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(责任编辑:顾文亮)

46 安徽科技学院学报 2024年

安徽科技学院学报,2024,38(1):47-51

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-08-28

基金项目:安徽省重点研究与开发计划项目(202204c06020069)。

作者简介:唐靖雯(1998-),女,安徽天长人,硕士研究生,主要从事园艺植物生物技术研究,E-mail:1515006898@qq.com。

通信作者:张从宇,研究员,E-mail:841968190@qq.com。

水稻愈伤组织诱导及不定芽分化培养体系建立

唐靖雯, 钱晶晶, 王 宁, 曹柳晴, 洪文静, 张从宇*

(安徽科技学院,安徽 凤阳 233100)

摘 要:目的:筛选高效诱导水稻愈伤组织及不定芽分化培养体系的培养基,为水稻基因工程育种奠定基

础。方法:以优质水稻品种(润珠香占)成熟胚为外植体,研究成熟胚愈伤组织出愈情况、不同培养基以及

植物生长物质浓度配比对愈伤组织诱导及不定芽分化的影响。结果:水稻愈伤诱导培养基出愈率大小为

N6>B5>MS>WPM,N6 与 B5、MS、WPM 差异显著;2,4-D 浓度愈伤组织诱导率大小为 B4>B3>

B5>B6>B2>B1,B4 与各处理组之间差异显著;植物生长物质浓度配比对愈伤组织不定芽分化率大小为

T5>T7>T6>T1>T8>T3>T2>T4,T5 与各处理组之间差异显著。结论:水稻成熟胚愈伤诱导的最佳

培养基及2,4-D质量浓度分别为 N6、2.0mg/L;不定芽分化最佳植物生长物质6-BA、KT、NAA 质量浓

度比为1∶1∶1,不定芽分化率最高。

关键词:水稻;成熟胚;愈伤组织;不定芽分化

中图分类号:S852.3 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)01-0047-05

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0008

Inductionofricecallusandestablishmentofadventitious

buddifferentiationculturesystem

TANGJingwen, QIANJingjing, WANGNing,

CAOLiuqing, HONG Wenjing, ZHANGCongyu*

(AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Screening efficient medium forinducing rice callus and adventitious bud

differentiationculturesystem,layingthefoundationforricegeneticengineeringbreeding.Methods:

Usingmatureembryosofhigh-qualityricevariety(Runzhuxiangzhan)asexplants,studiedthecallus

inductionofmatureembryos,theeffectsofdifferentmediaandplantgrowthsubstanceconcentrations

oncallusinductionandadventitiousbuddifferentiation.Results:Thecallusinductionrateofrice

mediumwasN6 >B5 >MS> WPM,N6wassignificantlydifferentfrom B5、MS、WPM.Thecallus

inductionrateof2,4-DconcentrationwasB4>B3>B5>B6>B2>B1,significantdifferencebetweenB4

andeachtreatmentgroup.Theratioofplantgrowthsubstanceconcentrationto Adventistbud

differentiationofcalluswasT5>T7>T6>T1>T8>T3>T2>T4,significantdifferencebetweenT5and

eachtreatmentgroup.Conclusion:Theoptimalculturemediumand2,4-Dconcentrationforinducing

ricematureembryocallusareN6,2.0mg/L.Theoptimalconcentrationofplantgrowthsubstancesfor

adventitiousbuddifferentiationis6-BA,KT,andNAAataratioof1∶1∶1,withthehighestrateof

adventitiousbuddifferentiation.

Keywords:Rice;Matureembryo;Callus;Adventitiousbuddifferentiation

水稻(Oryzasativa.L)是人类重要的粮食作物之一[1-2],养育了全球超过1/2的人口。60多年来,中

国科学家们围绕水稻高产目标,通过一系列的品种选育与应用推广,极大地提高了水稻的产量,为保障中

国和世界粮食安全做出了巨大的贡献[3]。如今,随着生物技术的快速发展,中国水稻育种技术迎来新的挑

战和机遇。传统育种面临水稻产量低、抗性差等问题[4]。水稻育种技术的深入研究和基因组学技术的进

步为水稻育种提供了新的思路[5-6]。因此,采用传统育种和分子育种结合的方法,可以快速、准确地鉴定品

种基因型,在保证其原有优良性状的基础上实现多基因聚合选育,从而获得高产、稳定、优质、多抗等优良

性状的水稻新品种,以满足未来市场的需求。

但水稻分子育种依然面临许多技术问题[7],其中建立高效的再生体系是实现分子育种的必要前提[8]。

水稻再生体系受基因型、外植体类型、基本培养基、植物生长物质和培养条件(光周期和温度)等诸多因素

影响[9]。目前,有关水稻组织培养已有相关报道[10-11],但存在分化率低、不定芽生长能力弱等问题[12]。因

此,如何提高水稻的组培再生能力成了亟待解决的问题。

本研究以‘润珠香占’成熟胚为外植体,探究不同培养基以及植物生长物质浓度配比对愈伤组织和不

定芽诱导的影响,建立高效水稻愈伤组织诱导与不定芽分化培养体系,以期为水稻的快繁提供参考,同时

为优良品种选育、遗传转化及基因功能研究等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻品种为‘润珠香占’,由湖北中香种业科技股份有限公司提供。选取饱满的成熟胚为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 挑选饱满成熟水稻种子,手工剥去颖壳,用自来水冲洗30min,在超净工作台上用

无菌水冲洗4次,75%乙醇浸泡30s,0.1% HgCl2 消毒8min,再用无菌水冲洗4~6次。将成熟胚接种

于不同类型的培养基中,置于(25±2)℃温度下、光周期为12h/d、光照为1500~2000lx、相对湿度为

60%~70%的培养室中进行培养。

1.2.2 不同培养基类型对愈伤的诱导 每种培养基(N6、B5、MS、WPM)内加入30.0g/L蔗糖和6.0g/L

琼脂,pH 调至6.0±0.2,加入2.0mg/L2,4-D、0.1mg/LVB8、1.0mg/LVB1、1.0mg/LVB6,放入高

压灭菌锅中121℃下灭菌20min。在超净工作台上将成熟胚放进培养基中,共4种类型的培养基,每种

培养基处理7瓶,每瓶接入成熟胚3个,15d后,观察水稻种子成熟胚出愈情况并记录数据。

1.2.3 不同浓度2,4-D对愈伤组织的诱导 以 N6 为基本培养基,加入30.0g/L蔗糖、6.0g/L琼脂、

pH 调至6.0±0.2,加入0.1mg/LVB8、1.0mg/LVB1、1.0mg/LVB6 后,分别加入6种不同质量浓度

2,4-D(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L),放入高压灭菌锅中121℃下灭菌20min,在超净工作台上完成

接种工作。共6个梯度,每个浓度重复3次,每个浓度梯度接种5瓶,每瓶3个接入愈伤组织。接种完成

后,置黑暗条件下36d,观察记录并计算诱导率。

1.2.4 不同植物生长物质浓度配比对愈伤组织不定芽的分化 将分化能力强的愈伤组织接种至 N6+

30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂,pH 调至6.0±0.2,加入0.1mg/LVB8、1.0mg/LVB1、1.0mg/LVB6

48 安徽科技学院学报 2024年

后,加入8种不同浓度的6-BA、KT、NAA,放入高压灭菌锅中121℃下灭菌20min。在超净工作台上选

取生长状态良好的愈伤组织为外植体,接至不同浓度6-BA、KT、NAA 的培养基中。共8组处理,每组

3次重复。32d后统计数据并计算愈伤分化率。

1.3 试验数据处理

使用SPSS软件对数据进行单向方差分析、双向方差分析和邓肯多重范围检验,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同培养基类型对愈伤诱导的影响

由表1可知,培养15d后,B5、MS与 N6 培养基差异不显著,WPM 与 N6、B5、MS培养基差异显著。

且 N6 培养基诱导的愈伤组织为淡黄色,分化能力强。因此,N6 为水稻愈伤组织诱导的最佳培养基。

表1 不同培养基类型对愈伤诱导的影响

Table1 Effectsofdifferentmediatypesoncallusinduction

培养基类型 出愈率/% 愈伤组织生长状态

N6 100.00a 淡黄色,颗粒状

B5 96.82±0.06a 白色,紧实

MS 92.85±0.03a 白色,紧实

WPM 76.19±0.05b 褐色,糊状

注:表中不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 不同2,4-D浓度对诱导愈伤组织的影响

由表2可知,不同2,4-D浓度诱导的水稻愈伤组织之间存在显著差异。B4 与B1、B2、B3、B5、B6 处理

组之间存在显著差异;B1、B2、B5、B6 与B3处理组之间存在显著差异;B5 和B6 处理组之间差异不显著。

因此,水稻愈伤组织诱导适宜的2,4-D浓度为2.0mg/L。

表2 不同2,4-D浓度对愈伤组织诱导的影响

Table2 Effectsofdifferent2,4-Dconcentrationsoncallusinduction

处理组 ρ(2,4-D)/(mg/L) 诱导率/% 愈伤组织生长状态

B1 0.5 28.33±0.04e 褐色,颗粒状

B2 1.0 40.53±0.01d 褐色,颗粒状

B3 1.5 78.89±0.04b 白色,紧实

B4 2.0 100.00a 淡黄色,致密颗粒状

B5 2.5 60.00±0.05c 白色,紧实

B6 3.0 53.89±0.03c 白色,紧实

2.3 不同植物生长物质浓度配比对愈伤组织不定芽分化的影响

将愈伤组织切成0.5cm2 的小块接至分化培养基中,培养20d后愈伤组织长出嫩绿色小芽,32d左

右长出肉眼可见的嫩芽(见图1)。由表3可知,T5 处理组与其他处理组存在显著差异;T7 与 T1、T2、T3、

T4、T6、T8 处理组之间差异显著;T6 与 T1、T3、T8 处理组之间差异不显著。当 NAA 浓度为0.5mg/L

时,愈伤组织分化率较低,且丛生芽生长情况由黄色逐渐变为褐色,甚至死亡;但随着 NAA 浓度增加至

1.0mg/L时,愈伤组织分化率显著高于0.5 mg/L;当其为1.0 mg/L 时,加入1.0 mg/L6-BA 和

1.0mg/LKT,愈伤分化率为71.67%;而加入1.0mg/L6-BA和2.0mg/LKT,愈伤组织分化不定芽的

能力较弱,低于50%。因此,当6-BA、KT、NAA的浓度为1∶1∶1时,愈伤组织分化不定芽能力强。

第38卷第1期 唐靖雯,等:水稻愈伤组织诱导及不定芽分化培养体系建立 49

图1 水稻愈伤组织的诱导及不定芽分化培养生长过程

Fig.1 Inductionofricecallusandgrowthprocessofadventitiousbuddifferentiationculture

注:A为 N6 培养基中成熟胚诱导的愈伤组织(15d);B为愈伤组织生长情况(36d);C为愈伤组织诱导的不定芽生长情况(32d);

D为愈伤组织诱导的不定芽生长情况(50d)。

表3 不同植物生长物质浓度配比对愈伤组织从生芽分化的影响

Table3 Effectsofdifferentplantgrowthsubstanceconcentrationsandproportionsoncallusdifferentiationfrombuds

处理组

试验因素

ρ(6-BA)/(mg/L) ρ(KT)/(mg/L) ρ(NAA)/(mg/L)

分化率/%

T1 1.0 1.0 0.5 28.00±0.04cd

T2 2.0 1.0 0.5 23.00±0.03d

T3 1.0 2.0 0.5 24.67±0.02cd

T4 2.0 2.0 0.5 20.33±0.03d

T5 1.0 1.0 1.0 71.67±0.04a

T6 2.0 1.0 1.0 33.33±0.09c

T7 1.0 2.0 1.0 43.00±0.06b

T8 2.0 2.0 1.0 25.67±0.10cd

3 结论与讨论

本试验通过对培养基类型、植物生长物质浓度等对水稻组织培养过程的影响进行筛选得出,N6 为诱

导水稻愈伤组织的最佳培养基,出愈率达到100%。最佳培养基配方为 N6+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼

脂+2.0mg/L2,4-D+0.1mg/LVB8+1.0mg/LVB1+1.0mg/LVB6,诱导出的愈伤组织结构紧实、

颜色微黄,适于诱导分化苗。在探讨不同植物生长物质浓度比例对水稻愈伤组织不定芽分化的影响中,当

6-BA、KT、NAA的质量浓度比为1∶1∶1时,愈伤组织分化率达到71.67%,即最佳培养基配方为 N6+

30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LKT+1.0mg/LNAA+2.0mg/L2,4-D+

