二、研究成果

46

Propionate 19.70±1.7b 20.38±1.32ab 21.88±2.13a 0.028

Isobutyrate 1.81±0.23c 3.05±0.30b 3.71±0.26a <0.001

Butyrate 13.82±1.33c 17.30±1.13b 20.53±1.04a <0.001

Isovalerate 2.88±0.30c 3.64±0.42b 4.73±0.44a <0.001

Valerate 1.54±0.17c 2.10±0.14b 2.38±0.11a <0.001

Acetate: propionate ratio 3.08±0.31a 2.39±0.19b 2.40±0.32b <0.001

3.3、对瘤胃微生物组成的影响

日粮中提高完整和粉碎亚麻籽能够影响瘤胃菌群的组成，瘤胃菌群组成如

图 1 所示。在门水平上，如图 1A 所示，与 CK 组相比，WF 与 GF 组中

Bacteroidetes 的丰度显著下降，其中 GF 组丰度最低（CK：64.77%, WF：

56.53%, GF：42.84%）。而与 CK 组相比，WF 与 GF 组中 Firmicutes 的丰度显

著升高，其中 GF 组丰度最高（CK：26.69%; WF：37.28%; GF：47.31%）。日

粮中添加粉碎亚麻籽能够改变瘤胃中主导的菌，由 Bacteroidetes 转化为

Firmicutes。在属水平上，如图 1B 所示，日粮添加亚麻籽能够降低

Succiniclasticum （P = 0.005）、Prevotellaceae_UCG-001（P < 0.001）、

Treponema_2（P < 0.001）和 Fibrobacter（P < 0.001）的丰度，变化趋势呈 CK

＞WF＞GF；然而能够提高 Ruminococcaceae_NK4A214_group（P < 0.001）、

Christensenellaceae_R-7_group（P = 0.001）、

Eubacterium_coprostanoligenes_group（P = 0.005）、 Candidatus_saccharimonas

（P = 0.002）的丰度，变化趋势呈 CK＜WF＜GF。

Ruminococcaceae_NK4A214_group 是已知的具有生物氢化的菌，本试验也有同

样发现，除了 Ruminococcaceae_NK4A214_group，Christensenellaceae_R7_group 和 Eubacterium_coprostanoligenes 也可能是潜在的生物氢化菌。同时也

有可能是由各具有生物氢化功能的菌的互相协作发挥生物氢化功能。

二、研究成果

47

图 1（A）门水平上细菌群落的相对丰度（仅列出前 10 个丰度门）。（B）

属级细菌群落的相对丰度（仅列出前 10 个丰度属）。

使用 PCoA 对三组的 OTU 进行分析，结果如图 2A 所示，PCo1=29.98%

PCo2=15.28%，其中 CK 与 GF 组能够很好的区分，CK 组样本全部位于 PCo1

负值一侧，而 GF 组样本主要位于 PCo1 正值一侧。而 WF 组与 CK 组和 GF 组

均不能区分。使用 ANOSIM 检验同样也发现三组差异极显著（R = 0.598; P =

0.001），CK 与 GF 组在 PCoA 图上确实能够很好的区分。

图 2（A） 瘤胃细菌样品的主成分分析；（B） 三组细菌属的相似性。

二、研究成果

48

4、结论：

不同形式亚麻籽中 ALA 的释放是不同的，完整亚麻籽中 ALA 释放时间比

粉碎亚麻籽时间长，这样会导致瘤胃中 ALA、EPA 与 n-3 UPFA 的含量保持在

较高的水平，但是瘤胃中 VFA 主要与瘤胃中 ALA 的释放量有关。每天奶牛摄

入 1500g 粉碎亚麻籽能够在门水平上改变瘤胃主导菌群。在属水平上，

Ruminococcaceae_NK4A214_group 是已知的具有生物氢化的菌，本试验也有同

样发现，除了 Ruminococcaceae_NK4A214_group、Christensenellaceae_R7_group、Eubacterium_coprostanoligenes 也可能是潜在的生物氢化菌。

研究成果已于 2021 年 11 月发表在《Frontiers in Microbiology》杂志。该成

果由国家重点研发计划、中国农业科学院农业科技创新工程重大产出科研选

题、中国农业科学院科技创新工程和现代农业产业技术体系专项资金资助，第

一作者为黄国欣，通讯作者为王加启，张养东。

——Guoxin Huang, Liya Guo, Xiaofeng Chang, Kaizhen Liu, Wenhao Tang, Nan

Zheng, Shengguo Zhao, Yangdong Zhang and Jiaqi Wang. Effect of Whole or Ground

Flaxseed Supplementation on Fatty Acid Profile, Fermentation, and Bacterial

Composition in Rumen of Dairy Cows. Frontiers in Microbiology 2021, 12:760528.

二、研究成果

49

糖蜜对苜蓿青贮发酵品质、微生物及口感的影响

一、研究背景

苜蓿因其良好的适口性和较高的蛋白质含量被认为是一种有前景的反

刍动物优质饲料，但在潮湿和多雨的气候条件下，容易因需氧变质而造成

营养损失，需要有效的保存方法。青贮是降低苜蓿营养损失、提高采食

量、获得长期保存的可行方法，在厌氧条件下通过自发乳酸(LA)发酵。随

着乳酸菌(LAB)的快速增殖，原料中的碳水化合物转化为以 LA 为主的有机

酸，导致 pH 迅速降低，抑制有害微生物的生长，最终获得了饲料保存的

稳定条件。在青贮过程中，足够的可发酵碳水化合物作为前期可发酵的底

物对 LA 的生产至关重要，降低了 pH 值，提高了青贮品质。然而，由于苜

蓿可发酵碳水化合物含量不足，且其缓冲能力(BC)较大，单独使用苜蓿难

以获得具有竞争力的发酵品质饲料。

前期研究表明，用玉米、甜高粱等高糖饲料作为青贮苜蓿可显著提高

苜蓿青贮发酵品质。另一种策略是添加廉价的外源糖添加剂，如糖蜜，它

已被广泛用于加速发酵和提高苜蓿青贮的质量。糖蜜添加不仅为 LA 的快

速积累和 pH 值的急剧降低提供了充足的底物，而且增加了微生物蛋白的

合成，提高了营养品质。前期研究表明，糖蜜添加改善了苜蓿混合青贮发

酵品质，添加 2.5%糖蜜比添加 5.0%糖蜜更适合实际应用。相反，其他研

究发现糖蜜添加增加了苜蓿青贮的有氧稳定性，但对发酵品质没有影响。

因此，对糖蜜添加苜蓿青贮发酵品质的研究还不够充分，存在争议。

此外，青贮饲料的口感在青贮后会发生变化，往往会提高适口性，但

有关苜蓿青贮饲料口感的资料很少。电子舌感应系统(e-tongue)是一种客观

的味觉评价方法，它能提供更接近人类感官评价的味觉结果。电子舌的工

作原理是，味觉物质与传感器膜相互作用时，测量传感器外膜边界与参比

电极之间的电极电位，并通过模式识别方法将电位变化转化为味觉信息，

对基本的味觉进行分类和识别，如酸味、咸味、苦味和鲜味。虽然电子舌

二、研究成果

50

已广泛用于食品和饮料、制药工业以及环境和发酵监测，但尚未扩展到饲

料加工行业。

本研究的目的是研究添加糖蜜后苜蓿青贮的发酵品质，并为实际应用

实现长期保存，包括化学成分、发酵特性和微生物群落。电子舌首次用于

饲料加工，用于评价苜蓿青贮饲料的味道。

二、实验方法

1、苜蓿的收获和青贮的准备

在天津梦得奶牛场种植的苜蓿，于第五茬次(294.90 g kg -1 干物质

(DM))时收割。新鲜的苜蓿用镰刀在离地约 8～10 厘米处手工切下，然后

用切纸机切成 2～3 厘米。从当地市场获得糖蜜(锤度为 87%)，作为苜蓿青

贮的添加剂。将切碎的苜蓿混合，分成等量处理：新鲜苜蓿在未添加糖蜜

(对照)、添加 1%糖蜜(M1)、添加 2%糖蜜(M2)和添加 3%糖蜜(M3)条件下

青贮发酵 206 天。每个处理的饲料混合料 3.3 kg 装入 4.9 L 聚乙烯发酵罐

中，用螺旋盖和塑料带密封，室温(21～25℃)保存。每个处理包含 6 个发

酵罐。

2、发酵特性

首先，用 20 克的新鲜苜蓿青贮和 130 mL 超纯水混合均匀放入 4°C 搅

拌机里摇 24 小时，然后用 4 层的无菌粗纱布过滤到烧杯里，再用定量滤纸

过滤到三角瓶中，留着测定发酵特性。

用玻璃电极 pH 计，采用伏安法立即测定滤液的 pH 值。LA 的测定采

用 Waters Acquity UPLC 系统，配备 Waters 2489 紫外/可见检测器和 HSS

T3 色谱柱(2.1×100 mm，1.8 μm)。分析条件如下：烘箱温度 35℃；流动相

A, 0.1%磷酸；流动相 B，甲醇；流速：0.2 mL/min；进样量，5μL。乙酸

(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)的测定采用美国 Agilent 7890A 气相色谱系

统，FID 检测器，FFAP 色谱柱(15m×0.32mm×0.25μm)。分析条件如下：入

口温度为 250°C；载气压力为 He 19.991 kPa；进样量为 2μL。

二、研究成果

51

3、化学成分

用苯酚-次氯酸钠法测定滤液中 NH3-N 含量。新鲜的苜蓿和青贮样品

在 65°C 的烘箱中干燥 48h，计算干物质（DM）；然后，样品通过粉碎机

粉碎后过 1mm 筛，用于化学成分分析。

粗蛋白(CP)测定采用凯氏定氮法，按 AOAC 标准程序进行；中性洗涤

纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的测定采用纤维分析仪；水溶性碳水化合

物(WSC)含量采用蒽酮比色法测定。

4、DNA 提取

使用 HiPure Stool DNA 试剂盒从每个青贮样品中提取微生物 DNA。取

10 g 样品与 90 mL 无菌生理盐水混合，用纱布过滤，离心。

5、PCR 扩增及 16S rRNA 测序

采用通用引物 799F (CCTAYGGGRBGCA)和 1193R

(ACGTCATCCCCACCTTCC)扩增 16S rRNA 的 V5-V7 区。用 KOD 聚合酶

在 94°C (2 min)下进行 PCR 扩增，然后在 98°C (10 s)、62°C (30 s)、68°C

(30 s)下进行 30 个循环，最后在 68°C 下延伸 5 min。

6、口感的测定

采用电子舌传感系统(INSENT SA402B，日本)测定青贮滤液的味道。

首先，以 30 mM KCl 和 0.3 mM 酒石酸为参比溶液，通过传感器 AAE、

CT0、CA0、C00 和 AE1 的输出分别评价鲜味、咸味、酸味、苦味和涩

味。传感器输出通过工作站平台上的程序转换为“味道信息”，其中“1 单

位”定义为一个人能区分的最小差异。

7、统计分析

本研究采用完全随机设计。所有化学成分和发酵参数的数据均采用单

因素方差分析(ANOVA)，使用 SPSS 统计 v. 26.0 (IBM, Armonk, NY, USA)

