吉林农业大学学报2023年第45卷第6期

发布时间:2023-12-26 | 杂志分类:其他
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吉林农业大学学报2023年第45卷第6期

吉林农业大学学报 2023 年 12 月Journal of Jilin Agricultural University 2023,Decembertransformation of ginsenoside Rb1 from Panax ginseng C. A.Meyer to Rg3 and Rh2 by Lactobacillus paracasei subsp. toler⁃ans MJM60396 [J]. Biotechnol Bioprocess Eng,2016,21(5):587-594.[42] Zhang C,Xu Y,Gu M,et al. Biotransformation of ginsenoside Rc to Rd by endophytic bacterium Bacillus sp. G9y isolated from Panax quinquefolius[J]. Antonie Leeuwenhoek,2021,114(4):437-444.[43] Ku S,You H J,Park M S.Whole-cell biocatalysis fo... [收起]
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吉林农业大学学报2023年第45卷第6期
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吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

transformation of ginsenoside Rb1 from Panax ginseng C. A.

Meyer to Rg3 and Rh2 by Lactobacillus paracasei subsp. toler⁃

ans MJM60396 [J]. Biotechnol Bioprocess Eng,2016,21

(5):587-594.

[42] Zhang C,Xu Y,Gu M,et al. Biotransformation of ginsenoside

Rc to Rd by endophytic bacterium Bacillus sp. G9y isolated

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(责任编辑:林海涛)

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吉林农业大学学报 2023,45(6):685-692 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

植物激素在人参皂苷生物合成中的作用及调控

机制*

梁 浩1,3

,孙 海1,3

,邵 财1,3

,张亚玉1,2,3**

1. 中国农业科学院特产研究所,长春 130112;2. 成都大学食品与生物工程学院,成都

610106;3. 吉林省中药材种植(养殖)重点实验室,长春 130112

摘 要:植物激素在调控植物生长发育、环境适应及次生代谢中发挥着重要作用,尤其是在药用植物中的科

学合理利用对促进其有效成分的形成具有良好效果。人参具有重要的药用价值,其有效成分人参皂苷的形成

受各种环境因子的影响,而植物激素作为植物对环境条件适应的调节剂,在调控人参皂苷生物合成中发挥重

要作用。文章归纳分析了茉莉酸、水杨酸、生长素、脱落酸和赤霉素在人参皂苷生物合成中的作用及调控机

制,指出植物激素作为信号分子介导人参皂苷生物合成途径中的关键酶活性或基因差异表达,从而影响人参

皂苷的合成,并初步绘制了茉莉酸、水杨酸、生长素、脱落酸和赤霉素调控人参皂苷积累示意图,同时展望未来

植物激素在药用植物中应用的研究方向,为在生产实践中推进中药材“高产优质”种植提供参考和借鉴。

关键词:植物激素;人参;皂苷;调控机制

中图分类号:S567. 51;R284. 3 文献标志码:A 文章编号:1000-5684(2023)06-0685-08

DOI:10.13327/j.jjlau.2023.20081

引用格式:梁浩,孙海,邵财,等.植物激素在人参皂苷生物合成中的作用及调控机制[J].吉林农业大学学报,

2023,45(6):685-692.

Role and Regulatory Mechanism of Plant Hormones in Ginsenoside

Biosynthesis *

LIANG Hao1,3

,SUN Hai1,3

,SHAO Cai1,3

,ZHANG Yayu1,2,3**

1. Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chang⁃

chun 130112, China;2. College of Food and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu

610106, China;3. Jilin Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicinal Materials Culti⁃

vation and Propagation, Changchun 130112, China

Abstract:Plant hormones play an important role in the regulation of plant growing development, en⁃

vironmental adaptation and secondary metabolism. Especially, the scientific and rational utilization

in medicinal plants has a good effect on promoting the formation of their effective components. Panax

ginseng is known as the \"king of herbs\" and has important medicinal value. The formation of its func⁃

tional component ginsenoside is affected by various environmental factors. Plant hormones are regula⁃

tors of plant adaptation to environmental conditions and play a key role in regulating ginsenoside bio⁃

synthesis. Based on the application of plant hormones in Panax ginseng, this paper summarized and

analyzed the role and regulatory mechanism of jasmonic acid, salicylic acid, auxin, abscisic acid and

* 基金项目:国家现代农业产业技术体系项目(CARS-21),四川省科技厅项目(2022YFQ0092)

作者简介:梁浩,男,博士研究生,主要从事药用植物栽培研究。

收稿日期:2023-01-31

** 通信作者:张亚玉,E-mail:zyy1966999@sina.com

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吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

gibberellin in ginsenoside biosynthesis. It pointed out that plant hormone act as signaling molecules

to mediate key enzyme activities or gene differential expression in ginsenoside biosynthesis pathway,

thus affecting the synthesis of ginsenosides. The diagrams of jasmonic acid, salicylic acid, auxin, ab⁃

scisic acid and gibberellin regulating the accumulation of ginsenosides were preliminarily drawn, and

future research direction of the application of plant hormones in medicinal plants was predicted. The

purpose of this paper is to provide reference for promoting the “high-yield and high-quality” cultiva⁃

tion of traditional Chinese medicine in production practice.

Key words:plant hormone;Panax ginseng; ginsenoside; regulation mechanism

植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机

物质,在极低浓度下就能引起植物生理效应的微

量物质,在调节植物生长发育、应对环境变化和防

御病虫害等方面具有重要作用[1]

。植物激素能调

节植(作)物的生存、产量和品质,尤其在调控药用

植物有效成分形成过程中起到重要作用,因此,植

物激素的应用也是提高药用植物产量和改善其品

质的可持续途径[2-3]

。许多植物激素参与了药用

植物生长的各个阶段,在调节植物生长发育的同

时,也调控植物的次生代谢,如黄酮、黄酮醇、花青

素等的合成[4]

。人参(Panax ginseng C. A. Meyer)

为五加科多年生草本植物,被誉为“百草之王”,其

代谢产物人参皂苷是主要的功效成分,在抗癌、抗

氧化、抗衰老和神经保护等方面具有显著的药理

作用[5]

。人参皂苷的生物合成途径主要分为 3阶

段:第 1 阶段由甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径

和 甲 基 赤 藓 醇 磷 酸(Methyl erythritol phosphate,

MEP)途径代谢产生异戊烯基二磷酸(Isopentenyl

pyrophosphate,IPP)和二甲丙烯二磷酸(Dimethyl⁃

allyl pyrophosphate,DMAPP),是人参皂苷前体物

质的合成阶段;第 2 阶段是人参皂苷 C 骨架延长

和母核苷元形成的三萜骨架生物合成阶段,IPP

和 DMAPP 在法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl diphos⁃

phate synthase,FPS)作用下,发生缩合反应生成法

尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate,FPP),之后FPP

在法尼基焦磷酸合成酶(Squalene synthase,SS)

的催化下生成鲨烯;第 3 阶段是人参皂苷合成母

核苷元的后修饰阶段,细胞色素 P450 和糖基转

移酶(Glyeosyl transferase,GT)在此阶段起重要作

用[6-8]

。植物激素调控人参皂苷的生物合成主要

通过调控以上 3 个阶段的相关酶活性和基因表

达,影响人参皂苷的形成和积累。

目前,植物激素主要应用在香蕉、葡萄、菠菜、

洋葱、小白菜等水果及蔬菜中,且相关调控机制也

得到解析,但在药用植物中的应用及机制解析较

少。研究植物激素在人参皂苷生物合成中的作用

及调控机制,在指导人参种植方面具有广泛的应

用前景。同时,随着多组学及现代生物技术的发

展,植物激素对药用植物有效成分生物合成调控

的研究将成为药用植物研究领域的热点。基于

此,本研究归纳分析了茉莉酸、水杨酸、生长素、脱

落酸和赤霉素对人参皂苷含量的影响及可能的调

控机制,并展望了未来植物激素在药用植物中应

用的研究方向,以期为在生产实践中推进中药材

“高产优质”种植提供参考和借鉴。

1 植物激素在人参皂苷生物合成中的作

用及调控机制

在人参应用的历史长河中,人参从单一的野

生人参逐步演变成今日品类繁多的类型,这是诸

多条件综合作用的结果,其中环境及人工干预起

到重要作用[6-7]

,在环境及人工干预的作用下,人

参的有效成分形成及积累也会受到影响,而当植

物膜受体感知到来自环境的信号时,会根据当时

的环境条件触发生理反应,其中植物激素是这种

植物-环境交流的关键。因此,植物激素常被用

作诱导子,诱导人参皂苷生物合成途径中相关基

因的表达,触发人参皂苷的积累[9-10]

,且这种诱导

可以以单一激素或多种激素协同的形式发挥作

用。目前,有关植物激素在人参中的应用研究主

要集中在茉莉酸、水杨酸、生长素、脱落酸和赤霉

素几大类植物激素。

1. 1 茉莉酸

茉莉酸类植物激素主要包括茉莉酸、茉莉酸

甲酯、茉莉酸异亮氨酸、12-羟基茉莉酸等环戊烷

酮类衍生物[11-12]

。茉莉酸是植物次生代谢的保守

诱导子[13]

,可以诱导植物萜类化合物、苯丙素、生

物碱等次生代谢物的合成[14]

。人参富含三萜类

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梁浩,等:植物激素在人参皂苷生物合成中的作用及调控机制

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

化合物,在逆境环境条件下,可以将茉莉酸作为外

源信号来调控植物对逆境的适应能力,同时植物

体内也会产生内源信号分子及启动相关基因表达

以影响三萜类化合物等次生代谢产物的积累[11]

无论是给予外源茉莉酸处理,还是植物在逆境中

产生的内源茉莉酸变化,均会影响三萜类化合物

的形成和积累[15-16]

。Rahimi 等[17]

研究表明,用茉

莉酸进行体外处理能够增加人参植株中的人参皂

苷产量,且过表达 1 个与人参皂苷生物合成相关

的脂氧合酶基因(PgLOX6)能促进植物的茉莉酸

和茉莉酸甲酯含量增加,进而促进三萜生物合成

基因角鲨烯合酶基因 SS1、角鲨烯环氧化酶基因

SE1 和达玛烯二醇Ⅱ合酶基因 DDS 上调表达,最

终促使人参皂苷含量增加了约 1.4 倍,这直接表

明,PgLOX6 通过上调人参皂苷生物合成基因的

表达来正向调控茉莉酸的生物合成,并促进三萜

皂苷的形成和积累。

随着多组学技术的发展,一些全基因组转录

谱分析研究表明,茉莉酸处理引发了广泛的代谢

转录重编码[13]

。在茉莉酸诱导后,编码 1 种特定

次生代谢途径的酶基因表达经常显示出显著的一

致上调,引发所谓的“转录调节因子”的识别[18]

以调控代谢物的形成和积累。Kang 等[19]

对用茉

莉酸甲酯处理的不同时间段的人参不定根中的

UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glycosyl transferase,

UGT)相关基因表达进行转录组研究,确定了11个

候选UGTs基因。同时,通过联合代谢组学分析人

参皂苷含量的变化,发现经茉莉酸甲酯处理诱发

了人参皂苷 Rb1,Rb2,Rb3,Rc,Rd 和绞股蓝皂苷

XVⅡ的形成,并且代谢分析和系统发育分析显

示,这些候选UGTs基因与人参皂苷生物合成密切

相关,有助于人参皂苷的糖基化。在随后的研究

中,Kim 等[20]

通过转录组测序技术对茉莉酸甲酯

诱导的人参毛状根培养物的转录谱进行研究,筛

选出与人参皂苷生物合成相关的差异表达 UGTs

基因 PG07029G02,PG07020C06,PG07025D04 等,

且 最 终 鉴 定 了 实 现 人 参 皂 苷 Rh2 到 Rg3 转 化 的

UGRh2GT 基因。类似地,基于转录组研究,Wang

等[21]

采用基因表达和性状关联分析方法,筛选出

7个与人参皂苷Rg3生物合成相关的基因,这些基

因 在 茉 莉 酸 甲 酯 诱 导 下 的 表 达 序 列 为 FPS→

UGT71A27_2,CYP339→PgRb3S03→PgRb3S10→

PgRb3S01,该序列可能代表了 Rb3合成和转运的

物质代谢过程。此外,Oh等[22]

对茉莉酸甲酯处理

的人参不同部位(须根、主根、表皮、根茎、茎和叶)

的人参皂苷含量进行了分析,结果表明,茉莉酸甲

酯处理2 d后,人参根中总皂苷含量显著高于未经

茉莉酸甲酯处理的对照组。因此,茉莉酸甲酯是

人参培养细胞和不定根中人参皂苷生物合成的有

效诱导子[23]

1. 2 水杨酸

水杨酸是一种酚类激素,主要通过对逆境的

响应调控植物生长发育及次生代谢物的生物合

成[24-25]

。在水杨酸依赖的抗病信号途径中,EDS5

(也称为 SID1)基因发挥了重要作用,该基因编码

一种MATE家族(Multidrug and toxic compound ex⁃

trusion family)转运蛋白,MATE 蛋白家族与植物

次生代谢产物相关的内源性和外源性解毒机制有

关,且 EDS5 的 表 达 受 高 浓 度 的 外 源 水 杨 酸 诱

导[26]

。在爪哇人参不定根培养物中加入水杨酸

处理,发现水杨酸诱导以时间和剂量依赖性的方

式调节爪哇人参不定根培养物中的人参皂苷合

成,在0.2 mmol/L水杨酸处理后,三萜皂苷含量增

加了 1.3倍[27]

。水杨酸可以通过调节一些抗氧化

酶活性来影响人参皂苷含量,利用水杨酸处理人

参,发现人参中的过氧化物酶、超氧化物歧化酶和

过氧化氢酶的活性增强,在全光照条件下人参苷

含量降低,但施水杨酸后,皂苷含量显著提高,在

0.2 mmol/L 水杨酸处理组中,人参皂苷 Rg1,Re,

Rb1含量及其他 6 种人参皂苷总含量远高于对照

组。在春季短时期内对人参进行全光照并喷施

0.2 mmol/L 浓度的水杨酸溶液处理,可增强人参

抗逆性,能较好地提高人参产量和质量[28]

。由于

水杨酸是在植物接种病原体或暴露于某些非生物

胁迫(如臭氧和UV-C光)后合成的,因此,在利用

水杨酸处理人参后,可能光照也作为一种环境信

号分子参与调控人参皂苷的生物合成,而水杨酸

诱导人参对这种环境因子胁迫产生抗性反应,以

此来影响人参皂苷含量。作为植物应对生物胁迫

及非生物胁迫反应的重要信号分子,水杨酸能诱

导植物对环境胁迫产生抗性反应[29]

,这对于人参

在应对环境胁迫中,系统性获得抗性和在接种有

毒病原体后减少疾病发展,从而保证产量及品质至

关重要。

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吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

1. 3 生长素

生 长 素 是 一 类 包 括 吲 哚 乙 酸(Indole acetic

acid, IAA)在内的具有与吲哚乙酸相似生理作用

的化合物总称,IAA 是天然植物生长素的主要活

性成分。生长素除了在发育过程中起作用外,还

参与植物次生代谢,如调控三萜类代谢物的合

成[30]

。有试验证明,生长素能通过PIN-FORMED

(PIN)和 PIN-LIKES(PILS)生长素转运蛋白转运

和积累,促进杂交人参的皂苷产生[31]

。在人参基

因组同源生长素转运蛋白基因的全基因组搜索中

发现 17个 PIN 基因和 11个 PILS 基因,且器官/组

织的表达模式,以及 PIN/PILS 表达与人参皂苷含

量之间的显著相关性显示,生长素转运蛋白可能

参与人参皂苷生物合成和局部积累的调控[32]

进一步对 PIN 基因(PIN2、PIN3、PIN6)的组织特

异性表达谱进行分析,推测这 3 个基因可能参与

了人参根的向性生长和地上部分的生长发育[33]

目前,主要通过在组织培养中加入生长素诱导不

定根以生产人参皂苷,如吲哚丁酸(IBA)的加入

提高了人参不定根中的皂苷含量[34-35]

。虽然对生

长素调控人参皂苷生物合成的机制尚未明确,但

有研究解析了人参生长素极性运输基因PIN的表

达谱,表明人参生长素极性运输基因 PgPIN3 与

PgPIN6 在人参不定根的根尖表达较高,PgPIN2

在人参组培苗的根部表达较高[36]

,这可能是生长

素通过影响人参根的生长发育,从而引起人参皂

苷含量变化的原因之一,这为了解人参中 PIN/

PILS的分子基础和调控机制提供了重要参考,包

括其在人参皂苷产生和应激反应中的作用。

1. 4 脱落酸

脱落酸是一种具有倍半萜结构的植物激素,

在植物生长发育过程(特别是种子休眠、萌发以及

萌发后生长等)中具有重要作用,并调控植物对环

境胁迫的响应。在人参皂苷合成的研究中,由于

人参不定根是一种极具吸引力的人参皂苷生产方

式,与大田栽培相比,人参不定根生长速度快,代

谢产物产量稳定[37]

,并被用于通过非生物和生物

因素提高人参皂苷的积累[38]

。因此,人参不定根

常被用于研究环境刺激对人参皂苷含量的影响,

基于此类方法,通过人参不定根研究脱落酸在人

参皂苷合成中的作用,结果表明,脱落酸参与人参

不定根中人参皂苷 Rg1和 Re 在冷胁迫下的合成,

脱落酸可作为人参不定根中人参皂苷Rg1和Re的

高效激发子[39]

。在调控机理解析上,Hong等[40]

道了人参基因组中脱落酸信号通路相关基因的功

能特征,指出脱落酸信号相关基因包括脱落酸受

体蛋白(PgPYLs)、激酶家族(PgSnRKs)和转录因

子(PgABFs、PgABI3s和PgABI5s)在人参基因组中

是进化保守的,这些基因的表达受外源脱落酸的

调控,且过表达人参脱落酸相关基因完全恢复了

脱落酸缺陷拟南芥突变体的脱落酸响应和胁迫耐

受能力。目前,关于脱落酸在人参皂苷生物合成

中的分子调控机制并未有明确的解析,但基于人

参不定根对人参皂苷形成及积累研究的延伸,未

来相关调控机理也将得到进一步明确。

1. 5 赤霉素

赤霉素是一类二萜化合物,可以调控植物种

子萌发、花和果实发育、营养胁迫等过程。截至目

前,已经有 130 余种赤霉素被鉴定出来,其中以

GA1、GA3、GA4 和 GA7 的 生 物 活 性 最 高[41-42]。

Hong等[43-44]

通过RNA-seq分析,从人参中鉴定了

8个 PgGID1基因,确定赤霉素是通过促进人参主

根的次生生长而提高产量的重要因子,且赤霉素

处理显著丰富了萜类生物合成过程。同时,外源

赤霉素处理增强了人参皂苷合成途径中大部分基

因 的 表 达 ,包 括 编 码 甲 基 赤 藓 糖 醇 -4- 磷 酸

(MEP)和甲戊酸(MVA)的基因表达,并增加了叶

和根中皂苷的含量。在随后的研究中,Kim 等[45]

对 赤 霉 素 信 号 相 关 基 因 PgGID1s、PgSLY1s 和

PgRGA 进行功能分析,证实了人参中赤霉素信号

元件的生理作用在进化上是保守的,活性 GA、

GID1、SCFSLY1

和RGA之间蛋白质相互作用的重要

功能域和氨基酸残基在功能上也是保守的。进一

步的功能研究发现,PgRGA2 和 PgSLY1-1 的过表

达分别补充了 atgid1a/c双突变体和 rga 五突变体

的赤霉素相关表型。虽然关于赤霉素在人参中的

应用研究较少,但现有的研究方法及结果都为进

一步研究赤霉素在人参皂苷生物合成中的作用及

调控机制提供了模型,且关于赤霉素信号基因的

研究有可能促进未来人参的基因工程和育种,以

及提高产量和有效成分的生产。

1. 6 植物激素间的互作

相互交叉形成复杂的调控网络是植物体内各

类激素信号调控的重要特征,如生长素与细胞分

688

第56页

梁浩,等:植物激素在人参皂苷生物合成中的作用及调控机制

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

裂素之间的相互作用,生长素响应因子 ARF3 可

以结合到细胞分裂素合成酶基因 IPT5 的启动子

上并抑制后者的表达,从而抑制细胞分裂素的生

物合成[46]