0.1mg/LVB8+1.0mg/LVB1+1.0mg/LVB6。本研究建立了水稻愈伤组织诱导及不定芽分化培养

体系,为水稻育种奠定了研究基础。

通过试验得出,不同培养基对水稻组织培养具有一定的影响。以成熟胚为外植体,采用 N6、B5、MS

培养基为主。本研究得出,N6 较其他培养基而言,对水稻愈伤组织的诱导有着积极的作用。张玲等[13]在

水稻组织培养研究中表明 N6 对愈伤组织诱导有较好的促进作用;本研究结果与张智奇等[14]、袁云香

等[15]研究结果一致。

研究表明,植物生长物质在植物组织培养中起着较大的作用[16-17]。本试验中2.0mg/L2,4-D愈伤

50 安徽科技学院学报 2024年

组织诱导为100%,与阎丽娜等[18]研究结果相同。郭晓丽等[19]研究同样表明加2.0mg/L2,4-D可提高

愈伤组织的诱导率,与本研究结果相同。生长素和细胞分裂素共同作用对于诱导不定芽的分化和生长有

着积极的作用[20]。本试验NAA是重要的激素之一,同时配以6-BA、KT效果较好,与朱克明等[21]所用的

激素名称一致,具体浓度不一致,可能是因为不同水稻品种对激素的耐受能力及敏感性不同。

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(责任编辑:顾文亮)

第38卷第1期 唐靖雯,等:水稻愈伤组织诱导及不定芽分化培养体系建立 51

安徽科技学院学报,2024,38(1):52-57

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-04-30

基金项目:安徽省自然科学基金(2308085MC90);作物抗逆育种与减灾国家地方联合工程实验室开放基金(NELCOF20190102);安徽

省高校自然科学研究项目(KJ2017A510,KJ2019A0814);安徽省重点研究与开发计划项目(202104a06020001);凤阳县科技

计划项目(NY2022-05);国家级大学生创新创业训练计划项目(202110879085)。

作者简介:杨胜雨(1999-),女,安徽广德人,硕士研究生,主要从事植物病害化学防治研究,E-mail:17856097851@163.com。

通信作者:段海明,副教授,E-mail:duanhm@ahstu.edu.cn。

18种化学杀菌剂及混配组合对高粱附球菌的抑制效果

杨胜雨1, 段海明2* , 孟祥涛1, 陈 甦2, 周 慧1

(1.安徽科技学院 资源与环境学院,安徽 凤阳 233100;2.安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100)

摘 要:目的:探究化学杀菌剂单剂及其混配对高梁附球菌(E.sorghinum)的抑制活性,旨在找出抑菌效

果最佳的混配组合。方法:采用 Horsfall的方法设计2种化学杀菌剂的混配试验,采用菌丝生长速率法求

出各配比的抑菌率和毒性比率。结果:咯菌腈对高粱附球菌的抑制活性最高,EC50 达0.32mg/L;其次为

咪鲜胺和氟硅唑,EC50 分别为0.38、0.52mg/L。百菌清、溴菌腈和代森锰锌对病菌的抑制活性较弱,EC50

分别为69.24、79.51、84.40mg/L。氟硅唑和克菌丹以6∶4的比例混配抑制效果最佳,毒性比率达1.40,

以2∶8比例的混配毒性比率达1.35;咪鲜胺与咯菌腈以3∶7的比例混配,毒性比率达1.34;以5∶5的

比例混配毒性比率为1.31。溴菌腈与百菌清以8∶2的比例混配毒性比率最高,为1.33,其次为7∶3的

比例混配毒性比率为1.30。氟硅唑与百菌清以4∶6的比例混配,毒性比率为1.31;溴菌腈与代森锰锌以

7∶3的比例混配,毒性比率为1.28。结论:不同化学杀菌剂的混配对于高粱附球菌能够表现出较好的增

效抑制活性,且大多为选择性杀菌剂和保护性杀菌剂混配,能够较好发挥预防和治疗的效果,其中以氟硅

唑和克菌丹的混配组合增效最佳,其次是咪鲜胺和咯菌腈的混配组合。

关键词:高粱附球菌;化学杀菌剂;混配;抑制效果;毒力测定

中图分类号:S482.2+99 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)01-0052-06

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0009

Inhibitoryeffectsof18chemicalfungicidesandtheir

mixedcombinationsonEpicoccumsorghinum

YANGShengyu1, DUAN Haiming

2* , MENGXiangtao1, CHENSu2, ZHOU Hui1

(1.CollegeofResourceandEnvironment,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Theinhibitoryactivityofsinglechemicalfungicidesandtheirmixedcombinations

againstE.sorghinum wasinvestigatedinordertofindoutthebestmixedcombinationofantifungal

effects.Methods:ThemixedtestoftwochemicalfungicideswasdesignedbyHorsfallmethod.The

inhibitionrateofeachratiowasdeterminedbymycelialgrowthratemethod,andthetoxicityratiowas

calculated.Results:FludioxonilhadthehighestinhibitoryactivityagainstE.sorghinum withEC50 of

0.32mg/L,followedbyprochlorazandflusilazolewithEC50 of0.38,0.52 mg/L,respectively.The

inhibitoryactivitiesofchlorothalonil,bromothalonilandmancozebwereweak,andtheEC50was69.24,

79.51,84.40mg/L,respectively.Themixtureofflusilazoleandcaptanataratioof6∶4hadthebest

inhibitoryeffect,withatoxicityratioof1.40,andthemixtureataratioof2∶8hadatoxicityratioof

1.35.Prochlorazandfludioxonilweremixedataratioof3∶7,andthetoxicityratiowas1.34.The

toxicityratioof5∶5was1.31.Thehighesttoxicityratioofbromothalonilandchlorothalonilinthe

ratioof8∶2was1.33,followedby7∶3toxicityratioof1.30.Flusilazoleandchlorothalonilwere

mixedataratioof4∶6,andthetoxicityratiowas1.31.Thetoxicityratioofbromothalonilto

mancozebat7∶3was1.28.Conclusion:Themixtureofdifferentchemicalfungicidescouldshowgood

synergisticinhibitoryactivityagainstE.sorghinum,and mostofthem were mixed withselective

fungicidesandprotectivefungicides,whichcouldbetterplaytheroleofpreventionandtreatment.

Amongthem,themixedcombinationofflusilazoleandcaptanhadthebestsynergisticeffect,followed

bythecombinationofprochlorazandfludioxonil.

Keywords:Epicoccumsorghinum;Fungicide;Mixture;Inhibitioneffect;Toxicitydetermination

高梁附球菌(E.sorghinum)是热带及亚热带地区的一种常见植物病原菌,通常在作物收获前后泛

滥,导致植物发生病害并造成较大损失[1-3],同时也是植物叶鞘组织最常见的内生真菌之一[4]。目前,全球

气候变暖等不利环境因素致使植物病害的发生情况复杂多变,发生危害范围正逐步扩大[5]。可以预测,高

粱附球菌的传播蔓延对农业生产具有较大的潜在危害性,甚至会演变成为重要的植物病原生物。因此,对

高粱附球菌的高效防治措施研究已迫在眉睫。

有报道称,高粱附球菌可以侵染玉米茎叶,使玉米植株产生多种病害,并在其它多种农作物上也发现

了由E.sorghinum 引起的植物叶斑病[6-7]。该真菌的寄主范围广泛,包括禾本科[8-10]、蜡梅科[11]、猕猴桃

科[12]、菊科[13]、茶科[14]、酢浆草科[15]、十字花科[16]、百合科[17]等科属,可侵染包括叶、茎、根系在内的多种

植物器官,在病菌适宜生长条件下可导致植物大面积受害,甚至死亡。但目前关于不同化学杀菌剂对高粱

附球菌的毒力测定研究鲜见报道,对于其危害防控经验更是不足。为了减少高粱附球菌对农业生产造成

的潜在损失,尽早开展相对应的化学杀菌剂筛选具有重要意义,筛选出增效混配组合是实现药剂减量化的

一种重要手段[18-20]。因此,本研究在杀菌剂单剂筛选的基础上,开展混配组合筛选,旨在筛选新型高效的

复配剂,为该病菌引起病害的治理工供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试药剂:96.2%氟硅唑原药、95.6%丙环唑原药、97.5%咪鲜胺原药、95%吡唑醚菌酯原药、98%异

菌脲原药、96.4%苯醚甲环唑原药、95%己唑醇原药、97.5%肟菌酯原药、97%戊唑醇原药、95%克菌丹原

药、98%咯菌腈原药、95%己唑醇原药、97.2%氟环唑原药、95%腈菌唑原药、95%溴菌腈原药、96%醚菌酯

原药,均由安徽省锦江农化有限公司提供。98.5%腐霉利原药和85%代森锰锌原药分别由江西禾益化工

股份有限公司和山东潍坊双星农药有限公司提供。

供试菌株:高粱附球菌(E.sorghum)由安徽科技学院植物病害防治实验室保存。

供试培养基:PDA培养基[21]。

1.2 测定项目及分析方法

1.2.1 不同化学杀菌剂对高粱附球菌的毒力测定 18种化学杀菌剂原药用丙酮溶解配制成5g/L母

液。通过预试验,确定药剂浓度范围后,将母液进行梯度稀释,配制成不同浓度的药液备用(表1)。利用

菌丝生长速率法[22]测定百菌清、咪鲜胺、腐霉利、代森锰锌、丙环唑等18种化学杀菌剂对高粱附球菌的抑

第38卷第1期 杨胜雨,等:18种化学杀菌剂及混配组合对高粱附球菌的抑制效果 53

制活性。接种完菌饼后放置于26℃培养箱中恒温恒湿培养120h,采用十字交叉法测量菌落直径均值。

采用SPSS25.0软件分别求出18种化学杀菌剂对病菌的毒力回归方程、EC50、95%置信区间和R2。

表1 18种药剂质量浓度梯度设置

Table1 Concentrationsettingofeighteenfungicides

药剂 药剂质量浓度/(mg/L)

咯菌腈 0.20 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00

咪鲜胺 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00 12.00

氟硅唑 1.00 2.00 4.00 8.00 12.00 24.00

己唑醇 0.20 0.40 0.80 1.60 3.20 4.80

苯醚甲环唑 0.10 0.20 0.40 0.60 0.80 1.60

异菌脲 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00

丙环唑 0.50 1.00 2.00 4.00 6.00 8.00

腐霉利 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00

氟环唑 1.00 2.00 4.00 8.00 12.00 16.00

腈菌唑 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00 32.00

吡唑醚菌酯 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00 32.00

肟菌酯 2.00 4.00 8.00 16.00 32.00 48.00

戊唑醇 2.00 4.00 8.00 16.00 24.00 32.00

醚菌酯 4.00 8.00 16.00 32.00 48.00 64.00

克菌丹 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00

百菌清 2.00 4.00 8.00 16.00 24.00 32.00

溴菌腈 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00 24.00

代森锰锌 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00

1.2.2 室内混配药剂筛选 基于不同作用机制以及保护性和选择性杀菌剂相配合的原则,开展药剂的混

配试验。代森锰锌、百菌清、克菌丹为多作用位点杀菌剂,其余15种均为现代选择性杀菌剂;咯菌腈、异菌

脲和腐霉利为信号转换抑制剂,醚菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯为细胞色素bc1Qo位泛醌醇氧化酶抑制剂,

溴菌腈为具有高度亲电子中心的选择性抑制剂,其它11种都是麦角甾醇生物合成抑制剂。按上述原则选

定的2种化学杀菌剂开展混配试验[23]。按其EC50 值剂量的比例分别设置0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、

5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0等11个配比,每个配比设置6个重复,用无菌水处理组作对照。采用

菌丝生长速率法测定各配比的抑菌率,计算出实际抑菌率、理论抑菌率以及毒性比率[24]。当毒性比率>1

时,为增效作用;当毒性比率<1时,为拮抗作用;当毒性比率为1时,为相加作用。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌剂对高粱附球菌的毒力测定