进行分析。P < 0.05 和 P < 0.01 分别表示差异显著和差异极显著。统计模

型如下:

二、研究成果

52

Yij = μ + Ti + Eij

其中，Yij 为观测的因变量，μ 为总体均值，Ti 为处理效果，Eij 为误

差。

三、结果与讨论

1、苜蓿青贮的化学成分

由表 1 可知，糖蜜添加对苜蓿青贮饲料 DM、WSC、NDF 和 ADF 含

量有显著影响(P < 0.05)，但对粗蛋白质含量无影响。随着糖蜜添加量的增

加，苜蓿青贮 DM 含量略有增加，M2 组和 M3 组分别比对照组高 10%和

5.4%。与此同时，WSC 含量在青贮后下降，并稳定在 30 g/kg DM 左右。

NDF 含量在青贮后下降，维持在 68.27～76.94%。青贮后 ADF 含量保持稳

定，保持在 91.71～101.10%。CP 含量各处理间无显著差异，与青贮前基

本一致。结果表明，苜蓿青贮的 WSC 大部分被消耗，部分 NDF 在青贮过

程中被分解，DM、CP、ADF 含量保持相对稳定。各处理中，M3 组 DM

和 CP 含量最高，NDF 含量最低。

表 1 苜蓿青贮的化学组成(n = 6)

Items

Treatment p Value

Control M1 M2 M3

DM (g/kg

FM)

297.03±1.74c 295.94±0.49c 306.77±0.73b 312.88±0.75a 0.048

CP (g/kg DM) 245.75±0.58 247.05±0.32 242.04±0.72 250.90±0.69 0.149

WSC (g/kg

DM)

31.71±0.82b 28.52±0.63b 37.19±0.86a 32.19±0.73b <0.001

NDF (g/kg

DM)

281.99±0.99a 275.30±1.46a 290.21±2.27a 257.50±1.18b 0.013

二、研究成果

53

ADF (g/kg

DM)

210.06±0.52a 204.72±1.04a 207.28±0.75a 190.55±0.90b 0.004

2、苜蓿青贮发酵特性

由表 2 可知，糖蜜添加对紫花苜蓿青贮的 pH 值、LA、AA、PA、

NH3-N 含量和 LA/AA 含量有显著影响(P < 0.05)，但对 BA 含量无显著影

响。

鲜苜蓿的 pH 值为 5.91，青贮后降低，随着糖蜜添加，pH 从 5.16 显著

降低到 4.48。与对照组相比，M1、M2、M3 组 LA 含量分别显著提高了

19.82%、21.40%、44.17%，AA 含量分别显著降低了 2.97%、25.35%和

32.44%。LA/AA 相应从 3.30 增加到 6.84。随着糖蜜添加量的增加，M1、

M2 和 M3 组的 PA 含量分别显著降低了 24.78%、67.83%和 70.43%。BA 含

量较低，分别降低了 30.30%、51.52%和 87.88%，NH3-N 含量也显著降低

了 24.91%、47.03%和 48.25%。

结果表明，青贮过程中 pH 值快速下降。在所有处理中，M3 组 pH 值

和 AA、PA、BA 和 NH3-N 含量最低，LA 含量和 LA/AA 最高。

表 2 苜蓿青贮发酵特性(n = 6)

Items

Treatment p Value

Control M1 M2 M3

pH 5.16±0.20a 4.84±0.09b 4.63±0.06c 4.48±0.02d <0.001

LA (g/kg

DM)

67.21±13.69c 80.53±10.87b 81.59±7.64b 96.90±8.78a <0.001

AA (g/kg

DM)

21.18±4.49a 20.55±4.23a 15.81±2.25b 14.31±1.42b 0.006

二、研究成果

54

PA (g/kg

DM)

2.30±0.73a 1.73±1.06a 0.74±0.35b 0.68±0.26b <0.001

BA (g/kg

DM)

0.66±0.60 0.46±0.47 0.32±0.23 0.08±0.09 0.132

LA/AA 3.30±0.88c 3.97±0.36bc 5.21±0.85b 6.84±1.05a <0.001

NH3-N (g/kg

TN)

100.86±27.90a 75.74±4.60b 53.43±4.69c 52.20±3.73c <0.001

3、苜蓿青贮的口感

如图 1a 所示，雷达图显示的是味觉信息，一个单位对应人可以分辨的

最小味觉差异。所有苜蓿青贮样品均具有较强的苦味、涩味和酸味，反映

了苜蓿青贮的味道。随着糖蜜添加量的增加，酸味增加，鲜味减少，苦

味、涩味和咸味保持不变。同时，对不同口味进行主坐标分析。如图 1b 所

示，M3 组与对照组的口味有明显的区别。

图 1 苜蓿青贮饲料的口感分析(n=6)。(a)雷达图。(b)主坐标分析。

4、苜蓿青贮微生物群落研究

采用 PCR 扩增和 16S rRNA 测序技术，描述了苜蓿青贮微生物群落，

从图 2 可以看出，青贮 206 天后的苜蓿青贮优势属为肠球菌(Enterococcus)

二、研究成果

55

和乳酸菌(Lactobacillus)，同时存在少量的泛菌(Pantoea)、肠杆菌

(Enterobacter)和魏斯氏菌属(Weissella)等。随着糖蜜添加量的增加，优势

菌属肠球菌和乳酸菌的百分比逐渐增加并趋于稳定，对照组含量为

88.63%，M1 组含量为 81.33%，M2 组含量为 93.20%，M3 组含量为

93.86%。在较低的 pH 条件下，不良微生物受到抑制，因此丙酸(PA)、丁

酸(BA)和氨氮(NH3-N)含量降低。

图 2 16S rRNA 序列测定苜蓿青贮 206 d 后的微生物群落(n=6)

四、结论

青贮后，苜蓿青贮的 DM 和 CP 含量基本没有变化，说明大部分营养

成分得到了保留。发酵底物 WSC 降至 30 g/kg DM 左右，pH 值也降至

5.16。在较低的 pH 条件下，NDF 含量下降主要是由于植物细胞消化更

多，而 ADF 含量保持稳定。随着糖蜜添加量的增加，苜蓿青贮的 DM、CP

和 ADF 含量保持稳定。pH 值从 5.16 显著降低到 4.48，导致 NDF 降低，

LA 含量和 LA/AA 增加，说明苜蓿青贮发酵已向异型发酵转变。青贮后的

优势菌属为肠球菌(Enterococcus)和乳酸菌(Lactobacillus)，在较低的 pH 条

件下，不良微生物受到抑制，导致 BA、PA 和 NH3-N 产量降低。此外，强

烈的苦味、涩味和酸味可以反映苜蓿青贮的味道，而随着糖蜜添加量的增

加，鲜味和酸味的变化可能会改善苜蓿青贮的味道，总体上，糖蜜的添加

二、研究成果

56

改善了发酵品质，改变了苜蓿青贮的味道。在所有处理中，M3 组获得了

最理想的 pH 值(小于 4.5)和长期保存的最佳条件。

该研究成果已在《Animals》上发表。该研究得到中国农业科学院农业

科技创新工程重大产出科研选题(CAAS-ZDXT2019004)、中国农业科学院

科技创新工程(ASTIP-IAS12)、现代农业产业技术体系专项资金(CARS-36)

等项目支持。罗润博为第一作者，王加启研究员为通讯作者。

——Runbo Luo, Yangdong Zhang, Fengen Wang, Kaizhen Liu, Guoxin Huang,

Nan Zheng, Jiaqi Wang* . Effects of Sugar Cane Molasses Addition on the

Fermentation Quality, Microbial Community, and Tastes of Alfalfa Silage.