;生长素与茉莉素之间的相互作用,茉

莉素可以通过上调转录因子 ERF109的表达来上

调生长素合成基因 ASA1 和 YUC2,从而促进生长

素的生物合成[47]

;生长素与脱落酸的相互作用,

脱落酸受体PYL8可以通过激活MYB77来增强生

长素响应基因的表达[48]

;生长素与乙烯的相互作

用,乙烯响应蛋白 HB52 可以通过结合到生长素

转运基因如PIN2,WAG1和WAG2的启动子上来调

控它们的表达[49]

;生长素还被报道与其他激素存

在相互作用,包括赤霉素、独脚金内酯、油菜素甾

醇和水杨酸等[14]

。在调控三萜类化合物生物合

成中,茉莉酸、茉莉酸甲酯、水杨酸不仅可以单独

诱导其合成,还可以协同调节以增强其调控作用,

其中茉莉酸被认为是植物激素信号网络中的核心

信号,在植物激素信号串扰中占重要地位[11,50]

激素之间的相互作用不仅能增强植物抵御逆境,

而且有利于次生代谢物的生成,如一定浓度的水

杨酸可诱导茉莉酸合成关键酶基因——脂氧合酶

基因 LOX 表达上调,从而促进茉莉酸的积累,并

显著上调表达人参三萜类化合物生物合成酶基

因——法尼基焦磷酸合酶基因FPS和异戊烯基焦

磷酸异构酶基因 IPPI[51]

。目前对于植物激素互

作调控人参有效成分合成的研究相对较少,但有

研究归纳总结了植物激素在三萜类化合物生物合

成中的作用及调控机制,指出植物次生代谢的诱

导并不只是单一激素所贡献的,激素间的信号串

扰起着重要调控作用,在三萜类化合物的生物合

成中,激素间相互影响和促进,以一种动态平衡的

状态存在,其调控机制的复杂性有待进一步研究

和明确[11]

2 人参皂苷响应植物激素诱导的调控机制

归纳分析现有研究可知,植物激素主要从影

响人参皂苷生物合成途径中的关键酶基因、过氧

化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、植物激素

信号途径基因、植物激素间协同交互和冷胁迫来

影响人参皂苷的合成和积累。基于此,本研究初

步绘制了人参皂苷生物合成响应植物激素诱导的

调控机制(图 1),以便直观地理解人参皂苷响应

植物激素诱导的调控机制。由于人参作为药用植

物,有区别于大田作物的自身的生境特点,并且在

栽培过程中要充分平衡产量与品质的关系,因此,

在探讨植物激素与人参皂苷积累的关系时,除了

要考虑植物激素的浓度外,激素的应用时期(不同

生长年限)、应用部位(药用器官)均是需要考虑的

关键问题,明确它们之间的关系是进一步用于指

导生产实践的前提。

图1 人参皂苷生物合成响应植物激素诱导的调控机制

Fig. 1 Regulation mechanism of ginsenoside biosynthesis in response to plant hormone induction

689

第57页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

3 展 望

随着农业现代化的不断发展与创新,植物激

素作为调控环境因素的有效措施被广泛应用于提

高作物产量和改善品质,其研究及在生产上的应

用已成为近代植物生理学及农业科学的重大进展

之一。安全、产量和品质均是中药生态农业关注

的重要指标,而多数次生代谢产物作为药用植物

的有效成分,是影响其品质的关键指标,也是中药

生态农业最重要的特征[52-56]

。因此,本研究以探

讨植物激素在人参皂苷生物合成途径中的作用及

调控机制为切入点,针对植物激素在药用植物中

的应用,展望未来研究的几个方向:

一是利用多组学联合分析及基因功能研究进

一步解析植物激素调控药用植物有效成分生物合

成的机理。非生物胁迫会诱发植物从形态构成、

细胞代谢和基因表达上发生变化,最终影响产量。

基于此,通过反向遗传学设计试验,综合利用多组

学联合分析、蛋白互作验证和基因编辑等现代分

子生物学技术[57]

,开展激素调控药用植物有效成

分形成与积累相关基因的挖掘及克隆,确定靶基

因作为评价药材质量的靶标,为道地性药材资源

的高效创建提供分子基础。

二是以植物激素作为诱导子加入药用植物组

织培养中,提高次生代谢产物。诱导子(如茉莉酸

甲酯、水杨酸等)的使用可以通过激活植物防御机

制来提高次生代谢产物的含量,因此被广泛应用

于植物组织培养中。在未来的研究中,充分发掘

具有诱导激活功能的新型植物激素(如独脚金内

酯、多肽激素等),不断探索其对药用植物有效成

分生物合成的影响作用,以合理利用到提高次生

代谢产物的生成中。

三是基于植物激素进行植物营养调控。虽然

关于植物激素在药用植物中的应用研究较少,但

可以通过土壤进行科学合理的添加,以探究其对

微生物的影响来调控植物对土壤养分的吸收,据

此对植物进行营养调控,如独脚金内酯能通过丛

枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)

调控植物对土壤氮磷养分的获取。

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梁浩,等:植物激素在人参皂苷生物合成中的作用及调控机制

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(责任编辑:林海涛)

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吉林农业大学学报 2023,45(6):693-701 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

人参皂苷生物合成相关基因 PgRg2BBE 克隆

及生物信息学分析*

李 傲1

,刘思章1

,王 义1**,王康宇1

,朱 蕾1

,李 俐1

,姜 悦1

,王艳芳2**

1. 吉林农业大学生命科学学院,吉林省人参基因资源开发与利用工程研究中心,长春

130118;2. 吉林农业大学国家中医药管理局药用植物栽培育种三级实验室,长春 130118

摘 要:克隆与人参皂苷Rg2合成相关的重要酶基因PgRg2

BBE全长cDNA序列,并利用在线软件对该基因编

码的蛋白质进行理化性质、结构域、亚细胞定位和系统进化等分析。结果表明:PgRg2

BBE基因cDNA序列长为

1 638 bp,编码 545个氨基酸。PgRg2

BBE 蛋白分子量为 60 967. 10 u,等电点为 8. 88,不稳定性指数为 34. 04,

预测该蛋白为一种稳定的亲水性跨膜蛋白,主要由 α-螺旋和无规则卷曲组成。PgRg2

BBE 蛋白含有

FAD_binding_4 和BBE 功能结构域,定位于叶绿体中,含有24个氨基酸序列信号肽。系统发育树分析发现,其

与智利茄的亲缘关系最近,氨基酸序列多重比对发现,RgRg2

BBE 中含有 4 个保守基序,进一步与拟南芥 At⁃

BBE家族蛋白进行同源序列比对,发现它们同时具有4个保守基序(RKYGL、MGED、FWAIRGG、FPEI)。

关键词:人参皂苷Rg2;生物合成;PgRg2

BBE;基因克隆;生物信息学;序列分析

中图分类号:S567. 51;R284. 3 文献标志码:A 文章编号:1000-5684(2023)06-0693-09

DOI:10.13327/j.jjlau.2022.1613

引用格式:李傲,刘思章,王义,等.人参皂苷生物合成相关基因PgRg2

BBE克隆及生物信息学分析[J].吉林农

业大学学报,2023,45(6):693-701.

Cloning and Bioinformatics Analysis of PgRg2BBE Gene in Panax gin⁃

seng Rg2 Biosynthesis *

LI Ao1

,LIU Sizhang1

,WANG Yi1**,WANG Kangyu1

,ZHU Lei1

,LI Li1

,JIANG Yue1

WANG Yanfang2**

1. College of Life Sciences, Jilin Province Engineering Research Center for Ginseng Genetic Resources

Development and Utilization, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;2. Labora⁃

tory for Cultivation and Breeding of Medicinal Plants of National Administrition of Traditional Chi⁃

nese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun,130118, China

Abstract:The syudy cloned the full-length cDNA sequence of PgRg2BBE, an important enzyme

gene related to ginsenoside Rg2 synthesis, and analyzed the physical and chemical properties, struc⁃

tural domain, subcellular localization and systematic evolution of the gene encoding protein usingh

online software. The results showed that the cDNA sequence of PgRg2BBE was 1 638 bp in length

and encoded 545 amino acids. The molecular weight of PgRg2BBE protein was 60 967.10 u, the iso⁃

electric point was 8.88, and the instability index was 34.04. It is predicted that the protein is a stable

* 基金项目:吉林省科技发展计划项目(20180101027JC,20200403011SF,20210204063YY),吉林省教育厅“十三五”科学技术项目

(JJKH20170310KJ),国家自然科学基金青年基金项目(31401445)

作者简介:李傲,女,在读硕士,研究方向:生物技术。

收稿日期:2022-01-27

** 通信作者:王义,E-mail:wanglaoshi0606@126.com;王艳芳,E-mail:yfwang2014@163.com

第61页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

hydrophilic transmembrane protein, mainly composed of α-helix and random coil. PgRg2BBE protein

contains FAD_binding_4 and BBE functional domain, which is located in chloroplast and contains

24 amino acid sequence signal peptides. Phylogenetic tree analysis showed that it had the closest ge⁃

netic relationship with Chilean eggplant, and multiple amino acid sequence alignment showed that

RgRg2BBE contained four conserved motifs. Further homologous sequence comparison with Arabidop⁃

sis AtBBE family proteins showed that there were four conserved motifs (RKYGL, MGED, FWAIRGG

and FPEI).

Key words:ginsenoside Rg2; biosynthesis;PgRg2BBE; gene cloning; bioinformatics; sequence

analysis

人 参(Panax ginseng C.A. Meyer)为 五 加 科

(Araliaceae)人参属多年生草本植物,长白山山脉

是人参的主要发源地之一,其应用最早可以追溯

到南北朝时期,距今已有 1 600 多年。人参具有

大补元气、复脉固脱、回阳救逆之功,根据其拉

丁学名的含义,提示人参对所有的疾病都有一

定的功效,因此被世人公认为“百草之王”[1]

,居

于吉林省首批十大道地药材之首。从我国第一

部本草著作《神农本草经》至历代本草中均有对

人参的记载[2]

。目前,在日韩等国人参已得到

深入的开发和利用,成为一种大众化的营养补

充 剂 和 化 妆 品 功 能 成 分 提 取 的 原 料[3]。在 我

国,人参被纳入药食同源品种范畴,这对于促进

人参产业的快速发展和完善人参产业链具有重

要意义。

人参主要活性成分为人参皂苷,因其结构多

样而具有广泛的药理活性[4]

。其中,人参皂苷Rg2

是一种达玛烷类原人参三醇型人参皂苷[5]

,由日

本学者柴田承仁于 1963 年首次发现并命名[6]

现代药理学研究表明,人参皂苷 Rg2具有保护神

经元损伤[7]

,改善皱纹[8]

,抗凝血[9]

,抗抑郁[10]

,抗

脱敏[11]

,改善脂质代谢[12]

,强心[13]

和预防肥胖症

的潜力[14]

。经检测发现,人参皂苷 Rg2主要存在

于人参的茎叶中,而且含量很低(本课题组未发

表),在实际生产中人参茎叶往往又被参农当作废

弃物,造成资源浪费。利用并提高人参茎叶中人

参皂苷 Rg2含量,是人参资源获得充分利用的重

要课题。

小檗碱桥酶 BBE 属于双共价黄素蛋白家族,

是苄基异喹啉类生物碱向小檗碱类生物碱转化的

关 键 酶 ,BBE 家 族 成 员 与 植 物 抗 逆 性 密 切 相

关[15]

。HbBBE1的启动子区域含有光、赤霉素、水

杨酸、机械伤害、真菌诱导子、防御和应激反应元

件,在白粉病侵染、干旱、高强度光照、过氧化氢及

赤霉酸、水杨酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和脱落酸等

外 源 激 素 处 理 下 都 能 显 著 上 调 HbBBE1 的 表

达[16]

。有研究表明,BBE 基因在植物抵御外界环

境的各种生物和非生物胁迫过程中发挥重要作

用。次生代谢产物是药用植物响应自身生存环境

变化而合成的一种“植保素”。目前,在人参皂苷

生物合成途径研究中尚未见有关 BBE 基因的研

究报道。基于此,本研究在实验室前期工作基础

上,结合基因组数据库,通过生物信息学方法筛选

到 与 人 参 皂 苷 Rg2 生 物 合 成 相 关 重 要 酶 基 因

PgRg2BBE,通过 PCR 扩增获得全长 cDNA 序列,

利用在线软件预测该基因编码蛋白质的基本信

息,通过系统进化树和氨基酸序列比对确定该基

因的亲缘关系和保守基序,为进一步鉴定人参

PgRg2BBE的生物学功能及其在人参皂苷Rg2合成

中的作用机制奠定基础,同时也为人参种质资源

的创新和利用提供基因资源。

1 材料与方法

1. 1 材料

人参材料为 4 年生的人参主根,采自吉林省

抚松县,由吉林农业大学王义教授鉴定为人参

(Panax ginseng C.A. Meyer)。

1. 2 菌种和载体

大肠杆菌 DH5α、克隆载体 pMD-18T 均购自

北京天根生化科技有限公司。

1. 3 主要试剂和工具酶

植物总 RNA 快速提取试剂盒(离心柱型),

DNA 胶回收试剂盒均购自北京天根生物技术有

限公司;M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂

盒购自 Promega公司;Ex Taq高保真酶、2×Mix酶、

DL2000 等 均 购 自 TaKaRa 公 司;其 他 试 剂 均 为

694

第62页

李傲,等:人参皂苷生物合成相关基因PgRg2BBE克隆及生物信息学分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

国产。

1. 4 人参总RNA提取及反转录

利用植物总 RNA 快速提取试剂盒提取人参

总 RNA,用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,Nano⁃

drop 2000 微量核酸蛋白检测仪检测其浓度和纯

度。以获得高质量 RNA,依据反转录试剂盒操作

说明将其反转录为cDNA,冻存,备用。

1. 5 人参PgRg2BBE基因的克隆及测序

利用 Premier 5.0 软件设计特异性引物(F:

ATGGCATCTTCAATATCTATCACAC,R:TCATCC

ATGCTTCAAATACTTTC),以上述 cDNA 为模板,

扩增体系:0.5 μL F,0.5 μL R,5 μL 2×Mix DNA聚

合酶,1 μL cDNA ,3 μL ddH2O。反应程序:94 ℃

预变性5 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃

延伸 90 s,30 个循环;循环结束延伸反应 5 min,

4 ℃保存。PCR 产 物 经 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检

测 ,切 胶 回 收 ,利 用 T4 连 接 酶 连 接 克 隆 载 体

pMD-18T,转化大肠杆菌感受态 DH5α,涂布于

含有抗生素的 LB 固体板上,37 ℃培养 16 h,挑

取单菌落进行 PCR 验证,选取阳性菌株送测序

公司测序。

1. 6 人参PgRg2BBE基因生物信息学分析

利用 NCBI-ORF 在线分析人参 PgRg2BBE 基

因的开放阅读框,NCBI-BLAST 搜索比对相似性

>75%的氨基酸序列。采用在线工具ProtParam分

析蛋白质的分子质量、氨基酸占比、等电点、亲水

性、稳定性;SOPMA在线分析蛋白质的二级、三级

结构功能预测,采用 SWISS-MODEL 在线工具进

行 三 维 同 源 建 模。NetPhos 预 测 磷 酸 化 位 点,

TMHMM 预测跨膜结构域,Proloc 预测亚细胞定

位,SignaIP 预测信号肽,利用 DNAMAN 软件进行

氨基酸序列多重比对,采用MEGA 7.0软件构建系

统进化树。

2 结果与分析

2. 1 人参总RNA提取及反转录

从鲜人参中提取总 RNA,经电泳检测发现

28S、18S 和 5S 3 条 带 清 晰 可 见(图 1-A),说 明

RNA完整性较好,OD260/OD280为1.93,说明纯度较

高 ,将 其 反 转 录 为 cDNA,以 此 为 模 板 ,利 用

Primer 5.0 软 件 设 计 的 上 下 游 引 物 进 行 PCR 扩

增,经琼脂糖凝胶电泳检测,获得 1 638 bp 条带

(图 1-B)。利用胶回收试剂盒回收目的片段,通

过 T4 DNA 连接酶与 pMD18-T 载体进行连接,取

PCR检测为阳性的菌落进行测序,经序列比对,表

明克隆得到的人参 PgRg2BBE 基因全长 cDNA 序

列与人参转录组数据库(本课题组保存)中筛选

得到的序列完全匹配(图 2),证明成功克隆目的

基因。

A.人参总RNA;B. PCR扩增;M. DL2000;1.阴性对照;2.目的条带

图1 人参总RNA及PCR扩增人参PgRg2BBE基因

Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA and

PCR amplification of PgRg2BBE

图2 序列比对

Fig. 2 Sequence qlignment

695

第63页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

2. 2 人参 PgRg2BBE序列生物信息学分析

2. 2. 1 理化性质预测及分析 经在线软件Prot⁃

Param 预测:PgRg2BBE 基因编码的蛋白分子质量

为 60 967.10 Da,分子式为 C2782H4303N715O791S17;原

子个数为 8 608,理论等电点为 8.88,带负电荷的

残基总数(Asp + Glu)为 37,带正电荷的残基总数

(Arg + Lys)为 45,脂质系数为 88.75,平均亲水系

数为-0.114,不稳定性指数(Ⅱ)为 34.04,暗示该

蛋白质为一种稳定的亲水性蛋白。

2. 2. 2 保守结构 域 及 功 能 结 构 域 预 测 与 分

析 通 过 NCBI 在 线 CDD 搜 索 发 现 人 参

PgRg2BBE 蛋 白 含 有 2 个 完 整 的 保 守 结 构 域

FAD_binding_4 和 GlcD,用 InterProScan 在线分析

人参 PgRg2BBE 蛋白的功能结构域,发现该蛋白

具有 FAD_binding_4 和 BBE 功能结构域。

2. 2. 3 二级结构及三级结构预测 利用SOPMA

软件在线预测表明,在其蛋白质的二级结构中,

α-螺旋(α-helix)占31.74%、β-转曲(Beta turn)占

6.42%、延伸链(Extended strand)占 23.12%、无规

则卷曲(Random coil)占 38.72%。对其三级结构在

线预测,利用 SWISS-MODEL建模显示:PgRg2BBE

蛋 白 与 PDB 数 据 库 中 的 AtBBE15 一 致 性 为

62.25%,序列覆盖度为 0.93,相似度为 0.49;该蛋

白模型主要由 α-螺旋和无规则卷曲组成,包含

FAD 和 BBE 结合域(图 3),推测目标蛋白以寡核

苷酸单体形式与 FAD 辅因子结合发挥作用。通

过 PEOCHECK 对建立的模型进行评估,结果表

明:98%氨基酸的结构处于合理区,证明模型建立

准确合理。

2. 2. 4 磷酸化位点、跨膜结构域及亚细胞定位

预测及分析 利用在线网站 NetPhos 对磷酸化位

点进行预测,发现该蛋白具有多个磷酸化位点,与

ATP 磷酸基团结合的氨基酸残基数量分别为丝

氨酸(Ser)31 个、苏氨酸(Thr)12 个、酪氨酸(Tyr)

7 个。推测该蛋白在行使功能时可能与磷酸化作

用有关,这种磷酸化主要发生在丝氨酸位点上。

跨膜结构域预测显示:该蛋白具有 2 个跨膜结构

域,说明该蛋白为跨膜蛋白,需转运到膜外行使功

能。亚细胞定位预测表明:该蛋白存在于叶绿体、

液泡、细胞核、质膜、内质网中,定位到叶绿体的可

能性最大,为64.3%,因此该蛋白可能存在于叶绿

体中。

2. 2. 5 信号肽预测 利 用 SignaIP 5.0 在 线 软

件 对 人 参 PgRg2BBE 蛋 白 进 行 信 号 肽 预测,发

现该蛋白存在 24 个氨基酸序列的信号肽,说明

PgRg2BBE蛋白是分泌性蛋白,可以通过信号肽进

行分泌表达。

2. 2. 6 系统发育树的构建及多重序列比对 利

用 NCBI-Blast 对 PgRg2BBE 氨基酸序列进行在线

比对,共比对到 21 个相似的氨基酸序列,其中与

智利茄(Solanum chilense)的氨基酸序列相似度

图3 PgRg2BBE蛋白三维结构模型和拉式图

Fig. 3 3D structure model and pull diagram of PgRg2BBE

696

第64页

李傲,等:人参皂苷生物合成相关基因PgRg2BBE克隆及生物信息学分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