由表2可以得出,己唑醇、咯菌腈、咪鲜胺、氟硅唑、苯醚甲环唑和异菌脲等6种药剂对高粱附球菌均

具有较好的抑制效果,EC50 均低于1.00mg/L。其中,咯菌腈对高粱附球菌的抑制活性最强,EC50 达

0.32mg/L,其次为咪鲜胺和氟硅唑,EC50 分别为0.38、0.52mg/L。百菌清、溴菌腈和代森锰锌对病菌

的抑制活性较弱,EC50 分别为69.24、79.51、84.40mg/L。

2.2 不同化学杀菌剂混配对高粱附球菌的毒性比率

从图1可以看出,氟硅唑和克菌丹、百菌清配合,溴菌腈和百菌清、代森锰锌的配合以及咪鲜胺和咯菌

腈的配合对高粱附球病菌的抑制效果均表现为增效作用。其中以6∶4比例的氟硅唑与克菌丹混配抑制

效果最佳,毒性比率达1.40。以3∶7的比例混配咪鲜胺与咯菌腈,毒性比率为1.34;当二者混配比为

5∶5时,毒性比率为1.31。溴菌腈和百菌清以8∶2的比例混配时毒性比率最高,为1.33;其次为7∶3

比例时毒性比率为1.30。氟硅唑与百菌清以4∶6的比例混配时毒性比率为1.31。溴菌腈与己唑醇、苯

醚甲环唑混配则表现出拮抗作用。由图2可以看出,高粱附球菌对照处理组菌落内缘有轻微红褐色出现,

外缘部呈白色,菌丝舒展正常,而经过杀菌剂混配处理的菌落直径与对照组直径对比则明显减小,部分混

配比例还产生了红色分泌物,而且抑制效果越好的组合,中央暗褐色面积越大,颜色更深。高粱附球菌对

54 安徽科技学院学报 2024年

照组菌丝较细、近乎无色、表面光滑,混配增效组处理后的高粱附球菌菌丝较粗、表面粗糙、菌丝弯曲、颜色

多呈现褐色,部分菌丝膨胀,有大量囊泡出现。

表2 18种化学杀菌剂对高粱附球菌的室内毒力

Table2 Indoortoxicityof18chemicalfungicidestoE.sorghinum

药剂名称 毒力回归方程(y=a+bx) EC50/(mg/L)(95%置信区间) R2

咯菌腈 y=0.49+0.99x 0.32(0.23~0.41) 0.93

咪鲜胺 y=0.23+0.56x 0.38(0.27~0.68) 0.92

氟硅唑 y=0.21+0.68x 0.52(0.21~0.89) 0.95

己唑醇 y=0.30+1.41x 0.61(0.48~0.74) 0.96

苯醚甲环唑 y=0.10+0.99x 0.79(0.64~1.05) 0.92

异菌脲 y=0.01+2.50x 0.97(0.86~1.08) 0.94

丙环唑 y=-0.23+0.89x 1.82(1.42~2.27) 0.96

腐霉利 y=-0.646+1.62x 2.50(1.87~3.50) 0.90

氟环唑 y=-1.09+1.55x 5.06(4.38~5.93) 0.98

腈菌唑 y=1.21+1.38x 7.52(6.43~8.87) 0.96

吡唑醚菌酯 y=-0.81+0.89x 8.04(6.41~10.35) 0.93

肟菌酯 y=0.44+0.48x 12.21(7.69~20.27) 0.96

戊唑醇 y=-2.85+2.52x 13.47(11.69~15.49) 0.94

醚菌酯 y=-0.57+0.46x 17.28(10.39~27.29) 0.93

克菌丹 y=3.77+2.25x 47.17(43.18~52.06) 0.97

百菌清 y=-1.50+0.82x 69.24(44.06~146.64) 0.93

溴菌腈 y=-1.99+1.04x 79.51(43.54~326.78) 0.90

代森锰锌 y=-2.62+1.36x 84.40(66.49~138.06) 0.97

图1 化学药剂混配对高粱附球菌的毒性比率

Fig.1 ToxicityratioofchemicalagentsmixedwithE.sorghinum

图2 化学药剂混配对高粱附球菌的抑制效果

Fig.2 SynergisticeffectofchemicalagentsontheinhibitionofE.sorghinum

注:A为对照;B为咪鲜胺∶异菌脲=9∶1;C为氟硅唑∶克菌丹=7∶3;D为氟硅唑∶克菌丹=6∶4;E为对照菌丝生长情况;F为

复配处理后菌丝生长情况。

第38卷第1期 杨胜雨,等:18种化学杀菌剂及混配组合对高粱附球菌的抑制效果 55

3 结论与讨论

高粱附球菌是高粱籽粒霉菌复合体中最常见的真菌之一,一直被视为一种植物弱寄生菌[25-26],也有

研究表明高粱附球菌可以作为植物幼苗根部的病原菌[27]。高粱附球菌侵染种子的包皮及胚乳且让感染

的种子表面产生虫害[28]。目前,高粱附球菌已从大约80个不同的寄主植物属以及牛饲料和家禽饲料等

基质中分离出来,足以说明该菌在自然环境中存在的广泛性,应引起足够重视。

目前,化学杀菌剂种类繁多,化学防治仍是防治各种植物病害最有效的手段之一。有研究表明,通过

药剂混配可以使药效提升、毒力增大。另一方面可以降低药液使用量和使用次数[29]。但现有研究对高粱

附球菌的化学抑制研究较少且不深入。王晗等[30]报道了7种杀菌剂对高粱附球菌菌丝的生长抑制情况,

表明在杀菌剂质量浓度为300mg/L时,苯醚甲环唑、戊唑醇和异菌脲等3种供试杀菌剂对高粱附球菌的

抑制率分别达到100.0%、97.7%和98.5%;当杀菌剂终质量浓度达到1mg/L时,噁霜·锰锌、戊唑醇、

精甲霜·锰锌、异菌脲、苯醚甲环唑等5种供试杀菌剂可以完全抑制病原菌在PDA培养基上的生长。苯

醚甲环唑对高粱附球菌较高的抑制性与本研究结果一致。曾慧兰等[31]的室内筛选结果表明,啶酰菌胺对

高粱附球菌的抑制作用最强,其次是咯菌腈和嘧菌环胺,EC50 值分别达到0.011、0.671、0.966mg/L;其

中嘧霉胺的效果最差,EC50 为2.168mg/L,本研究结果同样表明,咯菌腈对高梁附球菌的抑制效果最佳,

其次为咪鲜胺、氟硅唑等唑类杀菌剂。Li等[32]报道高粱附球菌和其它4种病原菌相互作用引发杨梅枝枯

病;室内杀菌剂筛选的结果表明,咪鲜胺(铜盐)是田间应用防效最好的杀菌剂,其次是吡唑醚菌酯、15%苯

醚甲环唑+15%丙环唑、苯醚甲环唑和腈菌唑。张艳婷[33]发现氟啶胺与解淀粉芽孢杆菌LAJ5按3∶7比

例混配后,对高粱附球菌引起的草莓茎基腐病的防治起到明显增效作用。段宝忠等[34]用嘧菌酯、多菌灵

和三唑酮等内吸性杀菌剂与代森锰锌等保护性杀菌剂进行混配来防治由高粱附球菌引起的滇重楼叶斑

病,可以对其产生较好的防治效果。现有对抑制高粱附球菌的混配杀菌剂研究较少,但从已有的研究结果

可以看出,杀菌剂混配使用可以促使药效得到进一步的提升。本试验结果表明麦角甾醇生物合成抑制剂

氟硅唑和多作用位点保护剂克菌丹混配比例为6∶4时毒性比率达到最高,对高粱附球菌的抑制效果也最

好,其次为麦角甾醇生物合成抑制剂咪鲜胺和信号转换抑制剂咯菌腈混配比例为3∶7时毒性比率可达到

1.34。可以推测不同作用机制的杀菌剂在混合施用时攻击病原菌多个位点,从而使病菌对药剂的敏感性

增强,表现出较为显著的增效结果。但由于室内环境与田间存在较大差异,下一步可通过盆栽和大田试验

进一步验证研究所得结果的可靠性。

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(责任编辑:顾文亮)

第38卷第1期 杨胜雨,等:18种化学杀菌剂及混配组合对高粱附球菌的抑制效果 57

安徽科技学院学报,2024,38(1):58-64

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-04-13

基金项目:农业农村部生物有机肥创制重点实验室开放课题(BOFA202010);安徽省大学生创新创业训练计划项目(S202210879123);

安徽省现代农业产业技术体系建设专项(皖农科函〔2021〕711号);芜湖市“两强一增”科技专项(2022ly17)。

作者简介:赵丹丹(1998-),女,安徽亳州人,硕士研究生,主要从事富硒有机肥应用研究,E-mail:zdd697298@163.com。

通信作者:邢素芝,教授,E-mail:Xingsz0906@qq.com。

叶面喷施亚硒酸钠对基质栽培辣椒产量和品质的影响

赵丹丹1, 周沪生1, 陈 鹏1, 裴文霞1, 袁先福1, 汪建飞1,2, 邢素芝1,2*

(1.安徽科技学院 资源与环境学院,安徽 凤阳 233100;

2.农业农村部生物有机肥创制重点实验室,安徽 蚌埠 233400)

摘 要:目的:研究叶面喷施亚硒酸钠对辣椒的产量、品质、硒及相关微量元素含量的影响,解析辣椒对亚

硒酸钠的积累及耐受特性,并筛选出有利于辣椒生长的最佳叶面喷施的亚硒酸钠浓度。方法:采用基质栽

培法,以“汴椒1号”辣椒品种为研究对象,设置5个亚硒酸钠质量浓度(0、50、100、150、200mg/L),各处

理辣椒喷施亚硒酸钠量均为50mL,每个处理设置3个重复。培育60d后,对辣椒的产量、品质、硒及相

关微量元素含量进行测定分析。结果:亚硒酸钠的施用对辣椒产量表现出“低浓度促进、高浓度抑制”的剂

量效应。亚硒酸钠质量浓度为100mg/L时,较对照处理(CK)产量增幅最大,达29%;当亚硒酸钠质量浓度

为150mg/L时,辣椒出现减产现象,较CK减产幅度达22.05%。当施用亚硒酸钠质量浓度为0~200mg/L

时,辣椒硒含量呈逐渐上升趋势,差异显著;辣椒果实中有机硒占总硒的百分比随着喷施亚硒酸钠浓度的

增加呈现出先升后降的趋势。对于各试验处理,当亚硒酸钠浓度逐渐增加时,辣椒果实中钙、铁、铜含量均

上升,但镁、锌含量无显著差异,粗蛋白、维生素C、总糖等品质指标含量均呈上升趋势。结论:叶面喷施适

宜浓度的亚硒酸钠能显著提高辣椒产量和果实中的硒、钙和铁的含量,有效改善辣椒品质。叶面喷施亚硒

酸钠质量浓度以50~100mg/L为宜。因此,在农业生产中,亚硒酸钠的合理使用是富硒农业发展的重要

方向之一,也是促进作物高产高效生产的重要环节。

关键词:辣椒;亚硒酸钠;叶面喷施;硒含量;产量;品质

中图分类号:S5-33 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)01-0058-07

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0010

Effectoffoliarseleniumenrichmentonyieldandfruitqualityofpepper

ZHAODandan1, ZHOU Husheng

1, CHENPeng

1, PEIWenxia1,

YUANXianfu1, WANGJianfei1,2, XINGSuzhi1,2*

(1.CollegeofResourcesandEnvironment,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.KeyLaboratoryofBio-organicFertilizerCreation,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,Bengbu233400,China)

Abstract:Objective:Tostudytheeffectsoffoliarsprayingsodium seleniteontheyield,quality,

selenium and related trace elementcontent of pepper,analyzethe accumulation and tolerance

characteristicsofpeppertosodiumselenite,andselectthebestconcentrationofsodiumselenitefor

peppergrowth.Methods:Thesubstratecultivation methodwasusedinthisstudy.BianjiaoNo.1

peppervarietywastakenastheresearchobject.Fiveconcentrationsofsodiumselenitewereset,which

were0,50,100,150,200mg/L,respectively.Theamountofsodiumselenitesprayedonpepperin

eachtreatmentwas50mL,andthreereplicatesweresetineachtreatment.After60daysofcultivation,

theyield,quality,seleniumandrelatedtraceelementsofpepperweredeterminedandanalyzed.Results:

Theapplication ofsodium seleniteshowedadoseeffectof\"low concentration promoting,high

concentrationinhibiting\"onpepperyield.Whentheconcentrationofsodiumselenitewas100mg/L,the

yieldincreasedby29%comparedwithCK.Whentheconcentrationofsodiumselenitewas150mg/L,

theyieldofpepperdecreasedby22.05%comparedwithCK.Whentheconcentrationofsodiumselenite

wasintherangeof0-200mg/L,theseleniumcontentofpeppershowedagradualupwardtrend,with

significantdifference;Thepercentageoforganicseleniumintotalseleniuminpepperfruitsincreased

firstandthendecreased withtheincreaseofsodium seleniteconcentration.Foreachexperimental

treatment,whentheconcentrationofsodiumselenitegraduallyincreased,thecontentofcalcium,iron

andcopperinpepperfruitsincreased,aswellascrudeprotein,vitaminC,totalsugarandotherquality

indicators,butthecontentofmagnesiumandzinchadnosignificantdifference.wererising.Conclusion:

Sprayingtheappropriateconcentrationofsediumseleniteontheleavescouldsignificantlyincreasethe

yieldandthecontentsofselenium,calciumandironinthefruits,andeffectivelyimprovethequalityof

pepper.Theoptimumconcentrationofsediumseleniteis50-100mg/L.Therefore,therationaluseof

sediumseleniteisoneoftheimportantdirectionsinthedevelopmentofSe-enrichedagriculture,itisalso

animportantlinktopromotehigh-yieldandefficientproductionofcrops.