Animals . 2021. 11(2). 355

二、研究成果

57

2. 奶产品质量安全风险评估

β-内酰胺类抗生素对生乳菌群和耐药基因影响

一、研究背景

牛乳房炎主要由乳房内细菌侵入乳房引起，是奶牛最常见的疾病之一。牛

乳房炎会降低牛奶产量和牛奶质量，增加兽医费用，并降低动物福利。乳房炎

也是牛场抗生素使用比例较高的疾病。在法国，70%的奶牛治疗抗生素都用于

治疗牛乳房炎。如今，抗生素的滥用已成为公共卫生的一大问题，在不同环境

样本甚至食品中都发现了大量的抗生素耐药菌。抗生素耐药被认为是世界上公

众面临的最大风险之一。食品中抗生素耐药细菌（Antibiotic Resistance Bacteria，

ARB）的流行导致人们担心食物可能是抗生素耐药基因（Antibiotic Resistance

gene，ARG）的储存库并能够传播抗生素耐药性。近年来，已经在从乳制品中分

离出的 ARB 中发现了 ARG。此外，微生物群落的耐药水平将影响抗生素治疗

后其他微生物群落的动态，导致抗生素耐药性进一步增加。使用抗生素的动物

可能也会将 ARB 和 ARG 传播到周围环境中。

头孢菌素用于治疗人和动物的各种细菌感染。在欧洲兽用抗生素消费监测

委员会(ESVAC)监测的 26 个国家中，近年来第三代和第四代头孢菌素的使用有

所增加。目前，很少有报道通过 16S rDNA 测序研究治疗性使用 β-内酰胺类抗

生素对牛奶中微生物群和耐药基因的影响。因此，本研究的目的是研究头孢菌

素治疗后牛奶微生物群和耐药基因的变化。评价抗生素的影响对维持合理使用

抗生素具有重要意义。

二、研究成果

58

二、实验方法

1. 样品采集

在研究之前，奶牛没有接触过抗生素。总共选择了 7 头患乳房炎的奶牛。

确诊后，将这些奶牛的牛奶从乳房收集到 400mL 无菌塑料瓶中，然后将头孢噻

呋注射到肌肉中，浓度为 2mg/kg，头孢喹肟按 0.75 ng/kg/天的水平持续乳注 3

天。然后在第 1、2、3、4、6、8、9、11、13 和 15 天对所有奶牛取样。牛奶中

的体细胞计数在第 4 天恢复到正常值，奶牛停止接受抗生素治疗。第 9 天检测

牛奶中无抗生素残留。第 0 天为用药前；第 1 天至第 3 天为用药期；第 4 天至

第 8 天为休药期；第 9 天至第 15 天为休药期后。

2. PCR 扩增

16S rDNA 的 V3-V4 区（94℃ 2 min，然后 98℃ 10 s，62℃ 30 s，68℃

30 s，30 个循环，最后在 68℃下延伸 5 分钟）使用引物 341F：

CCTACGGGNGGCWGCAG 和 806R：GGACTACHVGGGTATTCTAAT。用 50

μL 混合物进行三次重复 PCR 反应，该混合物含有 5 μL 10 × KOD 缓冲液、5

μL 2 mM dNTP、3 μL 25 mM MgSO4、1.5 μL 上下游引物（10 μM）、1 μL

KOD 聚合酶和 100 ng 模板 DNA。

3. 耐药基因的定量检测

使用 qPCR 评估了 16 个抗生素耐药基因的数量，包括 β-内酰胺类（cfxA、

blaROB、bla1 和 blaTEM）、氨基糖苷类（strA 和 strB）、大环内酯类[erm (A)

和 erm(B)]、磺胺类（sul1 和 sul2）、四环素类[tet(B)、tet(C)、tet(Q)和 tet(H)]

和万古霉素类（vanC 和 vanG）。这些基因与 16S rRNA 基进行比例计算，也可

以通过 qPCR 进行量化。使用 357-F：5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'和 518-

R：5'-ATTACCGCGGCTGCCTGG-3'引物扩增 16S rRNA 基因，这些引物也用

于生成 16s rRNA 基因库。

二、研究成果

59

三、结果

α-多样性通过丰富度（Chao 1）和多样性指数（Shannon 和 Simpson）来

衡量。不同时期微生物群的 Shannon 多样性指数和 Chao 1 指数的平均值相似，

表明微生物群的丰富度没有显著增加。然而，不同时期的 Simpson 指数平均值

存在显著差异，表明抗生素处理可能对微生物群落多样性产生影响（图 A）。

对不同时期采集的牛奶样品进行微生物种群的科级微生物种群分布分析。从科

水平看，假单胞菌科、伯克霍尔德菌科、瘤胃球菌科和毛螺菌科是数量最多的

四个科，属于梭状芽孢杆菌（图 B）。对于一些经常检测到的乳房炎相关细

菌，抗生素的使用也影响了其组成。最值得注意的是，肠杆菌的相对丰度在药

物治疗时显著降低（p < 0.05），并且从药物治疗到停药期间持续降低（图

C）。不同时期葡萄球菌和芽孢杆菌的相对丰度无显著差异。

对来自四个不同采样周期的牛奶样品中的 16 个抗生素耐药基因的比例进行

定量检测，头孢噻呋和头孢喹肟在休药期显著增加了牛奶中 blaTEM 的比例

（图 D）。与休药期相比，休药期后 blaTEM 的相对丰度显著增加。其他耐药

基因不受抗生素治疗的影响（数据未显示）。

二、研究成果

60

图 A 不同时期的 α 多样性。x0 用药前，X 用药期，Y 休药期，Z 恢复期

图 B 不同时期科水平上的微生物组成

图 C 牛乳腺炎相关细菌属的相对丰度。a）肠杆菌属，b）葡萄球菌属，

c）芽孢杆菌属

二、研究成果

61

图 D β-内酰胺类耐药基因 blaTEM 与 16S rRNA 基因的比例

四、结论

这项研究提供了受头孢菌素影响的牛奶微生物群和耐药基因的概况。随着

头孢菌素的使用，肠杆菌属的相对丰度显著降低。然而，β-内酰胺基因 blaTEM

的相对丰度在休药期有所提高。头孢菌素治疗对牛奶微生物群和耐药基因的影

响值得进一步研究。

研究成果已在国际知名学术期刊《Journal of Dairy Science》2021 年第 104 期

7018–7025页上发表。董蕾和孟璐博士为共同第一作者，王加启研究员为通讯作

者。

——L. Dong, H. M. Liu, L. Meng, M. R. Xing, J. Q. Wang, C. Wang, H. Chen,

N. Zheng. Effect of therapeutic administration of β-lactam antibiotics on the bacterial

community and antibiotic resistance patterns in milk. Journal of Dairy Science 104：

7018-7025.

