中国兰科植物增至 1677 种[4]；

而正在进行的全国野生兰科植物资源专项调查项

目阶段性成果中又报道了 43 个新种和新记录种[5]；

中国兰科植物合计达 1720 种。兰科植物又是世界

上最受威胁的类群之一[6]，在全球濒危物种数据

库中有超过 600 种兰科植物[7]，《野生动植物濒危

物种国际贸易公约》（CITES）中，将所有兰科植

物纳入保护范围[8]，2021 年中国调整后的《国家

重点保护野生植物名录》中，也新增了兰科植物

中的兜兰属大部分植物作为国家一级保护野生植

物，兰属大部分、杓兰属大部分等作为国家二级

保护野生植物[9]。兰科植物作为一个亟须重点保

护的类群，其野外种群容易受到自身及外界因素

的影响从而产生巨大的变化。因此，本研究针对

格西沟国家级自然保护区的兰科植物种类、区系

地理及分布格局进行初步研究，为保护区决策部

门制订野生兰科植物保护策略提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

四川格西沟国家级自然保护区（以下简称格西

沟自然保护区）在 1993 年成立，于 2012 年晋升为

国家级。保护区位于四川省甘孜藏族自治州雅江县

河口镇，距县城 3 km，地处雅砻江中游右岸、青

藏高原东南部横断山脉地带，地理位置为东经

100°46′51″~101°02′32″，北纬 29°47′52″~30°05′30″，

南北长 23.56 km，东西宽 15.29 km，总面积

22 896.8 hm2

（图 1）。海拔幅度在 2600~4702 m

图 1 格西沟自然保护区地理位置

Fig. 1 Geographical location of Gexigou National

Nature Reserve

第 11 期 郑 炜等：四川格西沟国家级自然保护区兰科植物多样性与分布格局研究 2201

之间，东部雅砻江河谷海拔较低。属大陆性季风

高原型气候特征，年均气温 2~10 ℃，平均降水量

约 705 mm，有明显的旱季（11—翌年 4 月），植

被和土壤类型丰富[10]。

1.2 方法

采用样线和样方法对保护区兰科植物开展野

外调查。于 2020 年 8 月和 2021 年 6—7 月选择兰

科植物的主要开花期开展调查。在考虑可达性的

前提下，尽量将样线均匀布设于核心区、缓冲区

和实验区，涵盖不同海拔带、沟谷、山坡、山顶

生境。考察样线合计 17 条，总长度 95 km，海拔

区间介于 2700~4300 m 之间，生境以沟谷和山坡

为主，山顶相对较少（图 2）。

图 2 兰科植物调查样线与样点图

Fig. 2 Orchids survey sample line and sample point map

对样线上所有兰科植物进行调查，记录种类、

数量、高度、物候、地理坐标、坡度、坡向等，

对每种兰科植物设置典型样方了解其植被类型信

息。每种兰科植物的分布有时具有成丛性，如黄

花杓兰（Cypripedium flavum）、山西杓兰（C.

shanxiense），有时具有明显的连续性，连续分布

于同一植被类型、坡向和坡度的生境内，将这些

成丛分布以及连续（不超过 20 m）分布的个体于

同一个分布点位，统计每种兰科植物的分布点位

和分布数量。

1.3 数据处理

调查数据录入 Excel 2010 软件，并在 SPSS 19

软件中进行相关性分析；用 Shapiro-Wilk 软件对

数据进行正态性检验，不符合正态分布的数据先

进行正态转换后，用 Pearson 相关系数分析相关

性；对转换后仍无法满足正态分布的数据，用

Spearman 相关系数分析相关性。调查路线采用

ArcGIS 10. 8 软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 格西沟自然保护区兰科植物种类与区系

通过野外调查累积调查到兰科植物 20 属 34

种[其中 1 种未知属种，物种分类系统参照中国植

物志英文版（Flora of China），表 1]。其中，国家

二级重点保护野生植物 5 种：黄花杓兰、紫点杓

兰 （ C. guttatum ）、 山 西 杓 兰 、 西 南 手 参

（Gymnadenia orchidis）和独蒜兰（Pleione bulbocodioides）。根据《中国物种红色名录》，有濒

危种 1 种：紫点杓兰；易危种 3 种：黄花杓兰、

山西杓兰、西南手参；近危种 5 种：西藏玉凤花

（Habenaria tibetica）、扇唇舌喙兰（Hemipilia

flabellata）、角盘兰（Herminium monorchis）、宽

萼角盘兰（H. souliei）、川西兜被兰（Neottianthe

compacta）。四川省兰科种类新记录种 2 种，分

别是褐花羊耳蒜（Liparis brunnea）、齿突羊耳蒜

（L. rostrata）（图 3）。

34 种兰科植物中，腐生兰有 3 种（7.9%）：

高山鸟巢兰（Neottia listeroides）、尖唇鸟巢兰（N.