Keywords:Pepper;Sediumselenite;Foliarspraying;Seleniumcontent;Output;Quality

目前研究已证实硒是构成哺乳动物体内30多种含硒蛋白质与含硒酶(如谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧

还原蛋白酶以及碘化甲腺原氨酸脱碘酶等)的重要组成成分,具有防衰老、抗肿瘤、抗毒等重要生理功能。

硒是人体必需的微量元素,人体缺硒易导致多种疾病,已查证有40多种疾病都因缺硒引起,严重缺硒还会

引发心肌病、心肌衰竭、大骨节病和克山病等[1-3]。这些病症的发生多与当地土壤中硒含量较低、膳食中硒

含量不足相关。据报道,中国缺硒地区高达72%,缺硒省份有22个,缺硒程度存在地域差异,部分地区极

度缺硒[3-4]。正在开展的全国第三次土壤普查首次把总硒含量作为土壤理化性质必检指标,足见国家对硒

与人体健康的重视。近年来,随着功能农业概念的普及推广,通过富硒农产品适当补硒、消除“隐性饥饿”、

促进身体健康的理念已被城乡居民广泛接受[5]。中国营养学会把硒列为15种人体必需的营养元素,建议

成人每日硒摄入量为50~250μg。科学补硒工作越来越受到重视,通过开发富硒农产品被认为是最佳的

补硒方式[6]。

辣椒(Capsicumannuum)属茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)草本植物,又名海椒、辣子、辣角、辣

茄等,是中国各地普遍种植的蔬菜品种之一。辣椒因其果实富含多种对人体有益的成分,如维生素C、维

生素E、矿物质、氨基酸和抗氧化物质而深受大众青睐[7-9]。赵玉玲等[10]对比了土壤穴施与叶面喷施硒肥

两种施肥方式,发现相比于土壤穴施,叶面喷施有机肥更有利于提高辣椒果实中总硒和有机硒含量以及果

实中有机硒的转化率。然而,富硒土壤生长的农产品不一定达到富硒标准[11],而不同的作物品种、生产环

境、栽培方式需要采取不同的富硒技术,才能生产出硒营养达标的功能农产品。当前,在温室或者植物工

厂环境下,采用基质栽培的辣椒面积不断扩大,如何在这一生产环境中,开发出相关的辣椒富硒生产技术,

对于提高辣椒附加值、市场竞争力以及农户增收都具有重要的意义。

本研究通过基质栽培试验,开展喷施不同浓度的亚硒酸钠对辣椒产量、总硒及有机硒含量、矿质元素

含量以及营养品质指标影响的研究,在探讨作物硒元素营养作用机理的同时,为温室和工厂化生产富硒辣

第38卷第1期 赵丹丹,等:叶面喷施亚硒酸钠对基质栽培辣椒产量和品质的影响 59

椒提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试辣椒品种为河南红绿辣椒种业有限公司培育而成的“汴椒1号”,供试亚硒酸钠(Na2SeO3,分析

纯)购于天津市福晨化学试剂厂,纯度为99%。

1.2 栽培基质

将泥炭土、蛭石、珍珠岩按1∶1∶1质量比充分混匀,制成培育基质[12-15]。将混匀的基质装入50个规

格为18cm(直径)×20cm(高)的塑料钵,装入量以基质表面距盆钵口沿下方1cm的位置为准。

1.3 基质盆栽辣椒

试验在安徽科技学院种植科技园2号温室大棚中进行。2019年11月12日,将辣椒种子催芽育苗;

2020年1月9日,将辣椒苗移栽到预先装好基质的培养钵中,每钵定植1株辣椒苗。统一进行日常水肥

和病虫害防治管理。

1.4 辣椒喷施亚硒酸钠试验方案

采用单因素完全随机试验设计,设置5个不同质量浓度亚硒酸钠处理,其含量分别为0(CK)、50、

100、150、200mg/L。每个处理3次重复,每钵喷施亚硒酸钠溶液用量均为50mL。

1.5 试验实施

为减少试验误差,待盆栽辣椒进入初花期,从定植的50钵辣椒中选取植株长势基本一致的25钵,用

于试验。

2020年4月24日,将同一浓度处理的5钵辣椒排成一排,5个处理浓度由低到高共排成5排。将

250mL亚硒酸钠溶液(CK是蒸馏水)装入手持喷雾器中,对同一处理的一排5钵辣椒喷施亚硒酸钠溶

液。喷施时,调整好喷雾速度和喷嘴方向,以保证富硒剂液滴尽可能均匀地分布在叶片上,同时,要保证同

一处理的每株辣椒叶片上喷施的溶液量基本一致。喷施作业时按照亚硒酸钠溶液浓度由低到高的顺序

进行。

分3次(2020年5月18日、6月1日、6月14日)采摘盆钵中长度达到7cm及以上的辣椒果实,称量

鲜质量;同一钵辣椒前后3次采样鲜果组成1个样品,果质量累加值作为每钵辣椒的产量。每个处理选取

产量居中的3个盆钵辣椒,作为试验的平行样本。

采摘的辣椒果实清洗晾干后,置于-4℃冰柜保存,鲜样用于测定总糖和维生素C含量;同时根据需

要从每个样品中选取部分果实杀青、烘干,用于测定总硒、有机硒、矿质元素以及粗蛋白含量。

1.6 指标测定方法

总硒和有机硒含量测定参照国家标准GB5009.93—2017《食品中硒的测定》;总糖含量采用硫酸蒽酮比

色法测定;维生素C含量采用2,6-二氯靛酚法测定;粗蛋白质含量测定参照《土壤农化分析》中的方法;微量

元素钙、镁、铁、锌、铜等含量测定分别参照国家标准GB5009.92—2016《食品中钙的测定》、GB5009.241—2017

《食品中镁的测定》、GB5009.90—2016《食品中铁的测定》、GB5009.14—2017《食品中锌的测定》、

GB5009.13—2017《食品中铜的测定》。

1.7 数据分析

采用SPSS19.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 喷施亚硒酸钠对辣椒产量的影响

从图1可以看出,随着叶面喷施亚硒酸钠浓度的增加,辣椒产量呈现出先增后降的趋势。喷施

100mg/L亚硒酸钠的辣椒产量最高,3钵辣椒平均鲜果质量为617.9g,比对照增产29%,差异显著

(P<0.05);随着喷施亚硒酸钠浓度的增加,辣椒产量则梯次下降。当喷施质量浓度为200mg/L时,每钵

60 安徽科技学院学报 2024年

辣椒的平均产量只有413.7g,仅为对照产量的86.4%,减产显著(P<0.05)。可见,喷施50~100mg/L亚

硒酸钠可以提高辣椒产量,而亚硒酸钠质量浓度超过150mg/L时,则会抑制辣椒产量的增加。

图1 喷施不同浓度亚硒酸钠对基质栽培辣椒产量的影响

Fig.1 Effectofsprayingdifferentconcentrationsofdisodiumseleniteonpepperyieldinsubstrateculture

注:不同英文字母表示差异显著(P<0.05),CK为对照处理。

2.2 喷施亚硒酸钠对辣椒果实硒含量的影响

叶面喷施不同质量浓度的亚硒酸钠对辣椒果实中硒含量、形态都有一定的影响(表1)。由表1可以

看出,随着叶面喷亚硒酸钠质量浓度的梯次增加,辣椒果实中总硒含量也逐步增加;相较于低浓度亚硒酸

钠处理,高浓度处理辣椒果实中总硒含量的增幅则呈现下降趋势。本试验中最高浓度亚硒酸钠喷施处理

的辣椒果实中总硒含量亦达到最大值,平均含量为2.322mg/kgDW。当喷施低于100mg/L亚硒酸钠

时,辣椒果实中有机硒含量随着喷施溶液浓度的增加而快速增加;当喷施大于100mg/L亚硒酸钠时,辣

椒果实中有机硒含量则不再增加,而是呈现一定的波动状态。

回归拟合分析发现,辣椒果实中总硒含量(YTSe)、有机硒含量(YOSe)与叶面喷施亚硒酸钠质量浓度

(x)之间存在着较显著的二次多项式相关性,其回归方程为YTSe=-0.1031x2+1.2232x-1.2041,R2=

0.9180;YOSe=-0.1160x2+1.0825x-1.0403,R2=0.8815。

表1数据还表明,辣椒果实中有机硒占总硒的百分比随着喷施亚硒酸钠浓度的增加呈现出先升后降

的趋势。当亚硒酸钠喷施质量浓度为50mg/L时,辣椒果实中有机硒占总硒比例为78.1%,是5个处理

中的最高值;当亚硒酸钠喷施质量浓度为100mg/L时,辣椒果实中有机硒占总硒比例降为76.9%,降幅

有限;喷施150、200 mg/L 亚硒酸钠时,辣椒果实中有机硒占总硒比例分别为69.5%、63.0%,均低

于70%。

表1 喷施不同浓度亚硒酸钠辣椒果实中总硒和有机硒含量

Table1 Totalandorganicseleniumcontentsinpepperfruitssprayedwithsodiumseleniteofdifferentconcentrations

ρ(亚硒酸钠)/(mg/L) 总硒含量/(mg/kg) 有机硒含量/(mg/kg) 有机硒占总硒百分比/%

0(CK) 0.056±0.021d 0.039±0.012d 70.1

50.0 0.424±0.034c 0.331±0.039c 78.1

100.0 1.918±0.019b 1.474±0.051a 76.9

150.0 1.938±0.028b 1.347±0.114b 69.5

200.0 2.322±0.169a 1.462±0.144a 63.0

注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05),CK为对照处理。下同。

2.3 喷施不同浓度亚硒酸钠对辣椒果实中矿质元素含量的影响

从表2可以看出,辣椒果实中Ca的含量随着叶面喷施亚硒酸钠溶液质量浓度的增加而增加,且质量

浓度高于100mg/L的3个处理辣椒果实中Ca含量均显著高于对照(P<0.05)。不同质量浓度亚硒酸

钠喷施处理的辣椒果实中的 Mg含量均低于对照,但各处理间差异不显著(P>0.05)。辣椒果实中微量

元素Fe的含量随着喷施硒浓度的增加而增加,且4个施用硒肥的处理均显著高于不施硒肥的对照

第38卷第1期 赵丹丹,等:叶面喷施亚硒酸钠对基质栽培辣椒产量和品质的影响 61

(P<0.05)。微量元素Zn、Cu的含量则随着叶面喷施亚硒酸钠溶液浓度的增加呈先增后降趋势,当喷施

质量浓度为150mg/L时,辣椒果实中Zn的含量为37.29mg/kg,Cu的含量为48.33mg/kg,均为各处

理中的最高值,显著高于对照(P<0.05)。

表2 喷施不同浓度亚硒酸钠对辣椒矿质元素含量的影响

Table2 Effectsofsprayingdifferentconcentrationsofsodiumseleniteonthecontentofmineralelementsinpepper