高达 97%。利用 MEGA 7.0 软件构建系统进化树

(图4),结果表明,该树分为5个大分支,其中人参

PgRg2BBE蛋白与小粒咖啡(Coffea arabica)、丁香

咖啡(Coffea eugenioides)、绒毛烟草(Nicotiana to⁃

mentosiformis)、智 利 茄(Solanum chilense)中 的

BBE聚集于同一分支上,表现出较近的亲缘关系,

这些蛋白被定义为能够结合 FAD 的小檗碱桥酶

样酶,因此,推测人参PgRg2BBE 也具有类似的生

物学功能。选择 14 个氨基酸序列相似度较高

物种的 BBE 序列进行比对(图 5),结果在这些

序列中发现若干个保守基序,其中有 4个序列较

长且极为保守的基序,分别为 RSGGHDYEGLSY、

FWAIRGGGG、FKAKSDFV和YVNYRD。

为了进一步确定人参PgRg2BBE蛋白的功能,

将其与模式植物拟南芥基因组中被注释为小檗碱

桥 环 酶 的 基 因(AtBBE-1、AtBBE-2、AtBBE-3、

AtBBE-4)进行多重序列比对,发现4个主要保守

基序(RKYGL、MGED、FWAIRGG、FPEI,图 6),在

P值极度严格下,经MEME软件预测到6个Motif,

说明 PgRg2BBE 与 AtBBE 结构域保守性非常高,

它们的生物学功能非常相近。基于以上分析,推

测 PgRg2BBE 基因很可能是人参中的小檗碱桥酶

基因,因此把该基因命名为PgRg2BBE。

图4 PgRg2BBE氨基酸序列系统发育分析

Fig. 4 Phylogenetic analysis of PgRg2BBE with homologous amino acid sequences

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第65页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

图5 PgRg2BBE同源序列多重比对

Fig. 5 Multiple alignment of PgRg2BBE homologous sequences

698

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李傲,等:人参皂苷生物合成相关基因PgRg2BBE克隆及生物信息学分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3 讨论与结论

人参皂苷生物合成机制的解析是破解人参道

地性成因的关键,同时也是阐明人参质量形成机

理的关键,一直是中药资源领域人参研究工作者

关注的焦点[17-18]

。由于人参皂苷元连接糖链的种

类和数目的不同而使人参皂苷呈现结构多样的特

征,这种复杂多样的表型与基因间的网络互作紧

密关联,使得人参皂苷生物合成机制的研究仍然

未取得突破性进展。目前,本课题组已系统分析

鉴定多个调控人参皂苷生物合成的关键结构基因

和调节基因[19-23]

,为明确人参皂苷生物合成调控

机制和人参药材道地性形成遗传因素的解析奠定

坚实的基础,同时也为人参皂苷的定向生产提供

重要的调控元件。

FAD 相关氧化酶的超家族可以分为多个亚

家族,这些亚家族更好地反映群体成员在结构、功

能和进化方面的不同[24]

。BBE 家族形成了其中

一个相对较大的亚群,是 FAD依赖氧化酶超家族

中的重要亚家族,在植物次级代谢产物形成过程

中发挥重要作用。目前 BBE 基因已经在拟南芥

图6 PgRg2BBE与AtBBE家族序列比对及 Motif 预测

Fig. 6 Sequence alignment and Motif prediction of PgRg2BBE and AtBBE families

699

第67页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

(Arabidopsis thaliana)[15]

、杨树(Populus tomentosa)[25]

罂 粟(Papaver somniferum)[26]和 唐 松 草(Thali⁃

drum flavum)[27]

等植物中得到克隆,而在人参中

尚未见相关报道。通过查阅文献,发现 BBE基因

在多种生物和非生物胁迫中起重要作用,如巴西

橡胶树中的 HbBBE1 基因在逆境处理下,表达显

著升高[16]

。用纯合的T-DNA敲除菌株对AtBBElike28进行初步研究,揭示其对植物生长和耐盐性

的影响[28]

。基于以上分析,推测人参 PgRg2BBE

基因很可能是响应逆境胁迫的关键基因,从而启

动人参体内 MEP 途径合成次生代谢物质人参皂

苷 Rg2,人参 PgRg2BBE 基因具体响应哪种逆境或

者复合逆境胁迫进而促进人参皂苷 Rg2的生物合

成还有待于进一步深入研究。

本研究成功分离到与人参单体皂苷 Rg2生物

合成相关酶基因 PgRg2BBE的全长cDNA序列,长

为 1 638 bp,编码 545 个氨基酸,在线软件预测和

三维结构建模均显示 PgRg2BBE 蛋白具有 FAD 和

BBE 功 能 结 构 域,系 统 发 育 树 分 析 发 现,人 参

PgRg2BBE蛋白与小粒咖啡、丁香咖啡、绒毛烟草、

智利茄中的小檗碱桥酶聚在一个分支,亲缘关系

较近,在与拟南芥 AtBBE家族蛋白进行同源序列

比 对 ,发 现 它 们 同 时 具 有 4 个 主 要 保 守 基 序

(RKYGL、MGED、FWAIRGG、FPEI),这与文献报

道一致[15],因此把这个基因命名为 PgRg2BBE。

本研究为人参皂苷 Rg2生物合成机制的研究提供

新的思路。

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李傲,等:人参皂苷生物合成相关基因PgRg2BBE克隆及生物信息学分析

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(责任编辑:林海涛)

701

第69页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2023,45(6):702-708

Journal of Jilin Agricultural University

人参皂苷 Rg1对 Fusarium solani 诱导作用及

相关酶活性的影响*

张善铭1

,陈彦霏1

,冯 时3

,田义新1

,许永华2

,张连学2

,高 洁2,3

,卢宝慧2,3**

1. 吉林农业大学中药材学院,长春 130118;2. 人参新品种选育与开发国家地方联合工程研究

中心,长春 130118;3. 吉林农业大学植物保护学院,长春130118

摘 要:从吉林省人参主产区分离人参根腐病样,获得菌株130株,经形态学及分子生物学鉴定,病原菌均为

Fusarium solani。采用生长速率法、菌丝干重法、孢子萌发法,筛选出对人参根腐病病原菌最佳诱导作用的Rg1

浓度,以及最适Rg1浓度条件下对防御相关酶活力的影响,为明确Fusarium solani参与人参连作障碍提供参考

依据。根据筛选出的最适浓度设置试验组,测定过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)、苯

丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和脂氧合酶(LOX)6种酶活性变化。Rg1质量浓度为5 mg/L时,培

养 4 d 后菌丝生长速率为 9. 33 mm/d,菌丝干重为(946. 11±12. 73)mg(P<0. 05),孢子萌发率(SGR)为 35. 17%

(P<0. 05);菌丝生长促进率为3. 466%(P<0. 05),菌丝干重促进率为9. 59%,孢子萌发促进率为44. 55%,对人

参根腐病菌诱导作用最强,在此浓度诱导影响下的POD、CAT、LOX酶活性得到了显著提高(P<0. 05)。

关键词:人参;Rg1;腐皮镰孢菌;诱导作用;酶活性

中图分类号:S567. 51 文献标志码:A 文章编号:1000-5684(2023)06-0702-07

DOI:10.13327/j.jjlau.2021.1216

引用格式:张善铭,陈彦霏,冯时,等 .人参皂苷 Rg1对 Fusarium solani 诱导作用及相关酶活性的影响[J].吉林

农业大学学报,2023,45(6):702-708.

Effects of Ginsenoside Rg1 on Induction of Fusarium solani and Re⁃

lated Enzyme Activities *

ZHANG Shanming1

,CHEN Yanfei1

,FENG Shi3

,TIAN Yixin1

,XU Yonghua2

,ZHANG

Lianxue2

,GAO Jie2,3

,LU Baohui2,3**

1. College of Chinese Medicinal Materials,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;

2. State Local Joint Engineering Research Center of Ginseng Breeding and Development,Changchun

130118,China;3. College of Plant Protection,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,

China

Abstract:Ginseng root rot samples were isolated from the main ginseng producing region of Jilin

province, and 130 strains were obtained and identified as Fusarium solani by morphology and mo⁃

lecular biology. Using growth rate method, hyphal dry weight method and spore germination method,

the optimal Rg1 concentration for inducing Fusarium solani were selected, and the effects of the opti⁃

mal Rg1 concentration on the activity of defense-related enzymes were analyzed, which provides a

* 基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(31701354),吉林省科技发展计划项目(20180311001YY,20180201003NY),

“111基地”建设项目(D17014)

作者简介:张善铭,女,在读硕士研究生,研究方向:药用植物。

收稿日期:2021-04-15

** 通信作者:卢宝慧,E-mail:LBH860110@126.com

第70页

张善铭,等:人参皂苷Rg1对Fusarium solani诱导作用及相关酶活性的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

reference basis for clarifying the participation of F. solani in ginseng continuous cropping obstacles.

The experimental group was set up based on the optimal concentration screened out, and the activi⁃

ties of the 6 related enzymes, peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), catalase (CAT),

phenylalanine ammonia lyase (PAL), lipoxygenase (LOX) and superoxide dismutase (SOD),

were measured. When concentration of Rg1 was 5 mg/L, mycelial growth rate was 9.33 mm/d after

4 days of culture, spore germination rate (SGR) was 35.17% (P<0.05), and dry weight of myce⁃

lium was (946.11±12.73) mg (P<0.05), promotion rate of mycelial growth was 3.466% (P<0.05),

promotion rate of spore germination was 44.55%, and promotion rate of hyphal dry weight was

9.59%. The strongest induction effect on F. solani was observed, and the activities of POD, CAT

and LOX enzymes were significantly improved (P<0.05) under the induction effect of this concentra⁃

tion.

Key words:ginseng; Rg1;Fusarium solani; induction; enzyme activity

人 参(Panax ginseng C. A. Meyer)为 五 加 科

(Araliaceae)多年生草本植物,具有很强的忌地

性,人参重茬地种植会导致高发病率,根部发病尤

为显著。常见的根腐病传染速度快、发病率高、不

宜防治,是人参的毁灭性病害,可称之为“植物癌

症”[1]

。人参在生长过程中,容易出现土壤酸化、

土壤微生态失衡、土壤理化性质恶化等问题,这些

是人参连作障碍的突出原因。对此现象有研究表

明,人参根部会产生一些根系分泌物,使得土壤中

病害问题增多,导致根部发生病害,严重影响人参

各个生长发育时期[2-3]

人参根腐病是人参根部主要病害之一[4]

,参

根发病时会呈现褐色,并伴有湿腐现象,后期呈糟

朽状,最终导致人参植株死亡。人参发生病害的

同时,会使人参质量与产量都显著下降,极为严重

时也可导致绝产绝收[5]

。以往研究表明,化感自

毒作用是造成人参连作障碍的主要原因之一,但

化感物质对人参造成毒害的机制尚不明确,一

些植物中具有极为重要作用的抗性相关酶,如

POD、PPO 和 SOD 等,其酶活性的水平也可能与

病害发生严重程度有关[6]

。目前,人参主要病

原菌是否会对皂苷单体有化学诱导作用及其机

理在国内外文献资料不多,而且皂苷单体的存

在对于致病能力的影响尚未见报道。因此,研

究 Rg1皂苷单体对人参根腐病菌的影响十分必

要,分析其对防御侵染相关酶活性的影响机制,

为研究人参连作障碍奠定理论基础,同时对提

高人参的产量、品质及保护生态环境具有重要

意义。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2019年5—10月于人参主产区老参地采集根

部带有根腐症状的人参。人参样品来源见表 1。

人 参 皂 苷 Rg1 购 自 成 都 曼 斯 特 生 物 科 技 有 限

公司。

供试 PDA 培养基制备:马铃薯 200 g、葡萄糖

20 g、琼脂 20 g,蒸馏水 1 000 mL,pH自然,121 ℃

高压灭菌40 min。

试验仪器:高压灭菌锅,超净工作台,恒温培

养箱,气浴恒温摇床,光学显微镜,PCR检测仪,台

式高速离心机,酶标仪。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 病原菌分离与鉴定 将试验材料用清水

冲洗30 min,切成1 cm小段,75%乙醇消毒3 min,

无菌蒸馏水冲洗3次,无菌环境中风干,接入PDA

培养基中,25 ℃条件下培养 5~7 d 后完成柯赫氏

法则,之后进行培养性状和形态学观察。

刮取生长在 PDA 培养基上的菌丝,采用 Bio⁃

spin 真菌基因组 DNA 提取试剂盒提取病原菌的

DNA,采用 NanoDrop 2000 微量分光光度计检测

表1 人参样品来源

Table 1 Ginseng sample source

分离时间

2019年5月

2019年6月

2019年7月

2019年8月

2019年9月

2019年10月

采集地点

抚松县抽水乡

集安市太王镇

抚松县万良镇

集安市清河镇

敦化市青沟子乡

安图县明月镇

分离株数

20

25

30

25

15

15

703

第71页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

DNA的质量,检测合格后备用。片段扩增采用真

菌 特 异 引 物 EF-1

α。25 μL PCR 反 应 体 系:10×

PCR buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL,

MgCl(2 2.5 mmol/L)1 μL,ITS4 1 μL,ITS5 1 μL,模

板DNA 1 μL,rTaq(5 U/μL)0.5 μL,ddH2O 16 μL。

PCR 扩增体系:95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性

30 s,58 ℃退火 45 s,72 ℃延伸 1 min,35 个循环;

最后72 ℃延伸10 min,4~16 ℃保存。

登录 NCBI,将 PCR 测序结果进行 Blast 检索

分析,用 MEGA 7.0 软件进行分析,以 Neighborjoining 方 法 构 建 系 统 发 育 树 ,使 用 Bootstrap

(1 000 次重复)进行检验。

1. 2. 2 生长速率法 采用生长速率法[7]

,测定

Rg1对人参根腐病菌的诱导作用。设置 PDA 培

养 基 中 含 Rg1 初 筛 质 量浓度分别为 200,20,2,

0.2 mg/L,接入病菌菌饼,每组3次重复,十字交叉

法进行测量并观察。选择诱导作用明显的浓度范

围,进一步细化浓度设置,Rg1复筛质量浓度分别

为 0.2,0.5,1,2,5,10 mg/L,每组重复 3 次。运用

公式计算菌丝生长的抑制率和促进率:菌丝生长

抑制率(%)=[(对照组菌丝直径-处理组菌丝直径)/

对照组菌丝直径]×100;菌丝生长促进率(%)=

[(处理组菌丝直径-对照组菌丝直径)/对照组菌

丝直径]×100。

1. 2. 3 菌丝干重法 采用菌丝干重法[8]

,基础培

养基为马铃薯营养培养基(Potato dextrose,PD),

取相同质量菌丝加入到装有 150 mL 的灭菌马铃

薯营养培养基中,试验组加入不同质量的Rg1皂苷

单体,置于恒温振荡摇床中振荡培养,160 r/min,

培养 4 d;采用中速定性滤纸过滤菌丝,置于 35 ℃

烘箱中烘干,称量干重。比较各皂苷单体及不同

处理对人参病原真菌菌丝干重的影响,每组重复

3次。根据公式测定:菌丝干重促进率(%)=[(处

理组菌丝干重-对照组菌丝干重)/对照组菌丝干

重]×100;菌丝干重抑制率(%)=[(对照组菌丝干

重-处理组菌丝干重)/对照组菌丝干重]×100。

1. 2. 4 孢子萌发法 基础培养基为 1% 葡萄糖

溶液,基础培养基中加入不同质量的 Rg1皂苷单

体即为试验组。将孢子悬浮液稀释至所需浓度,

不同试验处理加入相应质量的皂苷单体,用血球

计数板计数,设定2,4,6,8,12,24 h观察各皂苷单

体对孢子萌发的影响,每组重复 3 次。根据公式

测 定 病 菌 孢 子 萌 发 率[9]

(Spore germination rate,

SGR):SGR=N/100,N为孢子萌发数。

1. 2. 5 过氧化物酶(POD)活性测定 取 菌 丝

0.5 g,加入0.05 mol/L,pH 5.8磷酸缓冲液0.6 mL,

冰浴研磨成匀浆,然后在 4 ℃、1 万 r/min 离心,

收集上清液即为酶粗提液。采用 Andy gene 试剂

盒按照说明书步骤进行酶活性测定。

1. 2. 6 多酚氧化酶(PPO)活性测定 取菌丝

0.5 g,加入0.05 mol/L,pH 5.8磷酸缓冲液0.6 mL,

冰浴研磨成匀浆,然后在 4 ℃、1万 r/min离心,收

集上清液即为酶粗提液。采用诚林试剂盒按照说

明书步骤进行酶活性测定。

1. 2. 7 过氧化氢酶(CAT)活性测定 取菌丝

0.5 g,加入0.1 mol/L,pH 7.0磷酸缓冲液1.2 mL,冰

浴下研磨成匀浆,4 ℃、1.2万 r/min离心20 min,上

清液为待测液,4 ℃保存备用。采用 Andy gene试

剂盒按照说明书步骤进行酶活性测定。

1. 2. 8 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定 取菌

丝 0.5 g,加含 5 mmol/L 巯基乙醇的 0.05 mol/L 硼

酸缓冲液(pH 8.8)0.6 mL,在冰浴中研磨成匀浆,

转入 10 mL 离心管,然后在 4 ℃、1 万 r/min 离心

15 min,收集上清液,即为酶粗提液,4 ℃保存备

用。采用诚林试剂盒按照说明书步骤进行酶活性

测定。

1. 2. 9 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 取菌

丝 0.5 g,加 0.6 mL 预冷的 0.05 mol/L,pH 7.8 磷酸

缓冲液,冰浴上研磨成匀浆,4 ℃、1 万 r/min 离心

20 min,取上清液待测。采用诚林试剂盒按照说

明书步骤进行酶活性测定。

1. 2. 10 脂氧合酶(LOX)活性测定 取菌丝0.5 g,

加入0.05 mol/L pH 5.6的醋酸钠缓冲溶液1.0 mL。

冰浴下研磨成匀浆,4 ℃、1.2万 r/min离心20 min,

上清液为待测液,4 ℃保存备用。采用诚林试剂

盒按照说明书步骤进行酶活性测定。

2 结果与分析

2. 1 柯赫式法则验证

对不同产地人参病样进行病原菌分离并纯

化,将所有菌株进行柯赫式法则验证,共获得致病

菌株130株。部分致病性测定结果见图1。

704

第72页

张善铭,等:人参皂苷Rg1对Fusarium solani诱导作用及相关酶活性的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 2 病原菌鉴定