acuminata）、大花鸟巢兰（N. megalochila），附

生兰仅有独蒜兰（ 2.6% ），其余均为地生兰

（89.5%）。

除去 1 种不知属种的兰科植物，20 属中，鸟

巢兰属有 4 个种，杓兰属、角盘兰属、兜被兰属、

舌喙兰属均有 3 个种，羊耳蒜属、舌唇兰属、玉

凤花属有 2 个种，其余 12 个属内均只含 1 种。在

属级水平上，将格西沟的兰科植物 20 属划分为 7

个类型 2 个变型（表 2）。热带分布占 20%，温带

分布占 65%。说明保护区内兰科植物属以温带分

布占优势，尤其是北温带分布，达 8 属，占 40%。

中国-喜马拉雅分布有 1 属。

2202 热带作物学报 第 44 卷

表 1 格西沟自然保护区兰科植物名录

Tab. 1 List of orchids in Gexigou National Nature Reserve

属名

Genus

种

Species

保护区内典型生境

Typical habitat in the reserve

濒危状况

Endangered

status

保护等级

Protection

level

虾脊兰属 Calanthe 虾脊兰属未知种 Calanthe sp. 山杨林下，苔藓多的地面

头蕊兰属 Cephalanthera 头蕊兰 Cephalanthera longifolia 黄背栎林林下，腐殖质层厚的地面

黄花杓兰 Cypripedium flavum 夹杂有高山松的阔叶林林缘和林下，苔藓多的

地面

易危 国家二级

紫点杓兰 Cypripedium guttatum 低海拔处在有高山松的阔叶林林缘和林下，苔

藓多的地面；高海拔处在杜鹃灌丛林下

濒危 国家二级

杓兰属 Cypripedium

山西杓兰 Cypripedium shanxiense 夹杂有高山松的阔叶林林缘和林下，苔藓多的

地面

易危 国家二级

火烧兰属 Epipactis 火烧兰 Epipactis helleborine 山坡林下、草丛或沟边多种生境

盔花兰属 Galearis 二叶盔花兰 Galearis spathulata 杜鹃灌丛林下或草丛中，有苔藓的地面

斑叶兰属 Goodyera 小斑叶兰 Goodyera repens 杜鹃灌丛林下，有苔藓的多石少土山坡处

手参属 Gymnadenia 西南手参 Gymnadenia orchidis 高山草地、山坡林缘，石砾较多的地面 易危 国家二级

玉凤花属 Habenaria 落地金钱 Habenaria aitchisonii 白桦林下，有苔藓的陡坡处

西藏玉凤花 Habenaria tibetica 鳞皮冷杉或高山松栎类混交林下，有苔藓的陡

坡处

近危

舌喙兰属 Hemipilia 心叶舌喙兰 Hemipilia cordifolia 高山松林下，石质岩石上

扇唇舌喙兰 Hemipilia flabellata 高山松林下，石质岩石上 近危

角盘兰属 Herminium 叉唇角盘兰 Herminium lanceum 各种林下、灌丛下或草地中

角盘兰 Herminium monorchis 河滩边草地中 近危

宽萼角盘兰 Herminium souliei 各种林下、灌丛下或草地中 近危

羊耳蒜属 Liparis 褐花羊耳蒜 Liparis brunnea 灌木林下，苔藓多的地面

齿突羊耳蒜 Liparis rostrata 鳞皮冷杉林下石上覆土中

原沼兰属 Malaxis 原沼兰 Malaxis monophyllos 高山松林下

鸟巢兰属 Neottia 高山鸟巢兰 Neottia listeroides 松栎类混交林林下林窗处

尖唇鸟巢兰 Neottia acuminata 松栎类混交林林下

大花鸟巢兰 Neottia megalochila 松栎类混交林林下

西藏对叶兰 Neottia pinetorum 灰背高山栎林下

兜被兰属 Neottianthe 川西兜被兰 Neottianthe compacta 高山草地中 近危

二叶兜被兰 Neottianthe cucullata 栒子灌丛林下

二叶兜被兰（原变种）

Neottianthe cucullata var. cucullata

针阔叶混交林下，苔藓密生处

阔蕊兰属 Peristylus 一掌参 Peristylus forceps 林缘草地上

舌唇兰属 Platanthera 二叶舌唇兰

Platanthera chlorantha

白桦林下

小舌唇兰 Platanthera minor 杜鹃灌丛林下

独蒜兰属 Pleione 独蒜兰 Pleione bulbocodioides 高山松林林缘苔藓覆盖的岩石上 国家二级

小红门兰属 Ponerorchis 广布小红门兰

Ponerorchis chusua

松栎杜鹃林下林窗处

鸟足兰属 Satyrium 鸟足兰（原变种）

Satyrium nepalense var. ciliatum

草坡上、疏林下或高山松林下

绶草属 Spiranthes 绶草 Spiranthes sinensis 路边次生草地或山坡草地上

未知属 未知种 阔叶林林缘

第 11 期 郑 炜等：四川格西沟国家级自然保护区兰科植物多样性与分布格局研究 2203

褐花羊耳蒜（L. brunnea） 齿突羊耳蒜（L. rostrata）

图 3 四川省兰科植物 2 个新记录种

Fig. 3 Two new record species of orchids in

Sichuan province

2.2 格西沟自然保护区兰科植物数量、物候、

高度特征

所有样线的 2 次调查合计 34 种 6703 株兰科

植物。各兰科植物的分布点位和数量如图 4 所示，

其中二叶盔花兰（Galearis spathulata）最多，达

1972 株，大花鸟巢兰最少仅 1 株；超过 100 株的

有 13 种，10~100 株之间的有 14 种，10 株之内的

有 8 种。所有兰花共分布于 290 个点位，其中火

烧兰（Epipactis helleborine）点位最多，达到 45

个点位，分布点位大于等于 10 个的有 9 种，小于

10 个的有 26 种，有 5 种只分布于 1 个点位。

表 2 格西沟自然保护区兰科植物分布区类型

Tab. 2 Types of orchids in Gexigou National Nature Reserve

分布区类型 Distribution type 属 Genera 属数 Number of genera 占比 Percentage/%

1.世界分布 羊耳蒜属、原沼兰属 2

2.泛热带分布 虾脊兰属 1 5

5.热带亚洲至热带澳大利亚分布 阔蕊兰属 1 5

6.热带亚洲至热带非洲分布 鸟足兰属 1 5

7-2.热带印度至华南分布 独蒜兰属 1 5

8.北温带分布 杓兰属、盔花兰属、小红门兰属、舌唇兰属、玉凤

花属、斑叶兰属、火烧兰属、绶草属

8 40

9.东亚-北美间断分布 头蕊兰属 1 5

10.欧亚温带分布或旧世界温带分布 角盘兰属、手参属、鸟巢兰属、兜被兰属 4 20

14-2.中国-喜马拉雅分布 舌喙兰属 1 5

图 4 兰科植物分布数量与点位

Fig. 4 Number and location of orchids

由于调查月份在 6—8 月，是该地区大多兰科

植物的主花期。植株高度在 3~40 cm 之间，对同

样物候的同种兰科植物而言，不同植株之间高度

变化很小。比较特殊的是紫点杓兰，同样是花期，

2204 热带作物学报 第 44 卷

其最大个体高达 30 cm，最小个体高度仅 5 cm，

海拔越高，个体越小。Pearson 相关系数也表明，

其个体高度与海拔之间呈极显著负相关关系（r=

–0.968，P<0.01）。

2.3 格西沟自然保护区兰科植物整体分布

在垂直分布上，自然保护区海拔区间为 2700~

4702 m，本次调查海拔为 2700~4300 m，出现兰科

植物的海拔区间为2823~4055 m。以 200 m为梯度，

制作保护区兰科植物分布海拔图（图 5）。在

3100~3300 m 内的兰科植物种属数最多，有 14 属

23 种，其次是 2900~3100 m 区间。而 3900~4100 m

内的兰科植物数量最多，远高于其他海拔区间。

图 5 保护区不同海拔区间的兰花种类和数量

Fig. 5 Species and quantity of orchids at different elevation in the reserve

在水平分布上，格西沟自然保护区的核心区

有 16 属 21 种合计 2336 株兰科植物，缓冲区有 8

属 9 种合计 202 株兰科植物，实验区有 17 属 25

种合计 4165 株兰科植物。北部（格西沟流域）有

14 属 21 种 1822 株兰科植物，中部（G318 及无

名河及两侧）有 12 属 15 种合计 2941 株兰科植物，

南部（下独沟流域）有 15 属 19 种合计 1940 株兰

科植物。

2.4 属/种内分布与环境因素关系

本次调查中记录了各兰科植物分布点位的植

被类型、坡向和坡度，记录的植被类型有自然保

护区科学考察集[10]中提到的针叶林（21 种 2730

株）、针阔叶混交林（26 种 2039 株）、落叶阔叶

林（2 种 12 株）、常绿阔叶林（2 种 11 株）、落叶

阔叶灌丛（7种 247株）、常绿阔叶灌丛（6种 1159）、

高山草甸（1 种 7 株）、流石滩（1 种 17 株）。并

根据实际情况，新增了杂草草地和裸地这 2 个次

生植被/土地类型，种类数量均较少，其中杂草草

地中仅有绶草和宽萼角盘兰，裸地中有火烧兰、

二叶舌唇兰和扇唇舌喙兰。坡度按 0°、30°以下和

30°以上分 3 类，平地上有 12 种 271 株，缓坡上

有 28 种 4294 株，陡坡上则有 20 种 2138 株，尤

以扇唇舌喙兰分布区坡度最大，部分区域接近垂

直，落地金钱和西藏玉凤花次之。坡向按北、北

偏东、东偏北、东等依次划分的 12 种坡向，其中，

北向有 14 种 1833 株，北东向 12 种 1056 株，东

北向 5 种 36 株，东南向 13 种 854 株，南东向 7

种 139 株，南向 3 种 70 株，南西向 10 种 170 株，

西南向 5 种 46 株，西向 14 种 758 株，西北向 18

种 1295 株，北西向 9 种 125 株，其余为无坡向。

此外，对分布点位大于等于 10 的物种或多种

的属[包括头蕊兰（23 点位 184 株）、杓兰属（23

点位 284 株）及紫点杓兰（18 点位 230 株）、火

烧兰（45 点位 209 株）、二叶盔花兰（13 点位 1972

株）、西南手参（10 点位 41 株）、舌喙兰属（11

点位 493 株）、角盘兰属（45 点位 824 株），叉唇

角盘兰（25 点位 393 株），宽萼角盘兰（18 点位

373 株）、鸟巢兰属（13 点位 50 株），鸟足兰（原

变种）（10 点位 374 株）、绶草（37 点位 585 株），

进行分布数量与环境因素的相关性分析。结果表

明：仅头蕊兰数量与坡度因子呈显著正相关；二

叶盔花兰的数量与海拔呈极显著正相关；叉唇角

盘兰数量与植被呈极显著正相关；角盘兰属数量

与海拨呈显著负相关（表 3）。

3 讨论

3.1 格西沟自然保护区兰科植物资源相对丰富

西南地区是中国兰科植物最为突出的地区之

一[11]，据记载，四川有兰科植物 450 余种[12]，2020

年至今，又报道了十余种兰科植物四川省新记录

种[13~16]，四川兰科植物有近 460 种。格西沟自然

保护区内的 38 种兰科植物占四川省兰科植物的

8.44%，占全国 1720 种兰科植物的 2.21%。与邻近

的栗子坪国家级自然保护区[17]（102°10′33″E~

102°29′07″E，28°51′02″N~29°08′42″N）和卧龙国

家级自然保护区 [18] （ 102°52′E~103°25′E ，

30°45′N~31°25′N）相比，格西沟保护区虽然兰科

植物种属最少，但其单位面积上的兰科植物种数

是其他保护区的 4~114 倍。此外，从兰科植物株

数来看，格西沟自然保护区内调查到的株数达到

6703 株，远高于栗子坪保护区的 1800 株（表 4）。

加上 2 种四川省兰科种类新记录，说明在四川省

内，该保护区的兰科植物资源相对丰富。

第 11 期 郑 炜等：四川格西沟国家级自然保护区兰科植物多样性与分布格局研究 2205

表 3 兰科植物种内数量分布与环境因子的相关系数

Tab. 3 Correlation coefficient between intraspecific

quantitative distribution of orchids and

environmental factors

项目

Item

海拔

Elevation

植被

Vegetation

坡度

Slope

坡向

Aspect

头蕊兰数量 –0.268 0.259 0.415* 0.109

紫点杓兰数量 –0.100 0.282 0.274 –0.090

杓兰属数量 –0.011 0.235 0.263 –0.184

火烧兰数量 –0.049 0.108 0.061 –0.262

二叶盔花兰数量 0.688**

西南手参数量 0.395 0.484 0.410 0.397

舌喙兰属数量 0.274 –0.160 0.224 –0.034

叉唇角盘兰数量 –0.162 0.639** –0.241 0.166

宽萼角盘兰数量 –0.417 –0.342 0.197 –0.195

角盘兰属数量 –0.307* 0.196 –0.064 0.261

鸟巢兰属数量 0.066 –0.067 0.438 –0.327

鸟足兰(原变种)数量 0.453 0.235 0.059

绶草数量 –0.204 0.009 0.102 0.008

注：阴影数据为 Pearson 相关系数，其余为 Spearman 相关

系数；**表示在 0.01 水平（双侧）上极显著相关，*

表示在 0.05

水平（单侧）上显著相关。

Note: Shaded data are Pearson’s correlation coefficients, and

others are Spearman’s correlation coefficients; ** indicate extremely

significant correlation at 0.01 level (two-sided), *

indicates significant correlation at 0.05 level (one-sided).

表 4 格西沟与相邻区兰科植物比较

Tab. 4 Comparison of orchids between Gexigou and

adjacent areas

自然保护区

Nature

reserve names

属数

Number

of genera

种数

Number

of species

野外调查株数

Number of plants

in field survey

面积

Area/hm2

格西沟 21 38 34 种 6703 株 22 896.8

栗子坪 30 70 26 种 1800 株 4 794 000.0

卧龙 32 74 无调查数据 200 000.0

3.2 格西沟自然保护区兰科植物分布格局

保护区内兰科植物的种类丰富度在水平分布

上比较平均，北部略多于南部，中部最少，这与

3 个区域大环境无论海拔高度还是与雅砻江的距

离都类似有关，因此没有很大的差异。在垂直分

布上，3100~3300 m 区间的兰科植物种属最多，

物种多样性最高，符合“中间高度膨胀型”，与贵

州佛顶山国家级自然保护区的兰科植物分布[19]