ρ(亚硒酸钠)/(mg/L) Ca/(mg/kg) Mg/(mg/kg) Fe/(mg/kg) Zn/(mg/kg) Cu/(mg/kg)

0(CK) 393.6±30.3b 489.4±3.1 52.32±7.38b 28.08±1.55c 40.97±0.28c

50.0 399.9±16.8b 484.7±2.6 66.34±8.02a 28.67±2.83c 45.70±0.47bc

100.0 459.4±10.4a 488.9±4.3 68.41±4.42a 35.14±2.09ab 48.14±0.61a

150.0 489.6±15.9a 481.4±5.8 77.78±8.72a 37.29±0.39a 48.33±0.50a

200.0 493.5±22.2a 487.6±3.4 78.07±4.61a 32.62±1.52b 46.87±0.84ab

2.4 喷施不同浓度亚硒酸钠对辣椒果实品质的影响

由表3可知,叶面喷施亚硒酸钠对辣椒果实中粗蛋白、总糖和维生素C含量等3项品质指标均有一定

的影响。施用亚硒酸钠4个处理的辣椒果实中粗蛋白的含量均有所增加,且喷施质量浓度为50、

100mg/L处理组显著高于不施硒肥的对照组(P<0.05);喷施亚硒酸钠的质量浓度高于100mg/L后,

辣椒果实中粗蛋白的含量又呈现下降态势,但差异不显著(P<0.05)。辣椒果实中维生素C含量受喷施

亚硒酸钠浓度影响的响应趋势与粗蛋白含量的变化规律相似,即施用亚硒酸钠的辣椒果实中维生素C的含

量均高于对照,其中质量浓度为100mg/L的处理辣椒中维生素C含量最高,平均值为34.90mg/100gFW,

显著高于不施硒肥的对照(P<0.05),但高浓度(>100mg/L)的亚硒酸钠对维生素C含量的增加却有抑

制作用。与对粗蛋白、维生素C含量的影响不同,随着亚硒酸钠质量浓度的增加,辣椒果实中总糖的含量

一直呈现增加趋势,施硒各处理的总糖含量依次比对照(CK)提高2.70%、8.10%、19.59%和58.78%,亚

硒酸钠喷施质量浓度为200mg/L的处理辣椒果实总糖含量最高,平均值为2.35mg/kgFW,显著高于

对照(P<0.05)。

表3 喷施不同浓度亚硒酸钠对辣椒果实品质的影响

Table3 Effectsofsprayingdifferentconcentrationsofsodiumseleniteonpepperfruitquality

ρ(亚硒酸钠)/(mg/L) ω(粗蛋白)/% 总糖/(mg/kg) 维生素C/(mg/100g)

0(CK) 12.61±0.29c 1.48±0.24b 30.48±1.15d

50.0 14.48±1.03ab 1.52±0.17b 33.51±0.56ab

100.0 15.22±1.41a 1.60±0.15b 34.90±1.15a

150.0 13.02±0.42bc 1.77±0.30b 32.66±0.57bc

200.0 13.69±0.76abc 2.35±0.49a 31.30±1.14cd

3 结论与讨论

目前硒元素还没有明确为植物生长发育所必需的营养元素,但众多研究表明,低浓度硒具有促进植物

生长、提高植物耐受能力的功能。本试验结果与这一提法吻合,当叶面喷施50~100mg/L亚硒酸钠溶液

时,可以显著提高基质栽培辣椒的产量。这可能与硒可促进植物抗氧化系统功能发挥、提高光合效率、修

复对环境胁迫造成的膜结构损伤密切相关[16]。Haghighi等[17]研究发现,在春夏季节温室中高温环境下,

施用适量的硒可以提高辣椒叶片POD(过氧化物酶)和SOD(超氧化物歧化酶)活性,降低 MDA(丙二醛)

含量,有利于开花坐果,减少高温引起的落花落果,促进产量的提高。

需要指出的是,硒作为一种有益的微量元素,其有益与毒害作用之间的阈值较小,大部分植物在高浓

度硒环境下表现出中毒现象,即呈现出“低浓度促进、高浓度抑制”的剂量效应[18-19]。本试验发现,当喷施

亚硒酸钠质量浓度高于150mg/L时,对辣椒增产有抑制作用。喷施硒肥5d后,2个高浓度处理的辣椒

叶片出现了米粒至黄豆大小的淡黄色失绿斑点,之后逐渐坏死、焦枯,且喷施浓度越高,叶片上中毒坏死的

斑点越多。这种毒害作用直接影响到叶片的光合作用,最终会影响辣椒产量。因此,在生产实践中,要根

据作物品种和环境条件,通过试验确定作物适宜的喷硒浓度与剂量,才能保证在获得富硒农产品的同时,

62 安徽科技学院学报 2024年

农作物的产量不降低甚至增产。

喷施硒肥的主要目的是增加辣椒果实中硒含量,生产富硒农产品,满足人们对硒营养的需求。本试验

条件下,随着喷施亚硒酸钠浓度的增加,辣椒果实中总硒的含量逐渐增加。伴随着总硒含量的增加,辣椒

果实中有机硒的含量也相应增加。特别地,当喷施亚硒酸钠质量浓度大于100mg/L时,辣椒果实中有机

硒含量不再相应增加,而呈现出一定的波动(表1)。随着喷施亚硒酸钠浓度的增加,辣椒果实中有机硒占

总硒的比例逐步下降,说明从叶片转移到果实中的硒越多,以无机形态存在的量就更多。中华人民共和国

供销合作行业标准《富硒农产品》(GH/T1135—2017)规定,富硒蔬菜(以干质量计)的标准是总硒含量为

0.10~1.00mg/kg,硒代氨基酸占总硒的比例大于65%。显然,本试验中喷施浓度为200mg/L的处理

的辣椒果实中两项指标均不达标。硒盐的毒理研究表明,无机硒均具有较大的毒性,有机硒化合物毒性

低,生物利用率高。因此,从食物安全的角度考虑,不宜喷施高浓度的硒肥。

施用硒肥还可以影响植物对矿质营养元素的吸收与利用,进而影响到食用器官中矿质营养元素的含

量[20]。王晋民等[21]研究发现,叶面喷施硒肥可不同程度提高胡萝卜 Ca、Mg、Fe、K 等矿质元素的含量;

Wen

[22]指出高浓度硒(Se)对作物食用器官中Ca、Mg和Zn含量有负面影响,然而,适宜的硒浓度则具有

积极影响。本试验结果也表明,适宜浓度的亚硒酸钠溶液,可以提高辣椒果实中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu的含

量,而浓度较高时,除了Fe元素,其他4个元素的含量均有下降态势。李磊等[23]研究表明,随着喷施硒溶

液浓度的上升辣椒果实中Ca的含量呈上升趋势,Mg的含量呈先下降后上升态势,Fe、Cu的含量则呈现

逐渐下降的趋势,这与本试验结果存在较大差异。Ragályi等[24]研究发现,随着灌溉水中硒含量的增加,

不同蔬菜食用器官中 Mg、Fe、Zn、Cu等元素的含量变化因蔬菜品种、土壤类型不同有较大的差异。

Longchamp等[20]添加不同浓度、不同形态的硒进行水培玉米试验,发现无论硒的形态与浓度如何,对玉

米植株中铁的积累都没有影响;添加低浓度的硒对Ca、Mg、Zn、Mn、Cu等元素含量没有影响;添加高浓度

的硒酸盐则有利于玉米植株中Ca、Mg、Zn、Mn、Cu元素积累,而亚硒酸盐或者是硒酸盐/亚硒酸盐混合物

则倾向于减少Ca、Mg、Zn、Mn、Cu元素积累,且2种盐的混合物对元素积累的抑制作用更显著。王建

伟[25]研究也发现,无论是土施,还是叶面喷施硒肥,对玉米、小麦产量及生物量均无显著影响,对2种作物

籽粒的 N、P、K、S、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu等大中微量元素含量也无显著影响;而单独土施,对马铃薯、小白

菜、大豆等作物的产量、生物量及可食部位上述9种矿质元素含量无显著影响。不难看出,硒对作物食用

器官中矿质元素含量的影响,因作物种类、栽培方式、硒肥形态及其用量用法、土壤类型等因素不同而存在

较大差异,有待于进一步全面而深入的研究。

本试验还发现,叶面喷施亚硒酸钠可以提高辣椒果实粗蛋白、总糖、维生素C等品质指标含量,但高

浓度的亚硒酸钠对粗蛋白、维生素C含量有抑制效应。这与李磊等[23]研究结果基本一致。陈蓉等[26]研

究表明,脐橙通过叶面施硒能提高果实中的可溶性糖、维生素C的含量。龚天芝等[27]研究发现,核桃施入

一定量的外源硒,能够提高核桃果实品质。武文玥等[28]研究表明,随着亚硒酸钠浓度的增加,甜荞籽粒的

蛋白质含量与还原糖含量均呈升高的趋势。王晋民等[21]研究表明,随着施用硒浓度增加,胡萝卜中维生

素C含量呈下降趋势。院金谒等[29]研究发现,适量的硒使大蒜中还原糖含量下降。显然,硒对作物品质

的影响也受到作物种类与品种、施用方法与用量等多种因素的影响。

叶面喷施适量的亚硒酸钠溶液可以提高温室环境下基质栽培辣椒果实的产量和品质。在一定的喷施

浓度范围内,随着硒浓度的增加,辣椒产量显著增加,总硒和有机硒含量增加,果实中矿质营养元素含量以

及粗蛋白、维生素C、总糖等品质指标含量均呈上升态势。但喷施高浓度的亚硒酸钠会造成辣椒减产,且

果实中硒的总量超标,有机硒占比下降,粗蛋白和维生素C含量的提升也受到抑制。综上,在本试验条件

下,既能增加基质栽培辣椒果实中总硒和有机硒含量,又有利于提高品质和产量,保证食品安全,节约硒肥

投入成本,叶面喷施50~100mg/L亚硒酸钠为宜。

第38卷第1期 赵丹丹,等:叶面喷施亚硒酸钠对基质栽培辣椒产量和品质的影响 63

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(责任编辑:顾文亮)

64 安徽科技学院学报 2024年

安徽科技学院学报,2024,38(1):65-70

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-03-21

基金项目:作 物 抗 逆 育 种 与 减 灾 国 家 地 方 联 合 工 程 实 验 室 开 放 基 金 (NELCOF20190102);安 徽 省 高 校 自 然 科 学 研 究 项 目

(KJ2017A510,KJ2019A0814);安徽省重点研究与开发计划项目(202104a06020001);凤阳县科技计划项目(NY2022-05)。

作者简介:周慧(1986-),女,安徽蚌埠人,硕士研究生,主要从事植物病害生物防治研究,E-mail:61787447@qq.com。

通信作者:段海明,副教授,E-mail:duanhm@ahstu.edu.cn。

生防菌代谢产物与化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的

抑制活性研究

周 慧, 段海明* , 杨胜雨, 张 健

(安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100)

摘 要:目的:为更有效防治棉花枯萎病和研制新型生物农药提供技术依据,本研究探究生防菌代谢产物

与化学杀菌剂对棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)的抑制活性。方法:采用对峙

培养法、菌丝生长速率法测定生防菌、发酵上清液、脂肽粗提物以及化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的抑制特性。