二、研究成果

62

生乳菌落总数及热处理对乳制品内毒素含量的影响

原料奶营养丰富，是微生物的优质培养基。奶牛的养殖环境、挤奶条件和

运输条件均可能会造成微生物污染，导致生牛乳中微生物多样性和数量发生重

大变化，甚至导致病原菌入侵。为了确保消费者的健康，乳品厂采用热灭菌法

处理生牛乳，以消除生牛乳中微生物的潜在威胁。然而，微生物死亡后释放的

内毒素不能通过牛乳热灭菌过程完全灭活。内毒素也称为脂多糖（LPS），是

革兰氏阴性菌的主要成分，它为细菌提供了一种有效抵抗抗生素化合物的通透

性屏障，并防止补体介导的裂解。LPS 的一般结构由三个不同区域组成：（1）

由糖磷脂组成的脂质 A 在细胞膜内层具有免疫原性，（2）通过共价键与脂质

A 相连的核心低聚糖结构，以及（3）由重复的低聚糖单元组成的抗原性 O 链

多糖。在 250℃下加热 30 分钟或在 180℃下加热 3 小时，可使内毒素完全失

活。牛乳经不起如此长时间的高温处理。当前的乳制品加工技术中，生牛乳的

内毒素污染不能通过热处理工艺消除。然而，不同的生产工艺，特别是热处理

强度对牛乳制品中内毒素的影响尚不清楚。

在对南非、荷兰、西班牙、瑞士、美国、比利时、爱尔兰、斯洛文尼亚和

英国七个国家生产的婴儿配方奶粉（IFM）的调查中，发现 IFM 中的最高内毒

素为每克 55000 个内毒素单位（EU）每毫升。在健康条件下，如果没有因饮酒

和肠炎引起的肠道损伤，内毒素不会对人体产生免疫刺激。当成人肠道结构受

损时，肠道内的内毒素可能进入血液并触发免疫反应。对于肠道结构尚未完全

发育的婴儿，摄入内毒素可能对健康构成威胁。有研究显示，婴儿摄入内毒素

可能导致肠道、血液、肺、肝脏和其他器官的免疫反应甚至炎症。因此，研究

不同乳制品中的内毒素水平以及加工过程对成品奶制品中内毒素的影响，对乳

制品原料奶质量的可追溯性评价具有重要意义。

表 1 总结了在 20℃下储存的生牛乳成分随储存时间的变化。ALP、SFA、

MUFA 和 PUFA 无显著变化（P>0.05）。LPO 活性在贮藏 24h 后下降，48h 后

显著升高（P<0.05）。新鲜生牛乳中 TBC 的平均值为 2.13 log CFU/ml，并随贮

二、研究成果

63

存时间显著增加（P<0.001）。储存 24 小时后，TBC 含量增加了 10000 倍，达

到 6.12 log CFU/ml。与储存 24 小时的生牛乳相比，储存 48 小时的生牛乳 TBC

含量增加 50 倍，达到 7.48 log CFU/ml。同时，生牛乳在 0、24 和 48 小时的内

毒素含量（LPS）为 1.29 log EU/ml（20 EU/ml），分别为 2.5 log EU/ml（353

EU/ml）和 3.81 log EU/ml（9649 EU/ml）。

表 1 贮存时间对原料乳 TBC 及成分的影响

表 2 对牛奶成分数据随热处理强度增加的变化进行统计分析。处理后的牛

奶中 ALP 和 LPO 显著降低（P<0.001）。75℃处理 15s，可有效杀灭牛乳中

99.88%的细菌。此外，随着处理强度的增加，牛乳中的内毒素含量显著增加

（P<0.05，图 1A）。双向方差分析表明，生牛乳中的 TBC 含量对牛乳中的内

毒素含量有显著影响（P<0.001，图 1b）。热处理强度不影响牛乳中脂肪酸的比

例。当根据原料奶的储存天数将数据进行单向方差分析时，SFA 的比例随着储

存时间的变化而显著增加（P<0.05），MUFA 的比例显著降低（P<0.05）。

图 1 通过中试验证原料乳加热温度和 TBC 对灭菌乳内毒素含量的影响

Day1 Day2 Day3 P-value

Lg-TBC 2.13±0.12 c

6.12±0.17 b 7.48±0.43 a <0.001

Lg-LPS 1.29±0.08 c

2.5±0.15 b 3.81±0.32 a <0.001

Lg-ALP 5.25±0 5.25±0 5.24±0 0.564

Lg-LPO 4.07±0.08 ab 3.96±0.04 b 4.46±0.14 a <0.05

SFA (%) 70.93±0.04 70.91±0.12 71.22±0.29 0.466

MUFA (%) 25.2±0.02 25.19±0.13 24.83±0.38 0.484

PUFA (%) 3.87±0.04 3.9±0.02 3.95±0.1 0.663

a b

二、研究成果

64

表 2 热处理强度对牛奶成分的影响

对所有牛奶进行 37 种脂肪酸检测，在所有牛乳样品中均未检测到

c15:1n5、c20:3n3 和 c22:6n3（DHA）（图 2）。四种 SFA（C14、C16、C18 和

C24）、一种多不饱和脂肪酸（c22:1n9）和两种多不饱和脂肪酸（c22:2n6、

C18:2n6）在储存 24 和 48 小时的生牛乳和灭菌牛乳中的比例增加。

图 2 中试牛奶样品脂肪酸含量差异分析。

Group Lg-ALP Lg-LPO Lg-TBC Lg-LPS SFA (%) MUFA (%) PUFA (%

1D-RM 5.25±0.00 4.07±0.08 2.13±0.12 1.29±0.08 70.93±0.04 25.20±0.02 3.87±0.04

1D-72℃ 3.13±0.03 3.05±0.32 0.28±0.28 1.37±0.07 70.95±0.01 25.20±0.04 3.85±0.04

1D-75℃ 3.27±0.02 2.53±0.21 0.00±0.00 1.43±0.05 70.90±0.08 25.23±0.06 3.87±0.04

1D-80℃ 3.15±0.11 1.56±0.45 0.00±0.00 1.49±0.09 71.00±0.14 25.17±0.13 3.83±0.05

1D-85℃ 3.13±0.11 1.37±0.36 0.00±0.00 1.60±0.10 70.87±0.10 25.24±0.06 3.89±0.04

1D-90℃ 3.06±0.11 1.07±0.06 0.00±0.00 1.66±0.11 70.89±0.05 25.24±0.03 3.87±0.02

1D-95℃ 3.07±0.17 0.95±0.00 0.00±0.00 1.77±0.19 70.95±0.05 25.2±0.03 3.85±0.04

1D-100℃ 3.03±0.14 0.93±0.06 0.00±0.00 1.80±0.20 70.95±0.04 25.18±0.03 3.87±0.04

1D-105℃ 3.02±0.12 0.87±0.07 0.00±0.00 1.83±0.22 70.96±0.08 25.17±0.04 3.86±0.04

1D-110℃ 3.06±0.14 0.87±0.07 0.00±0.00 2.01±0.18 70.96±0.06 25.21±0.03 3.83±0.04

1D-115℃ 3.17±0.22 0.77±0.04 0.00±0.00 1.98±0.15 70.97±0.11 25.16±0.08 3.87±0.04

1D-120℃ 2.77±0.07 0.84±0.04 0.00±0.00 2.27±0.23 70.81±0.11 25.36±0.12 3.82±0.03

Day1 P-value <0.001 <0.001 <0.001 <0.005 0.943 0.774 0.989

2D-RM 5.25±0.00 3.96±0.04 6.12±0.17 2.5±0.15 70.91±0.12 25.19±0.13 3.9±0.02

2D-75℃ 2.77±0.12 2.60±0.27 0.26±0.14 2.69±0.05 71.10±0.27 25.01±0.29 3.89±0.04

2D-90℃ 2.78±0.08 1.45±0.05 0.10±0.10 2.89±0.22 71.14±0.29 24.90±0.40 3.96±0.11

Day2 P-value <0.001 <0.001 <0.001 0.298 0.784 0.796 0.792

3D-RM 5.24±0.00 4.46±0.14 7.48±0.43 3.81±0.32 71.22±0.29 24.83±0.38 3.95±0.10

3D-75℃ 2.20±0.42 2.02±0.47 0.99±0.84 4.58±0.43 71.09±0.33 24.99±0.36 3.92±0.03

3D-90℃ 1.90±0.64 1.08±0.07 0.88±0.88 4.87±0.47 71.28±0.35 24.84±0.39 3.87±0.06

Day3 P-value <0.005 <0.001 <0.001 0.251 0.918 0.949 0.704

Total P-value0.562 <0.05 <0.001 <0.001 <0.05 <0.05 0.051

二、研究成果

65

通过 Spearman 分析所有牛乳样品成分之间的相关性；P<0.05 的结果总结为

热图（图 3）。牛乳中的内毒素（LPS）与 ALP、C4、C6、c20:5n3 呈负相关。

此外，牛乳中的内毒素（LPS）与 C14、C15、C18、C24、c22:1n9、c22:2n6 和

C24:1n9 呈正相关。TBC 与 ALP、LPO 呈正相关。SFA 与 MUFA 呈显著负相

关。虽然生牛乳中的 TBC 含量与内毒素显著相关（P<0.001，图 1b），但牛乳

制品中的 TBC 含量与内毒素无关（P>0.05）。因此，单纯检测产品中的 TBC

指数不能完全保证牛乳产品的微生物安全。

图 3 在中试加工验证牛奶中脂肪酸、TBC、内毒素（LPS）、碱性磷酸酶

（ALP）和乳过氧化物酶（LPO）的相关性。

婴儿配方奶粉样品的内毒素含量结果。共分析了 75 份国产婴儿配方奶粉样

品。平均内毒素含量为 2.605 log EU/ml（14 EU/ml 至 4731 EU/ml）。同时，我

们分析了 74 种进口婴儿配方奶粉，平均内毒素含量为 2.359 log EU/ml（6

EU/ml 至 9080 EU/ml）。t 检验结果显示，进口和国产 IFM 在各阶段的内毒素

含量均无显著性差异（P>0.05）。四段 IFM 的平均内毒素含量明显低于其他阶

段 IFM。这可能是因为对 3 岁以上的儿童使用了第 4 阶段 IFM。第 4 阶段 IFM

的成分不同于其他阶段的 IFM，导致内毒素含量不同。

二、研究成果

66

表 4 总结了不同商业乳制品的内毒素含量。它包括巴氏杀菌牛乳（PM）、

超高温瞬时灭菌乳（UHT）和重组婴儿配方奶粉（IFM）。37 份巴氏灭菌乳样

品的内毒素含量最低（1.347 log EU/ml，6 EU/ml 至 231 EU/ml），40 份 UHT

乳样品（1.865 log EU/ml，31 EU/ml 至 1437 EU/ml）的内毒素含量介于 PM 和

IFM 之间，149 份重组 IFM 样品的内毒素含量最高（2.483 log EU/ml，6 EU/ml

至 9080 EU/ml）。不同乳制品的内毒素含量有显著性差异（P<0.001）。

表 4 市售乳制品中的内毒素

在这项研究中调查了市场上乳制品的内毒素含量。结果表明，不同 IFM 的

内毒素含量差异较大，热处理强度较高的乳制品内毒素含量较高。中试加工验

证试验发现，生牛乳的 TBC 含量和热处理强度会显著影响灭菌牛乳的内毒素含

量。综上所述，乳制品中存在内毒素，生牛乳中的细菌含量和热处理温度影响

乳制品中的内毒素含量。

该成果由中国博士后特别资助项目、国家重点研发计划、中国农业科学院

重大任务和现代农业产业技术体系等项目资助，吴浩铭为文章第一作者，王加

启为文章通讯作者。

——Wu H, Wang Y, Hao X, Meng L, Li H, Cheng M, Zheng N, Wang J. Effect

of TBC of raw milk and thermal treatment intensity on endotoxin contents of milk

products. Food Res Int (2021)110816. doi:10.1016/j.foodres.2021.110816

N Mean SD SE MIN MAX

PM 37 1.347 c 0.269 0.044 0.754 2.364

UHT 40 1.865 b 0.420 0.066 1.489 3.157

IFM 149 2.483 a 0.651 0.053 0.764 3.958

二、研究成果

67

建立牛奶中 AFM1 的核酸适配体检测技术

一 、研究背景

霉菌毒素是由霉菌产生的次级代谢物，通过污染饲料和动物性食品（肉、

蛋、奶等），对动物生产性能以及人类的组织和器官产生极大的危害。目前有

400 多种已知的霉菌毒素对人类和动物具有潜在毒性，常见的霉菌毒素主要包

括 AFB1、AFM1、OTA、FB1。AFM1 是 AFB1 的羟基化代谢产物，受污染的

动物饲料中约有 2-6％的 AFB1 在牛奶中转化为 AFM1。AFM1 已被国际癌症研