相似。

调查到的 34 种 6703 株兰科植物，主要处于

针叶林、针阔叶混交林和高山灌丛植被类型中，3

种生境下数量比例达到 88%，这 3 种植被类型大

多是原生植被类型，适应兰科植物生长。而裸地

和杂草草地是由保护区内道路影响形成，绶草、

宽萼角盘兰、火烧兰、二叶舌唇兰、扇唇舌喙兰

等已扩张到这些次生生境，说明其适应性较好、

生境广泛。兰科植物主要分布于缓坡上，陡坡上

常见的扇唇舌喙兰、落地金钱和西藏玉凤花大多

生长于多石基质，靠苔藓或石缝即可存活。在不

同坡向上的数量排序中，排名前 5 位的坡向中，

阴坡半阴坡占 4 位，比例达 73%，说明北坡、西

北、北东和西坡等阴坡半阴坡是兰科植物的主要

生境，阳坡出现的有火烧兰、头蕊兰、绶草、广

布小红门兰、宽萼角盘兰、绶草、叉唇角盘兰、

小斑叶兰等。

从不同兰科植物种/属分布数量与环境因子

的相关性分析结果来看，大部分物种/属的分布数

量与环境因子无显著相关关系，二叶盔花兰和角

盘兰属的数量都与海拔显著相关。二叶盔花兰在

高海拨区成片集群分布，最大集群量达到 504 株，

已成为杜鹃常绿阔叶灌丛的草本层优势物种。而

角盘兰属则倾向于成群分布于低海拔区域，它们

个体间间距常常很近。头蕊兰的数量则与坡度因

子呈显著正相关，在平坦地段数量少，在陡峭崎

岖之处生长更多。叉唇角盘兰的数量与植被呈极

显著正相关，在针阔叶混交林下分布明显，较针

叶林下更多。

4 展望

受保护区地形地貌及空间可达性制约，本研

究对山顶区域的调查不甚充足，尤其是高海拔的

4300~4700 m 区域，还应对其进行详细调查。建

议对保护区内一些兰科种类集中分布的区域设立

保护点并进行监测，对那些数量和点位均较少的

兰科植物尤其是珍稀濒危植物开展保育与繁殖生

态学研究。

本研究历时 2 年，在前后 2 次同路线的调查

中，有 4 株丛生于低海拔且靠近国道 318 的紫点

杓兰消失。此外，与前人在该保护区内兰科植物

调查[10, 20]相比，虽然本次调查获得的兰科植物种

属数大幅增加，但也失去了毛杓兰（C. franchetii），

无苞杓兰（C. bardolphianum）和西藏杓兰（C.

tibeticum）的踪迹。这几种杓兰都是国家保护种

类，也是观赏价值较高的种类，花期很容易被发

现，因此推测是人为破坏带来的种类消失和减少。

2206 热带作物学报 第 44 卷

如今川西旅游热度持续上涨，318 线自驾人车逐

年增多，加强对保护区内观赏兰科植物的宣传保

护及森林执法刻不容缓。

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热带作物学报 2023, 44(11): 22082218

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-12-20；修回日期 2023-01-31

基金项目 国家重点研发计划项目（No. 2021YFD1200200）。

作者简介 徐 言（1998—），女，硕士研究生，研究方向：兰花种质资源与遗传育种。*通信作者（Corresponding author）：

于晓南（YU Xiaonan），E-mail：yuxiaonan626@126.com；贾瑞冬（JIA Ruidong），E-mail：jiaruidong@caas.cn。

基于 SSR 标记的西南地区野生带叶兜兰资源遗传多样性分析

徐 言1,2，陈之光2

，徐玉凤2

，葛 红2

，杨树华2

，赵 鑫2

，寇亚平2

，

于晓南1*，贾瑞冬2*

1. 北京林业大学园林学院/花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室/国家花卉工程技术研究中心/城乡生态环境北京市实

验室，北京 100083；2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所/农业农村部花卉生物学与种质创制重点实验室（北方），北京

100081

摘 要：带叶兜兰[Paphiopedilum hirsutissimum (Lindl. ex Hook. f.) Stein]具有较高的观赏价值，是中国珍稀濒危保护植

物。为了研究中国西南地区野生带叶兜兰资源的遗传特性，促进野生带叶兜兰资源的保护和利用，本研究利用 SSR 分

子标记技术对中国西南地区广西、云南、贵州 3 省（区）收集的 6 个居群 190 份带叶兜兰资源进行遗传多样性和群体

遗传结构分析。结果表明：从 115 对引物中共筛选出 10 对扩增效果好的引物，10 对 SSR 引物在 190 份带叶兜兰中共

检测到 50 个等位基因，平均每个位点等位基因（Na）为 5 个，平均有效等位基因数（Ne）为 2.4835 个；平均 Shannon

信息指数（I）为 0.8592，平均观测杂合度（Ho）为 0.4518；平均期望杂合度（He）为 0.4387，平均 Nei’s 基因多样性

指数（h）为 0.4370，平均多态信息含量（PIC）为 0.3996。6 个野生带叶兜兰居群的 Na为 2.8000~4.3000，Ne为 1.9655~2.4060，

Ho 为 0.3891~0.4839，He 为 0.3795~0.4683，Shannon 信息指数（I）为 0.6584~0.8369，Nei’s 基因多样性指数（h）为

0.3648~0.4382。广西雅长（GYC）和贵州万峰湖（QWF）居群具有较高的遗传多样性（h=0.4382, h=0.4276），广西木

论（GML）居群具有最低的遗传多样性（h=0.3648）。分子方差分析（AMOVA）结果表明，遗传变异主要发生在居群

内个体间（94%），而居群内遗传分化很小（6%）。基于遗传距离构建的 UPGMA 聚类分析结果显示，6 个居群遗传距

离较小，居群间遗传距离和地理位置不完全相关。Structure 和主坐标分析结果表明，居群间存在均质化现象，无明显

类群划分。综上，带叶兜兰资源遗传多样性较为丰富，研究结果可为中国西南地区野生带叶兜兰资源的保护和利用提

供理论依据。

关键词：带叶兜兰；野生居群；SSR 标记；遗传多样性；遗传结构

中图分类号：S682.31 文献标识码：A

Genetic Diversity of Wild Paphiopedilum hirsutissimum Populations in

Southwest China with SSR Markers

XU Yan1,2, CHEN Zhiguang2

, XU Yufeng2

, GE Hong2

, YANG Shuhua2

, ZHAO Xin2

, KOU Yaping2

,

YU Xiaonan1*, JIA Ruidong2*

1. College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University / Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding / National Engineering Research Center for Floriculture / Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment, Beijing 100083, China; 2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences /

Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Flower Crops (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs,

Beijing 100081, China

Abstract: Paphiopedilum hirsutissimum (Lindl. ex Hook. f.) Stein is a rare and endangered plant in China with high

ornamental value. In order to explore the genetic characteristics of wild P. hirsutissimum resources in Southwest China,

and contribute to the protection and utilization of the wild resources, this study used SSR molecular marker to analyze

第 11 期 徐 言等：基于 SSR 标记的西南地区野生带叶兜兰资源遗传多样性分析 2209

the genetic diversity and population genetic structure of 190 P. hirsutissimum resources which collected from six populations in Guangxi, Yunnan and Guizhou provinces in Southwest China. In this study, the results showed that ten pairs of

primers with good amplification effect were selected from 115 pairs of primers, and 50 alleles were detected by 10 pairs

of SSR primers of 190 P. hirsutissimum. The average number of alleles (Na) was five and the average number of effective alleles (Ne) was 2.4835. The average Shannon information index (I) was 0.8592. The average observed heterozygosity (Ho) was 0.4518 and the average expected heterozygosity (He) was 0.4387. The average polymorphic information

content (PIC) was 0.3996 and the average Nei’s expected heterozygosty (h) was 0.4370. In this six wild P. hirsutissimum

populations, the number of alleles (Na) was from 2.8000 to 4.3000. The number of effective alleles (Ne) was from 1.9655

to 2.4060. The observed heterozygosity (Ho) was from 0.3891 to 0.4839. The expected heterozygosity (He) was from

0.3795 to 0.4683. The Shannon information index (I) was from 0.6584 to 0.8369, and the Nei’s expected heterozygosty

(h) was from 0.3648 to 0.4382. In the six wild populations, the genetic diversity of Guangxi Yachang (GYC) and

Guizhou Wanfeng Lake (QWF) populations was generally higher (h=0.4382, h=0.4276), while the genetic diversity of

Guangxi Mulun (GML) population was relatively low (h=0.3648). Analysis of molecular variance (AMOVA) results

showed that genetic variation mainly occurred among individuals within the population (94%), while genetic differentiation within populations was very small (6%). UPGMA cluster analysis based on genetic distance showed that the genetic distance of the six P. hirsutissimum populations was very small, there was no obvious group division and the genetic distance was not completely related to the geographical location. The results of Structure and principal coordinate

analysis were consistent with those of UPGMA cluster analysis. Structure and principal coordinate analysis results

showed that there was homogenization among the populations, and there was no obvious group division. In summary,

the genetic diversity of Paphiopedilum hirsutissimum resources is relatively rich, which can provide a theoretical basis

for the protection and utilization of wild P. hirsutissimum resources in Southwest China.

Keywords: Paphiopedilum hirsutissimum; wild populations; SSR; genetic diversity; genetic structure

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.009

带叶兜兰[Paphiopedilum hirsutissimum (Lindl.

ex Hook. f.) Stein]为兰科（Orchidaceae），杓兰亚

科 （ Subfam. Cypripedioideae ）兜兰属

（Paphiopedilum Pfitz.）植物，自然花期 3—5 月，

主要分布于中国、印度东北部、越南、老挝和泰

国，其中在中国分布于广西北部至西部、贵州西

南部、云南东南部等地[1]。由于生境破坏、过度

采集和非法贸易等情况严重，使带叶兜兰野生资

源遭受严重的威胁。目前带叶兜兰野生种已被列

入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》（CITES）

附录Ⅰ的保护范围，绝对禁止在国际上贸易[2-4]。

它还被收录于《中国高等植物红色名录》，评估等

级为易危（VU），且有野生带叶兜兰居群呈现破

碎化现象的报道[5-6]。此外带叶兜兰是一个变异幅

度很大的种，在花的结构上有很多变化[1]。因此，

利用分子技术对带叶兜兰野生资源及其遗传状况

进行研究具有重要的意义。

分子标记技术在兰科植物研究中已被广泛使

用。在兜兰属植物研究中，有基于 ITS 序列[7-8]、

RAPD[9]和 SRAP[10]标记的种间亲缘关系及其分

类归属研究，有基于 cpDNA[11]分子标记的系统进

化研究，有基于转录组数据开发 SSR 引物[12-13]

的研究，以及基于 SRAP[14-16]、ISSR[16-18]和 SSR[12]