根据菌落生长形态选取代表性的病原菌,由

抚松地区人参分离得到编号(SWY-GF)。经过分

离鉴定纯化后,选取得到根腐病菌(图2),菌丝呈

白色,菌丝体较细,呈白色圆形菌落并带有黄圈,

菌落边缘圆滑,病原菌菌株的成熟分生孢子呈镰

刀形,有明显分隔,小型分生孢子呈卵圆形。

以 EF1T 和 EF2T 为 引 物,经 测 序 公 司 测 得

SWY-GF 基因序列,通过 Blast 进行比对,挑选序

列相似率>99% 的序列通过 MEGA7.0.26 法构建

系统发育树,最终鉴定 SWY-GF 为 Fusarium so⁃

lani(图3)。

2. 3 不同浓度 Rg1对腐皮镰孢菌菌丝生长及干

重的影响

由图 4可见,在浓度为 2 mg/L和 20 mg/L时,

菌柄色素颜色为黄色并变化明显,初步鉴定 Rg1

质量浓度在 2~20 mg/L 时,对人参根腐病菌诱导

作用较为明显。对试验结果进行复筛,设置试验

组质量浓度为 0.2,0.5,1,2,5,10 mg/L,进行生长

速率测定,每组重复3次。

A.对照组,未发病人参;B~H.各地区部分人参发病情况

图1 部分菌株致病性测定结果

Fig. 1 Determination of pathogenicity of some strains

A.菌丝;B.产孢细胞;C.分生孢子

图2 腐皮镰孢菌形态

Fig. 2 Morphology of Fusarium solani

图3 菌株SWY-GF系统进化树

Fig. 3 Phylogenetic tree of SWY-GF

注:培养基Rg1浓度从左到右依次为对照组,0.2,2,20,200 mg/L

图4 菌丝生长情况

Fig. 4 Growth of mycelia

705

第73页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

由图5可见,不同浓度Rg1对菌丝生长速率的

影响均呈先快后缓慢的趋势,其中 Rg1质量浓度

为 0.2 mg/L 和 0.5 mg/L 时,抑制腐皮镰孢菌菌丝

生长,Rg1质量浓度为 1,2,5,10 mg/L 时,促进腐

皮镰孢菌菌丝生长,在 4 d时达到峰值。当 Rg1质

量浓度为5 mg/L时,菌丝生长速率为9.33 mm/d,

菌丝生长促进率为 3.466%,对腐皮镰孢菌菌丝生

长诱导作用明显(P<0.05)。

由图6可见,不同浓度Rg1对菌丝干重有明显

影响,当Rg1质量浓度为0.2 mg/L和0.5 mg/L时,对

腐皮镰孢菌生长起抑制作用,抑制率分别为0.77%,

2.51%;当Rg1质量浓度在1~10 mg/L时,对腐皮镰

孢菌菌丝生长起促进作用,菌丝干重呈现先增高后

降低趋势,并且在5 mg/L 时的诱导性显著高于其他

组(P<0.05),菌丝干重为(946.11±12.73) mg,菌丝

干重促进率为 9.59%;在质量浓度为 2 mg/L 和

10 mg/L时,对菌丝生长也有正诱导作用(P<0.05),

为进一步确定 Rg1对腐皮镰孢菌的最佳诱导浓

度,筛选出最优诱导Rg1浓度为2,5,10 mg/L。

2. 4 不同浓度 Rg1 对腐皮镰孢菌孢子萌发的

影响

由图7可见,不同浓度Rg1对腐皮镰孢菌孢子

萌 发 有 显 著 影 响 ,当 Rg1 质 量 浓 度 为 0.2,0.5,

10 mg/L时,对腐皮镰孢菌孢子萌发起抑制作用,

SGR 分别为 18.17%,23.50%,17.50%(P<0.05);当

Rg1质量浓度为 1,2,5 mg/L 时,对腐皮镰孢菌孢

子萌发起促进作用,SGR分别为25.50%,31.00%,

35.17%(P<0.05)。Rg1质量浓度为 5 mg/L 时,腐

皮镰孢菌孢子萌发率最高,孢子萌发促进率为

44.55%,诱导作用显著(P<0.05)。

2. 5 最优诱导浓度 Rg1对 Fusarium solani 过氧

化物酶(POD)活性影响

用 POD 酶试剂盒测得标准曲线:y=0.049 5x+

0.272 7(R2

=0.999),由表2可知,处理组POD酶活

性呈现先升高后降低趋势,质量浓度为2 mg/L和

10 mg/L 时的酶活性低于 5 mg/L 时的酶活性,当

Rg1质量浓度为5 mg/L时,POD酶活性最高,与其

他处理相比差异显著(P<0.05)。

2. 6 最优诱导浓度 Rg1对 Fusarium solani 多酚

氧化酶(PPO)活性影响

用 PPO 酶试剂盒测得标准曲线:y=0.055 1x+

0.038 7(R2

=0.999),由表 2 可知,处理组 PPO 酶活

性呈现先升高后降低趋势,质量浓度为2 mg/L和

10 mg/L 时的酶活性低于 5 mg/L 时的酶活性,当

Rg1质量浓度为 5 mg/L时,PPO 酶活性最高,与其

他处理相比差异显著(P<0.05)。

图5 不同Rg1浓度处理对菌丝生长促进率的影响

Fig. 5 Effects of different Rg1 concentrations on pro⁃

motion rate of mycelial growth

图6 不同处理组对菌丝干重的影响

Fig. 6 Effects of different treatment groups on dry

weight of mycelia

图7 不同处理组对孢子萌发率的影响

Fig. 7 Effects of different treatment groups on spore

germination rate

706

第74页

张善铭,等:人参皂苷Rg1对Fusarium solani诱导作用及相关酶活性的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 7 最优诱导浓度 Rg1对 Fusarium solani 过氧

化氢酶(CAT)活性影响

用 CAT 酶试剂盒测得标准曲线:y=0.084 8x+

0.017 5(R2

=0.999 7),由表 2 可知,处理组 CAT 酶

活性均高于对照组,且呈现先升高后降低趋势,质

量 浓 度 为 2 mg/L 和 10 mg/L 时 的 酶 活 性 低于

5 mg/L 时 的 酶 活 性,当 Rg1 质 量 浓 度 为 5 mg/L

时,CAT 酶活性最高,与其他处理相比差异显著

(P<0.05)。

2. 8 最优诱导浓度 Rg1对 Fusarium solani 苯丙

氨酸解氨酶(PAL)活性影响

用 PAL 酶试剂盒测得标准曲线:y=0.270 3x+

0.390 4(R2

=0.997 9),由表 2 可知,处理组 PAL 酶

活性呈现先升高后降低趋势,质量浓度为 2 mg/L

和 10 mg/L 时的酶活性低于 5 mg/L 时的酶活性,

当Rg1质量浓度为5 mg/L时,PAL酶活性最高,与

其他处理相比差异显著(P<0.05)。

2. 9 最优诱导浓度 Rg1对 Fusarium solani 超氧

化物歧化酶(SOD)活性影响

用 SOD 酶试剂盒测得标准曲线:y=0.140 5x+

0.445 1(R2

=0.999 2),由表 2 可知,处理组 SOD 酶

活性均高于对照组,且呈现先升高后降低趋势,

质量浓度为 2 mg/L 和 10 mg/L 时的酶活性低于

5 mg/L 时 的 酶 活 性,当 Rg1 质 量 浓 度 为 5 mg/L

时,SOD 酶活性最高,与其他处理相比差异显著

(P<0.05)。

2. 10 最优诱导浓度 Rg1对 Fusarium solani 脂

氧合酶(LOX)活性影响

用 LOX 酶试剂盒测得标准曲线:y=0.014 1x+

0.353 4(R2

=0.998 7),由表 2 可知,处理组 LOX 酶

活性呈现先升高后降低趋势,质量浓度为 2 mg/L

和 10 mg/L时的酶活性低于 5 mg/L 时的酶活性,

当 Rg1质量浓度为 5 mg/L 时,LOX 酶 活 性 最 高,

与其他处理相比差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

本试验研究表明,不同浓度人参皂苷 Rg1对

人参根腐病菌均有一定的诱导作用,并对其酶活

性也有不同程度的影响。人参根腐病菌对 Rg1浓

度为 5 mg/L 时表现出的诱导性最强,培养 4 d 后

菌丝生长速率为9.33 mm/d,菌丝干重为(946.11±

12.73)mg(P<0.05),SGR 为 35.17%(P<0.05);菌

丝生长促进率为 3.466%(P<0.05),孢子萌发促进

率为 44.55%,菌丝干重促进率为 9.59%。土壤中

及参根内 Rg1含量会对人参根腐病的发病情况产

生影响,试验发现在具有最强诱导作用的浓度下,

6种防御相关酶活性均增强,其中POD,CAT,LOX

酶活性得到了显著提高。

过氧化物酶[10]

主要通过清除氧化酶催化反

应中所产生的细胞毒性物质H2O2,进 而对菌丝体

起保护作用。苯丙氨酸解氨酶[11]

在木质素的积

累、植保素和酚类物质的合成中起重要作用,人参

根腐病菌感染细胞后,苯丙氨酸解氨酶含量增加,

为人参合成有益物质提供保障。多酚氧化酶能够

改变酚类物质性质,对人参根部细胞有毒害作

用[12-13]

,人参根腐病菌感染细胞后,多酚氧化酶含

量增多,为破坏人参组织提供保障。超氧化物歧

化酶[14]

是生物体内超氧自由基的天然消除剂,提

高了病原菌抵抗外界不良环境的能力。过氧化氢

酶是生物氧化过程中重要的抗氧化酶,能有效地

清除各种活性氧基团[15]

,在含有人参根腐病菌的

细胞中进行代谢过程,对破坏人参细胞保护自身

细胞起着重要作用。脂氧合酶[16]

在催化不饱和

脂肪酸生成氢过氧化物脂肪酸的同时,产生大量

的活性氧,后者参与细胞膜脂的过氧化,破坏人参

的细胞膜,导致组织细胞坏死。研究表明,在 Rg1

的诱导作用下,LOX、PPO、CAT、PAL 能够增强对

表2 不同浓度处理对6种防御相关酶活性的影响

Table 2 Effects of different concentration treatment groups on activities of six defense related enzymes

ρ(Rg1

)/

(mg·L-1

)

0(ck)

2

5

10

POD/(U·L-1

)

13.262 6±1.366 4b

13.835 0±1.975 1b

19.862 0±2.846 9a

11.074 1±2.729 0b

PPO/(ng·L-1

)

21.049 6±2.007 3b

21.170 6±0.395 5b

25.254 1±0.635 2a

20.777 4±1.817 9b

CAT/(ng·L-1

)

21.314 9±0.117 9c

23.113 2±1.680 4bc

28.449 3±1.533 0a

23.594 7±0.272 3b

PAL/(U·L-1

)

9.697 9±1.151 1b

8.884 0±1.068 6b

11.202 4±0.641 9a

8.427 7±0.320 9b

SOD/(U·mL-1

)

6.402 1±0.902 4c

8.323 8±0.902 4ab

9.699 9±0.543 6a

7.576 5±0.711 7bc

LOX/(U·L-1

)

42.690 3±8.663 3b

41.792 0±6.020 2b

67.607 6±5.146 8a

29.002 4±2.367 5c

注:同列不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)

707

第75页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

人参组织细胞的破坏作用,同时SOD、POD保护菌

体自身免遭植物抗病性物质的影响,增强了 Fu⁃

sarium solani对人参根部的破坏,利于病原菌的侵

染。本研究通过生长速率法、孢子萌发法和菌丝

干重法初步确定了对人参根腐病菌有明显诱导作

用的 Rg1浓度,通过分析酶活性来判断人参根腐

病的发病机制,为进一步研究人参连作障碍的机

理奠定了理论基础。

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(责任编辑:王希)

708

第76页

吉林农业大学学报 2023,45(6):709-715 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

氮素形态对人参氮代谢相关酶活性的影响*

巩金壮1,2,3

,焉学倩1,2

,陈艳阳1,2

,杨 平1,2

,代鸣涛1,2

,许永华1,2**

1. 吉林农业大学中药材学院,长春130118;2. 人参新品种选育与开发国家地方联合工程研究

中心,长春130118;3. 黑龙江八一农垦大学园艺园林学院,大庆163319

摘 要:通过对 3年生盆栽人参分别施用不同浓度外源性硝态氮与铵态氮,探讨其对氮代谢相关酶活性、根

生物量和皂苷含量的影响,旨在为人参氮肥管理提供理论依据。结果表明:在添加15,20 mmol/L外源氮,硝态

氮处理人参叶片硝酸还原酶(NR)活性较对照显著提高,铵态氮处理其活性较对照显著降低(P<0. 05)。硝态

氮处理较铵态氮处理有利于谷氨酸合成酶(GOGAT)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性的提高。硝态氮相比于铵态

氮有利于人参根部生物量的增加。10,15 mmol/L硝态氮和20 mmol/L铵态氮有利于9种皂苷总和的积累,20,

25 mmol/L硝态氮和25 mmol/L铵态氮处理不利于9种皂苷总和的积累。建议在人参的实际生产中应该注意铵

态氮肥的施入,尽量选择硝态氮肥。

关键词:人参;硝态氮;铵态氮;氨代谢;酶活性

中图分类号:S567. 51 文献标志码:A 文章编号:1000-5684(2023)06-0709-07

DOI:10.13327/j.jjlau.2022.1710

引用格式:巩金壮,焉学倩,陈艳阳,等 . 氮素形态对人参氮代谢相关酶活性的影响[J]. 吉林农业大学学报,

2023,45(6):709-715.

Effects of Nitrogen Forms on Enzyme Activities Related to Nitrogen

Metabolism in Panax ginseng *

GONG Jinzhuang1,2,3

,YAN Xueqian1,2

,CHEN Yanyang1,2

,YANG Ping1,2

,DAI Mingtao1,2

XU Yonghua1,2**

1. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,

China;2. State Local Joint Engineering Research Center of Ginseng Breeding and Application,

Changchun 130118, China;3. College of Horticulture and Landscape Architecture, Heilongjiang

Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China

Abstract:Three-year-old potted ginseng was treated with different concentrations of exogenous ni⁃

trate nitrogen and ammonium nitrogen to explore its effects on nitrogen metabolism-related enzyme

activities, root biomass and saponin content, hoping to provide a theoretical basis for ginseng nitro⁃

gen fertilizer management. The results showed that when adding 15 and 20 mmol/L exogenous nitro⁃

gen, NR activity of ginseng leaves in nitrate nitrogen treatment was significantly increased compared

with the control, while its activity in ammonium nitrogen treatment was significantly decreased com⁃

pared with the control. Nitrate nitrogen treatment was more beneficial to the improvement of GOGAT

and GS activities than ammonium nitrogen treatment. Compared with ammonium nitrogen, nitrate ni⁃

trogen was more beneficial to the increase of ginseng root biomass. 10 and 15 mmol/L nitrate nitrogen

and 20 mmol/L ammonium nitrogen were beneficial to the accumulation of nine saponins, while 20

* 基金项目:国家重点研发计划项目(2017YFC1702101),吉林省重大科技专项(20200504004YY)

作者简介:巩金壮,男,硕士,研究方向:药用植物规范化生产与质量控制。

收稿日期:2022-03-24

** 通信作者:许永华,E-mail:xuyonghua777@yeah.net

第77页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

and 25 mmol/L nitrate and 25 mmol/L ammonium nitrogen were not conducive to the accumulation of

the nine saponins. We suggest that attention should be paid to the application of ammonium nitrogen

fertilizer in the actual production of ginseng, and priority should be given to nitrate nitrogen fertilizer.

Key words:Panax ginseng; nitrate nitrogen; ammonium nitrogen; nitrogen metabolism; enzyme

activity

人参(Panax ginseng C.A. Mey.)为五加科人参

属多年生草本植物[1]

,有悠久的历史,是名贵的传

统中药,具有大补元气、补脾益肺、生津养血的功

效[2]

。吉林省、黑龙江省、辽宁省是人参的主要分

布区,以林下栽参和农田栽参为主要栽培模式[1]

近年来,伐林迹地人参栽培面积逐渐减少,人参需

求量逐年增加,农田栽参成为一种有效的替代性

栽培模式,农田因常年耕作造成土壤养分失衡,所

以农田栽参后期的养分管理至关重要。

氮素作为植物生长发育所必需的大量元素,

前人研究表明,施入氮肥会对人参生长、产量、皂

苷含量都产生影响[3-7]

,但铵态氮和硝态氮对人参

的生长发育影响是否一致尚未见报道。植物根吸

收硝态氮是植物利用硝态氮的第一步[8]

,但植物

并不能直接利用硝态氮[9]

,硝态氮进入植物体内

先通过硝酸还原酶将其还原成亚硝态氮,然后再

通过亚硝酸还原酶将亚硝态氮催化成氨,再通过

谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶途径进一步将其

转化成氨基酸,供植物利用。植物通过复杂的过

程将铵态氮吸收到体内,在根细胞中很快同化为氨

基酸。在铵态氮同化成氨基酸的过程中也需要谷

氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶循环(GS/GOGAT)

将其转化成有机态的氨基酸,再进一步转化成其

他氨基酸蛋白质,供植物生长发育需要[10]

。由此

可知,植物在氮素利用过程中硝酸还原酶、谷氨酰

胺合成酶和谷氨酸合成酶都发挥着重要的作用。

本试验通过施用不同浓度的硝态氮和铵态氮对

3 年生人参氮素代谢相关酶和皂苷含量的影响,

研究铵态氮和硝态氮对人参的影响,为人参栽培

过程中氮肥的管理施用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2021年4月10日在吉林农业大学中药材学院

人参试验基地采集 3 年生人参,2021 年 4 月 16 日

盆栽种植,基质为蛭石∶珍珠岩5∶1,每盆种植3株,

每个处理种植4盆,种前称量人参质量,盆栽种植

完成后将盆栽人参埋入大棚内,埋入的土深不超

过盆的最上沿。

1. 2 试验设计

在霍格兰营养液配方的基础上稍作修改,改

变氮素形态与浓度,NH4

+

-N和NO3

-

-N浓度分别为

5,10,15,20,25 mmol/L,以不施氮素(0 mmol/L)

为对照组,其他元素含量不变,向营养液中添加

7 μmol/L双氰胺[11]

,防止铵态氮硝化。于5月17日

和 6 月 17 日每盆浇灌 300 mL 改变氮素形态和浓

度的营养液,7 月 10 日将盆栽人参取出,洗净,擦

干水,称量部分人参叶片鲜样,用于测定酶活性,

人参根部40 ℃烘干,测定皂苷含量。

1. 3 硝酸还原酶活性测定

称取 0.500 g 鲜样,放入研钵中,加少量石英

砂 和 4 mL 提 取 缓 冲 溶 液,于 冰 浴 中 研 磨 成 匀

浆,转 移 至 离 心 管 中,在 4 ℃、4 000 r/min 离 心

15 min,上清液即为粗酶液。取粗酶液 1.5 mL 于

10 mL试管中,加入1.2 mL 0.1 mol/L KNO3磷酸缓

冲 溶 液 和 0.5 mL NADH 溶 液,混 匀,在 25 ℃水

浴 中 保 温 1 h,对 照 不 加 NADH 溶 液,以 0.5 mL

0.1 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替。保温结束后立

即加入1 mL磺胺溶液,然后再加入1 mL萘基乙烯

胺溶液,摇匀,显色 15 min后,于 4 000 r/min下离

心15 min,取上清液在540 nm下测定吸光值[12]

1. 4 谷氨酰胺合成酶活性测定

取1.0 g人参叶,加入3 mL提取液(50 mmol/L

pH 8 Tris-HCl,2 mmol/L 的 Mg2+ ,2 mmol/L 的

DTT,0.4 mol/L蔗糖),在低温环境下研磨,然后冷

冻离心,制备粗酶提取液,取 0.7 mL 提取液分别

加 1.6 mL反应液 A和反应液 B,37 ℃水浴 30 min,

加 1 mL 的 显 色 剂(0.2 mol/L TCA,0.37 mol/L

FeCl3,0.6 mol/L HCl 混 合 液),5 000 r/min 离 心

10 min。空白对照为只添加反应液 A,540 nm 处

测定其吸光值[13]

1. 5 谷氨酸合成酶活性测定

取 0.2 mL 酶 液 ,加 入 2.8 mL 反 应 混 合 液

(0.4 mL 20 mmol/L L-谷氨酸,0.05 mL 0.1 mol/L

710

第78页

巩金壮,等:氮素形态对人参氮代谢相关酶活性的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

α - 酮 戊 二 酸 ,0.1 mL 10 mmol/L KCl,0.2 mL

3 mmol/L NADH-Na2

,2.05 mL pH 7.6的25 mmol/L

Tris-HCl),20 s 读数 1 次,5 min 后再读数 1 次,以

每分钟反应液减少1 μmol NADH-Na2为一个酶活

单位,以此来计算这一时间段内的酶活[13]

1. 6 谷氨酸脱氢酶活性测定

取 0.5 mL 酶 液 ,加 入 2.5 mL 反 应 混 合 液

(0.3 mL 0.1 mol/L α-酮戊二酸,0.3 mL 1 mol/L

NH4Cl,0.2 mL 3 mmol/L NADH-Na2,1.7 mL

0.2 mol/L Tris-HCl pH 8.0),在 340 nm 处 20 s 读

数1次,5 min后再读取1次,计算这一时间段内的

酶活[13]