究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）列为第 1 类致癌

物。一旦原料奶被 AFM1 污染，牛奶和乳制品的常规热处理（巴氏杀菌或超高

温）不易降解 AFM1。

尽管严格控制牛奶中 AFM1，但 AFM1 污染事件仍时常发生。因此，检测

牛奶中 AFM1 的方法引起了更多的关注。目前已经开发了许多检测 AFM1 的方

法，包括高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、气相色谱法

（GC）和质谱法（MS）等仪器分析方法以及基于抗体的酶联免疫反应

（ELISA）、免疫传感器和表面等离子共振（SPR）等免疫分析方法。但这些检

测方法仍存在一些问题，比如在仪器分析方法在样品前处理过程中，步骤繁

杂、耗时长且不适合现场操作，同时需要大量的专业技术人员，而免疫分析方

法中使用的抗体价格昂贵且不稳定，制备时间长，不容易长期存储等。目前，

基于核酸适配体的生物传感器因具有易合成、易标记、易修饰、灵敏度高、特

异性高、分子量小、检测成本低等优势而受到广泛的关注。

由于基于核酸适配体的荧光淬灭信号感应平台具有较高的灵敏度和特异

性，它们被认为是用于检测各种生物分子的比较有前途的方法，并且在团队先

前的研究中，荧光淬灭方法已被用于检测 AFB1。Sharma 等开发了一种用于检

测 AFM1 的结构转换适配体。但是，该适配体对 AFM1 的选择性尚不清楚，因

为只选择了不相关的 OTA 和 AFB1 作为研究交叉反应的干扰物，而其他毒素

二、研究成果

68

（尤其是结构类似物 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2）之间的交叉活性测试实验

没有进行。 此外，食物中多种霉菌毒素的共存是一种常见而复杂的现象。因

此，应研究混合真菌毒素对适配体传感器特异性的影响。

本文研究基于核酸适配体的荧光传感器检测牛奶中 AFM1，并研究了该适

配体最优互补 DNA 和结构转换信号，可通过荧光的变化定量检测 AFM1 浓

度。

二、实验方法

1. 基于适配体的 AFM1 荧光检测方法

用 Tris-HCl 缓冲液溶解稀释 AFM1 aptamer 和 cDNA，将 AFM1 aptamer 与

cDNA 按照一定比例混合混匀，再将混合物于 88 ℃下水浴加热 5 min，之后室

温下静置至少 30 min，此时反应总体积为 1.0 mL。之后，向反应混合物添加

500 μL 不同浓度的 AFM1 标准溶液并涡旋混匀，最终反应体系体积为 1.5 mL，

用荧光分光光度计测量此时的荧光强度。类似地，将 500 μL Tris-HCl 缓冲液加

入到 AFM1 aptamer 和 cDNA 的混合物中，同时在不添加 AFM1 的情况下涡旋

混匀，然后用荧光分光光度计测量荧光淬灭时的荧光强度。为了避免黄曲霉毒

素背景荧光信号的影响，通过测量含有 AFM1 和 Tris-HCl 缓冲液但不含 AFM1

aptamer 或 cDNA 的作为试验对照，对试验进行荧光背景校正。

2. AFM1 适配体和 cDNA（1~7）优化

对试验中 AFM1 aptamer 与 cDNA 1~cDNA 7 进行优化，该实验中使 AFM1

aptamer 与 cDNA 的摩尔比为 1：2，反应中 AFM1 终浓度为 150 ng/mL。

3. 适配体和 cDNA 浓度比优化

该试验采用最优 cDNA，并设定 AFM1 aptamer：cDNA 的浓度摩尔比比例

为 1：1、1：2、1：3、1：4 和 1：5，反应中 AFM1 终浓度为 150 ng/mL。

4. AFM1 浓度分析

二、研究成果

69

该试验采用最优 cDNA 链，以及最优 AFM1 aptamer：cDNA 的浓度摩尔

比，反应中 AFM1 的终浓度依次为 0、1、5、10、20、40、60、80、150、

200、300 和 400 ng/mL。

5. 特异性分析

为了评估该检测方法对 AFM1 的特异性，选择与 AFM1（AFB1、AFB2、

AFG1、AFG2、OTA、ZEN 和 FB1）结构相关的 7 种霉菌毒素用于测试。该特

异性试验中，所有霉菌毒素均使用相同浓度（40 ng/mL）。试验中所有检测条

件均与检测 AFM1 相同。

6. 牛奶样品分析

该试验用于定量检测已知 AFM1 浓度的的液态奶样品中的 AFM1。当牛奶

样品中 AFM1 的浓度在 1~100 ng/mL 范围内时，使用以下预处理方法。向牛奶

样品中分别加入浓度为 5、10 和 20 ng/mL 的 AFM1 标准品。精确称量 0.5 mL

液态奶样品加入 10 mL 离心管中，然后加入 2.5 mL 70％ 甲醇水溶液从牛奶样

品中提取 AFM1。将整个混合物在 Vortex-Genie 上涡旋 5 min，以 10,000 rpm

离心 10 min。收集上清液。将上清液通过 0.22 μm 过滤膜过滤，再使用 N1-自

动氮气浓缩器将溶液浓缩至 0.5 mL。最后，将浓缩物重新溶解在 2 mL 甲醇水

溶液（5％，v/v）中并储存在 4℃下。

当牛奶样品中 AFM1 的浓度在 0~1.0 ng/mL 范围内时，采用增加牛奶样品

量的方式对样品进行预处理。精确称量 25 mL 样品，加入浓度为 0.5 ng/mL 的

AFM1 标准品，加热至约 35~37℃，然后以 4,000 rpm 离心 10 min。通过重力

的作用将 25 mL 的牛奶样品通过 AFM1 免疫亲和柱以促进 AFM1 结合。用 20

mL PBS 以每分钟约 5 mL 的流速洗涤亲和柱。用 1.25 mL 甲醇：乙腈（40 ：

60 v/v）以每秒一滴的流速从柱上洗脱 AFM1。洗脱后，将 1.25 mL 水通过亲和

柱并收集在相同的离心管中，总体积为 2.5 mL。将离心管放置于 N1-自动氮气

浓缩器中，将牛奶样品浓缩至 1 mL。浓缩后，加入 1.5 mL Tris-HCl 缓冲液溶

解，之后用荧光分光光度计检测荧光信号强弱。重复 5 次测量每个样品，以评

估该检测方法的准确性。

二、研究成果

70

三、结果与讨论

1. 设计基于核酸适配体的筛选平台

图 1. A 是基于核酸适配体检测 AFM1 的荧光传感器设计示意图。在该传感

器系统中，AFM1 aptamer 用 FAM 修饰，7-mer cDNA 用 TAMRA 修饰。当溶

液中没有 AFM1 时，TAMRA-cDNA 靠近 AFM1 aptamer 导致其荧光淬灭，进而

杂交形成 AFM1 aptamer-cDNA 复合物。在加入 AFM1 后，AFM1 诱导适配体

打开空间结构，形成 AFM1/aptamer 复合物。适配体结构的变化导致 cDNA 从

适配体中释放，使适配体荧光的恢复。由此可见，溶液中 AFM1 的浓度与反应

后荧光变化的强度呈正相关，故可以通过测定荧光变化的强度进而量化 AFM1

的浓度。为了证实 AFM1 可以解离 aptamer-cDNA 复合物并使适配体恢复荧

光，在 Tris-HCl 缓冲液中加入 150 ng/mL AFM1 至 10 nM aptamer 和 20 nM

cDNA 混合液中。图 1. B 显示加入 AFM1 后荧光强度增加了至少 11 倍。

图 1（A）用于基于适配体荧光传感器用于检测 AFM1 的示意图。（B）基

于适配体的传感系统中荧光发射光谱：（a）空白组（10mM Tris-HCl 缓冲液，

pH7.0）；（b）AFM1 aptaner 与 cDNA 结合；（c）150 ng/mL AFM1；（d）

AFM1 aptaner。

2. 优化 cDNA 序列

在该试验中，将 10 nM AFM1 aptamer 添加至 20 nM cDNA 1~7 中，用移液

枪轻轻混匀，放至水浴锅中，88 ℃温育 5 min，冷却至室温 30 min，添加

AFM1 标准液，使反应终浓度为 150 ng/mL。在图 2. A 中，黑色柱表明当体系

中无 AFM1 时，AFM1 aptamer 与 cDNA 1~cDNA 7 结合后的荧光值，蓝色柱表

二、研究成果

71

明加入 AFM1 后的荧光值。表明当体系中无 AFM1 时，cDNA 5~7 可以有效淬

灭 AFM1 aptamer 荧光并降低荧光信号。由于 cDNA 1~4 链的长度较短，与

AFM1 杂交后结构不稳定，故而产生更高的荧光信号。当 cDNA 5 与 aptamer 杂

交时，加入 AFM1 后可观察到荧光（F/F0）显著增加，而较长的 cDNA 序列

（cDNA6 和 cDNA7）也可有效地淬灭荧光（图 2. B）；这可能是因为 cDNA 5

与 cDNA 6~7 相比，与 aptamer 结合更加紧密，可以促进 aptamer-cDNA 双链体

的形成，同时限制 AFM1 诱导 cDNA-aptamer 结构转变。因此，本试验认为

cDNA5 是该反应最优的 cDNA 序列。

图 2 cDNA 序列、浓度和反应稳定性的优化。（A）通过改变 cDNA 链的长

度来优化 cDNA（cDNA 1~7）。黑色条带表示加入 AFM1 前的荧光强度，蓝色

条带表示加入 150 ng/mL AFM1 后的荧光强度。（B）加入 150 ng/mL AFM1 后

荧光增强比（F/F0）。（C）优化 aptamer：在 150 ng/mL AFM1 存在下的

cDNA5 浓度比。（D）加入 150 ng/mL AFM1 后反应中荧光强度的稳定性。实

验中数据为三个平行实验的平均值和标准偏差。

二、研究成果

72

3. 优化 cDNA5 浓度

为了更好优化该传感器的性能，对 cDNA5 浓度进行优化。在该实验中，将

10 nM AFM1 aptamer 与 cDNA5 分别以 1：1、1：2、1：3、1：4 和 1：5 的摩

尔比进行混合，用移液枪轻轻混匀，添加 AFM1 标准液，使反应终浓度为 150

ng/mL，同时监测荧光信号的变化。如图 2 C 所示，cDNA5 浓度为 20 nM 时达

到最大荧光增强（F/F0）。因此，即使在较高浓度的 cDNA5 中，

cDNA5/aptamer 双链体的形成也产生低背景荧光。当 cDNA 5 浓度高于 20 nM

（AFM1 aptamer 浓度的两倍）时，会影响 AFM1 与 aptamer 相互结合，进而限

制荧光强度的增加。然而，当 cDNA 5 浓度低于 20 nM 时，荧光背景值过高，

导致荧光强度恢复减慢。因此，优化后的传感器 cDNA 5 的最佳浓度为 20

nM。

4. 验证反应稳定性

为了产生所需的荧光强度，分析了 AFM1 与 aptamer 的反应时间。如图 2

（D）所示，反应初期 aptamer 和 AFM1 快速结合。当反应时间为 1 min 时，该

传感器即可检测出溶液中 AFM1 溶度，并且检测出的荧光强度可保持 30 min

内不变。因此，该荧光适配体传感器具可信的稳定性。本试验选择 15 min 时反

应时间为测定时的最佳时间。

5. 定性检测 AFM1

基于上述优化试验，使用该传感器定性检测不同浓度的 AFM1。如图 3 A

所示，反应中荧光强度随 AFM1 浓度增加而增强，并且在 AFM1 浓度为 150

ng/mL 时荧光强度最高。当 AFM1 的浓度在 1~100 ng/mL 范围内与反应的荧光

强度呈线性关系（图 3 B），其线性回归方程为 F = 1.665C + 7.652（R2 =

0.9963），其中 F 表示荧光强度，C 表示 AFM1 浓度。检测限为 1.0 ng/mL，信

噪比为 3（S/N = 3）。

二、研究成果

73

图 3（A）适配体传感器的荧光发射光谱。（B）荧光强度与 AFM1 浓度之

间的线性关系。

6. 特异性实验

为了评估该适配体传感器的特异性，选择了 7 种与 AFM1（AFB1、

AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZEN 和 FB1）结构相似的霉菌毒素作为对照。在

用于检测 AFM1 的相同实验条件下，以相同浓度（40 ng/mL）检测这些霉菌毒

素。如图 4 所示，相对于体系中没有添加霉菌毒素的对照组相比，只有霉菌毒

素和 AFM1（MIX1）以外的所有化合物的混合物都没有显著改变荧光（P >

0.05）。包括 AFM1（MIX2）的所有毒素的混合物具有比只有 AFM1 稍弱的效

果，但差异不显著。这些结果证实该荧光生物传感器不与 AFM1 以外的霉菌毒

素反应，表明该方法对 AFM1 的检测具有高度特异性。

7. 牛奶样品分析

为了进一步验证适用性和可行性，将试验中的方法应用于两种不同品牌的

加标牛奶样品中 AFM1 的检测。将四种不同浓度的 AFM1（0.5、5、10 和 20

ng/mL）添加到牛奶样品中，每种浓度重复检测 5 次。如表 1 所示，加标牛奶

样品的回收率范围在为 93.4~101.3％（n = 5），表明该适配体传感器可用作真

实牛奶样品中定量检测 AFM1。

二、研究成果

74

表 1 加入牛奶样品中的 AFM1 的测定(n = 5)