结果:对峙培养法得出生防菌SJ06对棉花枯萎病菌的抑制率为78.24%。发酵上清液的浓度从6.25μL/mL

增至100.00μL/mL对病菌的抑制率从46.90%增至80.30%,其对病菌的EC50 为7.37μL/mL;脂肽粗

提物的质量浓度从673.96μg/mL增至8120.00μg/mL对病菌的抑制率从19.90%增至77.30%,对病

菌的EC50 为2720.20μg/mL。棉花枯萎病菌对多菌灵、戊唑醇的敏感性较高,戊唑醇和多菌灵对病菌的

EC50 分别为0.34、0.49μg/mL;其次分别为腈菌唑、苯醚甲环唑和丙环唑,其对病菌的EC50 分别为1.07、

1.34、1.54μg/mL,而丙森锌对病菌的抑制活性较差,EC50 为63.25μg/mL。结论:解淀粉芽孢杆菌发酵

代谢物和戊唑醇等麦角甾醇生物合成抑制剂对棉花枯萎病菌具有较好的抑制活性。

关键词:棉花枯萎病;生防菌代谢产物;化学杀菌剂

中图分类号:S471 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)01-0065-06

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0011

Inhibitoryactivityofmetabolitesofbiocontrolbacteriaandchemical

fungicidesagainstFusariumoxysporumf.sp.vasinfectum

ZHOU Hui, DUAN Haiming

* , YANGShengyu, ZHANGJian

(CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Inordertoprovidetechnicalbasisformoreeffectivepreventionandcontrolof

cottonFusarium wiltandthedevelopmentofnew biologicalpesticides,thisstudyexploredthe

inhibitoryactivityof metabolitesofbiocontrolbacteriaandchemicalfungicidesagainstFusarium

oxysporumf.sp.vasinfectum.Methods:Theinhibitioncharacteristicsofbiocontrolbacteria,fermentation

supernatant,lipopeptidecrudeextractandchemicalfungicidesoncottonFusariumwiltweredetermined

byconfrontationculture methodand mycelialgrowthrate method.Results:Theinhibitionrateof

biocontrolstrainSJ06againstcottonFusarium wiltwas78.24% byconfrontationculture.Whenthe

concentrationoffermentationsupernatantincreasedfrom6.25μL/mLto100.00μL/mL,theinhibitionrate

increasedfrom46.90%to80.30%,andtheEC50 was7.37μL/mL.Theinhibitionrateincreasedfrom

19.90%to77.30% whentheconcentrationoflipopeptidecrudeextractincreasedfrom673.96μg/mLto

8120.00μg/mL,andtheEC50oflipopeptidecrudeextracttopathogenwas2720.20μg/mL.Cotton

Fusariumwiltwashighlysensitivetocarbendazimandtebuconazole.TheEC50tothepathogenwas

0.34μg/mLand0.49μg/mL,respectively.TheEC50 ofmyclobutanil,difenoconazoleandpropiconazole

againstpathogenswere1.07,1.34,1.54μg/mL,respectively.Theinhibitoryactivityofpropinebagainst

bacteriawaspoor,theEC50 was63.25μg/mL.Conclusion:Bacillusamyloliquefaciensfermentation

metabolitesandergosterolbiosynthesisinhibitorssuchastebuconazolehavegoodinhibitoryactivity

againstFusariumoxysporumf.sp.vasinfectum.

Keywords:CottonFusariumwilt;Metabolitesofbiocontrolbacteria;Chemicalfungicides

棉花是我国重要的经济作物之一,其产量一直位于世界前列,然而棉花枯萎病对我国乃至全球范围内

的棉花产量与质量均造成严重损失,属于毁灭性病害[1]。棉花枯萎病在棉花整个生育期都会引起危害,苗

期会引起棉苗大量死亡,棉花生长后期会导致植株枯萎、铃重减轻,对棉花种子的发芽率、成熟度以及棉花

纤维的强度与长度都会产生重要影响,开展该病害的防治措施研究具有重要意义[2]。

目前,棉花枯萎病的防治措施主要以化学防治为主。李海微等[3]得出0.30%四霉素水剂可有效防治

南疆地区棉花枯萎病 DD11和 DD22菌株,抑菌效果分别达97.91%和99.35%;郭明程等[4]研究表明

60%吡唑醚菌酯·代森联 WG以1080g/hm2 的剂量防治棉花枯萎病,防效为58.52%~62.84%,并具

有促生增产作用;郑德有等[5]发现宁南霉素对棉花枯萎病菌抑制率达68.24%,EC50 为8.03mg/L。生物

防治由于绿色无污染而日益引起研究者的重视。戴蓬博等[6]采用生物学特性观察和16SrDNA基因序列

分析等方法得出菌株SC11为壮观链霉菌(Streptomycesspectabilis)是一株棉花枯萎病拮抗菌,其防效可

达42.51%,且能提高棉花产量。张克诚等[7]进行了室内和田间试验得出了链霉菌(Streptomycesspp.)

S-5能有效抑制棉花枯萎病菌,防治效果为66.50%;Hao等[8]从棉花根组织分离得到的内生细菌 DG3-1

抑制棉花枯萎病同时增加叶绿素含量,鉴定为耐盐农杆菌(Agrobacteriumspp.)。赵莹莹等[9]采用枯草

芽孢杆菌 KXZ-33发酵液处理种子和地上部喷施10mg/L的甲基硫菌灵相结合可以提高防治棉花枯萎

病的效果;高景凯等[10]从广东石豆兰中筛选内生细菌-枯草芽孢杆菌BK27发酵液,其对棉花枯萎病尖孢镰

刀菌萎蔫专化型抑制率为60.78%。化学农药大量过频使用会引起病菌抗药性、药物残留和环境污染等突出

问题威胁农产品安全[11]。生物防治对环境无污染,但是对病害发挥效应较为缓慢。因此,化学防治和生物防

治结合起来开展棉花枯萎病的防治具有重要意义。本研究开展了8种化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的室内抑

制活性和解淀粉芽孢杆菌所产发酵上清液和脂肽粗提物对病菌的的抑制效果研究,旨在筛选出对棉花枯萎

病菌抑制效果较好的化学药剂和生防菌株,从而为后续棉花枯萎病的综合治理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试杀菌剂 95%苯醚甲环唑原药、96%戊唑醇原药、96%腈菌唑原药、96%多菌灵原药、95%甲

基硫菌灵原药、97.6%萎锈灵原药、95.6%丙环唑原药由安徽省锦江农化有限公司提供。70%丙森锌可湿

性粉剂由拜耳作物科学有限公司提供。多菌灵使用0.1mol/LHCl溶液配成1.0×104μg/mL,其它杀菌

剂原药采用丙酮溶解,配制成1.0×104μg/mL母液,置于4℃冰箱中保存备用;丙森锌由灭菌水溶解配

制而成。

1.1.2 供试菌株和培养基 棉花枯萎病病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)和解淀粉芽孢

66 安徽科技学院学报 2024年

杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SJ06由本研究室提供。供试培养基包括PDA 培养基、NA 培养基和

NB培养基[12]。

1.2 试验方法

1.2.1 解淀粉芽孢杆菌SJ06与棉花枯萎病菌的对峙培养 接种环挑取SJ06菌苔接入距PDA平板中心

相互垂直2cm的四点处,再将棉花枯萎病菌菌饼(直径7mm)接至平板中心,以不接细菌的平板为对照,

重复3次,置于26℃恒温箱中培养,4d后测量病菌直径,计算抑制率。

1.2.2 不同稀释倍数的发酵上清液对棉花枯萎病菌的抑制活性测定 接种解淀粉芽孢杆菌SJ06至 NB

培养基中,发酵培养时间为72h。培养结束后以10000r/min,4℃离心制得发酵上清液分别稀释到不同

的浓度,然后取5mL加入到冷却到50℃左右的45mLPDA培养基充分混匀,使得发酵上清液在PDA

培养基中的终浓度分别为6.25、8.33、12.50、25.00和100.00μL/mL,中央接种病菌后置于26℃恒温箱

中培养96h,然后按照十字交叉法测定不同稀释倍数的发酵上清液处理病菌的菌落直径,采用SPSS13.0

软件计算发酵上清液对棉花枯萎病菌的EC50。

1.2.3 脂肽粗提物的制备及抑制活性测定 采用李宝庆等[13]方法制备脂肽粗提物,将制得的脂肽粗提

物稀释不同梯度,取5mL的脂肽粗提物与冷却到50℃的45mLPDA培养基充分混匀,使得脂肽粗提物

的含量分别为673.96、1015.00、2030.00、4060.00、8120.00μg/mL。然后计算脂肽粗提液对棉花枯萎

病菌的EC50。

1.2.4 8种化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的室内毒力测定 测定苯醚甲环唑、戊唑醇、腈菌唑、丙环唑、萎

锈灵、多菌灵、甲基硫菌灵和丙森锌对棉花枯萎病菌的抑制活性,8种化学杀菌剂在PDA中培养基的终浓

度见表1。接种完毕后置于26℃恒温箱中培养96h,用十字交叉法测量菌落直径。采用SPSS13.0软件

求出8种化学杀菌剂对病菌的毒力回归方程、EC50 值、95%置信区间和R2。

表1 8种化学杀菌剂质量浓度设置

Table1 Concentrationgradientof8fungicides

杀菌剂 质量浓度梯度/(μg/mL)

苯醚甲环唑 0.1 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

戊唑醇 0.05 0.10 0.20 0.40 0.80 1.60

腈菌唑 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0

丙环唑 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4

萎锈灵 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0

多菌灵 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2

甲基硫菌灵 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0

丙森锌 2 5 50 100 200 500

2 结果分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌SJ06与棉花枯萎病菌对峙培养结果

由图1可见,菌株 SJ06对棉花枯萎病菌抑制效果明显,能抑制病菌菌丝生长,抑制率平均值为

78.24%,而且发现生防菌菌株SJ06可以将病原菌完全包围,阻止其进一步发生扩展下一步可进行菌株产

发酵上清液和脂肽粗提物对病菌的抑制活性研究。

图1 解淀粉芽孢杆菌SJ06与棉花枯萎病菌对峙结果

Fig.1 EffectofconfrontationculturebetweenB.amyloliquefaciensSJ06andF.oxysporumf.sp.vasinfectum

注:A为菌株SJ06与病菌对峙结果;B为对照。

第38卷第1期 周 慧,等:生防菌代谢产物与化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的抑制活性研究 67

2.2 不同稀释倍数的发酵上清液对棉花枯萎病菌的抑制活性

由表2可见,解淀粉芽孢杆菌SJ06发酵上清液的浓度从6.25μL/mL增至100.00μL/mL,在26℃

恒温恒湿培养箱中培养96h对棉花枯萎病菌的抑制率从46.90%增至80.30%,高浓度的发酵上清液对

棉花枯萎病菌抑制作用较强(图2)。经SPSS13.0软件分析得出发酵上清液对棉花枯萎病菌的EC50 为

7.37μL/mL(R2=0.95)。

表2 不同稀释倍数的发酵上清液对棉花枯萎病菌的抑制率

Table2 InhibitionrateofdifferentdilutiontimesofB.amyloliquefaciensfermentationsupernatanttoF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

稀释倍数 发酵上清液浓度/(μL/mL) 抑制率/%

10 100.00 80.30±0.40

40 25.00 71.80±1.10

80 12.50 66.50±1.00

120 8.33 60.20±1.00

160 6.25 46.90±1.00

注:A、B、C、D、E分别为菌株SJ06发酵上清液稀释10、40、80、120、160倍;F为对照。

图2 不同稀释倍数的发酵上清液对棉花枯萎病菌的抑制效果

Fig.2 InhibitoryeffectoffermentationsupernatantwithdifferentdilutiontimesonF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

2.3 不同稀释倍数的脂肽粗提物对棉花枯萎病菌的抑制活性

由表3、图3可知,脂肽粗提物的浓度从673.96μg/mL增至8120.00μg/mL,在27℃恒温恒湿培养

箱中培养96h对棉花枯萎病菌的抑制率从19.90%增至77.30%(表3),分析得出脂肽粗提物对棉花枯萎

病菌的EC50 为2720.20μg/mL(R2=0.98)。

表3 不同稀释倍数的脂肽粗提物对棉花枯萎病菌的抑制率

Table3 InhibitionrateofdifferentdilutiontimesofcrudelipopeptideextracttoF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

稀释倍数 脂肽粗提物质量浓度/(μg/mL) 抑菌率/%

100 8120.00 77.30±1.00

200 4060.00 60.50±0.80

400 2030.00 37.80±0.90

800 1015.00 28.60±0.70

1200 673.96 19.90±0.60

注:A为对照;B、C、D、E、F为脂肽粗提物稀释1200、800、400、200、100倍。

图3 不同稀释倍数的脂肽粗提物对棉花枯萎病菌的抑制效果

Fig.3 InhibitoryeffectofcrudelipopeptideextractswithdifferentdilutiontimesonF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

68 安徽科技学院学报 2024年

2.4 8种化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的抑制活性

由表4可知,棉花枯萎病病菌对戊唑醇的敏感性最高,EC50 为0.34μg/mL,其次为多菌灵,其对病菌

的EC50 为0.49μg/mL。苯醚甲环唑和腈菌唑对棉花枯萎病菌的EC50 分别为1.34μg/mL和1.07μg/mL,

丙环唑对病菌的EC50 为1.54μg/mL。甲基硫菌灵对病菌的EC50 为7.87μg/mL,萎锈灵对病菌的EC50

为10.65μg/mL。丙森锌对病菌的抑制活性最差,其EC50 为63.25μg/mL。

表4 8种化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的毒力测定

Table4 Toxicitylevelsof8chemicalfungicidestoF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