1. 7 皂苷含量测定

仪器与试剂:Dionex UltiMate 3000 高效液相

色谱仪;UNIEX-7700型蒸发光散射检测器(美国

通微公司);人参皂苷标准品Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、

Rc、Rb2、Rb3、Rd;乙 腈(HPLC 级);甲 醇(HPLC

级);试验用水为二次蒸馏水。

样品提取方法:精密称取人参粉末 500 mg,

加入 10 mL 甲醇,超声 1 h,置于 4 ℃冰箱过夜,取

出,超声 3 h,5 000 r/min 离心 5 min,取上清,过

0.22 μm滤膜,待液相检测,进样量10 μL。

标准品溶液的制备:取对照品人参皂苷 Rg1、

Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和 Rd,精密称定,加

甲 醇 制 成 每 1 mL 分 别 含 上 述 人 参 皂 苷 0.200,

0.200,0.194,0.200,0.224,0.210,0.200,0.190,

0.204 mg的混合对照品溶液,备用。

标准曲线:取上述混合对照品溶液,分别进样

1,2,4,8,16,20 μL,测定各种人参皂苷的峰面积,

以测得的峰面积自然对数值和进样量的自然对数

值,用最小二乘法进行线性回归,得到各个成分的

回归方程以及线性范围。

色 谱 条 件 :Waters XBridge®C18(4.6 mm×

250 mm,5 μm);流速 1 mL/min;柱温 35 ℃;流动

相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱0~35 min 19% A,

35~50 min 19%~22% A,50~108 min 22%~45% A;

流速 1 mL/min;蒸发光散射检测器漂移管温度

75 ℃,气体流量2.5 L/min,增益值1。

1. 8 统计与分析

数据分析采用 Excel 2010 作图,DPS 软件进

行差异显著性检验和相关性分析。利用 Duncan

多重比较不同浓度的铵态氮和硝态氮处理差异显

著性,显著性用小写字母表示,利用 t检验分析显

著性,大写字母表示同浓度下的铵态氮和硝态氮

显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2. 1 不同处理对人参根生物增长量的影响

由图1可见,人参根生物增长量(试验结束后质

量-种植前质量)受到氮素形态和浓度的显著影响。

添加10,15,20 mmol/L硝态氮和15,20 mmol/L铵

态氮处理与对照相比,显著提高了人参的生物量,

硝态氮处理较铵态氮处理提高的多。在25 mmol/L

硝态氮和铵态氮处理与对照无显著差异,说明并

不是外源氮浓度越高越有利于人参根生物量的增

加,添加过高的外源氮不利于生物量的增加。

2. 2 不同处理对人参叶片硝酸还原酶活性的影响

植物吸收硝态氮后,在植物体内同化第一个

参与反应的酶是硝酸还原酶,因此硝酸还原酶在

植物氮素代谢过程中发挥重要作用。由图 2 可

见,施入外源硝态氮,在 20 mmol/L 时硝酸还 原

酶 活 性 最 高,显 著 高 于 其 他 浓 度 硝 态 氮 处 理

(P<0.05),但与 15 mmol/L 处理无显著差异。施

入外源铵态氮后,随着施入外源铵态氮浓度的升

高,逐渐缓解了硝酸还原酶活性降低的程度,当浓

度为 25 mmol/L 时,硝酸还原酶活性与对照组无

显著差异。施入 5,10,15,20 mmol/L 外源硝态

氮,硝酸还原酶活性显著高于同浓度铵态氮处理

(P<0.05),25 mmol/L 硝态氮与 25 mmol/L 铵态氮

无显著性差异。

小写字母表示不同处理之间差异显著性(P<0.05),大写字母表示

同处理之间差异显著性(P<0.05)。下图同

图1 不同处理对生物增长量的影响

Fig. 1 Effects of different treatments on biomass growth

711

第79页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

2. 3 不同处理对人参叶片谷氨酰胺合成酶活性

的影响

谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶是植物氨

同化的主要酶,其活性受到多种因素的影响。由

图 3 可见,添加外源氮使谷氨酰胺合成酶活性提

高,显著高于对照组(P<0.05)。硝态氮处理谷氨

酰胺合成酶活性随氮素浓度的升高呈先增加后降

低的趋势,添加 15 mmol/L 硝态氮时谷氨酰胺合

成酶活性最高,显著高于其他处理和对照组(P<

0.05)。5,10 mmol/L浓度时硝态氮与铵态氮对谷

氨酰胺合成酶活性影响无显著差异,在 15,20,

25 mmol/L浓度时硝态氮处理的谷氨酰胺合成酶

活性显著高于铵态氮处理(P<0.05)。

2. 4 不同处理对人参叶片谷氨酸合成酶活性的

影响

由图 4 可见,添加不同形态不同浓度的外源

氮对人参叶片谷氨酸合成酶有一定程度的影响。

添加5,10 mmol/L浓度硝态氮和铵态氮与对照比

无显著差异,添加15,20,25 mmol/L硝态氮和15,

20 mmol/L 铵态氮处理与对照相比,显著提高了

谷氨酸合成酶活性(P<0.05)。20,25 mmol/L 硝

态氮处理谷氨酸合成酶活性显著高于同浓度外源

铵态氮处理(P<0.05)。添加外源硝态氮处理谷氨

酸合成酶活性在20 mmol/L时最高,显著高于其他

硝态氮处理(P<0.05)。添加铵态氮处理谷氨酸合

成酶活性在20 mmol/L时最高,显著高于其他铵态

氮处理(P<0.05)。

2. 5 不同形态氮对人参叶片谷氨酸脱氢酶活性

的影响

由图 5 可见,添加不同形态不同浓度的外源

氮显著影响人参叶片谷氨酸脱氢酶活性。施入外

源氮提高了谷氨酸脱氢酶活性,随外源氮浓度升

高,谷氨酸脱氢酶活性呈先升高后降低的趋势,当

浓度为 20 mmol/L 时,谷氨酸脱氢酶活性达到最

大值。同浓度水平的铵态氮和硝态氮处理谷氨酸

脱氢酶活性无显著性差异。

图2 不同处理对硝酸还原酶活性的影响

Fig. 2 Effects of different treatments on NR activity

图3 不同处理对谷氨酰胺合成酶活性的影响

Fig. 3 Effects of different treatments on GS activity

图4 不同处理对谷氨酸合成酶活性的影响

Fig. 4 Effects of different treatments on GOGAT activ⁃

ity

图5 不同处理对谷氨酸脱氢酶活性的影响

Fig. 5 Effects of different treatments on GDH activity

712

第80页

巩金壮,等:氮素形态对人参氮代谢相关酶活性的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 6 不同形态氮对人参皂苷含量的影响

由表1可知,添加外源氮对9种人参根中单体

皂苷,9种皂苷总和的积累都有一定的影响。硝态

氮浓度在 10 mmol/L 时,人参皂苷 Rg1,Re 含量最

高,与对照组相比差异显著(P<0.05);15 mmol/L

硝 态 氮 处 理 时 人 参 皂 苷 Rb1,Rb3,Rd 含 量 最

高 ,显 著 高 于 对 照 组 和 15 mmol/L 铵 态 氮 处 理

(P<0.05)。铵态氮浓度在 15 mmol/L 时,人参皂

苷 Re,Rg2含量最高,显著高于对照组(P<0.05);

浓 度 在 20 mmol/L 时,人参皂苷 Rf,Rb1,Rb3,Rd

含量最高,显著高于对照组,显著高于 20 mmol/L

硝 态 氮 处 理(P<0.05)。 硝 态 氮 处 理 浓 度 在

15 mmol/L时,9种人参皂苷总和最高,10,15 mmol/L

硝态氮处理与对照相比,9 种皂苷总和的含量

显著提高(P<0.05)。铵态氮浓度在20 mmol/L时,

9 种人参皂苷总和最高,显著高于对照组处理

(P<0.05)。

3 讨 论

硝酸还原酶在植物氮代谢过程中起到关键作

用,尤其在植物对硝态氮的同化过程中扮演着重

要角色,是植物体内硝态氮同化的第一个酶,也是

植物体内硝态氮代谢的限速酶[14]

。硝酸还原酶

先将植物吸收的硝态氮在植物根或叶肉细胞质中

还原成 NO2

-

,然后在质体中将 NO2

-

还原成 NH4

+

,再

进一步由谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶

(GOGAT)循环(GS/GOGAT)转化形成有机态谷

氨酰胺,然后形成植物所需要的氨基酸[15]

。硝酸

还原酶是底物诱导酶,它的活性受硝酸盐的诱

导[16]

。有研究表明,大豆施入单一硝态氮对硝酸

还原酶活性的促进作用显著好于施入混合态氮和

表1 不同处理对人参皂苷的影响

Table 1 Effects of different treatments on ginsenosides mg/g

皂苷

Rg1

Re

Rf

Rg2

Rb1

Rc

Rb2

Rb3

Rd

总计

氮素

形态

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

硝态氮

铵态氮

c/(mmol·L-1

)

0

2.797±0.551bA

2.797±0.551bA

3.583±0.534cA

3.583±0.534bA

1.277±0.126abA

1.277±0.126bcA

0.377±0.012abA

0.377±0.012cA

4.253±0.496cA

4.253±0.496cA

1.597±0.301aA

1.597±0.301bA

2.410±0.226abA

2.410±0.226aA

0.413±0.065cA

0.413±0.065dA

1.553±0.280bA

1.553±0.280bcA

18.260±0.981bA

18.260±0.981bA

5

2.843±0.345bA

2.060±0.115cB

3.850±0.225bcA

4.760±1.817aA

1.313±0.087abA

1.430±0.000bA

0.380±0.020abA

0.457±0.012bA

5.800±0.285abA

5.370±0.121bB

2.377±0.533aA

1.810±0.208abA

2.430±0.276abA

2.007±0.023bcA

0.630±0.046abA

0.520±0.017bcB

1.787±0.212abA

1.537±0.006bcA

21.410±1.408abA

19.883±0.245bA

10

3.977±0.666aA

2.420±0.104bcB

5.867±0.866aA

3.653±0.482bB

1.467±0.316aA

1.223±0.142cA

0.463±0.131aA

0.410±0.020cA

5.517±0.956abA

5.283±0.339bA

2.247±0.772aA

1.670±0.303bA

2.393±0.726abA

1.853±0.104cA

0.643±0.015aA

0.473±0.075cdB

1.867±0.575abA

1.433±0.129bcA

24.440±4.369aA

18.387±1.300bA

15

2.810±0.793bA

2.380±0.315bcA

5.700±0.304abA

5.223±0.761aA

1.550±0.242aA

1.387±0.040bA

0.420±0.052aB

0.557±0.031aA

6.527±0.618aA

5.427±0.299bB

2.537±0.558aA

1.740±0.195bB

2.950±0.339aA

1.873±0.091cB

0.710±0.030aA

0.507±0.049bcdB

2.220±0.210aA

1.403±0.126cB

25.423±4.614aA

20.407±1.353bA

20

1.983±0.734bB

3.493±0.189aA

3.817±0.329bcA

4.993±0.828aA

1.040±0.296bB

1.727±0.074aA

0.277±0.064bB

0.553±0.025aA

4.977±0.231bcB

6.757±0.764aA

1.830±0.313aA

2.217±0.293aA

2.020±0.382bA

2.427±0.031aA

0.463±0.023cB

0.707±0.023aA

1.350±0.192bB

2.077±0.289aA

17.757±3.391bB

24.950±2.010aA

25

2.400±0.192bA

2.217±0.134cA

3.407±0.248cB

4.073±0.314bA

1.237±0.012abA

1.217±0.045cA

0.273±0.006bB

0.377±0.015cA

4.117±0.601cB

6.110±0.332abA

2.170±0.106aA

1.963±0.147abA

2.280±0.113abA

2.203±0.168abA

0.523±0.124bcA

0.583±0.055bA

1.670±0.108abA

1.763±0.103abA

18.077±1.079bB

20.507±0.952bA

注:不同小写字母表示处理之间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示同处理之间差异显著(P<0.05)

713

第81页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

单一铵态氮[17]

。在枳橙的研究中表明,全硝态氮

处理硝酸还原酶活性显著高于全铵态氮处理[18]

有学者在对甜菜的研究表明,在同一氮素水平下

硝酸还原酶活性受氮素形态比例的影响,硝态氮

能提高硝酸还原酶活性,铵态氮抑制硝酸还原酶

活性[19]

。在拟南芥、油菜中的研究表明,硝态氮

均诱导了硝酸还原酶活性[20-21]

。前人对其他作物

研究表明,硝态氮较铵态氮更有利于硝酸还原酶

活性的提高,本研究结果表明,施入外源硝态氮提

高了硝酸还原酶活性,但高浓度硝态氮会使硝酸

还原酶活性降低,这与Chen等[20]

在油菜上的研究

结果一致;施入铵态氮 5~20 mmol/L 降低了人参

叶片硝酸还原酶的活性,这与李彩凤等[19]

在甜菜

上的研究结果一致;施入 25 mmol/L 铵态氮人参

叶片硝酸还原酶与对照组无显著性差异。原因可

能是:硝酸还原酶作为底物诱导酶,添加铵态氮的

情况下缺少硝态氮的吸收,所以硝酸还原酶活性

降低。硝酸还原酶将硝态氮转化为亚硝态氮,亚

硝态氮在质体中还原成铵态氮,施入铵态氮植物

体内铵态氮增多,抑制了亚硝态氮转化为铵态氮,

进一步抑制了硝酸还原酶的活性。

GS/GOGAT 循环是高等植物氨同化的主要

途径,在无机氮转化成有机氮的过程中起到至关

重要的作用,其活性受到植株生长年龄、植物种

类、氮素形态浓度等诸多因素的影响[22]

。当人参

在供氮充足或碳水化合物缺乏时,过多的氨以酰

胺的形态贮存起来,以避免游离氨中毒。在人参

体内,形成的谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的作用下,

进一步氨化,形成谷氨酰胺,谷氨酰胺和谷氨酸在

酶的作用下进一步同化成各种氨基酸[4]

。有研究

表明,铵态氮能提高水稻[23]

、甜菜[24-25]

的谷氨酰

胺合成酶活性,提高氮素用量可以使玉米[26]

、花

生[27]

谷氨酰胺合成酶活性提高,但其用量过高会

对其活性产生抑制作用。本研究结果表明,施氮

提高了人参叶谷氨酰胺合成酶活性,铵态氮和硝

态氮对其影响不同,在 5,10 mmol/L 浓度时铵态

氮处理谷氨酰胺合成酶活性高于硝态氮处理,在

15,20,25 mmol/L浓度时硝态氮处理谷氨酰胺合

成酶活性高于铵态氮处理,在低浓度的氮素处理

下铵态氮对谷氨酰胺合成酶活性提高大于硝态

氮,高浓度的铵态氮处理对其活性的提高显著低

于硝态氮处理。

谷氨酸脱氢酶一般认为主要有两种作用,一

是催化NH4

+

与α-酮戊二酸生成谷氨酸[28]

;二是当

碳骨架受限制时,催化谷氨酸脱氢形成α-酮戊二

酸,为三羧循环提供碳骨架[29]

,对缓解植物氨中

毒有一定作用[30]

。关于谷氨酸脱氢酶在菠菜[31]

上的研究也表明,外源铵能诱导菠菜茎叶中谷氨

酸脱氢酶活性,施入外源铵态氮会引起谷氨酸脱

氢酶活性的升高,施入外源硝态氮初期对谷氨酸

脱氢酶无影响,随着时间的延长会提高谷氨酸脱

氢酶的活性[32]

。本研究结果表明,施入外源硝态

氮和铵态氮 2 个月后,人参叶片谷氨酸脱氢酶活

性都随浓度的升高呈先增加后降低的趋势,在

25 mmol/L时其酶活性低于20 mmol/L浓度,但其

活性高于不添加外源氮处理。

氮元素在维持和促进人参生长发育中发挥着

重要作用。植物体内核酸、蛋白质、叶绿素、某些

维生素、生物碱及激素等成分都含有氮元素,因此

植株对氮素的需求量较大。氮素对植株光合作用

和增产方面起着不可替代的作用[33-37]

。氮素用量

对人参产量和质量的高低有显著影响,正常氮代

谢能促进人参有效成分、营养成分的合成和积

累[3-4]

。研究表明,人参光合速率、叶绿素含量受

到不同浓度氮的显著影响。人参生长过程中出芽

延缓,茎叶短小,参根严重减少,枯萎期延后等情

况 都 与 土 壤 中 高 浓 度 氮 含 量 有 关 ,NH4

+

-N 比

NO3

-

-N 危害更加严重。施入过多的氮肥会造成

根部皂苷含量下降,增加了淀粉含量,向茎部转移

的碳同化产物增加,参根干物质积累受到影响,降

低了人参的品质[6-7]

。当氮素含量过低时,抑制了

人参的光合作用,活性氧代谢失衡,生物膜结构受

到损失。

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(责任编辑:林海涛)

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E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2023,45(6):716-724

Journal of Jilin Agricultural University

人参根际PGPR的分离鉴定及其促生效果*

关雪梅1

,刘思雨1

,王 义2

,刘思章2

,于靖辉2

,汪树理3

,张爱华1

,王艳芳1**

1. 吉林农业大学中药材学院,国家中医药管理局药用植物栽培育种三级实验室,长春130118;

2. 吉林省人参基因资源开发与利用工程研究中心,长春130118;3. 农业农村部参茸产品质量

监督检验测试中心,长春130118

摘 要:为丰富人参根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)菌种资源,以人参根际土壤为材

料,使用功能性培养基分离筛选具有促生潜力的植物根际促生菌。通过形态学、生理生化和16S rDNA测序对

分离菌株进行分类鉴定,并通过盆栽试验验证所筛选 PGPR 对人参幼苗生长的作用。结果表明:共分离出根

际促生菌17株,其中具有溶磷能力的菌株10株,具有产铁载体能力的菌株8株,产IAA能力的菌株7株,具有

固氮效果的菌株 9株,有 10株菌具有 2种及 2种以上不同的促生功能。17株根际促生菌分别来自 Pseudomo⁃

nas、Burkholderia、Bacillus、Enterobacter、Agrobacterium、Paenarthrobacter、Acinetobacter、Leclercia、Priestia 9个不同

的菌属,其中假单胞菌(Pseudomonas)数量最多,占比29. 41%。F05-44菌株综合促生能力最强,盆栽试验发现,

该菌株在不施肥条件下促进人参生长,株高和根长分别提高38. 53%,24. 65%,展叶期缩短3~4 d,具有潜在应用价值。

关键词:人参;PGPR;分离鉴定;促生作用

中图分类号:S567. 51 文献标志码:A 文章编号:1000-5684(2023)06-0716-09

DOI:10.13327/j.jjlau.2023.0214

引用格式:关雪梅,刘思雨,王义,等.人参根际PGPR的分离鉴定及其促生效果[J].吉林农业大学学报,2023,

45(6):716-724.

Isolation and Identification of PGPR from Ginseng Rhizosphere and

Its Promoting Effect *

GUAN Xuemei1

,LIU Siyu1

,WANG Yi2

,LIU Sizhang2

,YU Jinghui2

,WANG Shuli3

,ZHANG

Aihua1

,WANG Yanfang1**

1. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Laboratory for Cultivation

and Breeding of Medicinal Plants of National Administration of Traditional Chinese Medicine,Chang⁃

chun 130118, China;2. Jilin Province Engineering Research Center for Ginseng Genetic Resources

Development and Utilization, Changchun 130118, China;3. Ginseng and Antler Products Testing

Center of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People's Republic of China,Changchun

130118,China

Abstract:In order to enrich ginseng growth promoting rhizobacteria, this study used ginseng rhizo⁃

sphere soil as materials to isolate and screen plant growth promoting rhizobacteria with probiotic po⁃

tential by using functional medium, and isolated strains were classified and identified by morphology,

physiology, biochemistry and 16S rDNA sequencing, and the effects of the screened PGPR on the

* 基金项目:吉林省科技发展计划项目(20200403011SF,20190201171JC),吉林省教育厅科学技术项目(JJKH20170310KJ,

JJKH20200362KJ),国家自然科学基金青年基金项目(31401445)

作者简介:关雪梅,女,在读硕士,研究方向:药用植物。

收稿日期:2023-05-01

** 通信作者:王艳芳,E-mail:yfwang2014@163.com

第84页

关雪梅,等:人参根际PGPR的分离鉴定及其促生效果

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

growth of ginseng seedlings were verified by pot test. The results showed that 17 strains of PGPR

were isolated, including 10 strains with phosphorus solubilizing ability, 8 strains with iron carrier pro⁃

ducing ability, 7 strains with IAA producing ability, 9 strains with nitrogen fixing effect, and 10 strains

with two or more different promoting functions. They are from 8 different genera, Pseudomonas, Burk⁃

holderia, Bacillus, Enterobacter, Agrobacterium, Paenarthrobacter, Acinetobacter, Leclercia and Pries⁃

tia, among which the largest number of Pseudomonas accounted for 29.41%. Strain F05-44 had the

strongest overall growth-promoting ability, and the pot test found that this strain promoted the growth of

ginseng without fertilization, and plant height and root length increased by 38.53% and 24.65%, respec⁃

tively, and leaf spreading period was shortened by 3-4 days, which has potential application value.