标记的遗传多样性研究，其中关于带叶兜兰的研

究报道较少，仅见基于 SRAP 标记对广西木论自

然保护区的 40 份野生带叶兜兰资源[14]和基于

SSR 标记对广西雅长自然保护区的 32 份野生带

叶兜兰资源进行遗传多样性研究的报道[12]。中国

西南地区的云南、贵州和广西 3 个省（区）均为

中国带叶兜兰的主要分布地区，而只有以上 2 篇

研究广西地区带叶兜兰单居群遗传多样性的文

献，涉及的采集样本均有一定的地域局限性，且

未涵盖多居群和群体结构研究，不足以反映中国

带叶兜兰资源的遗传水平。

SSR 简单重复序列（SSR）又称为微卫星

（microsatellites）或者串联重复序列（STR），由 1~6

个碱基为重复单位组成的短串联重复序列，它广

泛、丰富且随机地分布于真核生物基因组中[19]。SSR

标记具有数量多、分布广、多态性高、重复性好、

共显性和易检测等特点，已经成为研究种群遗传多

样性和遗传结构的最有效分子标记之一[20]。

本研究以云南、贵州和广西的 6 个野生带叶

兜兰居群为研究材料，在已发表的带叶兜兰表型

多样性研究的基础上[21]，利用 SSR 标记技术对其

进行遗传多样性分析和群体结构分析，并综合分

析表型数据和分子数据，以期为中国西南地区野

2210 热带作物学报 第 44 卷

生带叶兜兰的资源保护工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

根据网上搜索、相关文献记载和实地踏查情

况，采集来源于带叶兜兰天然分布区内广西、云

南和贵州 3 省（区）的 6 个野生居群，共计 190

份样品，具体采样信息见表 1 和图 1。其中在广

西木论（GML）和云南柳井（YDZ）居群带叶兜

兰分布范围较窄，数量较少，因此采集到的样本

数量也相对较少。采样标准为居群间的地理距离

大于 10 km，株间距大于 10 m，且无病虫害。每

个单株采集新鲜叶片放入装有变色硅胶的塑料自

封袋中，干燥备用。

表 1 6 个居群的采样信息

Tab. 1 Sample information of six populations

居群（简称）

Population system (abbreviation)

采样地点

Collection site

样品数量

Sample quantity

样品编号

Sample No.

GML 广西壮族自治区环江县木论乡 13 GML 01-13

GYC 广西壮族自治区乐业县雅长乡 39 GYC 01-39

YDZ 云南省文山州文山县柳井彝族乡 9 YDZ 01-09

YFD 云南省文山州西畴县法斗乡 40 YFD 01-40

QWF 贵州省安龙县万峰湖镇 58 QWF 01-58

QJS 贵州省兴义市桔山镇 31 QJS 01-31

图 1 样品采集点分布图

Fig. 1 Geographic distribution of sample locations

1.2 方法

1.2.1 基因组 DNA 提取 基因组 DNA 的提取参

照本实验室改良后的亨利兜兰基因组 CTAB 提取

方法进行[22]。获取的基因组 DNA 用 1%琼脂糖凝胶

电泳检测纯度和完整性，并用 Nanodrop 2000 微量

分光光度计（Thermo，美国）检测浓度和质量，将

合格的 DNA 样品保存于‒20 ℃，备用。

1.2.2 SSR 引物筛选 参考本实验室基于亨利兜

兰转录组数据开发的引物[22]，从 115 对引物中共

筛选出 10 对扩增效果好的 SSR 引物（表 2）。引

第 11 期 徐 言等：基于 SSR 标记的西南地区野生带叶兜兰资源遗传多样性分析 2211

表 2 10 对 SSR 引物信息

Tab. 2 Information of ten SSR primers

位点

Locus

引物序列（5'‒3'）

Primer sequences (5'‒3')

退火温度

Annealing temperatue/℃

重复单元

Repeat motif

片段长度

Size range/bp

DY011 F: CGAAGCACGGGTCTCTTTCT

R: ACCACCGACATTACCTGCAG

60.0 TTC (7) 107

DY356 F: TGCAGATGAGCCCATGCATT

R: TCACGCCTGTATTTCTGCGT

60.2 GAA (6) 260

DY376 F: GGCACTTACAGCAAGGCTCT

R: GAGACCTGGGCCCATCAAAA

60.1 CTG (6) 102

DY383 F: ACGCGGCAAAAATGATGAGG

R: AGGAGGGTTCATGCAGTAGT

58.9 TCA (6) 100

DY413 F: CAGGCTCCAAAACAAGGCAC

R: GGGACTGGGGAGTAAAAGGC

60.0 CAG (7) 263

DY669 F: CAAACCTCGCTCGGAAGACT

R: AGGGTTTCTATCGCTTGGCC

60.0 TCGAC (6) 259

DY687 F: GCTGCCAATTCGAATGGAGG

R: GCTGCCGATTCTCCTTCCTT

59.9 GGC (6) 203

DY716 F: AGCTATGAGGAACTGCGCTG

R: TGTTGACATGATCCGTGGCA

60.1 GGC (6) 182

DY800 F: AGCTTGAAGTACTTGGGGGC

R: TCCACCTTCTCCTCCTCACT

59.6 TGG(8) 146

DY877 F: GGCGATTGACCTCTGCTGAT

R: TCGGCTTTGGTTGCTGAGAT

60.1 CGC (6) 217

物由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分

公司合成。

1.2.3 PCR 扩增及测序 在 C1000 Touch 实时定

量 PCR 仪（Bio-Rad，美国）上进行反应，PCR 反

应体系（20 μL）：10×buffer 2.0 μL，dNTPs 1.5 μL，

上、下游引物各 2.0 μL，Ex Taq 0.2 μL，DNA 3.0 μL，

ddH2O 9.3 μL。PCR 扩增反应程序为：94 ℃预变性

5 min；94 ℃变性 30 s，65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸

40 s，循环 10 次；94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，

72 ℃延伸 40 s，循环 15 次；94 ℃变性 30 s，55 ℃

退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，循环 10 次；72 ℃延伸

10 min；4 ℃保存。PCR 产物使用 2%琼脂糖凝胶电

泳检测，合格后送至上海天昊生物公司进行基于二

代测序技术的 SSR 基因分型。

1.3 数据处理

采用 Excel 2010 软件统计并整理 SSR 基因分

型数据。利用 Genalex 6.501[23]和 PopGene 1.32[24]

软件计算多态性位点比率（PPB）、等位基因数

（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon 信息指

数（I）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、

Nei’s 基因多样性指数（h）、Nei’s 遗传距离（Gd）、

遗传相似性（Gi）和基因流（Nm）等。利用 PIC-Calc

软件计算多态信息含量（PIC）。利用 Genalex

6.501[23]软件进行基于遗传距离的主成分分析

（PCoA）和分子方差分析（AMOVA）。利用 Mega

7.0[25]软件的非加权平均法（UPGMA）进行聚类

分析，并构建基于遗传距离的聚类图。利用

Structure 2.3.4[26]软件进行遗传结构分析，设置 K

值为 1~10，对不同的 K 值进行 10 次重复运算。使

用马尔可夫链法（Markov’s Chain Monte Carlo,

MCMC），设 burn-in 为 100 000 次，run-length 为

100 000 次迭代，之后用在线软件 Structure harvester

（http://taylor0.biology.ucla.edu/structure harvester/）

根据∆K 峰值位置来确定最佳分组群，并绘制群体

结构分析图。

2 结果与分析

2.1 SSR 标记多态性

利用 10 对 SSR 引物对 190 份带叶兜兰材料进

行 SSR 多态性分析（表 3）。由表 3 可知，共检测

到 50 个 Na，Na 在 2~9 之间，平均每个 SSR 标记 5

个等位基因。Ne为1.0269~ 6.7468，平均值为2.4835。

I 在 0.0843~2.0272 之间，平均值为 0.8592。Ho 在

0.0265~0.8677 之间，平均值为 0.4518。He 在

0.0263~0.8540 之间，平均值为 0.4387 。 h 在

0.0262~0.8518 之间，平均值为 0.4370。PIC 在

0.0260~0.8346 之间，平均值为 0.3996 。参照

BOTSTEIN 等[27]提出的衡量基因变异程度高低的

PIC 指标，有 4 个位点（DY383、DY687、DY716、

DY800）是高度多态性位点（PIC>0.50），4 个位点

（DY356、DY376、DY413、DY669）是中度多态

性位点（0.25<PIC≤0.50），2 个位点（DY011、

DY877）是低度多态性位点（PIC≤0.25）。

2212 热带作物学报 第 44 卷

表 3 10 对 SSR 引物的多态性分析

Tab. 3 Polymorphism analysis of ten SSR primers

位点

Locus

观测等位基因数

Na

有效等位基因

数 Ne

Shannon 信息指

数 I

观测杂合度

Ho

期望杂合度

He

基因多样性指

数 h

多态信息含量

PIC

DY011 4 1.0269 0.0843 0.0265 0.0263 0.0262 0.0260

DY356 4 1.3741 0.5840 0.2707 0.2730 0.2723 0.2588

DY376 4 1.4707 0.6174 0.3457 0.3209 0.3200 0.2966

DY383 9 6.7468 2.0272 0.8360 0.8540 0.8518 0.8346

DY413 2 1.9886 0.6903 0.4811 0.4985 0.4971 0.3736

DY669 5 1.3824 0.5774 0.2919 0.2774 0.2766 0.2592

DY687 5 2.9327 1.1811 0.6667 0.6664 0.6590 0.5916

DY716 7 3.6963 1.4146 0.8677 0.7314 0.7295 0.6817

DY800 5 3.1602 1.2554 0.6878 0.6854 0.6836 0.6202

DY877 5 1.0567 0.1603 0.0437 0.0538 0.0537 0.0532

均值 5 2.4835 0.8592 0.4518 0.4387 0.4370 0.3996

2.2 居群遗传多样性

带叶兜兰各野生居群遗传多样性检测结果见

表 4。6 个居群的多态性位点比率（PPB）在

70%~100%之间，平均值为 88.33%。Na 在 2.8000~

4.3000 之间，平均值为 3.3833。Ne为 1.9655~2.4060，

平均值为 2.1901。I 在 0.6584~0.8369 之间，平均值

为 0.7425。Ho 在 0.3891~0.4839 之间，平均值为

0.4465。He在 0.3795~0.4683 之间，平均值为 0.4205。

h 在 0.3648~0.4382 之间，平均值为 0.4008。表明 6

个带叶兜兰居群的遗传多样性丰富，其中广西木论

（GML）遗传多样性最低，广西雅长（GYC）和贵

州万峰湖（QWF）遗传多样性较高。

表 4 基于 10 对 SSR 引物的带叶兜兰 6 个居群的遗传多样性

Tab. 4 Genetic diversity for the six populations of P. hirsutissimum based on ten SSR primers

