袁滨 等 毛木耳发酵料堆细菌群落多样性分析
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全长 16S rRNA 序列,在不考虑测序平台、测序
质量等条件下,模拟对比 6 个常用连续扩增区域
发现,V3-V4 区和 V4-V5 区在各分类层级鉴定的
准确性最高。在微生物多样性的分析时,可优先
选择 V3-V4 区。因此,本研究拟采用 16S rDNA
的 V3-V4 区进行发酵料微生物多样性分析。
PCR 扩增条件如下:94℃ 2 min,然后 98℃
10 s,62℃ 30 s (16S V4 区时,为 55℃ 30 s),
68℃ 30 s 进行 30 个循环,最后 68℃ 5 min。使
用扩增引物 341F: CCTACGGGNGGCW GCAG;
806 R: GGACTACHVGGGTATCTAAT,产物片段
长度约为 466 bp。PCR 反应进行一式 3 份。扩增
体系:50 μL 混合物,包含 5 μL 10×KOD 缓冲液,
5 μL 2 mmol/L dNTPs,3 μL 25 mmol/L MgSO4,
1.5 μL 下游引物(10 μmol/L),1 μL KOD 聚合
酶,100 ng 模板 DNA。从 2%琼脂糖凝胶中搜集
扩增子,使用 AxyPrep DNA 凝胶提取试剂盒
(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)
按照制造商的说明进行纯化,并使用 ABI StepOnePlus 实时 PCR 系统(Life Technologies,Foster
City,USA)进行定量。纯化后的扩增子根据
Illumina 平台进行 PE250 模式上机测序。该项工
作委托广州基迪奥生物科技有限公司完成。
(3)OTU 聚类与 PCA 分析 使用 Uparse
(Edgar, 2013)软件将测序获得的 Clean tags 进行聚
类,设置相似度≥97%聚类为同一个操作分类单
元(Operational taxonomic units, OTU)。采用
UCHIME 算法对 Clean tags 存在的嵌合体进行检
查和过滤,获得的 Effective tags 进行 OTU 丰度统
计和其他后续分析。选取丰度最高的 Tag 作为每
个 OTU 的代表序列,计算每个 OTU 在各个样品
中的 tags 丰度信息。基于 OTU 列表的物种丰度
信息,进行主成分分析(PCA,Principal Component
Analysis);基于欧式距离(Euclidean distances)
进行方差分解,对多维数据进行降维,从而提取
出数据中最主要的元素和结构,研究样本间的组
成距离关系。分析结果中,样品微生物组成越相
似,反映在 PCA 图中的距离越近。
(4)稀释曲线及α多样性分析 稀释曲线
(Rarefaction curve)用于评价测序量是否足以覆
盖所有类群。不同阶段的发酵料 ACE 指数的稀释
曲线,反映物种丰富度的变化趋势,ACE 指数越
大,表明物种丰富度越高。采用α多样性指数
Shannon、Simpson 和 Pielou 分析样品中微生物群
落多样性与复杂度,指数越高表明群落多样性越
高。采用 UPGMA 2.2.1(非加权组平均法)展现
各个样品的关系和样品分组。
(5)物种组成分析 利用注释软件 RDP 2.2
(Edgar, 2013)将 OTU 代表序列比对到 SILVA 数据
库,进行物种分离注释,设置阈值为 0.8~1.0。根
据不同样品的微生物物种组成分布,采用 R 语言
ggplot 2 包绘制物种丰度堆叠图。
(6)指示物种分析 采用 R 语言 labdsv 包计
算比较组各个样品中丰度值>0 且总占比>0.1%的
物种在每个分组的 indicator value,找出各个组的
指示物种。使用 cross-validation 进行统计检验,
获得 P 值。
2 结果与分析
2.1 培养料发酵效果与营养成分变化情况
培养料刚堆积发酵时升温较慢,36 h 后料堆
50 cm 深处料温达到 52℃,之后逐渐上升,至第
3 天后料温达到 65~73℃,保持约 3 d,之后料温
逐渐下降,料温降至约 60℃前开始翻堆,翻堆后
当天料温即可达 50℃以上,并快速上升,2 d 后
料温达到 65~70℃。毛木耳培养料发酵后期,料
堆高温保持的时间逐渐减少,料温下降速度增加,
若没有及时翻堆,料堆表面温度过低,可能会出
现墨汁鬼伞,浪费培养料营养,而且料堆底部会
因缺氧而局部厌氧发酵,因此后期翻堆间隔时间
逐渐缩短。发酵成功的培养料,颜色由本色逐渐
变为灰褐色,pH 约 7.5,有大量白色放线菌等有
益菌的生长,料堆没有刺鼻的氨味,而是有一股
清香味。
发酵前后,培养料营养成分发生较大的变化。
从表 1 可以看出,培养料全氮含量从发酵前的
0.43%提高至发酵后的 0.83%,C/N 从 88.0 降低至
43.92;粗纤维含量从 45.88%减少至 39.56%,可
溶性糖含量减少更加显著,从 1.95%减少至
0.52%。发酵前后,全氮含量增加了 93.02%,粗
纤维和可溶性糖含量分别减少了 13.78% 、
73.33%。真菌是喜糖生物,在形成菌落初期主要
利用葡萄糖、果糖等可溶性糖类,发酵料不容易
感染链孢霉可能与可溶性糖等物质的减少有关。