Key words:ginseng; plant growth promoting rhizobacteria; isolation and identification; promoting

effect

植物根际促生菌(PGPR)是一类定殖在植物

根际,生长旺盛且有益的根际细菌[1]

。研究发现,

根际促生菌具有改善土壤理化性质、促进植物生

长、降解污染物、保护植物免受非生物胁迫和生物

胁迫等有益作用[2]

,可以广泛应用于药用植物的

质量提升、病害防控、土壤改良、缓解连作障碍等

过程[3]

,并且利用根际促生菌制备微生物肥料具

有绿色安全、生态环保等特点[4-5]

。熊春霞等[6]

现,含细黄链霉菌的激抗菌 968 可以有效提升延

胡索单株产量和单株有效药用生物碱延胡索乙素

的含量,在延胡索种植中具有良好的应用潜力和

推广价值。李小玲等[7]

田间试验发现,微生物菌

肥能够通过影响川党参植株的光合代谢、抗氧化

能力以及土壤酶活性改善其生长,从而有效防控

川党参连作障碍和紫纹羽病害。吴红淼等[8]

通过

田间定位试验分析,发现微生物菌肥能有效减缓

太子参连作障碍,改善重茬太子参质量。

人参(Panax ginseng C. A. Meyer)是我国具有

悠久应用历史的传统名贵中药,有“百草之王”之

称,药用和经济价值极高[9-10]

,但人参种植的连作

障碍问题严重,致使道地产区宜栽参土地资源几

近枯竭,严重制约吉林省人参“千亿级”产业的进

程和发展[11-12]

。人参根际微生态与土壤理化性

质、有害物质残留污染及土传病害的发生和调控

密切相关,影响人参的产量和质量[13-15]

。连作障

碍现象的本质是土壤微生态系统失衡,调控人参

根际微生态对提高人参质量和产量十分重要[16]

从根际微生态平衡角度出发,通过根际调控开展

连作障碍土壤生态修复关键技术研究是人参栽培

工作者关注的热点,同时也是保障人参产业可持

续发展的重要路径[17-18]

。PGPR 具有较强的根际

定殖能力和独特的微生态学功能,可促使植物根

际微生态达到一种动态平衡,形成稳定、健康的根

际微生态系统[19]

。利用根际微生物实现生态修

复最关键的一步就是获得能够进行纯培养的有益

微生物菌株,基于此,本试验以人参根际土壤为材

料,分离筛选人参根际促生细菌,并对其分类地位

进行归属,通过盆栽试验验证所筛选的 PGPR 对

人参的促生效果,一方面可以丰富人参微生物菌

种资源库,另一方面挖掘人参根际细菌促生潜力,

为人参等中药材绿色种植提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 供试土壤样品

根际土壤样品采集自吉林省集安市人参种植

合作社(北纬 40°59'46″,东经 126°05'),采用 5 点

取 样 法 ,利 用 无 菌 铲 子 挖 取 种 植 2 年(F02)、

3年(F03)、4年(F04)和 5年(F05)的健康农田参,

轻轻取出人参后抖落大块土,把参根与附着在参

根表面的根际土壤(距离根系<1 mm)装入无菌袋

中,低温运回实验室。

1. 2 供试培养基与试剂

LB 培养基:胰蛋白胨 10.0 g,酵母浸粉 5.0 g,

NaCl 10.0 g,琼脂20.0 g,蒸馏水定容1.0 L;无机磷

细菌培养基:葡萄糖10.0 g,(NH4

)2SO4 0.5 g,酵母浸

粉 0.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4

·7H2O 0.3 g,

FeSO4

·7H2O 0.03 g,MnSO4

·4H2O 0.03 g,Ca(3 PO4

)2

5.0 g,琼脂 20.0 g,蒸馏水定容至 1.0 L;CAS 检测

培养基:铬天青 S(chromeazurol S,CAS)60. 5 mg,

十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 72. 9 mg,FeCl·3 6H2O

2.645 mg,NaH2PO4

·2H2O 295.25 mg,Na2HPO4

·

12H2O 1 213.5 mg,NH4Cl 125.0 mg,KH2PO4

717

第85页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

37.5 mg,NaCl 62.5 mg,pH 6.8,琼脂 9.0 g,蒸馏水

定容1.0 L;MKB 液体培养基:酸水解酪蛋白5.0 g,

甘 油 15.0 mL,K2HPO4

·7H2O 2.5 g,MgSO4

·7H2O

2.5 g,蒸馏水定容 1.0 L;Ashby 无氮培养基:甘露

醇 10.0 g,NaCl 0.2 g,KH2PO4 0.2 g,CaCO3 5.0 g,

MgSO4

·7H2O 0.2 g,CaSO4 0.1 g,琼脂 20.0 g,蒸馏

水定容至 1.0 L;Salksowski 比色液:50.0 mL H2O,

1.0 mL 0.5 mol/L FeCl3,30.0 mL 98.0% H2SO4。

1. 3 PGPR分离纯化

采用稀释涂布平板法从人参根际土壤中分离

纯化根际细菌。取出低温运回实验室的参根,放

入50 mL无菌离心管中,加入灭菌水,振荡洗下根

际土壤,28 ℃振荡 30 min(160 r/min)制备成土壤

悬液。使用无菌水将土壤悬液逐级稀释为 10-3

10-4

,10-5

,10-6 4 个梯度的稀释悬液,分别吸取各

浓度稀释悬液 100 μL,用无菌涂布器将其均匀地

涂布于 LB 固体培养基上,37 ℃倒置培养 1~7 d。

期间每天观察培养基上菌落的生长状况,选择形

态、颜色、大小有差异的单菌落,将其挑取至新的

LB固体培养基平板上划线纯化,连续纯化 3代以

上,直到分离出纯菌株。纯化后的菌株进行甘油

管冻存,以“年份 + 数字”的格式命名,于-80 ℃冰

箱中保存备用。

1. 4 人参根际促生菌的筛选

溶磷细菌的筛选参照杜雷等[20]

的方法,接种

细菌于无机磷细菌培养基上,通过菌株在培养基

上有无透明圈来判断菌株有无溶磷活性,然后采

用钼锑抗比色法测定菌株溶解无机磷的能力;产

铁载体细菌的筛选参照葛淼淼等[21]

的方法,接种

细菌于 CAS固体培养基上,观察菌株周围是否出

现橙色铁载体晕圈,有橙色晕圈为产铁载体菌株,

然后通过铬天青比色法测定菌株产铁载体的能

力;产 IAA 细菌的筛选参照刘长征等[22]

的方法进

行菌株培养,采用 Salkowski 比色法测定菌株产

IAA能力。固氮细菌的筛选参照江美彦等[23]

的方

法,接种细菌于Ashby无氮培养基上,通过菌株在

培养基上的生长状况判断细菌有无固氮活性。

1. 5 致病性检验

选用健康人参根进行回接试验,检验菌株致

病性。LB液体培养基活化菌株至对数生长期,在

消毒处理的人参根上划 3 道伤口,取对数生长期

浓度为 108

CFU/mL 的菌液接种在伤口处,无菌

LB 培养基为对照。接种完后用带有无菌水的脱

脂棉覆盖伤口,用塑料袋套住保湿,25~28 ℃培养

10 d,观察人参根是否有腐烂、病斑等发病症状。

1. 6 人参根际促生菌的鉴定

1. 6. 1 形态和生理生化鉴定 将菌株划线接种

在 LB 培养基上,37 ℃ 培养过夜,记录菌落形态,

进行革兰氏染色观察,方法参照文献[24-25]。

1. 6. 2 分子生物学鉴定 使用细菌基因组提

取试剂盒提取细菌基因组 DNA 作为模板,采用

16S rDNA 引物 27F/1492R进行 PCR 扩增,PCR 产

物经 2% 琼脂糖凝胶电泳检测后,送至长春库美

科技有限公司进行测序,将所得序列在 GenBank

上进行系统进化分析,初步确定菌株的分类地位。

1. 7 根际促生菌对人参生长的促生效果验证

人参苗栽用 75% 乙醇擦拭消毒,无菌水清洗

3 次,种植于装有 500 g 已灭菌基质(土壤∶蛭石∶

珍珠岩=3∶1∶1)[26]

的塑料盆中,每盆种植 4~5 株,

置于 25 ℃培养箱中,生长到第 7 天时拔除差异较

大的植株,每盆保留长势一致的 3 株人参。将菌

株接种于 LB液体培养基,180 r/min、37 ℃恒温摇

床培养24 h,6 000 r/min 离心10 min后收集菌体,

加入无菌水振荡重悬,将菌液浓度调至 OD600约为

0.6,备用。从种植第 1 天起,每隔 7 d 在人参根部

浇灌菌液,每株 50 mL,以接种无菌水的盆栽为对

照。每组10个,每个重复3次,共30株,生长期间

每天观察人参的生长情况。盆栽试验30 d后测定

人参植株的株高、鲜重、根长等指标,并进行统计

分析。

1. 8 数据分析

使 用 Excel 2010 软 件 进 行 数 据 整 理,SPSS

23.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)统计,检

验结果均取(P<0.05)作为统计学意义判断标准。

2 结果与分析

2. 1 根际细菌菌株分离纯化

通过稀释涂布平板法,从人参根际土壤中共

分离纯化出 173 株细菌,分别编号为 F02-1~19,

F03-1~56,F04-1~48,F05-1~50。

2. 2 PGPR的筛选

2. 2. 1 溶解无机磷菌株的筛选 利用功能培养

基共筛选得到 11 株产生溶磷圈的根际细菌,见

图 1。配制不同浓度的磷标准溶液并通过钼锑抗

比色法测定溶液中的磷含量,根据磷标准溶液测

718

第86页

关雪梅,等:人参根际PGPR的分离鉴定及其促生效果

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

定结果并绘制磷标准曲线,得到线性回归方程 y=

1.788x+0.005 3(R2

=0.999 2)。11株细菌的溶磷能

力定量检测结果见图 2,菌株间的溶磷能力差异

显著,90.91% 的菌株溶磷能力>100 mg/L,菌株

F05-48 溶解无机磷的能力最强,为 468.42 mg/L,

F04-28和F05-44次之。

2. 2. 2 产铁载体菌株的筛选 筛选得到 9 株细

菌 出 现 橙 色 晕 圈,见 图 3。发 酵 上 清 液 与 等 量

CAS检测液反应后,使用酶标仪在 630 nm处测定

吸光度值,计算9株细菌产铁载体的能力,结果见

图4。9株细菌的产铁载体能力存在差异,产铁载

体 能 力 在 29.28%~60.47%,菌 株 F03-36、F05-45

的产铁载体能力最强,为 60.47%,58.88%,菌株

F05-44 的产铁载体能力最弱,为 29.28%。菌株

F03-50 在 CAS 平板上形成的晕圈与其他菌株不

同,其摇瓶试验上清液与 CAS检测液混合后为红

色,其他菌株为橙黄色,初步推断菌株 F03-50 分

泌的铁载体类型与其他菌株不同。

2. 2. 3 产IAA菌株的筛选 以不加菌液的LB培

养液为阴性对照,10 mg/L 的 IAA 标准液为阳性

对照,筛选得到 11 株具有产 IAA 能力的菌株,显

色反应见图5。配制不同浓度的IAA标准溶液,根

图1 人参根际细菌溶解无机磷效果检测

Fig. 1 Detection of the effect of ginseng rhizosphere bacteria on dissolving inorganic phosphorus

不同小写字母表示菌株间差异显著(P<0.05),下图同

图2 人参根际细菌溶解无机磷能力测定

Fig. 2 Determination of the capacity of ginseng rhizo⁃

sphere bacteria in dissolving inorganic phos⁃

phorus

图3 人参根际细菌产铁载体效果检测

Fig. 3 Detection of the effect of iron-producing carriers of ginseng rhizosphere bacteria

719

第87页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

据IAA标准溶液测定结果绘制IAA标准曲线,得到

线 性 回 归方 程 y=54.519x-0.143 4(R2

=0.999 3)。

根据IAA标准曲线计算细菌的 IAA 产量,结果见

图6。11株细菌的IAA分泌量为21.72~54.05 mg/L,

其中菌株F02-13产IAA 的能力最强,定性观察显

色反应颜色最深,为深红色,分泌量为54.05 mg/L,

其次是菌株 F03-1,分泌量为 34.57 mg/L。菌株

F05-48的产 IAA能力最弱,定性观察显色反应颜

色最浅,为浅粉色,分泌量为10.96 mg/L。

2. 2. 4 固氮菌株的筛选 将173株单菌在Ashby

无氮培养基上划线培养,选取培养基上生长较快,

菌落形态较大的菌株,进行反复划线转接,经3次

转接后,有11株细菌仍能生长,具有固氮能力,见

图 7。根据细菌在 Ashby 无氮固体培养基上的长

势情况,判断其固氮能力的强弱,结果见表 1,其

中菌株 F03-56 长势较好,具有较强的固氮能力,

F05-45和F02-1次之。

图4 人参根际细菌产铁载体能力测定

Fig. 4 Determination of the capacity of iron-producing

carriers of ginseng rhizosphere bacteria

2. 3 致病性检验

将筛选得到的菌株回接在人参根部,室温培

养 10 d,以菌株 F03-25,F03-2,F03-5,F03-1 为

例,结果见图8,与对照组相比,接种菌株F03-25、

F03-2 的人参根部无发病现象,判断其为对人参

无致病性的菌株。而接种菌株 F03-5,F03-1 后,

人参根部出现病斑腐烂现象,判断为致病菌株,结

果共获得17株无致病性的根际促生细菌,分别为

F02-1,F02-8,F02-9,F02-13,F03-2,F03-16,

F03-25,F03-36,F03-46,F03-50,F03-56,F04-

28,F04-29,F04-48,F05-44,F05-45,F05-48,其

中具有溶磷能力的菌株10株,具有产铁载体能力

的菌株 8 株,产 IAA 能力的菌株 7 株,具有固氮效

果的菌株9株,有10株菌具有2种及2种以上不同

的促生功能。

2. 4 人参根际促生菌的鉴定

2. 4. 1 形态和生理生化鉴定 菌株的形态特征

和生理生化鉴定结果见表 2。以菌株 F05-44 为

例,将菌株接种在 LB 培养基上,37 ℃培养 24~

48 h,形态特征和革兰氏染色结果见图 9,菌落颜

色白色、形状圆形、表面光滑湿润、革兰氏染色阴

性,可以利用葡萄糖为碳源、硝态氮为氮源,荧光、

吲哚试验、接触酶阳性,在 NaCl 为 5% 的 LB 固体

平板上可以生长。

图5 人参根际细菌产IAA效果检测

Fig. 5 Detection of IAA-producing effect of ginseng rhizosphere bacteria

图6 人参根际细菌产IAA能力测定

Fig. 6 Determination of IAA-producing capacity of

ginseng rhizosphere bacteria

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关雪梅,等:人参根际PGPR的分离鉴定及其促生效果

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

图8 部分人参根际细菌回接致病性检验

Fig. 8 Pathogenicity test of some ginseng rhizo⁃

sphere bacteria after backgrafting

图7 人参根际细菌固氮效果检测

Fig. 7 Detection of nitrogen fixation effect of ginseng rhizosphere bacteria

表1 人参根际细菌的固氮能力

Table 1 Nitrogen fixation capacity of ginseng rhizo⁃

sphere bacteria

菌株编号

F02-1

F02-9

F03-2

F03-6

F03-16

F03-25

F03-52

F03-56

F05-44

F05-45

F05-48

固氮能力

+++

+

++

++

++

+++

+++

+++++

+++

++++

+++

注:“+”代表固氮能力,越多代表固氮能力越强

表2 人参根际细菌的形态特征和生理生化鉴定

Table 2 Physiological and biochemical identification of ginseng rhizosphere bacteria

菌株编号

F02-1

F02-8

F02-9

F02-13

F03-2

F03-16

F03-25

F03-36

F03-46

F03-50

F03-56

F04-28

F04-29

F04-48

F05-44

F05-45

F05-48

形态特征

透明、圆形、光滑湿润

黄色、圆形、光滑湿润

污白色、圆形、粗糙湿润

半透明、圆形、光滑湿润

淡黄半透明、圆形、光滑湿润

浅黄色、圆形、光滑湿润

白色、圆形、光滑湿润

浅黄色、圆形、光滑湿润

白色、圆形、光滑湿润

灰白色、圆形、光滑湿润

白色、圆形、光滑湿润

黄色、圆形、光滑湿润

白色半透明、圆形、光滑湿润

浅黄色、圆形、光滑湿润

白色、圆形、光滑湿润

乳黄色、圆形、光滑湿润

白色、圆形、光滑湿润

葡萄糖

+

-

-

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

硝态氮

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

-

+

+

+

-

荧光

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

吲哚

-

-

-

+

+

+

+

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

接触酶

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

耐盐度/%

≤5

≤3

≤7

≤7

≤5

≤7

≤3

≤3

≤3

≤3

≤3

≤7

≤3

≤7

≤5

≤5

≤5

革兰氏染色

-

-

+

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

注:“+”表示该试验结果为阳性;“-”表示该试验结果为阴性

721

第89页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

2. 4. 2 分子生物学鉴定 利用通用引物进行

PCR 扩增,获得 17 株细菌的 16S rDNA 序列。将

所得16S rDNA序列与NCBI数据库进行BLAST搜

索比对,并进行系统进化分析,结合形态学和生理

生化鉴定结果,17株细菌的鉴定结果见表3。17株

细菌对比结果同源性均>99%,分别来自 Pseudo⁃

monas、Burkholderia、Bacillus、Enterobacter、Agro⁃

bacterium、Paenarthrobacter、Acinetobacter、Leclercia、

Priestia 9个不同的菌属,其中假单胞菌属(Pseudo⁃

monas)数量最多,占比29.41%。

2. 5 根际促生菌对人参生长的促生效果验证

菌 株 F05-44(Pseudomonas glycinae)具 有 溶

解无机磷、产生铁载体、产 IAA 和固氮作用,综合

能力最强。选择菌株F05-44进行盆栽验证,结果

见表4,菌株F05-44能够显著促进人参幼苗生长。

与无菌水处理相比,株高和根长分别提高38.53%,

24.65%,同时展叶期缩短3~4 d(P<0.05)。

A.F05-44菌落形态观察;B.F05-44革兰氏染色观察

图9 人参根际细菌F05-44形态特征

Fig. 9 Morphological characteristics of ginseng rhizo⁃

sphere bacteria F05-44

表3 菌株的16S rDNA序列同源性分析对比结果

Table 3 Comparison of homology analysis of 16S rDNA sequences of all strains

菌株编号

F02-1

F02-8

F02-9

F02-13

F03-2

F03-16

F03-25

F03-46

F03-50

F03-56

F03-36

F04-28

F04-29

F04-48

F05-44

F05-45

F05-48

对比信息(登陆号)

Pseudomonas grimontii (NR_025102.1)

Burkholderia ambifaria (NR_074687.1)

Bacillus subtilis(NR_112116.2)

Enterobacter ludwigii(NR_042349.1)

Pseudomonas brassicacearum (NR_024950.1)

Leclercia adecarboxylata (NR_104933.1)

Agrobacterium tumefaciens (NR_115516.1)

Agrobacterium arsenijevicii(NR_179408.1)

Pseudomonas multiresinivorans(NR_119225.1)

Agrobacterium fabrum (NR_074266.1)

Microbacterium foliorum (NR_025368.1)

Pseudomonas fulva (NR_104280.1)

Enterobacter asburiae (NR_024640.1)

Priestia aryabhattai (NR_115953.1)

Pseudomonas glycinae (NR_179889.1)