居群

Population

多态性比率

PPB/%

观测等位基因数

Na

有效等位基因数

Ne

Shannon 信息指

数 I

观测杂合度

Ho

期望杂合度

He

基因多样性

指数 h

GML 70 2.8000 2.1056 0.6584 0.3891 0.3795 0.3648

GYC 100 3.9000 2.2820 0.8245 0.5070 0.4452 0.4382

YDZ 90 2.9000 1.9655 0.6753 0.4222 0.3981 0.3742

YFD 90 3.2000 2.2494 0.7453 0.4839 0.4683 0.4135

QWF 100 4.3000 2.4060 0.8369 0.4132 0.4329 0.4276

QJS 80 3.2000 2.1323 0.7143 0.4633 0.3988 0.3864

均值 88.33 3.3833 2.1901 0.7425 0.4465 0.4205 0.4008

2.3 居群遗传分化

带叶兜兰居群的分子方差分析（AMOVA）结

果表明，带叶兜兰居群间的遗传变异仅有 6%，而

居群内的遗传变异有 94%，绝大部分遗传变异发

生在各居群的内部（表 5）。说明野生带叶兜兰资

源的遗传多样性以居群内的变异为主，居群内分

化程度较高，而居群间遗传分化较小。

2.4 聚类和主坐标分析

遗传距离和遗传相似性是衡量居群亲缘关系

的重要指标，6 个居群间的 Nei’s 遗传距离（Gd）

和遗传相似性（Gi）见表 6。6 个居群间 Gd 在

0.0169~0.1330 之间，Gi 在 0.8755~0.9832 之间。

其中 GML 和 YDZ 居群间的 Gd 最大（0.1330），

GYC 和 QWF 居群间的 Gd 最小（0.0169）。GYC

和 QWF 居群间的 Gi 最大（0.9832），GML 和 YDZ

居群间的 Gi 最小（0.8755）。

根据居群间的 Nei’s 遗传距离采用 UPGMA

法进行聚类分析（图 2），结果显示，广西雅长

（GYC）和贵州万峰湖（QWF）首先聚为一支，

再依次和贵州桔山（QJS）、云南法斗（YFD）、

云南柳井（YDZ）聚集，最后和广西木论（GML）

聚集。结果表明居群间遗传距离与地理距离无显

第 11 期 徐 言等：基于 SSR 标记的西南地区野生带叶兜兰资源遗传多样性分析 2213

表 5 带叶兜兰群体间分子方差分析（AMOVA）

Tab. 5 Molecular variance analysis (AMOVA) among P. hirsutissimum populations

变异来源

Source of variation

自由度

df

均方和

SS

均方偏差

MS

方差组分

Variance components

变异百分比

Percentage of variation/%

P

居群间 5 64.978 12.996 0.284 6 <0.001

居群内 184 828.037 4.500 4.500 94 <0.001

总计 189 893.016 4.784 100

表 6 带叶兜兰居群间的遗传距离（Gd）和遗传相似性（Gi）

Tab. 6 Nei’s genetic distance (Gd) and genetic identity (Gi) of P. hirsutissimum

居群 Population GML GYC YDZ YFD QWF QJS

GML 0.9107 0.8755 0.9209 0.8926 0.8862

GYC 0.0936 0.9458 0.9597 0.9832 0.9613

YDZ 0.1330 0.0557 0.9285 0.9508 0.9604

YFD 0.0824 0.0412 0.0742 0.9750 0.9592

QWF 0.1136 0.0169 0.0505 0.0253 0.9751

QJS 0.1208 0.0395 0.0404 0.0416 0.0252

注：对角线下方为 Nei’s 遗传距离（Gd），对角线上方为 Nei’s 遗传相似性（Gi）。

Note: Below diagonal is Nei’s genetic distance (Gd), and above diagonal is Nei’s genetic identity (Gi).

图 2 基于 Nei’s 遗传距离的带叶兜兰居群的聚类图

Fig. 2 Cluster of the population of P. hirsutissimum based

on Nei’s genetic distance

著相关性。

为进一步研究群体间的遗传关系，对 190 份

带叶兜兰进行主坐标分析（PCoA）。其中第一主成

分和第二主成分分别可以解释总变量的 31.63%和

10.07%（图 3）。主坐标结果表明带叶兜兰居群间

均质化明显，居群内存在着种质混杂现象。

2.5 居群遗传结构

利用 Structure 的贝叶斯聚类方法对 6 个带叶

兜兰居群进行遗传结构分析，根据 EVANNO 等[28]

的方法用最大似然值∆K 来确定 K 值。Structure

图 3 基于 Nei’s 遗传距离的主坐标分析图

Fig. 3 Principal coordinate analysis diagram based on

Nei’s genetic distance

分析结果显示 K 在 1~10 之间，K 为 2 时，∆K 取

得最大值（图 4），表明 6 个居群 190 个个体的

基因型分为 2 种。2 种基因型在每个居群中分布

比例相似，不能按照不同基因池区分（图 5），

表明带叶兜兰居群间均质化，可能由于较高基

因流导致。

图 4 ∆K 分布图

Fig. 4 Distriction of ∆K

2214 热带作物学报 第 44 卷

图 5 带叶兜兰居群 Structure 聚类结果（K=2）

Fig. 5 Clustering results of P. hirsutissimum (K=2)

3 讨论

3.1 带叶兜兰居群的遗传多样性

遗传多样性是体现一个物种进化潜力和抵抗

外界环境变化的能力，遗传多样性水平越高，物

种适应环境变化的能力越强，反之越弱[29]。本研

究所选的 6 个居群是本实验室从 2013 年开始，通

过查阅文献、网上搜索和多年实地踏查所收集到

的所有居群，其中贵州万峰湖（QWF）、贵州桔

山（QJS）、云南法斗（YFD）和云南柳井（YDZ）

这 4 个居群均是首次对其进行研究报道。

本研究对 6 个带叶兜兰居群的 SSR 检测结果

表明，在物种水平（I=0.8592, h=0.4370）和居群

水平（PPB=83.33%, I=0.7425, h=0.4008）上均具

有丰富的遗传多样性。与以往的兜兰属植物遗传

多样性研究相比，高于朱亚艳等[10]利用 SRAP 标

记分析的 8 种兜兰的遗传多样性（PPB=80.26%,

I=0.4241, h=0.2879），略高于李宗艳等[17]利用 ISSR

标记分析的 7 个硬叶兜兰居群的遗传多样性（PPB=

96.04%, I=0.4889, h=0.3244），略高于 HUANG 等[16]

利用 ISSR 和 SRAP 标记分析的 15 个硬叶兜兰居群

的遗传多样性（ISSR: PPB=80.28%, I=0.4236; SRAP:

PPB=70.67%, I=0.3301），也高于秦惠珍等[18]利用

ISSR 标记分析的 8 个白花兜兰居群的遗传多样性

（PPB=78.33%, I=0.4191, h= 0.2808）。高丽霞等[14]

利用 SRAP 标记分析的广西木论自然保护区的 40

份野生带叶兜兰的遗传多样性（PPB=24.22%,

I=0.1582, h=0.1282）低于本研究中同位于广西木

论县木论自然保护区的广西木论（GML）的遗传

多样性（PPB=70%, I=0.6584, h=0.3648），推测可

能与本研究采用的 SSR 标记具有更高的多态性和

保护区的保护有关。CHEN 等[12]利用 SSR 标记分

析的广西雅长自然保护区的 32 份野生带叶兜兰

的遗传多样性（ Na=2.9300, Ne=2.2200, He=

0.5313）略高于本研究中同位于广西雅长自然保

护区的广西雅长（GYC）的遗传多样性（Na=

3.9000, Ne=2.2820, He=0.4452）。本研究对 6 个带

叶兜兰居群的研究也显示了广西木论（GML）的

遗传多样性最低，广西雅长（GYC）的遗传多样

性较高，推测可能和位于雅长自然保护区的带叶

兜兰居群较大，而位于木论自然保护区的居群较

小有关。本研究与上述近缘或相同物种的多项指

标比较表明，带叶兜兰整体遗传多样性丰富，高

于硬叶兜兰和白花兜兰。

3.2 带叶兜兰居群的遗传结构

遗传分化是反映遗传结构的重要指标。本研

究通过 AMOVA 分析显示，94%的遗传分化发生

在居群内，居群间遗传分化很小（6%），即带叶

兜兰主要遗传变化来自居群内的个体间变异。李

宗艳等[17]利用 ISSR 标记对 7 个硬叶兜兰居群进

行 AMOVA 分析显示，硬叶兜兰居群内（60.4%）

的遗传变异大于居群间（39.60%）。HUANG 等[16]