添加浓度

(ng/mL)

检测浓度

(ng/mL)

相对标准偏差(%)

回收率

(%)

0.5 0.47 4.8 93.4

5 5.1 3.6 101.3

10 9.7 2.9 97.5

20 19.4 2.6 97

四、结论

本试验研究了基于适配体的荧光淬灭检测方法，可用于直接检测 AFM1，

并将该方法成功应用于实际牛奶样品中 AFM1 的检测。在最佳条件下，AFM1

浓度在 1~100 ng/mL 范围内，该适配体传感器的荧光强度随着 AFM1 浓度增

加呈线性增加，LOD 为 0.5 ng/mL。该试验为检测 AFM1 提供了一种新颖、简

便、快速、特异、方便和经济的方法，并提供了定量测定乳制品中霉菌毒素的

新思路。

研究成果已在《Frontiers in Chemistry》上发表。乔勤勤、郭晓东和文芳博

士为共同第一作者，王加启研究员为通讯作者。

——Qinqin Qiao, Xiaodong Guo, Fang Wen, Lu Chen, Qingbiao Xu, Nan Zheng,

Jianbo Cheng, Xiuheng Xue, Jiaqi Wang* . Aptamer-Based Fluorescence Quenching

Approach for Detection of Aflatoxin M1 in Milk. Front Chem. 2021. 9. 653869

二、研究成果

75

黄曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 联合诱导小鼠肾损伤机制

黄曲霉毒素 M1（AFM1）和赭曲霉毒素 A（OTA）是环境中广泛存在的有

害霉菌毒素。AFM1 和 OTA 共存可能会导致加和或协同效应，为公众健康带来

更大的风险。然而，AFM1 + OTA 诱导的肾毒性及其机制仍有待进一步研究。

本研究采用 3.5 mg/kg b.w. AFM1、OTA 和 AFM1+OTA 处理 CD-1 小鼠 35 天，

采用 LC-MS 代谢组学方法构建小鼠肾脏代谢物图谱，随后进行人肾近端小管

（HK-2）细胞实验，以找出差异代谢物和肾毒性之间的因果关系。

试验中小鼠总共灌胃 35 天，每周测量一次体重，得到小鼠的体重变化图

（图 1A）。由图可知，五个小组的小鼠平均初始体重没有显著差异（p >

0.05）；对小鼠的终体重进行差异显著性分析，结果如 3.1B 所示。DMSO 处理

组小鼠的最终体重与对照组相比差异不显著（p > 0.05），而其余三个毒素处理

组（AFM1 组、OTA 组、AFM1+OTA 组）的小鼠终体重与对照组相比差异达

极显著（p < 0.01）；根据小鼠终体重，计算出小鼠的肾脏指数，见图 1C，由

图可知 DMSO 组、AFM1 组与对照组相比，小鼠肾脏系数无显著差异（p>

0.05），而 OTA 组及 AFM1+OTA 组与对照组相比，小鼠肾脏系数呈极显著下

降（p< 0.01）。如图 1D-F，测定了三个常见的小鼠肾脏损伤血清生化指标：血

尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）及血尿酸（UA）。与对照组相比，DMSO

组的三种指标均无显著差异（p> 0.05），而毒素处理组 AFM1 组及

AFM1+OTA 组中 BUN 值，SCr 值及 UA 值均极显著上调（p < 0.01），OTA 组

中 BUN 值及 SCr 值极显著上调（p < 0.01），UA 值无显著差异。这些表型结

果表明，OTA 对肾脏造成显著的损害，而 AFM1 与 OTA 相比肾毒性作用相似

但有限。

二、研究成果

76

图 1 单独及联合的 AFM1 和 OTA 对小鼠体重、肾指数和血清生化参数的

影响。

H&E 染色和 Masson 染色用于评估单独和联合的 AFM1 和 OTA 对肾脏形

态和纤维化程度的影响（图 2）。对照组和 DMSO 组细胞形态、大小均匀，胶

原纤维增生不明显，无出血、水肿或其他明显异常。如黑色箭头所示，毒素处

理组中某些肾小管上皮细胞轻度水肿变性，细胞肿胀，胞浆疏松深染。此外，

AFM1 组偶尔出现细胞变形、炎性细胞浸润和轻度胶原纤维增生（蓝色区

域）。OTA 组可见部分细胞变形，局部组织水肿（模糊区域），出血（红色点

状区域），胶原增生明显，肾组织轻度纤维化。AFM1 + OTA 组胶原纤维增生

量多于 OTA 组水平，大量蓝色区域弥漫，肾细胞结构紊乱，进入稳定的纤维化

期。对小鼠肾组织胶原纤维面积的统计分析表明，与对照组相比，分析表明，

AFM1 +OTA 组的肾组织胶原纤维面积显著增加（p < 0.05）。

二、研究成果

77

图 2 单独及联合的 AFM1 和 OTA 对肾脏组织形态和纤维化程度的影响

首先通过二维主成分（PCA）分析来观察代谢组学数据的样本方差和组内及

组间的分布。PCA 评分图显示各组均无分离样本，因此后续分析均未移除样本

（图 3A）。使用 OPLS-DA 分析进一步对样本进行分组和分类。如图 3B 所示，

与对照组相比，DMSO 处理未显著改变小鼠肾脏主要代谢物的总体组成，而毒素

单独或联合处理改变了代谢物图谱(如样本与对照组和 DMSO 组的距离偏差所

示)。OTA 组和 AFM1 + OTA 组代谢组改变程度更明显，说明 OTA 对小鼠肾组

织的毒性较 AFM1 强。

图 3 PCA 分析与 OPLS-DA 分析

UPLC-MS 检测和数据库参考注释共鉴定出 115 种代谢物。本研究采用

MetaMapp 软件建立了包含所有 115 种已鉴定代谢物的完整代谢网络。通过成

对比较，筛选出差异表达的代谢物（基于单变量分析：student t 检验 p < 0.05 且

FC 值>1.5）。图 4A、B、C 和 G 显示了毒素处理组和 DMSO 组之间比较的结

二、研究成果

78

果。与 DMSO 组相比，AFM1 处理引起 8 种代谢产物的上调和下调；OTA 处理

引起 26 种代谢产物的上调和 19 种代谢产物的下调；AFM1 + OTA 处理导致 36

种代谢产物上调，21 种代谢产物下调。另一方面，图 4D、E、F 和 H 绘制了毒

素处理组之间的比较概况。与 AFM1 组相比，OTA 组共有 20 种代谢物发生显

著变化，包括 6 种上调代谢物和 14 种下调代谢物；AFM1 + OTA 组中总共有

29 种代谢物发生显著变化，包括 18 种上调代谢产物和 11 种下调代谢产物。然

而，与 OTA 组相比，AFM1 + OTA 组中只有 4 种代谢物有明显变化，包括 2 种

上调代谢产物和 2 种下调代谢产物。这表明，当两种毒素共存时 OTA 可能是产

生主要毒性作用的毒素。

图 4 差异代谢网络分析

如上所述，AFM1 和 OTA 对肾脏代谢组的调节存在一些显著差异。因此，

我们应用热图分析，以便对样本和组间的代谢组水平进行直观比较（图 5A）。

由于代谢物在热图中的表达水平是聚集的，因此很容易看出前两组（DMSO

组，AFM1 组）的代谢模式明显不同于其他两组（OTA 组，AFM1 + OTA

组）。如图 5A 所示，共筛选出 30 种代谢物，符合标准：t 检验 p< 0.05 和

VIP >1.0，溶血磷脂酰胆碱（LysoPCs）为显著上调的主要类型，其中 LysoPC

（16:0）所占比例最高；LysoPC（18:1）、LysoPC（18:2）和 LysoPC（22:6）

为次要成分（图 5B）。OTA 和 AFM1 + OTA 对 LysoPC 提高的影响比 AFM1

单独处理更明显；而 OTA 与 AFM1 + OTA 对 LysoPCs 的影响无统计学差异，

再次说明 OTA 与 AFM1 联合处理时可能是优势毒素。

二、研究成果

79

图 5 小鼠肾组织中差异表达的代谢物

HK-2 细胞 Western blotting 结果显示，OTA 组和 AFM1 + OTA 组凋亡蛋白

Bax、caspase 3 和 PARP 的表达水平显著提高，Bcl-2 蛋白表达显著降低；而

AFM1 处理仅显著提高 caspase 3 的表达水平（P<0.05）。LysoPC（16:0）而非

LysoPC（18:1）显著提高了 HK-2 细胞中 caspase 3 和 PARP 的蛋白水平，并降

低了 Bcl-2 的水平（P<0.05）。

二、研究成果

80

结论： 本研究首次评估了 OTA 和 AFM1 联合处理导致的肾毒性，我们猜

测，与 AFM1 相比，OTA 对肾脏的毒性更为明显；LysoPC（16:0）是联合毒素

处理引起肾损伤的关键代谢产物，可能是敏感而特异的肾毒性生物标志物。未

发现 AFM1 和 OTA 在肾病的发生或发展中存在明显的协同作用。

图 7 AFM1 和 OTA 单独和联合处理致小鼠肾损伤的可能机制

二、研究成果

81

研究成果已于 2021 年 6 月发表在《Toxicology》杂志。该成果由国家自然

科学基金（31972190）、现代农业产业技术体系（CALS—36）、农业科技创新

计划（ASTIPS IAS12）、中国农业科学院重大任务（CAAS-ZDXT201900）等

项目资助，王子微、高亚男、黄鑫为文章第一作者，郑楠为文章通讯作者。

——Ziwei Wang, Yanan Gao, Xin Huang, Shengnan Huang, Xue Yang, Jiaqi

Wang, Nan Zheng. Metabolomics analysis underlay mechanisms in the renal

impairment of mice caused by combination of aflatoxin M1 and ochratoxin A.