Paenarthrobacter nicotinovorans(NR_026194.1)

Acinetobacter calcoaceticus (NR_119113.1)

系统类比

Pseudomonas

Burkholderia

Bacillus

Enterobacter

Pseudomonas

Leclercia

Agrobacterium

Agrobacterium

Pseudomonas

Agrobacterium

Microbacterium

Pseudomonas

Enterobacter

Priestia

Pseudomonas

Paenarthrobacter

Acinetobacter

相似性/%

99.78

99.70

99.93

99.79

99.56

99.71

99.78

100.00

99.79

99.93

100.00

100.00

99.85

99.93

99.93

99.93

99.86

表4 接种F05-44对人参生长的促生效果

Table 4 Growth-promoting effect of inoculation with

F05-44 on ginseng

指标

株高/cm

根长/cm

鲜质量/g

展叶时间/d

ck

7.920±0.32b

9.667±1.69b

2.971±0.69a

12.667±0.47a

F05-44

10.967±1.78a

12.05±0.56a

3.792±0.67a

8.833±0.69b

722

第90页

关雪梅,等:人参根际PGPR的分离鉴定及其促生效果

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3 结论与讨论

人参在连作过程中土壤微生态恶化,病虫害

泛滥,人参健康生长发育受阻,产量和品质下降,

土壤质量恢复问题亟待解决。根际有益微生物有

独特的微生态学功能,是一项重要的土壤修复技

术,因此,利用有益微生物进行土壤微生态修复是

保障人参产业可持续发展的关键。目前,有益微

生物制剂已在人参的病害防控上得到初步应用,

Durairaj 等[27]

室内筛选得到 2 株拮抗菌株铜绿假

单胞菌 Pseudomonas aeruginosa (D4)和同温层芽

孢杆菌Bacillus stratosphericus(FW3),对人参根腐

病有抑制作用;牛玮浩[28]

发现,施用微生物菌肥

可以显著改变土壤的细菌群落组成,提高土壤酶

活性,并改变土壤中氮、磷、钾元素配比,从而使土

壤更适宜人参出芽期的发育。张洁婧等[29]

从人

参根际土壤中分离得到1株人参锈腐病的生防细

菌C10,鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliq⁃

uefaciens),回 接 试 验 结 果 表 明,其 抑 菌 率 可 达

80.95%。本研究从来源于人参根际的173株细菌

中筛选到 17 株具有溶解无机磷、产铁载体、分泌

IAA、固氮等促生特性的根际促生菌,盆栽试验初

步 验 证 PGPR 菌 株 的 促 生 作 用,结 果 发 现 菌 株

F05-44对人参幼苗生长有明显的促进作用。

通过结合形态特征、生理生化鉴定及分子鉴

定,结果表明:17 株根际促生菌分别来自 Pseudo⁃

monas、Burkholderia、Bacillus、Enterobacter、Agro⁃

bacterium、Paenarthrobacter、Acinetobacter、Leclercia、

Priestia 9 个不同的菌属。目前已有文献报道,

PGPR 的 种 类 主 要 包 括 假 单 胞 菌 属(Pseudomo⁃

nas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和伯克霍尔德氏菌属

(Burkholderia)等,具有溶磷、产IAA、产铁载体、固

氮等促生功能,与本试验结果一致。本试验中促

生潜力最强的菌株 F05-44 为 Pseudomonas glyci⁃

nae,属于韩国假单胞菌 Pseudomonas koreensis 亚

群(SG)的菌株[30]

,韩国假单胞菌能够改善酸化植

烟土壤质量,在微生物修复酸化土壤和防控烟草

根茎病害中具有较大的应用潜力。陈先意等[31]

发 现,Pseudomonas glycinae 可 以 抑 制 病 原 真 菌

Mycogone perniciosa 生 长,具 有 成 膜 能 力 和 运 动

性。本试验促生验证结果表明,菌株F05-44同时

具有溶解无机磷、产铁载体、产 IAA 和固氮的作

用,并且可以促进人参地上部分生长,缩短人参展

叶期,具有发展成为人参有益微生物资源的潜力,

可进一步研究。其他研究报道较少的菌株,如

F03-16 为 非 脱 羧 勒 克 氏 菌(Leclercia adecarbox⁃

ylata),研究发现其可以高效降解农药卡巴呋喃,

同时促进玉米幼苗生长[32]

。菌株 F05-48 为醋酸

钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus),接种醋酸

钙不动杆菌对达乌里胡枝子幼苗和成株均表现出

良好的促生作用,可用于开发促生菌剂[33]

。菌株

F05-45 为类节杆菌属(Paenarthrobacter),被发现

可用来降解土壤中的农残、重金属[34]

等污染物。

本试验筛选的17株菌株都具有一定的有益作用,

研究结果可为栽参土壤生态修复提供有益微生物

资源。

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(责任编辑:林海涛)

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吉林农业大学学报 2023,45(6):725-736 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

人参属植物炭疽病菌致病机制研究进展*

杨一帆,占浩鑫,陈禹彤,卢宝慧,刘丽萍**,高 洁**

吉林农业大学植物保护学院,长春130118

摘 要:炭疽菌属(Colletotrichum)真菌被列为全球第八大植物病原真菌,在全世界范围内可引起众多单双子

叶植物病害,人参属(Panax)植物被炭疽菌属真菌侵染后产量受损、品质下降,直接或间接导致严重经济损失。

对人参属植物炭疽病菌的分类学进展、致病机制研究进展及存在问题进行综述,并讨论了人参属植物炭疽病

菌的研究方向,以期为系统研究炭疽菌属真菌致病机制和人参属植物病害防治提供理论支持。

关键词:人参属;炭疽菌属;致病机制;致病基因

中图分类号:S435.675 文献标志码:A 文章编号:1000-5684(2023)06-0725-12

DOI:10.13327/j.jjlau.2023.20431

引用格式:杨一帆,占浩鑫,陈禹彤,等.人参属植物炭疽病菌致病机制研究进展[J].吉林农业大学学报,2023,

45(6):725-736.

Research Advances of Pathogenic Mechanism of Colletotrichum spp.

on Panax genus Plants

YANG Yifan,ZHAN Haoxin,CHEN Yutong,LU Baohui,LIU Liping**,GAO Jie**

College of Plant Protection,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China

Abstract:Colletotrichum is the eighth most common plant pathogen in the world, and can cause a

variety of plant diseases of monocotyledonous and dicotyledonous plants worldwide. After being in⁃

fected by fungi of Colletotrichum, Panax plants suffer from yield damage and quality decline, directly

or indirectly leading to serious economic losses. This paper reviews the taxonomic development of

Colletotrichum on the Panax plants, pathogenic mechanism, and existing problems of the anthrac⁃

nose pathogen on Panax plants, and discusses future research directions of anthracnose pathogen in

Panax plants, in order to provide theoretical support for the systematic study of pathogenic mecha⁃

nism of anthracnose fungi and the prevention and control of diseases on Panax plants.

Key words:Panax;Colletotrichum; pathogenic mechanism; pathogenitic gene

1 人参属植物概况

人参属(Panax)植物最早由著名瑞典植物学

家卡尔·冯·林奈(C. Linné)于 18世纪初开始进行

相关分类学研究,并于 1735 年创立,其模式物种

为分布于北美洲的西洋参(P. quiquefolius),Panax

由希腊语中全面的(Pan)和药(Acos)组合而来,意

为“全面的药物”[1-2]

。1880 年,Jackson 将 143 种

植物归类到了人参属中,而随着分类学的不断进

步与完善,原先人参属植物中的多个种改归入

五加属(Eleutherococcus)、树参属(Dendropanax)、

幌 伞 枫 属(Heteropanax)等 其 他 属 中,如 今 一般

* 基金项目:吉林省科技发展计划项目(20230202104NC),吉林省教育厅项目(JJKH20220356KJ),国家中药材产业技术体系项目

(CARS-21),国家自然科学基金青年基金项目(31700010),“111基地”建设项目(D17014)

作者简介:杨一帆,男,硕士研究生,研究方向:植物病原菌的致病机制。

收稿日期:2023-11-10

** 通信作者:刘丽萍,E-mail:zhou_237@163.com;高洁,E-mail:jiegao115@126.com

第93页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

采 用 更 加 严 格 的 人 参 属 定 义(叶 轮 生、掌 状 复

叶 ;草 本 植 物)来 定 义 人 参 属 植 物,现 人 参属

仅 有 8 个 物 种,包 括 人 参(P. ginseng)、西 洋 参

(P. quinquefolius)、竹 节 参(P. japonicus)、三 叶 参

(P. trifolius)、假人参(P. pseudoginseng)、屏边三

七(P. stipuleanatus)、三七(P. notoginseng)以及羽

叶三七(P. bipinnatifidus)[3-6]

人参属植物主要分布于亚洲东部、北美洲东

部及北部,在我国具有丰富的人参属植物资源,且

自古以来人参属植物在中国的药用植物中都具

有非常高的药用地位,具有显著的医学利用价

值。研究表明,人参属各植物均含有各自的特色

化学成分,且都具有特色有效成分含量高、药理

活性广泛、分子多样性丰富等特点[7]

,其中人参、

西洋参与三七是人参属中药用最广泛、经济价值

最高的 3 种代表性植物,而其他的人参属植物则

因为经济价值低、分布范围小或者产量低等原因

被忽视。

2 炭疽菌属分类学的发展

1926年以前,由于植物学家在传统的半知菌

分类系统中根据原始的形态学和发育学特征各自

划分出了 Colletotrichum(狭义)以及与其无差别

的几个属,导致了炭疽菌属 Colletotrichum(广义)

在一段时间内的分类和命名一直处于混乱状态,

在 1926 年之后,Archer、Hemmi、Petra、Grove 等均

对炭疽菌属的分类及命名提出了新的见解,最终

在 1928 年至 1980 年,Duke、Arx 和 Sutton 等根据

国际植物命名法规(Intornational coda of botanical

nomenclature,ICBN)对炭疽菌属 Colletotrichum 做

了系统性研究,将 Colletotrichum 认定为唯一正确

属名,并将其他属下的一些种陆续归入其中[8-11]

2023 年 9 月,真菌名称数据库(http:∥www.

indexfungorum.org/)中共有炭疽菌属1 034条记录

(图 1),炭疽菌属中最早报道的记录是 1831 年

Corda 描述并命名的 Colletotrichum Corda。由图 1

可见,炭疽菌属的记录大部分产生于 20 世纪初,

2010年后报道迅速增多,2020年以后新物种的报

道趋缓。

目前,学者们共收集到 7 种能够在人参属植

物上引发病害的炭疽菌属真菌(表 1),由于其他

人参属植物研究甚少,均未查找到有炭疽菌属真

菌侵染的相关研究。

图1 真菌名称数据库中不同年份炭疽属物种的记录数量分布

Fig. 1 Distribution of number of Colletotrichum species and infraspecifc taxa recorded in Index Fungrum according

to the year of publication

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第94页

杨一帆,等:人参属植物炭疽病菌致病机制研究进展

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3 人参属植物炭疽病菌致病机制研究

进展

3. 1 炭疽病菌侵染致病过程

炭疽菌属真菌属于半活体营养型寄生微生

物,在侵入前期,处于活体营养寄生;随着时间推

移,侵染菌丝侵入植物细胞间隙,缓慢杀死寄主植

物,之后开始死体营养寄生。1996 年、1999 年,

Morin 等[22]

与 Smith 等[23]

分别研究了胶孢炭疽菌

和黑线炭疽菌的侵染过程,包括分生孢子对寄主

表面的黏附、分生孢子萌发、芽管及附着胞的形

成、侵染钉的分化以及对寄主表面的刺穿等过程。

Smith等[23]

研究指出,分生孢子长出芽管的位置不

固定,分生孢子上的任意点都能形成芽管,并且芽

管的生长没有特定的朝向,不会因为气孔在周围

而朝向气孔生长,从20 h开始,附着胞会形成侵染

钉穿透植物表皮,并在表皮细胞内部形成感染囊

泡,从这些感染囊泡中形成多节的初级菌丝,开始

感染邻近的表皮细胞,从40 h开始,最初被侵染的

表皮细胞被初生菌丝填满,开始产生次生菌丝,次

生菌丝呈分枝状,比初生菌丝更细,在细胞间和细

胞内快速生长,从一个表皮细胞穿过细胞壁到下

一个表皮细胞,由此开始死体营养阶段。2017年,

De Silva 等[24]

发现,在炭疽菌属真菌侵染植物的

前段时间内,不同种的炭疽菌具有不同的侵染类

型,许多学者认为,胶孢炭疽菌是典型的半活体

营养型真菌,在感染的植物内能观察到细胞内半

活体营养和壁内坏死性感染[25-27]

,在最初感染的

表皮细胞上形成感染囊泡和菌丝,随后进入坏死

阶 段[27-28]。 但 是 ,2004 年 Barhoom 等[29]认 为,

胶孢炭疽菌同时有 2 种侵染类型“pathogenic”和

“saprophytic”,“pathogenic”萌发通常发生在植物

上或疏水表面,其特征是快速的有丝分裂,然后形

成单个芽管,该过程在诱导后就会立即启动开始

萌发,并在 4 h 内终止;“saprophytic”萌发主要发

生在营养丰富的培养基中,需要更长的萌发时间,

其特征是从孢子的相反两侧形成 2 个芽管,这些

芽管不会形成附着胞,因此以这种方式萌发的孢

子无法感染植物。这2种萌发方式受不同的信号

通路调控:“saprophytic”通过cAMP通路控制孢子

萌发,而“pathogenic”萌发与cAMP通路无关,但与

稻瘟病菌相似,分生孢子萌发后附着胞的形成阶

段也同样需要cAMP通路来调控。

3. 2 人参属植物炭疽病菌致病相关基因的研究

随着各种遗传转化技术的进步和基因组测序

技术的发展应用,人参属植物炭疽病菌的致病相

关基因先后被报道。致病相关基因研究较多的是

胶孢炭疽菌和希金斯炭疽菌,其次是球炭疽菌。

截至目前,人参属植物炭疽菌上鉴定的与致病相

表1 导致人参属植物病害的炭疽菌属真菌

Table 1 Colletotrichum fungus causeing diseases on Panax plants

寄主

P. ginseng

P. quinquefolius

P. notoginseng

真菌

C. panacicola

C. lineola

C. coccodes

C. higginsianum

C. dematium

C. dematium

C. coccodes

C. sojae

C. gloeosporioides

C. panacicola

发展历程

1922年Nakata和Takimoto报道了C. panacicola,并命名为叶枯病,早期C. panacicola与

C. gloeosporioides被认为是同种病原菌,导致一些病原为C. panacicola的炭疽病被鉴定

为C. gloeosporioides,随着研究深入,2个种被分离开来,1960年Bunkina等与Edel'shteín

等发现C. panacicola会在6月开始出现症状,7-8月出现大规模传染,除人参属外,对其

他属植物基本无致病性,其发病时大概率会伴随着人参链格孢菌(Alternaria panax)一

起发生

2020 年 Liu 等报道了在东北人参产区的人参中分离到了232株炭疽菌,经过ITS、

GADPH、TUB2等序列分析,发现其中97株属于C. lineola,135株属于C. panacicola

2011年 Choi等在人参上接种了许多不同炭疽菌,发现 C. higginsianum(C97027)以及

C. coccodes(C96002)可以从伤口侵入,在人参上引发炭疽病,但若人参没有伤口则无法

发病

2004年Han等在韩国国内首次报道了由C. dematium引起的人参炭疽病

1998年Amrita和Hosoya发现西洋参中的2种炭疽病病原菌:C. dematium和C. coccodes

2019年Guan等在中国吉林省观察到3年西洋参炭疽病,在30 hm2

的农田中,>36%的植

物被感染,在其中共分离到15株炭疽菌,鉴定为C. sojae

2017 年 Wei 等通过将叶片穿孔和褐化的三七叶片上的病原分离和鉴定,发现了

C. gloeosporioides与C. panacicola

文献来源

[12-17]

[12]

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[18]

[19]

[20]

[21]

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吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

关的基因已有多达百余种,作用在炭疽病菌的各

个侵染过程中,涉及的功能有:分生孢子的产生与

萌发,附着胞的形成及黑化,附着胞穿透,炭疽菌

活体营养到死体营养阶段的转换,以及在此过程

中相关蛋白的分泌和酶的活性等(表2,表3)。

3. 2. 1 分生孢子在表面定殖及萌发 炭疽病菌

侵染植物要在植株表面定殖,而定殖分为两步,首

先要求分生孢子停留在人参属植物组织表面,然

后在植物表面萌发,最后形成正常的附着胞[30]

1995 年,Hwang 等[31]

在胶孢炭疽菌上发现,

cap20基因在其侵染宿主时在体内表达,是寄主表

面蜡质诱导表达的附着胞形成基因,缺失时会导

致致病性丧失。1998年,Liu等[32]

发现,泛素结合

酶蛋白 Chip1可调控孢子萌发与附着胞形成时蛋

白质的降解。2000 年,Kim 等[33]

报道了胶孢炭疽

菌中的 CgMEK1 基因影响附着胞的正常分化,即

分生孢子是否有能力形成正常的附着胞。2008年,

Barhoom等[34]

发现了一个假定的液泡铜离子转运

蛋白 CgCTR2,这个基因会调控孢子的萌发及孢

内铜离子的平衡,如果这个基因缺失,会导致超氧

化物歧化酶(SOD)的活性降低,孢子萌发率降低,

对植物的毒性也会降低,但在附着胞的形成和侵

入方面不会出现任何缺陷。2013年,Yong等[35]

道有丝分裂激活蛋白激酶基因 Cgl-SLT2 与胶孢

炭疽菌产孢、极性生长、附着胞形成和致病性都

相关,这个基因缺失后会导致致病性丧失;同年

Shnaiderman 等[36]

发现,AMET、MEPB 基因的表达

与分生孢子的定殖有很大关系,这 2 个基因的缺

失会造成孢子在植物表面的定殖分别减少 45%

和 75%。2016 年,Wu 等[37]

探究了胶孢炭疽菌多

个 基 因 功 能 ,其 中 CgMCT1,CgRRN3,CgGD1,

Cgcon1,CgCOP9,CgMRP1,CgBBD1,Cgcon3 和

CgOPT2 共同调控分生孢子的形成与形状,其中

一些基因的缺失会导致分生孢子的形状变异,最

终导致分生孢子无法正常附着及萌发,一些基因

的 缺 失 甚 至 会 导 致 分 生 孢 子 无 法 正 常 形 成。

2016 年,Xu 等[38]

报道了 CgRhoB 基因缺失突变体

的分生孢子形成正常,但孢子萌发会受到抑制。

2017 年,Bi 等[39]

及吴曼莉等[40-42]

报道了 CgareA、

CgRGS2 和 CgRGS7 基因参与调控胶孢炭疽菌的

分生孢子形成及萌发,附着胞形成及细胞壁完整

性,对其致病性具有一定的影响;同年 Zhou 等[43]

发现,CgABCF2基因的缺失会造成分生孢子形成

大量减少,且∆cgabcf2突变体不能形成附着胞,失

去侵染能力;Liu 等[44]

报道了 CgRGS1 基因控制

着分生孢子的形成,突变体分生孢子产量明显减

少。2018 年后,对于胶孢炭疽菌的致病基因探

索开始了井喷式发展,学者们发现在胶孢炭疽菌

中 CgRGS3,Cgpel3,CgUBCs,CgAAP,CgUbl4,

CgUBC22,CgbHLH6,CgNSPG1,Cglac3,Cglac7,

CgNPG1,CgSho1,CgMsb2,CgSat4,CgNOXA,

CgNOXB,CgNOXR,CgCdc42,CgGCS,CgPpz1 和

CgFim1 直接或间接控制着分生孢子的形成、萌

发、附着胞形成等功能,如果缺失其中某个基因,

大多最后只能导致病原菌的致病能力有所下降,

而附着胞形成相关的基因的缺失,多数都会直接

导致致病性丧失[45-59]

在希金斯炭疽菌中,2016 年,Yuan 等[60]

发现

ChSte7 基因缺失时无法形成正常附着胞,也就自

然无法侵染寄主。2017年,Schmidpeter等[61]