利用 ISSR 和 SRAP 标记对 15 个硬叶兜兰居群进

第 11 期 徐 言等：基于 SSR 标记的西南地区野生带叶兜兰资源遗传多样性分析 2215

行 AMOVA 分析，ISSR 标记结果显示硬叶兜兰居

群内（69%）遗传变异大于居群间（31%），SRAP

标记结果也显示硬叶兜兰居群内（75%）遗传变

异大于居群间（25%）。秦惠珍等[18]利用 ISSR 分

子标记对 8 个白花兜兰居群进行 AMOVA 分析显

示白花兜兰居群内（87.53%）遗传变异大于居群

间（12.47%）。多项指标表明多数兜兰属植物的遗

传变异均以居群内的遗传变异为主。这一结果可

能与兜兰具有欺骗性授粉的特征有关，欺骗性授

粉的物种比向传粉者提供回报的物种具有更高

的基因流动，且兜兰种子细小也有利于远距离传

播[11]。此外，评价居群的遗传结构需要结合物种

的繁育系统和传粉方式等因素进行综合分析，目

前尚无带叶兜兰繁育和传粉的相关报道，后续应

加强对这方面的研究来进一步阐明其遗传结构的

形成原因。

遗传结构是评价遗传资源的关键。本研究通

过 UPGMA 聚类、PCoA 分析和 Structure 群体结

构分析对带叶兜兰资源进行划分，3 种分析方法

得到的结果相似，均显示 6 个野生带叶兜兰居群

无明显的类群划分，居群间存在基因渐渗的现象

且均质化明显。这可能会降低物种的长期适应性

进化能力，增加在不断变迁的环境中因随机事件

而灭绝的风险。推测很可能因为现存的各个居群

起源于相同的祖先居群，由于在历史中发生生境

片段化，造成这一连续分布的祖先居群残留成目

前多个分散的居群。

3.3 表型多样性和遗传多样性关联分析

本研究与本实验室王文晓等[21]的带叶兜兰表

型多样性分析结果相比，其中有 5 个居群采样地

点均与王文晓等文中相对应（王文晓等文中的

YDZ 居群采样地由云南省马关县斗嘴乡更正为

云南省文山县柳井彝族乡斗咀村，居群字母简称

YDZ 不变）。王文晓等根据 18 个表型性状变异系

数分析显示，5 个野生居群内变异系数由高到底

为云南法斗（YFD）＞贵州万峰湖（QWF）＞广

西雅长（GYC）＞云南柳井（YDZ）＞广西木论

（GML），本研究根据遗传多样性分析结果显示，

6 个野生居群遗传多样性由高到低为广西雅长

（GYC）＞贵州万峰湖（QWF）＞云南法斗（YFD）

＞贵州桔山（QJS）＞云南柳井（YDZ）＞广西

木论（GML），二者结果部分相似；但王文晓等

根据巢氏方差分析表型分化系数显示，居群间的

表型分化大于居群内，而本研究根据 AMOVA 分

析遗传分化系数显示，居群内的遗传分化远远大

于居群间；聚类结果也不同，王文晓等按照表型

性状 Q 型聚类将居群划分为 3 类，云南法斗

（YFD）和云南柳井（YDZ）为一类群，广西雅

长（GYC）和广西木论（GML）为一类群，贵州

万峰湖（QWF）为一类群，其结果大致同地理位

置及生境相符。这种利用表型性状检测植物遗传

变异和多样性的方法简便易行，能够短期内基本

了解植物的遗传变异水平[30]。但植物形态学特征

受环境影响较大，在不同生境下营养和生殖性状

均会出现差异，因此存在一定的局限性[31]。而利

用 SSR 分子标记技术是从 DNA 水平上反映个体

间的遗传变异现象，不受生长发育和时间的制约，

避免环境干扰，成本低，检测效率高，能更准确

地反映类群间的亲缘关系[32]。基于 SSR 技术，本

研究聚类结果表明，不同居群的带叶兜兰的遗传

结构未严格按照地理距离划分，这一结果与本实

验室硬叶兜兰 13 个居群遗传多样性分析结果类

似，广西木论（GML）居群和其他居群遗传距离

最远（数据尚未发表）。其原因可能是：（1）由于

贵州万峰湖（QWF）居群位于 5 个居群的中间位

置，与其他居群有相对较大的基因流交流，基因

重组的空间和机会更大，更容易扩大种群的遗传

多样性水平；（2）贵州万峰湖（QWF）和广西雅

长（GYC）居群分别位于红水河水系的上下游，

通过红水河水系增加了这 2 个居群间的基因交

流，因此这 2 个居群间关系最近。

3.4 带叶兜兰资源保护

遗传多样性是种质资源保护与评价的重要指

标[33]。通过对中国西南地区的 6 个带叶兜兰居群

的遗传多样性进行研究，结果表明带叶兜兰具有

相对丰富的遗传多样性，但居群间存在均质化现

象。在 6 个居群中，贵州万峰湖（QWF）居群和

位于广西雅长自然保护区的广西雅长（GYC）居

群遗传多样性较高，应作为核心种群重点保护，

可见选择在广西雅长作为全国唯一一个国家级兰

科植物自然保护区，在带叶兜兰的保护上其意义

重大。由于带叶兜兰居群内个体间的遗传变异较

高，因此也要加强对居群内部每个个体的保护，

以保持最大遗传变异基因库为目标。

此外，通过全基因组重测序和简化基因组测

序等高通量测序技术开发分子标记，已广泛应用

于大田作物和蔬菜中，这也给兰科植物起源和进

化带来新的研究方向[34]。如简化基因组测序技术

2216 热带作物学报 第 44 卷

有不参考基因组就可以进行大量 SNPs 开发的优

势，目前在兰科植物中石斛属[35]、蝴蝶兰属[36]

上已有应用，但尚无新型分子标记技术应用于兜

兰属植物的报道。为了更好地保护兜兰属植物，

今后可以利用新型高通量测序技术开发新的标记

技术，加强与邻国的交流，增加越南、老挝、印

度、泰国等国家野生居群采样，以全面了解带叶

兜兰资源的遗传状况。

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收稿日期 2023-08-02；修回日期 2023-09-14

基金项目 国家热带植物种质资源库建设项目（No. NTPGRC2023）；国家大宗蔬菜产业技术体系花卉海口综合试验站专项资

金项目（No. CARS-23-G60）。

作者简介 冷青云（1985—），男，硕士，助理研究员，研究方向：热带花卉遗传育种与种苗繁育。*通信作者（Corresponding

author）：尹俊梅（YIN Junmei），E-mail：yinjunmei2004@163.com。

基于流式细胞术的兰属杂交后代倍性鉴定

冷青云，陆锦萍，黄少华，徐世松，李海燕，牛俊海，尹俊梅*

中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室/海南省热带观赏

植物种质创新利用工程技术研究中心/海南省热带作物资源遗传改良与创新重点实验室，海南海口 571101

摘 要：倍性鉴定是热带花卉种质资源鉴定及新品种选育的基础工作之一。本研究利用流式细胞仪对兰属杂交后代进

行倍性鉴定。针对裂解液种类、试验材料组织器官等关键环节，以细胞核解离情况、主峰清晰程度、变异系数及取材

容易程度等方面为评价指标，建立鉴定体系，并比较不同倍性植株的气孔性状差异。结果表明：CyStain UV Precise P

为 3 种裂解液中最优，组织器官以嫩叶为宜；从 3 个杂交组合后代中鉴定出三倍体 6 株，四倍体 2 株，不同倍性间的

气孔长度、宽度和密度均差异显著（P<0.05），气孔长度和宽度的排序为四倍体>三倍体>二倍体，而气孔密度的排序

则相反。该研究结果对杂交兰多倍体选育及开展不同倍性间杂交育种具有重要应用价值。

关键词：流式细胞术；兰属；倍性鉴定

中图分类号：S682.3 文献标识码：A

Ploidy Identification of Cymbidium Hybrid Seedlings by Flow Cytometry

LENG Qingyun, LU Jinping, HUANG Shaohua, XU Shisong, LI Haiyan, NIU Junhai, YIN Junmei*

Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene

Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Provincial Engineering Technology Research Center of Tropical Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization / Key Laboratory of

Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation of Hainan Province, Haikou, Hainan 571101, China

Abstract: Ploidy identification is one of the basic tasks for germplasm resources and new variety breeding of tropical

flowers. In this study, flow cytometry was used to identify the ploidy level of Cymbidium hybrid seedlings. aiming at the

key links such as the type of dissociated liquid, the tissue organ of the test material, evaluation indexes such as the nuclear dissociation, the clear degree of the main peak, the easy degree of sampling, and the coefficient of variation. A

technique system was established and the stomatal traits of different ploidy were analyzed. The results showed that

CyStain UV Precise P was the best of the three dissociated liquid and young leaves were most suitable. Six triploid and

two tetraploid were identified from the offspring of the three hybrid combinations. There were significant differences in

stomatal length, width and density between different ploidy (P<0.05). The rank of stomatal length and stomatal width

was tetraploid>triploid>diploid, while stomatal density was reversed. This study is valuable for the polyploid selection

and use of different ploidy germplasm resources for cross breeding of Cymbidium hybrid.

Keywords: flow cytometry; Cymbidium; ploidy identification

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.010

兰属（Cymbidium Sw.）是兰科（Orchidaceae）

重要观赏类群之一，原生种约 86 种[1]，主要分布

于亚洲热带和亚热带地区，向南到澳大利亚北部，

中国是该属的分布中心和多样性中心，分布于秦

岭山脉以南地区，约有 63 种[2]。种内品种及种间

杂种和品种间杂交种超过 2 万种，截至 2022 年，

2220 热带作物学报 第 44 卷

在国际兰花杂种登录权威机构（International Registration Authority for Orchid Hybrids, RHS）上登

录的兰属植物杂交种有超过 17 363 个[3]。

兰属育种方式有选择育种、杂交育种与诱变

育种等，其中杂交育种是兰属植物的主要育种手

段。在杂交育种工作中，了解亲本及杂交后代的

倍性和育性十分重要，有利于提高育种的成功

率。通过染色体计数法对一些兰属原生种及杂交

品种（杂交兰和大花蕙兰）进行倍性鉴定研究，

原生种及杂交兰主要是二倍体，大花蕙兰（Cymbidium hybridium）的染色体倍性多样化，有二倍

体、三倍体、四倍体、六倍体和非整倍体[4-10]。

然染色体计数法对细胞学操作技术要求较高，且

费时费工，面对大规模种质资源及杂交后代群体

的倍性鉴定需要寻找一种快速便捷、高通量鉴定

的方法。

流式细胞术（flow cytometry, FCM）是 20 世

纪 70 年代发展起来的一种对悬浮的单细胞进行

高速分析和分选的技术。在植物学研究中，常用

于倍性分析、细胞计数、细胞周期分析及植物基

因组大小估算等研究，具有分析速度快、灵敏度

高、可靠性好等优点[11-12]。近年来在红掌[13]、香

蕉[14]、橡胶[15]、火龙果[16]、茉莉花[17]、桂花[18]、

三角梅[19-20]等植物倍性鉴定中应用。在兰科植物

研究中，已有超过 26 属 70 种的基因组大小是通

过 FCM 评估，包括兰属、兜兰属（Paphiopedilum）、

树兰属（Epidnedium）等[21-25]，另外，FCM 也应用

于对化学诱变剂处理后的蝴蝶兰（Phalaenopsis）、

石斛（Dendrobium)、白芨（Bletilla）倍性鉴定[26-29]。

本研究通过流式细胞术对兰属 3 个杂交后代群体

进行倍性鉴定，以期为快速鉴定杂种后代倍性提

供技术方法，并获得优良的多倍体植株，为今后

的多倍体育种提供种质材料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为亲本黄金小神童（Cymbidium Golden

Elf. ‘Sundust’）、冬风兰（Cymbidium dayanum Rchb.

f）、美花兰（Cymbidium insigne Rolfe）以及其杂

交后代群体，其中，黄金小神童为杂交种，其他

为原生种，具体组合及杂交后代数量见表 1。所

有材料均保存于中国热带农业科学院热带作物品

种资源研究所八队热带花卉种质资源圃。

表 1 兰属杂交组合情况表

Tab. 1 List of Cymbidium hybrid seedlings

序号

No.