杀菌剂 毒力回归方程 EC50/(μg/mL) 95%置信区间 R2

戊唑醇 y=0.057x+1.034 0.34 0.30~0.39 0.94

多菌灵 y=0.036x+0.53 0.49 0.42~0.51 0.94

腈菌唑 y=0.033x-0.141 1.07 0.93~1.22 0.96

苯醚甲环唑 y=0.034x-0.141 1.34 1.12~1.62 0.91

丙环唑 y=0.032x-0.26 1.54 1.39~1.71 0.97

甲基硫菌灵 y=0.042x-0.71 7.87 6.51~9.88 0.91

萎锈灵 y=0.035x-0.65 10.65 8.68~13.48 0.98

丙森锌 y=0.980x-1.91 63.25 56.05~71.36 0.97

3 结论与讨论

棉花枯萎病是棉花生产中的重要土传病害,一旦发病难以防治,对于棉花生产造成了重大威胁[14]。

陈淑珍等[15]在棉花现蕾前连续使用10%恶霉灵纳米乳1500倍液灌根20d之后对棉花枯萎病菌的防治

效果为97.22%。刘春英[16]发现多菌灵对棉花尖孢镰刀菌的EC50 是0.06mg/L;韩新才等[17]采用生长

速率法测定了多菌灵对棉花枯萎病菌的抑制活性,EC50 达10.30μg/mL。本研究通过菌丝生长速率法比

较了8种化学杀菌剂对棉花枯萎病的抑制活性得出戊唑醇对棉花枯萎病的抑制活性优异,其 EC50 为

0.34μg/mL;其次多菌灵EC50 为0.49μg/mL,可以看出棉花枯萎病菌对同一种药剂的毒力水平存在较

大差异,这与不同来源的菌株有关,所以不同地区的棉花枯萎病的防控推荐用药应根据当地病菌的药敏性

作具体分析随着农药使用量零增长以及植病生防的推广,生防菌的使用能够明显减少化学药剂的用量,用

于棉花枯萎病的生防菌报道有短小芽孢杆菌[18]、蜡状芽孢杆菌 YUPP-10

[19]、壮观链霉菌SC11

[6]等。李

玉洋等[20]采用平板稀释法分离获得一株对棉花枯萎病抑制活性为65.19%的菌株SN06;丁建朋等[21]通

过田间试验发现解淀粉芽孢杆菌 HFW217对棉花枯萎病的防效达80.97%。张一白等[22]通过田间试验

得出奥瑞根(地衣芽孢杆菌制成)可湿性粉剂对棉花枯萎病的防治效果为28.4%~51.5%。余利等[23]将

解淀粉芽孢杆菌脂肽粗提物分别与克菌丹质量比1∶100、代森锰锌5∶100时,增效系数SR达1.78和

1.74。本试验通过菌丝生长速率法检测解淀粉芽孢杆菌SJ06发酵上清液的10倍稀释液对棉花枯萎病菌

的抑制率达80.2%,而脂肽粗提物100倍稀释液对病菌的抑制率达到77.30%,在棉花枯萎病的生物防控

方面具有潜在的利用价值。本研究初步探索了生防菌发酵上清液、脂肽粗提物和8种化学杀菌剂对棉花

枯萎病菌的抑制效果,为进一步探究化学杀菌剂和生防菌剂的复配及其抑制机理提供了基础数据。

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(责任编辑:顾文亮)

70 安徽科技学院学报 2024年

安徽科技学院学报,2024,38(1):71-76

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-04-25

基金项目:安徽省高校协同创新项目(GXXT-2021-089);安徽省现代农业产业技术体系建设专项资金(小麦);国家级大学生创新创业

训练计划项目(202110879079)。

作者简介:陶庭余(2001-),男,安徽芜湖人,本科生,主要从事作物栽培生理生态研究,E-mail:taotingyu2023@163.com。

通信作者:李文阳,教授,E-mail:liwy@ahstu.edu.cn。

密度和钾肥及其互作对小麦茎秆

形态特征与抗倒性的影响

陶庭余, 王荣圆, 魏 鹏, 闫素辉, 李文阳*

(安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100)

摘 要:目的:探索安徽沿淮地区小麦品种对种植密度及钾肥的响应。方法:以‘华成3366’为材料,设置

2个种植密度(240万株/hm2、300万株/hm2)和3个钾肥水平(60、120、180kg/hm2)二因素裂区试验,对

其株高、重心高度、基部第2节形态特征及内含物、茎秆机械强度及抗倒伏指数等指标进行测定。结果:在

D2 水平下小麦的株高、重心高和节间长较D1 水平下有所增加,分别增加3.92、2.29、0.58cm。在 D2 水

平下的节间直径、节间壁厚、节间干质量、纤维素、半纤维素、木质素以及节间针刺力和节间抗折力较 D1

有所减少,导致茎粗系数、节间充实度、抗倒伏指数降低,分别降低0.04、3.21g/mm2、0.08。在 K1 水平

下小麦株高、重心高、节间长较 K2、K3 水平下有所增加。在 K1 水平下小麦节间直径、节间壁厚、节间干质

量、纤维素、半纤维素、木质素以及节间针刺力和节间抗折力较 K2、K3 水平下有所减少,导致茎粗系数、节

间充实度、抗倒伏指数减少。相关性分析表明,株高、重心高与抗倒伏指数呈极显著负相关,与节间壁厚、

纤维素呈显著正相关。结论:本试验条件下,随着钾肥水平的提高,小麦茎粗系数、节间直径和节间干质量

增加,进而增强小麦的抗倒伏能力,因此可通过增加钾肥施用量提高小麦抗倒伏性能。

关键词:小麦;钾肥;茎秆;抗倒伏

中图分类号:S852.3 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)01-0071-06

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0012

Effectsofdensity,potassiumfertilizerandtheirinteractiononstem

morphologicalcharacteristicsandlodgingresistanceofwheat

TAOTingyu, WANGRongyuan, WEIPeng, YANSuhui, LIWenyang

*

(CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Toexploretheresponseofwheatvarietiestoplantingdensityandpotassium

fertilizerinAnhuialongtheHuaiheRiverregion.Methods:TakingHuacheng3366asthematerial,a

two-factorsplit-plotexperimentwassetupwithsowingrate(2.4million/hm2,3million/hm2)and

potassiumfertilizerlevel (60,120,180kg/hm2).Theplantheight,heightofcenterofgravity,

morphologicalcharacteristicsandinclusionsofthesecondsectionofthebase,culm mechanicalstrength

andlodgingresistanceindexweremeasured.Results:Theresultsshowedthattheplantheight,height

ofcenterofgravityandinternodelengthofwheatunderD2levelincreasedby3.92,2.29,0.58cm,

respectively,comparedwiththoseunderD1level.AttheD2level,theinternodediameter,internode

wallthickness,internodedry weight,cellulose,hemicellulose,lignin,andinternodepin-staband

internodefractureresistancewerereducedcomparedwithD1,resultinginstemindiameter,internode

fillingrate,andlodgingresistanceindexdecreasedby0.04,3.21g/mm2and0.08,respectively.The

plantheight,heightofcenterofgravityandinternodelengthatK1levelwerehigherthanthoseatK2

andK3levels.Comparedwith K2 andK3levels,theinternodediameter,internodewallthickness,

internodedryweight,cellulose,hemicellulose,lignin,andinternodepin-stabandinternodefracture

underK1levelwerereduced,resultingreductioninstemindiameter,internodefillingrate,andlodging

resistanceindex.Correlationanalysisshowedthatplantheightandheightofcenterofgravitywere

significantlynegativelycorrelatedwithlodgingresistanceindex,andsignificantlypositivelycorrelated

withinternodewallthicknessandcellulose.Conclusion:Undertheconditionsofthisexperiment,with

theincreaseofpotassiumfertilizerlevels,thestemindiameter,internodediameterandinternodedry

weightofwheatincreased,thusenhancingthelodgingresistanceofwheat.Therefore,thelodging

resistanceofwheatcouldbeimprovedbyincreasingtheamountofpotassiumfertilizer.

Keywords:Wheat;Potassiumfertilizer;Stem;Antiinversion

高产是小麦生产追求的重要目标,而倒伏是限制小麦高产的关键因素之一[1]。特别是在小麦生育后

期,遇连续阴雨天气,小麦极易发生倒伏[2]。且大量的降水会松动根部土壤,加重倒伏的可能性。安徽省

沿淮地区属于过渡性气候,自然灾害频繁。沿淮地区每年约有15%面积小麦田发生倒伏,致使减产约

25%

[3]。在实际生产中,会通过增加播种密度和施肥量来提高产量,但基本苗过多以及施肥的不合理会导

致倒伏的发生[4-5]。

小麦倒伏的发生受品种特性和外部因素的影响,品种特性是由基因型导致的茎秆形态结构等性状差

异,外部因素归结为栽培措施和自然环境[6]。关于小麦倒伏的影响因素,国内外学者有多方面的研究,但

结论不一。有学者研究表明小麦的抗倒性能与茎秆基部节间的机械强度、形态特征有关[7-9];但也有学者

研究木质素和纤维素的含量对倒伏的影响[10-12]。

本试验以小麦品种‘华成3366’为材料,设置不同种植密度和钾肥处理,研究不同种植密度和钾肥对

其株高、重心高、节间长、节间直径、节间壁厚和节间干质量等6个农艺性状,抗折力和针刺力2个力学特

性以及半纤维素、纤维素和木质素含量等3个非结构性碳水化合物等的影响,进而分析抗倒伏指数与茎秆

农艺性状等参数的关系,旨在为小麦抗倒伏育种和丰产优质栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2018—2019年在安徽科技学院种植园进行。以小麦品种华成3366为试验材料,试验采用大田

种植,裂区设计,密度处理为主区,钾肥为副区,试验设3次重复,与10月下旬播种,试验地前茬作物为玉米,

设2个密度水平(240万株/hm2(D1)、300万株/hm2(D2))和3个钾肥水平(60kg/hm2(K1)、120kg/hm2(K2)、

180kg/hm2(K3))。小区面积为9m2(3m×3m),行距15cm。田间管理同常规生产。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 株高、重心高的测定 于乳熟期在每个小区选取15株有代表性的小麦,用钢尺测量株高和重心