报道

了 ChMob1 与 ChMob2 基因对希金斯炭疽菌的产

孢、孢子萌发、隔膜的形成及对拟南芥的致病性有

影 响。2017 年,Gu 等[62]对 希 金 斯 炭 疽 菌 中 的

ChRgf 基因做了相关研究,发现其与孢子附着能

力有关,基因缺失时孢子无法附着在疏水表面,从

而减少了致病性。2019 年,Zhu 等[63]

在 cAMP 信

号通路中挑选了关键基因 ChCAP,cAMP 信号通

路主要参与炭疽菌的孢子发育、附着胞发育及黑

化等过程,ChCAP 基因缺失会导致分生孢子和菌

丝生长速率降低;同年Fukada等[64]

报道了能干扰

希金斯炭疽菌有丝分裂的 ChBUB2 基因,缺失突

变体有丝分裂的 S 期起始较早,导致分生孢子隔

膜形成受损,致病力显著降低。2022 年,祝一鸣

等[65]发 现,定 位 于 细 胞 质 和 细 胞 膜 上 的 基 因

ChEP085与希金斯炭疽菌的孢子产量有关。

3. 2. 2 附着胞穿透植物细胞角质层 植物病原

真菌主要有 2 种穿透寄主角质层的机制:酶解反

应和机械穿透。与其他侵染植物的病原真菌一

样,炭疽菌会分泌果胶酸裂解酶(Pectate lyase)、

内聚半乳糖醛酸酶(Endopoly galacturonase)和果

胶裂解酶(Pectin lyase)等蛋白水解酶,这些必需

的蛋白水解酶可以在感染和定殖过程中降解宿主

细胞壁中的多糖[43]

。1986 年,Dickman 等[66]

发现

胶孢炭疽菌可以通过分泌角质酶穿透番木瓜的角

728

第96页

杨一帆,等:人参属植物炭疽病菌致病机制研究进展

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

质层进行侵染,角质酶缺失的胶孢炭疽菌突变体

菌株不能感染无损伤的植物表皮。然而,当提前

对植物表皮进行机械损伤或采用角质酶预处理后

再接种突变体时,会产生明显的炭疽病病斑,从而

证明角质酶降解角质层对胶孢炭疽菌的致病至关

重要。2001 年,Yakoby 等[67]

发现 pelB 基因敲除

后,胶孢炭疽菌不能产生果胶裂解酶 B (Pectate

lyase B),且果胶裂解酶的活性比野生型低 25%,

但聚半乳糖醛酸酶(Poly galacturonase)活性比野

生型高 15%,并且宿主的苯丙氨酸解氨酶活性提

高,使宿主具有更高的抗性。2013年,Alkan等[68]

发现在胶孢炭疽菌侵染过程中,转录因子pacC显

著激活了一些降解酶的产生,对关键致病基因可以

整体的正向调控。而在球炭疽菌 C. coccodes 中,

2012 年,Ben-Daniel 等[69]

则发现 pelA 基因的缺失

会导致果胶酶的分泌减少,最终导致致病力降低。

另一种机制是由于附着胞在植物角质层上产

生膨压从而穿透角质层,有研究认为,附着胞胞壁

沉积的黑色素和高强度的压力对炭疽病菌的致病

力影响非常大[70]

。黑色素的合成与附着胞形成

几乎是同步进行,附着胞壁层中的黑色素层为附

着胞膨压的形成提供先决条件[71]

,并且附着胞需

先进行黑化,才能有足够压力产生穿透孔形成侵

染钉、侵染囊泡。在胶孢炭疽菌中,2000 年,Ste⁃

phenson等[72]

发现 CgDN3基因在附着胞穿透植物

表皮的过程中发挥作用,其主要在侵染囊泡中表

达,CgDN3敲除突变体产生的孢子在叶片表面能

正常萌发形成附着胞,但不能在完整、健康的寄主

叶片上感染和繁殖,当分生孢子直接接种到伤口

部 位 时 ,突 变 体 又 能 够 在 叶 片 上 致 病 ,说 明

CgDN3 在产生物理机械压力时(侵染囊泡产生

时)发挥作用。2002年,Goodwin等[73]

发现胶孢炭

疽菌的非发酵蔗糖(SNF1)相关蛋白激酶 Cgsnf基

因参与调控了附着胞穿透过程。2009年,Chagué

等[71]

报道 CGOPT1 缺失导致孢子形成受损,还会

导致附着胞黑化减少。2018年,Fang等[74]

发现了

3个与机械压力相关的基因,CgMCK1、CgMkk1和

CgMps1,3个基因缺失后会表现出相似的缺陷,即

在细胞壁完整性和对渗透压力上表现出显著缺

陷,突变体会失去形成压迫的能力,并完全失去对

寄主植物的致病性。2019年,Li等[75]

证实 CgAzf1

基因参与黑色素的产生[75]

。2020 年,Wang 等[76]

发现 Cgscd1 基因在黑色素形成和侵染菌丝形成

时发挥作用;同年,Wang等[77]

报道 CgCrzA基因对

细胞壁完整性极其重要,缺失后完全无法形成侵

染结构。2021 年,Wang 等[53]

对附着胞形成基因

CgMk1

[78]

的上游调控基因进行了研究,发现了2个

信号识别基因 CgSho1 和 CgMsb2,CgSho1 不能单

独激活 CgMk1,而是与 CgMsb2 合作激活 CgMk1,

这2个基因对附着胞形成、附着胞穿透能 力 有 较

大 影 响 ;同 年 Wang 等[79]报 道 了 CgEnd3 基 因

同 时 在 附 着 胞 形 成、黑 化、机 械 压 力 的 积累、

附着胞穿透能力等方面发挥作用。2022 年,Gao

等[80]

发现 CgHSF1 基因缺失时黑色素生物合成

缺陷严重,病原菌致病性降低。以上研究表明,

黑色素合成障碍以及渗透压力缺陷的突变体都

会导致突变体在健康植株上没有或几乎没有感染

能力。

在希金斯炭疽菌中,2012 年,Takahara 等[81]

利用根癌农杆菌介导的转化对希金斯炭疽菌进行

随机插入突变,获得了 2 个精氨酸缺陷营养突变

体 path-19 和 path-35,这 2 个突变体的渗透和侵

袭生长能力降低,在提供 L-精氨酸后,侵染能力

恢复。因此,可以知道精氨酸的生物合成对于炭

疽菌的侵染是必不可少的。2013年,刘丽萍[82]

用对Ch-MEL1基因的敲除和互补技术,验证了该

基因与希金斯炭疽菌的附着胞黑色素化、附着胞

对寄主的侵入能力及侵染菌丝的产生能力密切相

关。2015年,Korn等[83]

在希金斯炭疽菌中发现了

与附着侵入能力相关的基因 ChPma2,其基因缺

失突变体能够形成完全黑化的附着体,并且附着

胞能够产生与野生型相当的膨压,但完全不能穿

透宿主组织。2016年,Wei等[84]

研究发现 ChMK1

基因与病菌的生长、细胞壁完整性、菌落黑化和致

病性有关;同年 Takahara 等[85]

研究发现了 2 个与

希 金 斯 炭 疽 菌 附 着 胞 产 生 渗 透 压 相 关 的 基 因

ChELP1 与 ChELP2,这 2 个基因缺失时菌丝会停

留在宿主细胞表面团成球状,但无法侵入。2017

年,Liu等[86]

报道了ChMfs1基因,其缺失突变体在

拟南芥叶片上形成附着胞后,侵入菌丝无法分化

成大的初生菌丝和细的次生菌丝,而是在表皮细

胞中形成大量的球根状菌丝。2019年,皮磊[87]

过ATMT技术分别获得了ChEP011和ChEP113基

因敲除突变体,研究发现,与野生型菌株相比,

729

第97页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

ChEP011 和 ChEP113 都会导致菌丝黑色素减少,

生长速率减慢,产孢量和菌丝干重增加,且菌丝尖

端变笔直,分叉变少,但并不影响菌丝机械穿透

力,其中 ChEP011基因敲除突变体基本不影响对

拟南芥的致病性,ChEP113 基因敲除突变体大部

分孢子萌发只在一侧产生芽管,不产生黑化附着

胞,但仍有小部分孢子可以正常萌发产生黑化附

着胞,对拟南芥的致病性减弱。2019年,Gu等[88]

也报道了 ChAcs1 基因会影响希金斯炭疽菌的脂

质代谢、碳源利用及其致病力,缺失时会导致附着

胞没有足够压力穿透植物表皮。2020—2021年,

Yan等[89-90]

发现ChCDC25基因的缺失突变体在拟

南芥叶片上的菌丝生长、分生孢子产生、分生孢子

萌发、附着胞形成和侵入性菌丝生长方面存在缺

陷,最终导致毒力损失,并分析了酰基辅酶A结合

蛋白(ACBPs)主要参与真核细胞中酰基辅酶A酯

的结合和运输,可能与致病相关,于是在希金斯炭

疽菌中对相应基因进行了验证,发现了ChAcb1的

缺失会导致营养生长和分生孢子的缺陷,显微镜

检查显示其在压迫渗透和感染生长方面存在缺

陷。2023 年,段灵涛等[91-92]

报道了 2 个自噬基因

ChAtg8、ChAtg26 的缺失会导致希金斯炭疽菌的

黑色素合成能力丧失,而在进一步对黑色素合成

通路的研究中发现,聚酮合成酶基因 ChPKS的缺

失同样会使其附着胞丧失黑化能力,完全失去侵

染功能;同年,祝一鸣等[93-94]

通过与其他炭疽菌中

黑色素合成相关基因比对,发现了希金斯炭疽菌

中的Chthr1基因,缺失突变体的黑色素合成减少,

致病性丧失,同时还发现 Ch174 基因参与附着胞

的形态建成,敲除Ch174基因后,突变体菌株产生

的附着胞不能正常产生侵入钉,无法正常穿透植

物表皮细胞,完全丧失侵染能力。

表2 希金斯炭疽菌致病相关基因

Table 2 Pathogenic genes relqted to Colietotrichum higginsianum

基因

path-19

path-35

Ch-MEL1

ChPma2

ChSte7

ChMK1

ChELP1

ChELP2

ChMob1

ChRgf

ChMfs1

ChMob2

ChCbk1

ChPKA1

ChAcs1

ChCAP

ChBUB2

ChEP113

ChCDC25

ChHxt4

ChHxt6

ChAcb1

ChEP085

ChAtg26

Chthr1

ChAtg8

ChPKS

Ch174

相关功能

分生孢子萌发、侵染时压力的产生

分生孢子萌发、侵染时压力的产生

附着胞黑化、侵染时压力的产生、侵染菌丝形成

侵染钉穿透宿主表皮细胞

附着胞形成

附着胞黑化、菌丝生长

侵染时压力的产生

侵染时压力的产生

分生孢子形成、分生孢子萌发、隔膜形成

孢子附着能力

侵入菌丝分化

分生孢子萌发、侵染时压力的产生

分生孢子形成、隔膜形成

分生孢子形成、菌丝生长、侵染时压力的产生

侵染时压力的产生

分生孢子形成、菌丝生长

隔膜形成

附着胞黑化

菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成、侵入性菌丝生长

初生菌丝、次生菌丝形成

次生菌丝形成

侵染时压力的产生

分生孢子形成

分生孢子形成、附着胞黑化

附着胞黑化

附着胞黑化

附着胞黑化

附着胞形成、侵入钉形成

编号

CH063_11554

CH063_15109

未知

CH063_09060

CH063 02455

CH063_08490

CH063_13023

CH063_04445

CH063_02209

CH063_04363

CH063_12120

CH063_12012

CH063_12968

CH063_00098

CH063_08070

CH063_04510

CH063_01076

CH063_00125

CH063_04363

CH063_05768

CH063_13236

CH063_07803

CH063_11815

CH063_01732

CH063_08913

SCEN_B00400

GLRG_04203

未知

发表年份

2012

2012

2013

2015

2016

2016

2016

2016

2017

2017

2017

2017

2017

2017

2019

2019

2019

2019

2020

2021

2021

2021

2023

2023

2023

2023

2023

2023

参考文献

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730

第98页

杨一帆,等:人参属植物炭疽病菌致病机制研究进展

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

4 基因组测序

全基因组测序是对未知基因组序列的物种进

行个体的基因组测序,以得到微生物的全部基因

序列,通过全基因组测序与比较基因组学分析,不

仅可以将各个种间的致病基因相互联系起来,发

现基因间的相互作用,还能发现新的致病基因。

随着测序技术的不断进步以及生物信息分析技术

的迅猛发展[97]

,已有部分人参属炭疽病菌完成全

基因组测序,截至目前,在 NCBI数据库中公开的

人参属炭疽病菌全基因组组装数据有23条,包括

胶孢炭疽菌、希金斯炭疽菌、球炭疽菌和 C. sojae

(表4),从基因组水平分析致病机制成为了现实,

2012 年,O'Connell 等[98]

通过比较希金斯炭疽菌

C. higginsianum 与禾生炭疽菌 C. graminicola 基因

组数据,发现希金斯炭疽菌中编码效应蛋白、果胶

降解酶、次级代谢酶、转运蛋白和肽酶的基因家族

相较于禾生炭疽菌更大,并且分析了炭疽菌从活

体营养型转换到死体营养型的机制,发现炭疽菌

在活体营养阶段,效应蛋白和编码次级代谢的酶

对致病起主要作用,而在死体营养阶段,多数水解

酶和转运蛋白则发挥重要作用。

表 3 胶孢炭疽菌致病相关基因

Table 3 Pathogenic genes related to Colietotrichum gloeosporioides

基因

cap20

CgMEK1

CgDN3

pelB

CGOPT1

转录因子pacC

AMET

MEPB

Cgl-SLT2

CgRhoB

CgABCF2

CgareA

CgMK1

CgRGS1

CgCdc42

CgMCK1

CgMkk1

CgMps1

CgAzf1

CgGCS

Cgscd1

CgCrzA

CgNPG1

CgSho1

CgMsb2

CgEnd3

CgHSF1

CgSat4

CgNOXA

CgNOXB

CgNOXR

CgPpz1

CgFim1

相关功能

附着胞形成

附着胞形成

侵染时压力的产生

降解酶的产生

附着胞黑化

降解酶的产生

孢子在植物表面的定殖

孢子在植物表面的定殖

分生孢子形成、菌丝生长、附着胞形成

分生孢子萌发

分生孢子形成、菌丝生长、附着胞形成

分生孢子形成、氮代谢的调节

附着胞形成

分生孢子形成、分生孢子萌发

分生孢子形成、菌丝生长

侵染时压力的产生

侵染时压力的产生

侵染时压力的产生

分生孢子形成、分生孢子萌发、附着胞黑化

分生孢子形成、分生孢子萌发

附着胞黑化、侵染时压力的产生

细胞壁完整性、侵入性结构的形成

分生孢子形成、分生孢子萌发、菌丝生长

附着胞形成、附着胞穿透能力

附着胞形成、附着胞穿透能力

附着胞形成、附着胞黑化、附着胞穿透能力

附着胞黑化

分生孢子形成

附着胞形成

附着胞形成

附着胞形成

分生孢子萌发

附着胞的极性生长和发育

编号

ERS239662_02433

AAD55385

AAB92221

AAD09857.1

FJ008981

未知

GH270297

AFC37778

AFD31817

CGLO_07699

KX755251

EQB57057

未知

KY861062

CDC42_COLGL

未知

未知

未知

AUS82351

CGLO_07573

QID98947

APU53507

未知

CGLO_14158

CGLO_16512

CGLO_08955

未知

未知

未知

未知

未知

CGGC5_v015588

未知

发表时间

1995

2000

2000

2001

2009

2013

2013

2013

2013

2016

2017

2017

2017

2018

2018

2018

2018

2018

2019

2019

2020

2020

2021

2021

2021

2021

2022

2022

2022

2022

2022

2022

2022

参考文献

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731

第99页

吉林农业大学学报 2023 年 12 月

Journal of Jilin Agricultural University 2023,December

5 问题与展望

炭疽菌属(Colletotrichum )真菌引起的人参

属植物炭疽病是近些年来发生较严重的人参病害

之一,发病后常会造成人参属植物产量下降、品质

降低,同时成为下一年的初侵染来源,若气候条件

适宜,将会导致人参炭疽病的流行,造成严重经济

损失。近些年来,学者对人参属植物病害鉴定与

分类、生物学特性、基因功能验证、炭疽病菌的全

基因组测序以及炭疽病的防治技术进行了诸多研

究,但仍存在不足。由于早期分类学混乱导致某

些炭疽病菌鉴定错误、种类混淆,造成人参炭疽病

化学药剂防治不精准。原因是不同种类的炭疽病

菌对同一药剂的敏感性不同,例如张琳等[99]

研究

发现人参生炭疽菌与线列炭疽菌对不同药剂的敏

感性存在差异。

炭疽菌属真菌对人参属植物的致病是十分复

杂的过程,主要包括分生孢子对寄主表面的黏附、

分生孢子萌发、芽管及附着胞形成、侵染钉分化、

穿透后形成感染囊泡和初生菌丝以及活体营养型

到死体营养型的转变等过程,每个过程对于炭疽

病菌的侵染都十分重要,且各阶段均包含炭疽病

菌与寄主之间的互作,涉及到不同的基因参与,且

部分基因已被克隆及验证。截至目前,在炭疽病

菌的侵染过程中,附着孢的形成与黑化以及侵染

时压力的产生,对病原菌的致病性是必不可少的,

缺失时会导致炭疽病菌完全丧失毒力。但寄主植

物的抗病机制的研究较少,炭疽病菌与人参属植

物的互作尚未研究。各个侵染过程都具有大量相

应基因被发现,但是活体营养与死体营养的转变

过程基因研究尚少,仅有个别基因被发现[100-102]

因此,针对炭疽菌从活体营养阶段转变到死体营

养阶段的基因功能验证仍是科学工作者的研究

难点。

对抗炭疽病的方式主要是喷洒化学农药和种

植抗病品种,但由于病原菌可以很快适应传统的

抗病基因调控的抗病策略,导致化学农药失效,农

表4 人参、西洋参和三七炭疽病菌全基因组组装数据

Table 4 Whole genome assembly data of Colletotrichum spp. on P. ginseng, P. quinquefolius and P. notoginseng

真菌名称

C.coccodes

C.gloeosporioides

C.higginsianum

C.sojae

菌株

CCND04

NJ-RT1

RP180a

JS-0417

CgDa01

GZ15

TYU

CgLH19

Cg01

hn1205-1

30206

ES026

KY332

COLG-95

Lc1

SMCG1#C

23

Cg-14

MI 349063

MAFF305635-RFP

MAFF 245053

MI 349063

CSOJ01

基因组大小/Mb

50.24

50.12

51.50

65.36

62.78

57.84

53.01

55.56

55.77

57.15

57.60

58.52

58.00

53.72

61.90

61.92

58.84

53.21

49.08

49.79

49.07

50.72

49.35

基因组GC值/%

53.80

53.80

53.50

34.10

50.10

51.60

49.60

52.40

52.90

52 50

53 20

51.60

52.30

52.40

50.80

50.30

52.30

53.40

55.10

54.60

54.30

54.41

55.90

基因组编号

GCA_020466075.1

GCA_002249775.1

GCA_002249805.1

GCA_029169055.1

GCA_021650765.1

GCA_027406185.1

GCA_002901105.1

GCA_011947415.1

GCA_003666125.1

GCA_019022565.1

GCA_002189585.1

GCA_003568745.1

GCA_014705165.1

GCA_011428055.1

GCA_011800055.1

GCA_003243855.1

GCA_021432615.1

GCA_000446055.1

GCA_000313795.2

GCA_004920355.1

GCA_023705605.1

GCA_001672515.1

GCA_014235955.1

732

第100页

杨一帆,等:人参属植物炭疽病菌致病机制研究进展

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

药用量越来越多、使用频率越来越频繁,造成人参

品质下降。随着基因组学技术的进步,现已有部

分炭疽病菌的全基因组测序组装完成,需要充分

利用现有炭疽病菌全基因组测序组装信息,从分

子角度对炭疽病菌侵染过程中各个阶段进行分析

研究,预测其他未知致病基因。同时进行炭疽病

菌的遗传转化体系建设,用于基因功能验证,从更

高层次上掌握其致病机制及规律,从而发展新的

诊断、预防及治疗人参属植物炭疽病的方法。

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733

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