Toxicology 2021, 458: 152835.

二、研究成果

82

赭曲霉毒素 A 通过 WNT/Ca2+信号通路诱导肠道紧密连接

蛋白损伤机制

赭曲霉毒素 A（ochratoxin A，OTA）是由某些曲霉菌和青霉属的真菌菌株

（疣状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、黑曲霉和赭曲霉）产生的次级代谢产物。

OTA 是一种广泛存在的环境污染物，对人类和动物的健康构成了极大的威胁，

仍然是全球关注的公共卫生问题，引起了人们的重视。肠道屏障是抵御外来污

染物的第一道屏障。紧密连接（Tight junction，TJ）附着在肠道上皮细胞以维

持其结构和细胞极性，从而维持上皮细胞的生物学和屏障功能。TJ 蛋白能阻断

细胞间隙，阻止细菌和毒素进入血液循环，在维持肠道屏障功能方面具有重要

意义。而霉菌毒素可以通过破坏肠道 TJ 蛋白发挥毒性作用。本研究的目的是揭

示 OTA 处理 Balb/c 小鼠后，肠道 TJ 蛋白中非编码（non-coding，nc）RNA 和

mRNA 的表达模式的变化，并找到 OTA 发挥肠道毒性作用的关键靶标，进一

步为 OTA 的风险评估提供更全面的理论依据。

基于 mRNA 测序，全转录组构建了两种类型的文库（小 RNA 文库和核糖

体特异性文库），可以同时分析四种不同 RNA 的数据：长链非编码（lnc）

RNA、环状（circ）RNA、微（mi）RNA 和 mRNA。通过 miRNA 和三种 RNA

（lncRNA、circRNA 和 mRNA）的竞争性结合，可以建立竞争性内源 RNA

（competing endogenous RNA，ceRNA）网络，从而更准确地找到影响生物过程

的关键 RNA。近年来，全转录组分析逐渐成为研究霉菌毒素毒性作用机制的趋

势。但迄今为止，仍缺乏相关的体内研究数据，且大多集中在全转录组的生信

分析上，并未进行体外验证试验。本试验通过体内动物模型和体外细胞模型，

结合全转录组学分析来研究 OTA 损伤肠道 TJ 蛋白的机制。Balb/c 小鼠经 3

mg/kg b.w. OTA 灌胃 28 天后，取其空肠组织，一方面用于染色观察、杯状细胞

计数、紧密连接蛋白的表达水平的测定；另一方面用于全转录组学分析。血液

用于测定与肠道通透性相关蛋白的表达水平。体外经 20 μM OTA 处理 48 h 的

二、研究成果

83

Caco-2 细胞用于全转录组学的体外验证，其中未分化的细胞用于 Ca2+水平的测

定，分化的细胞用于测定 TJ 蛋白的表达水平（图 1）。

图 1. 解析 OTA 损伤 TJ 蛋白作用机制的实验流程图。

从灌胃第 1 天开始，每隔 2 天称一次小鼠的体重并记录，如图 2a 所示，其

体重从灌胃第 7 天开始显著下降，且小鼠的平均终体重排序为：

CTL>DMSO>OTA。为了更全面地评价 OTA 诱导的肠道屏障毒性，采用 ELISA

法检测了 DAO、D-lactate 和 I-FABP 等关键血液生化指标，OTA 可显著提高 D乳酸和 I-FABP 含量（p<0.05）（图 2b）。OTA 组小鼠空肠绒毛高度显著低于

对照组（p<0.05）（图 2c, d），绒毛高度与隐窝深度的比值及空肠杯状细胞数

显著低于对照组（p<0.05）（图 2e, f, g）。

二、研究成果

84

图 2. OTA（3 mg/kg b.w.）对 Balb/c 小鼠空肠结构的影响。（a）OTA 处理

后 Balb/c 小鼠体重的变化。（b）OTA 处理后对血液生化水平的影响。（c）

OTA 对小鼠空肠组织绒毛形态的影响。（d-e）OTA 对小肠上皮绒毛高度和隐

窝深度的影响。（f-g）OTA 对小鼠空肠杯状细胞数量的影响。不同的字母代表

显著差异。

基于 FC>1.5 和 FDR<0.05，将筛选得到的差异表达（Differential

expression）mRNA 进行 KEGG 富集分析。如图 3a 所示，OTA 诱导的

DEmRNAs 主要富集在肌动蛋白细胞骨架的调节、PI3K-AKT 信号通路、MAPK

信号通路以及 Tight Junction 信号通路。此外，根据 KEGG 富集的结果，选择了

一些关键通路中的关键基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。如图 3b

所示，PPI 分析筛选出 G1/S-特异性周期蛋白-D1（CCND1）、Wnt 家庭成员 5a

（WNT5a）、卷曲类受体 4（FZD4）、Axin2（AXIN2）、肌动蛋白 γ1

（ACTG1）和小窝蛋白 1（Cav1）等关键基因，大部分属于 Wnt 信号通路。

二、研究成果

85

图 3. OTA 诱导的 DEmRNA 的分析。（a）DEmRNA 的 KEGG 富集分析。

（b）43 个关键基因的 PPI 网络分析。

根据关键基因的功能预测和靶向性分析，miR-1258-x（靶向 FZD4、

Cav1、CCND1、Rasgrp3、Foxp1）、mmu-miR-1258-3p（靶向 Plau、E2f5、

Hspb1）、mmu-miR-122-5p（靶向 Wnt5a）、miR-205-z（靶向 Cav1、

Ccm2）、mmu-miR-1981-5p（靶向 Wnt5a）、mmu-miR-1943-5p（靶向 Igf2、

Axin2、Pkd1）和 mmu-miR-146b-5p（靶向 Ccl8，Lgr6）可能是与肠屏障功能

相关尤其是 TJ 蛋白的关键分子（图 4a）。

在对 DElncRNA 的靶向 DEmRNAs 进行功能预测后，如图 4b 所示，

DElncRNAs Zeb1、Stk36、Phkb、Prss23、Inpp5e 和 Gm28588 与肠道 TJ 蛋白紧

密相关。

二、研究成果

86

图 4. 关键差异表达 RNA 两两互作分析。（a）DEmiRNA-DEmRNA 互作

网络，（b）DEncRNA-DEmRNA 互作网络。

基于关键 miRNA-mRNA 和 lncRNA-mRNA 靶向关系对，ceRNA 分析进一

步解析 ncRNAs 和 mRNAs 在肠道 TJ 蛋白中的作用。图 5a 揭示了与 TJ 蛋白相

关的 DEmRNA 和 DEncRNA 之间的关系。对关键 DEmRNAs 的分析表明，

WNT/Ca2+信号级联在 OTA 诱导的 TJ 蛋白损伤中起关键作用，且 KEGG 分析表

明 FZD4、WNT5a 和 Cav1 参与调节 Ca2+水平。通过 ceRNA 分析，发现了参与

钙信号调节的上游靶标 DEmiRNAs 和 DElncRNAs。结果显示 lncRNA Zeb1 通

过靶向 miR-1258-x 调节 FZD4 与 WNT5a 结合的表达，从而激活 Ca2+信号级

联。此外，Cav1 和几种 lncRNAs 与 miR-205-z 竞争性结合以调节 Ca2+的释放。

为了确定 Ca2+对 TJ 蛋白表达的影响，我们采用体外 Caco-2 细胞模型进行

进一步验证。结果表明，OTA 显著增加了 Ca2+的水平（图 5b），并且降低了

TJ 蛋白的表达水平。当加入 Ca2+抑制剂 BAPTA-AM 时，TJ 蛋白的表达水平显

著高于单独使用 OTA 的表达水平（图 5c,d）。以上结果表明 Ca2+水平的增加降

低了 TJ 蛋白的表达水平。

二、研究成果

87

图 5. OTA 损伤肠道 TJ 靶标的筛选。（a）OTA 损伤 Balb/c 小鼠 TJ 蛋白的

lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 网络。椭圆代表 mRNA，V 形代表 miRNA，菱

形代表 lncRNA。（b）OTA 处理后 Ca2+水平的变化。（c，d）OTA 和 BAPTAAM 对 claudin-4/ocludin 表达的影响。不同字母表示显著差异。BA 代表

BAPTA-AM。

结论：基于体内全转录组分析结合体外细胞验证表明，OTA 通过

WNT/Ca2+信号通路损伤紧密连接蛋白，存在的上游机制为：（i）lncRNA-Zeb1

通过靶向 miR-1258-x 调节 FZD4 与 WNT5a 结合释放 Ca2+；（ii）miRNA-1258-

x 调节 Cav1 的表达，控制细胞外 Ca2+进入。该研究成果为解析 OTA 的肠道毒

性机制，挖掘毒性作用靶标提供了重要指导。

摘要图 OTA 损伤 TJ 蛋白的作用机制

二、研究成果

88

研究成果已于 2021 年 9 月发表在《Ecotoxicology and Environmental

Safety》杂志。该研究得到国家自然科学基金、中国现代农业产业技术研究体

系、农业科技创新重大成果科研项目和农业科技创新计划项目资助。杨雪、高

亚男为文章第一作者，通讯作者为郑楠。

——Xue Yang, Yanan Gao, Shengnan Huang, Chuanyou Su, Jiaqi Wang, Nan

Zheng. Whole transcriptome-based ceRNA network analysis revealed ochratoxin Ainduced compromised intestinal tight junction proteins through WNT/Ca2+ signaling

pathway. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 224: 112637.