母本

Female parent

父本

Male parent

后代数量

No. of hybrids

1 黄金小神童 冬凤兰 126

2 黄金小神童 美花兰 98

3 黄金小神童×冬凤兰 美花兰 56

1.2 方法

1.2.1 兰属流式细胞术倍性检测技术体系构建

裂解液种类、试验材料组织部位是影响倍性检测

的关键环节。本试验应用了 3 种裂解液 Galbraith’s

buffer （ GLB ）（ 30 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O 、

45 mmol/L MgCl2 、 20 mmol/L 3-[nmorpholino]

propanesulfonic acid]、0.1% Triton X-100（w/V），

pH 7.0）、Woody Plant Buffer（WPB）（0.2 mol/L

Tris-HCl，86 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 焦亚硫酸

钠 ， 4 mmol/L MgCl2·6H2O, 2 mmol/L EDTANa2·2H2O，1% PVP-10，1%（V/V）Triton X-100，

pH 7.5[26]、CyStain UV Precise P 试剂盒，以黄金

小神童幼嫩叶片、根尖组织、花梗、花萼片为材

料，利用流式细胞仪测定相对荧光强度（relative

fluorescence intensity of PI-stained nuclei，FL）和

G0/G1 期的变异系数（coefficient of variation，

CV），筛选出最适合裂解液及组织部位，每个处

理重复 3 次。

1.2.2 兰属杂交后代流式细胞术倍性检测 基于

黄金小神童为试验材料构建的兰属流式细胞术倍

性检测技术体系：解离液为 CyStain UV Precise P，

幼嫩叶片为试材，检测其倍性。

将样品置于含 1.0 mL 预冷的 GLB 解离液的

培养皿中，用锋利的刀片切碎，2 min 后用 300

目尼龙网过滤，滤液加入预冷的碘化丙啶（PI）

和 RNAase 溶液，工作浓度均为 50 μg/mL。置于

冰上避光染色 0.5~1 h后上机检测，仪器为 Sysmex

CyFlow® Ploidy Analyser，激发光为 488 nm，每

次检测收集 5000 个颗粒，仪器自带软件作图分析，

变异系数控制在 5%以内。每份材料重复 3 次。

1.2.3 不同倍性气孔形状观察 叶片气孔大小和

密度比较：取不同倍性叶片，在叶片下表皮均匀

涂上一层透明指甲油，待指甲油干后，用镊子挑

取其表皮置于有蒸馏水的载玻片上，吸取多余的

水分，加盖玻片后在 Leica DM2500 生物显微镜

40×物镜下观察测量。每片至少观察 10 个视野，

记录每个视野内气孔器的个数，每片选取 30 个气

孔，测量每个气孔器的长度和宽度。

第 11 期 冷青云等：基于流式细胞术的兰属杂交后代倍性鉴定 2221

2 结果与分析

2.1 兰属流式细胞术倍性检测技术体系构建

2.1.1 不同裂解液对细胞核解离的影响 以黄金

小神童嫩叶为供试材料，利用流式细胞仪研究 3

种裂解液对兰属植物的裂解效果（图 1，表 2），

发现 3 种裂解液均能较好地保证完整的细胞核从

破碎细胞中裂解出来，同时可降解细胞中的次生

代谢产物。对于 FL 值，3 种裂解液有显著差异，

其中 GLB 裂解液裂解样品得出的 FL 值最低，最

高的 FL 值出现在 CyStain UV Precise P 裂解的样

品中，且显著高于另外 2 个裂解液。在用 3 种裂

解液对兰属进行流式分析中，CV 值差异不显著，

最高的为 WPB 裂解液，CV 值为 5.66%，大于 5%；

最低为 GLB 裂解液，为 3.93%。裂解液的选择标

准为有最高的 FL 值和最低的 CV 值，通过表 2

发现，CyStain UV Precise P 在 3 种裂解液种中最

佳。从图 1 也可看出，CyStain UV Precise P 制备

的样品流式细胞图出峰清晰、稳定、杂峰少，并

且可以清晰地观察到 G2 期。因此，选定 CyStain

UV Precise P 试剂盒为本研究后期的裂解液。

图 1 3 种裂解液的流式覆盖图

Fig. 1 Overlays of distributions obtained with

three buffers by FCM

表 2 3 种细胞裂解液流式细胞术参数评定

Tab. 2 Assessment of flow cytometric parameters

in three nuclear isolation buffers

裂解液

Nuclear isolation buffers

相对荧光强度

FL

变异系数

CV/%

GLB 12 495.67±145.36a

3.93±0.46a

WPB 13 838.33±609.45b

5.66±1.09a

CyStain UV Precise P 18 676.33±117.12c

4.04±0.76a

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data

indicate significant difference (P<0.05).

2.1.2 不同组织部位对植物倍性的影响 本研究

分别使用植株的嫩叶、根尖、花梗和花萼片来验

证不同组织器官对植物倍性检测结果准确性的影

响。由图 2 可知，4 种组织器官均能裂解出细胞

核，嫩叶和花梗有一个明显峰值，其峰值清晰，

细胞碎片少，根尖和花萼片流式 DNA 含量直方

图显示出 2C、4C、8C 共 3 个峰值，根尖在 2C、

4C 处峰值等高，花萼片的主峰值出现在 4C 处，

是叶片主峰值的 2 倍，这 2 种组织呈现体内多倍

化现象，不适合作为兰属倍性检测的组织材料，

花梗能较好地出峰，也无多倍化细胞干扰，但其

取材时间只能在开花期特定时间采集，而叶片可

以在任何季节取材，是理想的兰属倍性检测组织

部位。在后续的研究中选择以幼嫩叶片为材料开

展流式细胞术检测。

2.2 兰属杂交后代流式细胞术倍性检测

以 CyStain UV Precise P 试剂盒为裂解液，利

用流式细胞仪对 3 个亲本及其杂交后代进行倍性

检测。测定结果见图 3，3 个亲本流式细胞图出峰

清晰、稳定、杂峰少，荧光强度在 12 251~13 509

之间，差异不大。因 3 个亲本均为二倍体，将杂

交后代 DNA 相对含量峰值在 12 800 左右定为二

倍体，三倍体峰值在 19 200 左右和四倍体峰值在

25 600 左右。杂交后代倍性检测统计结果见表 3，

共检测出多倍体 8 株，其中黄金小神童×美花兰后

代检测出三倍体 1 株，占比为 1.02%；（黄金小神

童×冬凤兰）×美花兰后代检测出三倍体 5 株，占

比 8.92%；四倍体 2 株，占比 3.57%。

2.3 不同倍性气孔形状比较

兰属二倍体、三倍体和四倍体的气孔性状分

析结果表明（表 4，图 4），不同倍性间的气孔长

度、宽度和密度均差异显著（P<0.05）；气孔长

度和宽度的排序为四倍体>三倍体>二倍体，而气

孔密度的排序则相反。

3 讨论

目前，流式细胞术是大规模检测植物倍性的

有效手段，具有快速、准确、操作简便和可重复

性强等优点。其中裂解液种类和试验材料组织部

位是影响其准确性的关键因素。前人研究发现

GLB 对兰属裂解效果最好[24-25]。本研究在对兰属

植物裂解试验中，发现 CyStain UV Precise P 试剂

盒裂解液是所用 3 种裂解液中效果最佳的，

CyStain UV Precise P 为专利产品，配方成分未公

2222 热带作物学报 第 44 卷

图 2 不同组织器官流式细胞仪测定直方图

Fig. 2 Histograms of different tissue parts using flow cytometry

表 3 杂交后代倍性检测结果

Tab. 3 Ploidy analysis of hybrid seedlings

序号

No.

母本

Female parent

父本

Male parent

后代数量

No. of hybrids

二倍体数

Diploid/%

三倍体数

Triploid/%

四倍体数

Tetraploid/%

1 黄金小神童 冬凤兰 126 126(100.00) 0(0.00) 0(0.00)

2 黄金小神童 美花兰 98 97(98.98) 1(1.02) 0(0.00)

3 黄金小神童×冬凤兰 美花兰 56 49(87.50) 5(8.92) 2(3.57)

表 4 不同倍性兰属种质叶片气孔特征比较

Tab. 4 Comparison of different ploids stomatal characters

in Cymbidium hybrids

倍性

Ploids

气孔长度

Stomatal

length/µm

气孔宽度

Stomatal

width/µm

气孔密度

Stomatal

density/(个·mm–2)

二倍体 18.13±0.38a

11.39±0.58a

101.85±14.80a

三倍体 23.93±1.13b

13.06±0.71b

71.06±7.11b

四倍体 26.65±1.05c

20.23±0.47c

49.74±7.10c

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data

indicate significant difference (P<0.05).

开，且售价偏高，GLB 含有柠檬酸钠和 TritonX100，能清除兰属植物叶肉细胞中含有大量的糖

类、酚类等黏性物质，其裂解的细胞悬浮液也能

出较好的峰值，因此在对兰属物种进行流式细胞

技术测定时，无法获得 CyStain UV Precise P 试剂

盒裂解液的情况下，也可选择 GLB 进行试验。兰

科普遍存在核内再复制现象[12]，兰属组织器官中

也均存在多倍体化[30]。本研究所选的 4 种植物组

织中，根尖和花萼片均存在不同程度的内源多倍

体化现象，内源多倍体化在植物倍性鉴定中会造

成倍性改变的假象，对结果的准确性产生影响；

嫩叶和花梗出峰稳定，因嫩叶不受开花等影响，

在幼苗期及成苗期均可以采样，是兰属倍性检测

的最佳组织材料。

多倍体育种是观赏植物育种的重要方向之一。

第 11 期 冷青云等：基于流式细胞术的兰属杂交后代倍性鉴定 2223

图 3 不同种（品种）流式细胞仪测定直方图

Fig. 3 Histograms of different species (varieties) using flow cytometry

D1：二倍体；D2：三倍体；D3：四倍体；比例尺：50 µm。

D1: Diploid; D2: Triploid; D3: Tetraploid; Scale: 50 µm.