二、研究成果

89

黄曲霉毒素 B1 和 M1 通过内吞作用诱导肠道完整性损伤的

机制

一 、研究背景

霉菌毒素黄曲霉毒素 B1（AFB1）广泛存在于农作物中，是由包括黄曲霉

和寄生曲霉等霉菌产生的有毒次级代谢产物，黄曲霉毒素 M1（AFM1）是牛奶

中唯一具有最大限量的霉菌毒素。在黄曲霉毒素的几种亚型中，AFB1 的毒性

最强，因此 AFB1 被世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）认定为 1 级致癌

物。同时，IARC 在 2002 年，将 AFM1 对人类致癌物等级从 2 级升为 1 级。

结构完整的肠上皮具有许多关键功能，保证动物和人类的福利和健康。肠

上皮不仅可促进从肠腔吸收营养物质，而且可作为抵御外部污染物的第一道屏

障，防止各种有毒化合物进入人体。肠道屏障的破坏可能会导致炎症反应的激

活，从而威胁人类健康。相邻细胞间的紧密连接 (TJ) 蛋白是肠道屏障的主要功

能成分。已经有研究报道证明，TJ 蛋白可以通过内吞作用被内化，随后在体内

被降解。

本研究的目的是利用体内和体外模型，评估 AFB1 和 AFM1 对肠屏障影响

的联合毒性及其机制。体内 ICR 小鼠的血清生化指标和肠道组织检测的结果表

明，AFB1 和 AFM1 可影响与肠道屏障完整性相关的血清生化指标、损伤肠道

组织形态和 TJ 蛋白的分布。分化 Caco-2 细胞的体外实验分析了 AFB1 和

AFM1 对肠道屏障功能表型和机制的影响。本研究中的体内和体外结果首次表

明 AFB1 和 AFM1 联合作用可导致肠道屏障受损，并且受损机制与网格蛋白介

导的内吞作用相关。此外，我们的结果表明， AFB1 和 AFM1 损伤肠屏障功能

主要为协同作用。

二、实验方法

1. 试验动物

二、研究成果

90

本实验所用 40 只 ICR 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司

（Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.），雄性，健康且精

神状态良好，清洁级别为 SPF 级别，均为 4 周龄左右，体重均在 20±2g 范围

内。7 天适应期后，40 只小鼠随机分为 4 组，即对照组（1% DMSO）、AFB1

单独处理组（0.3 mg/kg b.w.）、AFM1 单独处理组（3.0 mg/kg b.w.）和混合毒

素 AFB1+ AFM1 处理组（0.3 mg/kg b.w.+ 3.0 mg/kg b.w.）。处理组的小鼠每天

灌胃一次（0.2ml/只小鼠），持续四周，并一周 2 次称重。第 29 天，用二氧化

碳对小鼠实施安乐死。

采集到的小鼠肠道组织固定在 10%福尔马林缓冲液中，用于随后的组织学

评估和免疫组织染色。并从小鼠眼眶取血。所有动物程序均按照中国动物实验

指南进行，符合国际公认的实验动物使用原则。动物实验得到了中国农业科学

院北京畜牧兽医研究所伦理委员会的批准（Beijing, China, IAS 2019-3）。

2. 细胞培养与处理

20-35 代 Caco-2 细胞应用在本研究中，Caco-2 细胞生长在 5%CO2，95%湿

度，37℃的培养环境下。培养基为 DMEM，其中包含 10%胎牛血清、4.5g/l L谷氨酰胺，双抗（100 units/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）以及 1%的非必需氨

基酸。培养 3 天后，细胞汇合度达到 80%，将细胞用胰酶消化下来，并且以

40,000 细胞/cm2 的密度种到 Transwell 培养板中。连续培养 21 天，每两天换液

一次，期间用 Millicell-ERS 电阻仪测定细胞间的跨膜电阻(TEER)值，当 TEER

值达到 300 Ω.cm2 时，即可证明 Caco-2 细胞分化完成。AFB1 和 AFM1 被添加

到 Transwell 板的上室中孵育 48 h。

3. 血液生化指标检测

采集的血样在 37℃下凝固 1-2 h（不含抗凝剂），然后在 4℃下，以 4000

转/分的速度放置在离心机离心 10 分钟，以获得上清液（血清）。通过

HITACHI 7080 全自动生化分析仪和酶联免疫吸附试验（ELISA）测定与肠屏障

功能相关的血清生化参数，包括 Cit、DAO、I-FABP 和 D-乳酸。

4. 小鼠回肠的组织形态学评估

二、研究成果

91

迅速利用预冷的 PBS 冲洗解剖得到的回肠内容物，放入 10%福尔马林溶液

中固定 24 h 以上，冲洗后包埋，利用切片机切蜡带，制作肠道组织石蜡切片。

将石蜡切片置于二甲苯中 10 min，脱蜡完成后，将切片依次置于不同浓度酒精

中，最后放入蒸馏水中。随后置于苏木精中 10 min，移入水中洗去残液，置于

1%盐酸酒精中分化 3-30 秒，再移入水中洗涤 30 min。再置于伊红染液中 2-5

min，入水洗去染液。置于 80%酒精中脱水 5 min，再入 90%酒精中脱水 5

min，移入二甲苯中透明后，最后用中性树胶固片，晾干后即可。每组取 6 只小

鼠的回肠组织，每个区段取 3 个不同位置制作切片，在显微镜下观察 HE 染色

后的小肠绒毛形态，并在每张切片上选取 5 根绒毛，测定绒毛长度和隐窝深

度，计算两者的比值。

5. 细胞毒性的测定

CCK-8 实验用来测定在不同组合霉菌毒素的处理下细胞存活率。在处理之

前，以 6×104 细胞/ml 的密度接种在 96 孔培养板中贴壁培养 24 h。接着，加入

不同浓度及组合的霉菌毒素处理细胞，AFB1 和 AFM1 (0.5, 1, 2, 4 和 8 μg/ml)。

48 h 后，移除包含着霉菌毒素的培养基，再加入 100 μl CCK-8 试剂，在培养箱

中孵育 2 h。最后，将 96 孔培养板放入酶标仪中，在 450nm 处测定吸光度。

6. TEER 值测定

TEER 值是测定细胞间完整性最方便的方法。在培养分化 Caco-2 细胞的

Transwell 板的上室和小室中分别加入单独和混合的 AFB1 和 AFM1 (0.5, 1, 2, 4

和 8 μg/ml)，处理 48 h 后，测定 TEER 值。

7. 免疫荧光染色

利用激光共聚焦显微镜观察紧密连接蛋白的定位。单独及混合 AFB1 和

AFM1 处理分化 Caco-2 细胞 48 h。处理后，细胞用 4%多聚甲醛固定 10 min，

随后用 0.1%Triton X-100 做透化处理 5 min。细胞用封闭液封闭 1.5 h，然后孵

育 claudin-3、claudin-4、ZO-1、occludin 一抗 1.5 h，随后细胞用荧光二抗避光

室温孵育 45 min。细胞利用 LSM780 激光共聚焦显微镜进行观察。

8. 紧密连接蛋白水平的测定

二、研究成果

92

PCR 和 Western blot 试验分别用来测定紧密连接蛋白的 mRNA 和蛋白水

平。分化 Caco-2 细胞被裂解后，用上样缓冲液混合均匀，电泳。PVDF 膜利用

5%脱脂牛奶室温下封闭 1.5 h。接下来，claudin-3、claudin-4、ZO-1、

occludin、β-actin 一抗室温孵育 3 h。相对应的二抗室温孵育 1 h。灰度值利用

ImageJ 软件分析。

三、结果与讨论

图 1 展示的是小鼠暴露于单独及混合的 AFB1 和 AFM1 对肠道屏障相关的

血液指标的影响。如图所示，AFM1 单独灌胃组及 AFB1 单独灌胃组小鼠血液

中瓜氨酸（Cit）含量与对照组相比差异不显著（p > 0.05）；AFB1 与 AFM1

联合灌胃组小鼠血液中瓜氨酸（Cit）含量显著低于对照组及单独灌胃组（p <

0.05）。AFM1 单独灌胃组小鼠血液中 DAO 活性显著高于对照组（p <

0.05），AFB1 单独灌胃及其与 AFM1 联合灌胃组小鼠血液中瓜氨酸含量显著

高 AFM1 单独灌胃组（p < 0.05）。AFM1 单独灌胃组及 AFB1 与 AFM1 联合

灌胃组小鼠血液中肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）含量显著高于对照组（p <

0.05），且 AFB1 与 AFM1 联合灌胃组显著高于 AFM1 单独灌胃组（p <

0.05）；各处理组小鼠血液中 D-乳酸(D-lactate)含量均显著高于对照组（p <

0.05），AFB1 与 AFM1 联合灌胃组小鼠血液中 D-乳酸含量显著高于单独灌胃

组（p <0.05）。

二、研究成果

93

图 1. AFB1 和 AFM1 诱导小鼠肠道屏障相关血液指标的变化

如图 2 所示，灌胃结束时，三个处理组小鼠回肠绒毛长度值均显著低于对

照组（p < 0.05），且 AFB1 与 AFM1 联合灌胃组显著低于两个毒素单独灌胃组

（p < 0.05）；各处理组小鼠回肠绒毛隐窝深度值均显著高于对照组（p <

0.05），但三个处理组间差异不显著（p > 0.05）；三个处理组小鼠回肠绒毛长

度与隐窝深度的比值均显著低于对照组（p < 0.05），且 AFB1 与 AFM1 联合

灌胃组显著低于两毒素单独灌胃组（p < 0.05），两毒素单独灌胃组间差异不显

著（p > 0.05）。

图2. AFB1和AFM1诱导小鼠回肠形态结构的变化

二、研究成果

94

如图 3 所示，与对照组相比，低浓度（0.5 μg/mL）的 AFB1 和 AFM1 即使

以混合方式处理，也不会显著降低 TJ 蛋白转录水平（p＞0.05）。与单独毒素

处理相比，混合 AFB1 和 AFM1 在 0.5 μg/mL 浓度下导致 TJ 蛋白 mRNA 表达更

严重的下调。4 μg/mL AFB1 导致 TJs mRNA 表达显著降低（p<0.05），而 4

μg/mL AFM1 中未发现这种影响。然而，尽管 AFB1 和 AFB1+AFM1 联合处理

组之间没有显著差异（p＞0.05），但 4 μg/mL AFM1 有加剧 AFB1 诱导的 TJ 蛋

白破坏的趋势。

如图 4 所示，4 μg/mL AFB1 及混合毒素可导致乳酸脱氢酶含量显著升高

（图 4A），对细胞造成损伤。但加入网格蛋白抑制剂（氯丙嗪，CP），AFB1

和 AFM1 诱导的细胞跨膜电阻（TEER）值的增加得到抑制（图 4B），同时紧

密连接蛋白的内化作用得到缓解（图 4C）。结果表明，AFB1 和 AFM1 可通过

网格蛋白介导的内吞作用诱导肠道完整性受损。

二、研究成果

95

图3. AFB1与AFM1对分化Caco-2细胞紧密连接蛋白表达与定位的影响

图4. AFB1与AFM1诱导分化Caco-2细胞紧密连接蛋白内化