图 4 不同倍性兰属种质叶片气孔特征

Fig. 4 Stomatal characters of different ploids in Cymbidium hybrids

目前商业化的大花蕙兰品种多数为多倍体。不同

倍性品种间杂交是兰属多倍体的主要选育途径，

三倍体可由四倍体为亲本与二倍体杂交产生，四

倍体由四倍体和四倍体杂交产生，二倍体品种间

杂交也能产生四倍体的子代[8, 10]。本研究在 2 个

二倍体为亲本的杂交组合后代中检测到三倍体和

四倍体，四倍体可能是由二倍体合子经体细胞加

倍后发育成植株，三倍体是由未减数分裂的 2n 配

2224 热带作物学报 第 44 卷

子和经减数分裂 n 配子受精融合发育而成，其中

2n 配子来源于母本的概率大于父本，因为在获得

多倍体杂交组合的母本均为杂交种，黄金小神童

是建兰（C. ensifolium）和大花蕙兰（C. Enid Haupt）

的杂交种，经多次杂交选育而成，具有 50%建兰、

12.5%美花兰和 6.25%独占春的血统[英国皇家园

艺学会（RHS）的兰科植物品种国际登录网]。有

研究表明远缘杂交是获得高效发生 2n 配子资源

的有效手段，杂交种在配子形成过程中减数分裂

异常，出现 2n 配子概率显著高于原生种[31-32]。

从本研究中杂交组合 3 比组合 2 出现多倍体比例

高的现象，也可发现杂交代数越高，遗传背景越

复杂，获得可育配子比例低，产生后代数量也相

对少，但更容易出现多倍体。在兰属杂交育种中，

亲本选择可以亲缘关系较远，亲本至少有一方是

经过多代杂交后的杂交种，这样子代植株倍性会

相对丰富。

染色体组的加倍会导致基因表达和调控的改

变，从而造成植物形态和生理上的相应变化，如

叶片变宽、变厚，花瓣变厚、颜色变深，气孔长

度和宽度增大、密度降低、育性和抗性改变等。

本研究发现，随着倍性的提高气孔的长度和宽度

均增大，气孔密度变小。这与张源源等[33]在橡胶

多倍体研究中的结果相似。而株型、花朵数量、

大小和颜色、花期长短、抗性及育性等特性有待

进一步观察。

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收稿日期 2023-06-30；修回日期 2023-09-15

基金项目 河南省重点研发与推广专项（科技攻关）（No. 232102111101）；河南省林木种质资源建设项目（豫财环资[2023]60 号）。

作者简介 王世尧（1996—）， 男，硕士，研究实习员，研究方向：蝴蝶兰栽培与育种。*通信作者（Corresponding author）：

王 俊（WANG Jun），E-mail：wangjun.hnzz@163.com。

基于表型的蝴蝶兰花色数量分类

王世尧，张 果，杨书才，蒋拴丽，王瑞华，王 俊*

郑州市农林科学研究所，河南郑州 450005

摘 要：为精准界定蝴蝶兰的花色，建立基于表型的蝴蝶兰花色数量分类体系。本研究利用分光测色仪和比色卡测定

146 份蝴蝶兰种质的花色表型，通过聚类分析且结合 ISCC-NBS 色名表示法对各蝴蝶兰的花色命名，并进行数量分类研

究。结果表明：蝴蝶兰花瓣和萼片颜色差异不大，唇瓣相较二者颜色更暗，彩度较大。基于侧花瓣的 L*

、a*

、b*

值聚

类分析的分类结果不能完全表征蝴蝶兰花色的分类特点；ISCC-NBS 色名表示法将蝴蝶兰花色分为黄、棕、红、紫罗兰、

粉、紫、白 7 大色系，各色系与 CIE Lab 表色系统的各参数具备较好的对应关系，可实现对不同蝴蝶兰花色的定量描

述，色系分类合理；蝴蝶兰花色丰富，且其不同色系的花色存在显著差异，缺乏蓝绿色系；整体上蝴蝶兰花色明度和

彩度呈负相关，可分为 2 个类群，第 1 类群包含黄、棕、紫罗兰、粉、紫、白色系，第 2 类群为红色系。

关键词：蝴蝶兰；花色表型；数量分类；聚类分析；ISCC-NBS 色名表示法

中图分类号：S682.31 文献标识码：A

Numerical Classification of Phalaenopsis Flower Colour Based on

Phenotype

WANG Shiyao, ZHANG Guo, YANG Shucai, JIANG Shuanli, WANG Ruihua, WANG Jun*

Zhengzhou Institute of Agriculture and Forestry Science, Zhengzhou, Henan 450005, China

Abstract: The study aimed to define the floral colour of Phalaenopsis precisely and establish a classification system of

Phalaenopsis based on floral colour phenotypes. In this study, the floral colour phenotypes of 146 Phalaenopsis germplasm resources were determined using colourimeter and RHSCC, and the floral colours of each Phalaenopsis were

named by cluster analysis and combined with ISCC-NBS system, and the quantitative classification was studied. The

results showed that the colour of Phalaenopsis petals and sepals did not differ much, and the lip petals were darker and

more colourful than petals and sepals. The classification results based on cluster analysis of L*

, a*

and b*

of petals could

not fully characterize the classification of Phalaenopsis flower colours. The ISCC-NBS system divided Phalaenopsis

flower colour into yellow, brown, red, violet, pink, purple and white groups. Each group had a preferable correspondence with L*

, a*

and b*

parameters of the CIE Lab system, which could realize the quantitative description of different

Phalaenopsis flower colour and the colour group classification was reasonable. Phalaenopsis were rich and colourful, and

there were significant differences between different colour groups of Phalaenopsis, but lacking blue-green colour. Overall

the brightness and colouration of Phalaenopsis were negatively correlated, and could be divided into two groups, the first

type containing yellow, brown, violet, pink, purple and white groups, the second type containing red colour groups.

Keywords: Phalaenopsis; flower colour phenotype; numerical classification; cluster analysis; ISCC-NBS method

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.011

蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.），因花姿似蝴蝶

飞舞而得名，素有“兰之皇后”之美誉[1]。当前，

全球已登录 38 963 个栽培蝴蝶兰品种，长期的杂

交育种使蝴蝶兰具有丰富绚丽的色彩[2]。花色是

2228 热带作物学报 第 44 卷

观赏植物的重要经济性状，精准定义蝴蝶兰花色

对其分类、品种鉴定及产业交流的规范性举足轻

重[3]。陈和明等[4]基于 213 份蝴蝶兰资源的 18 个

性状构建蝴蝶兰品质性状综合评价体系，花色性

状为品质评价的关键指标之一，且变异程度较高。

汤楷等[5]对 17 份蝴蝶兰新品种（系）的 16 个性

状运用加权主成分分析法进行商品性综合评价，

花色权重占 20.87%。近年来，蝴蝶兰花色表型研

究主要借助定性描述及比色卡来鉴别花色，宋一

岚等[6]通过定性描述将蝴蝶兰分为白、黄、紫红、

深紫、暗紫及 6 个复色镶嵌色系；陈剑锋等[7]利

用比色卡对 127 份蝴蝶兰各花器官的主色进行了

定义，但 2 种方式皆易受环境和人为因素影响进

而造成较大误差。分光色差仪等精密仪器可有效

消除上述影响，具备稳定性高、可量化的特点，

目前已广泛应用于菊花[8]、荷花[9]、百合[10]、月

季[11]等多种重要观赏植物的花色分类研究中，使

得花色表型的数量化得以实现。

随着蝴蝶兰种质资源愈加丰富，蝴蝶兰在花

色素组成[12]、花色功能基因鉴定[13-14]及基于形态

特征的系统分类学[15-16]等方面开展了大量的研究

工作，但基于蝴蝶兰花色表型数量化的分类研究

尚无相关报道。对观赏植物的花色进行精准评价亦

是建立其与各组遗传标记之间联系的前提[17]，因

此，亟须建立一套科学系统的基于表型的蝴蝶兰

花色数量分类体系。本研究通过使用分光测色仪

结合英国皇家园林协会 RHS 植物比色卡（Royal

Horticultural Society Colour Chart, RHSCC）对 146

份蝴蝶兰种质进行花色测定，采用聚类分析和

ISCC-NBS 色名表示法对其进行分类命名，并对

分布情况进行分析，以期精准定义蝴蝶兰花色并

科学分类，为蝴蝶兰品种数量分类与鉴定、花色

定向育种等工作提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料均为郑州市农林科学研究所蝴蝶兰

种质资源圃所收集、保存的资源。2022 年 9—10

月对资源圃内资源利用降温设备进行催花处理，

2023 年 1—2 月进入盛花期。经初步鉴定和筛选，

选取长势良好，花色表型稳定的 146 份蝴蝶兰种

质（部分如图 1 所示），于盛花期的晴朗上午进行

取样测定。

图 1 供试部分蝴蝶兰种质

Fig. 1 Selected Phalaenopsis germplasm for testing

1.2 花色表型的测定

对每个品种选取具有典型颜色特征的 3 朵

花，分别利用 RHSCC 和分光测色仪（三恩时

TS7036）进行测定：在室内自然光条件下用比色

卡进行比色，3 次重复后以出现频率最高的颜色

为最终测定结果；在光源 C/2°、测量口径 4 mm

的参数设置下使用测色仪，置花被片平铺于白纸

上，将集光孔对准测定部位（图 2），测定 3 个重

复，取均值代表花被片颜色。

蝴蝶兰侧花瓣、萼片及唇瓣由斑点、条纹等

图案导致的异色，根据其是否能覆盖底色来判定，

若连成片状且颜色异于底色则认为是复色，若不

能将底色覆盖则定义为纯色。

1~3：纯色测定部位；A(a)~C(c)：复色测定部位。

1-3: The measuring position of pure colour flower; A(a) -C(c): The

measuring position of the biocolour flower.

图 2 蝴蝶兰花色测定部位

Fig. 2 Measuring position of Phalaenopsis