高度。

72 安徽科技学院学报 2023年

1.2.2 节间长、节间直径、节间壁厚和茎粗系数的测定 于乳熟期在每个小区选取15株有代表性的小

麦,用直尺和游标卡尺测定其基部二节间的节间长、节间直径及节间壁厚。茎粗系数为节间直径/节间长

的数值[13]。

1.2.3 节间干质量和节间充实度的测定 于乳熟期在每个小区选取15株有代表性的小麦,取小麦基部

第二节间茎秆,放入烘箱内,105℃杀青30min,在80℃下烘干至质量恒定,称量基部节间干质量。节间

充实度为节间干质量/节间长的数值。

1.2.4 茎秆半纤维素、纤维素和木质素含量的测定 于乳熟期在每个小区选取15株有代表性的小麦,取

小麦基部二节间茎秆,烘干至质量恒定,粉碎,过筛,参照 Van-soest等[14]方法测定半纤维素、纤维素及木

质素含量。

1.2.5 茎秆机械强度和抗倒伏指数的测定 于乳熟期在每个小区选取15株有代表性的小麦,取小麦基

部二节间茎秆,用 YDD-1茎秆强度测定仪(浙江托普仪器有限公司)测定基部二节间抗折力、针刺力。抗

倒伏指数为抗折力/重心高的数值[15]。

1.3 数据分析与处理

采用Excel2016、DPS进行数据分析。采用 Origin作图。

2 结果与分析

2.1 不同种植密度和钾肥对株高与重心高的影响

由图1~2可知,种植密度、钾肥对小麦的株高和重心高有极显著影响。种植密度和钾肥互作对小麦

的株高和重心高有极显著影响。随种植密度的增加,小麦的株高和重心也随着增高,在D2 水平下株高和

重心高较D1 增加3.92、2.29cm。随钾肥水平的增加,小麦的株高和重心高均随之显著降低,在 K3 水平

下株高较 K1、K2 降低4.36、0.20cm,重心高较 K1、K2 降低3.83、1.07cm。由此可见,种植密度的增加

会增加小麦的株高,在相同的种植密度下,钾肥会降低重心高。

图1 密度和钾肥水平对株高的影响

Fig.1 Effectsofdensityandpotassiumlevelonplantheight

图2 密度和钾肥水平对重心高的影响

Fig.2 Effectsofdensityandpotassiumlevelonhighcenterofgravity

注:误差线为标准误,小写字母表示P<0.05。

2.2 不同种植密度和钾肥对茎粗系数的影响

由表1可知,种植密度、钾肥对小麦的节间长、节间直径、茎粗系数有极显著的影响。种植密度和钾肥

互作对小麦的节间长和茎粗系数有极显著影响,对节间直径有显著影响。随密度的增加,小麦的节间长增

加,节间直径和茎粗系数降低,在D2 水平下节间长较 D1 增加0.58cm,节间直径和茎粗系数较 D1 降低

0.11m和0.04。随着钾肥水平增加,小麦的节间长降低,节间直径和茎粗系数增加,在 K1 水平下节间长

较K2、K3 降低0.65、0.92cm,在K3 水平下节间直径较K1、K2 增加0.12、0.02cm,茎粗系数较K1、K2 增

加0.08、0.01。

第37卷第6期 陶庭余,等:密度和钾肥及其互作对小麦茎秆形态特征与抗倒性的影响 73

表1 密度和钾肥水平对基部二节间的影响

Table1 Effectsofdensityandpotassiumfertilizerlevelsonthebasalinter-segment

种植密度 钾肥水平 节间长/cm 节间直径/cm 茎粗系数

D1 K1 7.91±0.48b 3.76±0.4c 0.45±0.01d

K2 7.58±0.57cd 3.84±0.35ab 0.52±0.01a

K3 7.45±0.36d 3.87±0.38a 0.52±0.01a

D2 K1 9.01±0.77a 3.64±0.24d 0.41±0.01e

K2 8.04±0.66b 3.74±0.39c 0.47±0.01c

K3 7.62±0.56c 3.76±0.36bc 0.49±0.01b

F D 179.17** 8.92** 222.60**

K 200.69** 23.41** 166.98**

D×K 44.51** 0.03 8.17**

注:同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05);* 为0.05水平,差异显著;** 为0.01水平,差异显著,D为密度;K为钾肥。

下同。

2.3 不同种植密度和钾肥对节间充实度的影响

由表2可知,种植密度、钾肥对小麦的节间壁厚和节间充实度均有极显著影响,对节间干质量有显著

影响。种植密度和钾肥互作对节间壁厚有极显著影响,对节间干质量和节间充实度没有显著差异。随密

度增加小麦的节间壁厚、节间干质量和节间充实度下降,在D2 水平下节间壁厚、节间干质量和节间充实度

较D1 降低0.12m、0.01g、3.21g/mm2。随钾肥的增加节间壁厚、节间干质量和节间充实度增加。节间壁

厚在 K3 水平下较 K1、K2 增加0.17、0.07m。节间干质量在 K3 水平下较 K1、K2 增加0.02、0.01g。节

间充实度在 K3 水平下较 K1、K2 增加4.02、1.74g/mm2。

表2 密度和钾肥水平对基部二节间充实度的影响

Table2 Effectsofdensityandpotassiumfertilizerlevelonthefullnessofthebaseinter-segment

种植密度 钾肥 节间壁厚/m 节间干质量/g 节间充实度/(g/mm2)

D1 K1 0.61±0.09d 0.15±0.02b 18.93±1.8bc

K2 0.76±0.12b 0.16±0.01ab 20.94±1.6ab

K3 0.87±0.15a 0.17±0.02a 23.08±2.19a

D2 K1 0.58±0.15e 0.14±0.02b 15.62±1.68d

K2 0.64±0.09c 0.15±0.02b 18.19±1.55c

K3 0.66±0.12c 0.15±0.01b 19.52±1.28bc

F D 142.60** 5.34* 15.02**

K 208.40** 8.28* 28.53**

D×K 37.86** 0.52 0.16

2.4 不同种植密度和钾肥对结构性碳水化合物的影响

由表3可知,种植密度、钾肥对小麦的半纤维素和木质素均有极显著影响,对纤维素有显著影响。随

密度的增加,小麦的半纤维素、纤维素、木质素含量降低,随着钾肥水平增加,小麦的半纤维素、纤维素、木

质素含量增加。

表3 密度和钾肥水平对小麦基部二节间结构性碳水化合物的影响

Table3 Effectsofdensityandpotassiumfertilizerlevelsoninter-segmentstructuralcarbohydratesatthebaseofwheat

种植密度 钾肥水平 ω(半纤维素)/% ω(纤维素)/% ω(木质素)/%

D1 K1 0.54±0.01bc 0.69±0.01b 0.15±0.01cd

K2 0.57±0.02b 0.73±0.01a 0.17±0.01a

K3 0.60±0.01a 0.74±0.01a 0.16±0.01b

D2 K1 0.49±0.02d 0.65±0.00c 0.13±0.00d

K2 0.53±0.01cd 0.72±0.01b 0.15±0.00bc

K3 0.56±0.01bc 0.70±0.00b 0.15±0.00bc

F D 26.45** 28.04** 15.02**

K 16.56** 22.46** 28.53**

D×K 0.14 0.30 0.16

2.5 不同种植密度和钾肥对力学性状和抗倒伏指数的影响

由表4可知,种植密度、钾肥对小麦的针刺力、抗折力和抗倒伏指数有极显著影响。种植密度和钾肥

74 安徽科技学院学报 2023年

互作对针刺力、抗折力和抗倒伏指数有极显著影响。随着密度增加小麦的节间针刺力、节间抗折力和抗倒

伏指数降低,在D2 水平下,节间针刺力、节间抗折力和抗倒伏指数较D1 降低1.71N、1.92N、0.08。随着

钾肥水平的增加小麦的节间针刺力、节间抗折力和抗倒伏指数增加。节间针刺力在 K3 水平下较 K1、K2

增加1.98、0.94N。节间抗折力在 K3 水平下较 K1、K2 增加1.88、1.24N。抗倒伏指数在 K3 水平下较

K1、K2 增加0.08、0.04。

表4 密度和钾肥水平对小麦基部二节间力学性状与抗倒伏指数的影响

Table4 Effectsofdensityandpotassiumfertilizerlevelsoninter-segmentmechanicaltraitsandlodgingresistanceindexofwheatbase

种植密度 钾肥水平 针刺力/N 抗折力/N 抗倒伏指数

D1 K1 9.83±0.76b 11.92±0.79b 0.35±0.04c

K2 11.4±0.51a 12.75±0.65a 0.39±0.02ab

K3 11.13±0.71a 12.95±0.37a 0.41±0.01a

D2 K1 8.03±0.51c 9.55±0.90d 0.25±0.03e

K2 8.53±0.59c 10.00±0.48c 0.31±0.03d

K3 10.68±1.32ab 12.29±0.54b 0.37±0.03bc

F D 18.83** 84.87** 78.98**

K 42.23** 258.09** 171.36**

D×K 7.12** 28.77** 13.06**

2.6 相关分析

由表5可知,小麦植株抗倒伏指数与节间干质量、节间充实度、节间直径、节间壁厚、茎粗系数、木质

素、纤维素、半纤维素,节间针刺力和节间抗折力呈显著正相关,而与株高、重心高、节间长、木质素、纤维

素、半纤维素呈显著负相关。

表5 小麦植株基部二节间特性与抗倒伏能力的相关性分析

Table5 Correlationanalysisoftheinter-ganglioncharacteristicsofwheatplantbaseandlodgingresistance

指标 抗倒伏指数

株高 -0.92**

重心高 -0.94**

节间长 -0.97**

节间干质量 0.88**

节间充实度 0.96**

节间直径 0.96**

节间壁厚 0.81*

茎粗系数 0.92**

节间针刺力 0.96**

节间抗折力 0.97**

半纤维素 0.98**

纤维素 0.83*

木质素 0.88**

3 结论与讨论

因对小麦需求的提升,较大的播种密度成为小麦高产的保障。在生产中播种密度过大,茎秆发育力

差[16],倒伏发生时期提前,倒伏程度严重[17],同时株高增加,加大了倒伏风险[18],适当的播种密度可提高

单株分蘖数和茎秆质量,构建合理的群体结构,从而有利于防倒伏,增加产量。同时密度对节间壁厚无显

著影响,茎粗系数随密度的增大而减少。研究表明,播种密度会影响小麦的干物质的累积,进而影响产

量[19]。本研究中,随着播种密度增大,株高等农艺性状随之上升,而节间直径、抗折力等随之降低。

研究表明,合理的钾肥施用有利于根系生长[20],小麦茎秆逐渐粗壮,抗倒伏能力增强,成穗率提高,籽

粒饱满[21]。袁志华等[22]研究表明,施用钾肥对力学特性有不同程度的影响,施用钾肥可显著提高灌浆期

第37卷第6期 陶庭余,等:密度和钾肥及其互作对小麦茎秆形态特征与抗倒性的影响 75

茎秆基部二节间的弯曲强度及抗弯刚度。许文燕等[23]认为,充足的钾肥会使植株茎秆粗壮、强度增大、机

械性能改善,抗倒伏能力提高。本研究表明,随着钾肥水平的提高,小麦茎粗系数、节间直径和节间干质量

增加,进而提高小麦的抗倒伏能力,因此可通过增加钾肥施用量提高小麦抗倒性能。

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(责任编辑:顾文亮)

76 安徽科技学院学报 2023年

安徽科技学院学报,2024,38(1):77-87

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-10-20

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31970312,32170315);安徽省科技重大专项(202003a06020011)。

作者简介:孙红叶(1995-),女,安徽合肥人,博士研究生,主要从事大豆等农产品加工储藏与综合利用研究,E-mail:1041228728@qq.com。

通信作者:金日生,助理研究员,E-mail:jinrisheng@hfut.edu.cn。

大豆磷脂酶 D的固定化及其催化功能

孙红叶, 朱梦男, 姚改芳, 张 华, 金日生*

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230009)

摘 要:目的:单因素试验研究大豆磷脂酶D(phospholipaseD,PLD)的固定化工艺以及固定化PLD催化

合成大豆磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的最佳工艺。方法:首先通过非极性溶剂辅助Stöber法

制备纳米级介孔二氧化硅作为固定化酶的载体,通过吸附-沉淀-交联方式将PLD固定,单因素试验优化

固定化条件,并对固定化后的PLD进行结构表征和热稳定性及贮存稳定性研究;然后利用固定化PLD以

大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物催化合成PS,并通过单因素试验确定最佳合成工艺;最后对固定化PLD的

循环使用性能进行研究。结果:非极性溶剂辅助 Stöber法制备的介孔二氧化硅 BET 比表面积为

948m2/g,气孔体积为1.35cm3/g,孔径为8.20nm,平均粒径为335.10nm,扫描电镜确定载体的形貌为

近球形结构;当加入5.00mL乙醇、1.00mL酶液(温度为35℃、pH 为6.50)、0.40mL戊二醛时,固定化

PLD的相对酶活达到最大值(88.39%±1.00%),蛋白固定化率为80.76%±1.30%;70℃时游离PLD的相

对酶活剩余15.30%,而固定化PLD的相对酶活仍然有66.40%,且游离PLD被固定化后半衰期由20d延长

到50d;当乙酸乙酯与乙酸钠/醋酸缓冲溶液的比为6∶1,卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8,反应温度为

40℃,pH为6.50,固定化PLD的加入量为40%,反应时间为12h时,PS的产率达86.60%±1.40%,纯度为

90.30%,且固定化PLD循环使用7次PS的产率仍有61.70%±1.60%,而游离PLD循环使用4次PS

的产率只剩余21.60%±1.80%。结论:介孔二氧化硅固定化PLD的稳定性、催化性能均显著提高,实现

了PLD的回收重复使用,降低了生产成本;同时为PS的固定化酶法工业化生产提供技术支持。

关键词:大豆磷脂酶D;固定化酶;转磷脂酰化反应;大豆磷脂酰丝氨酸

中图分类号:TS214.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)01-0077-11

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0013

ImmobilizationofsoybeanphospholipaseDanditscatalyticfunction

SUN Hongye, ZHU Mengnan, YAOGaifang, ZHANGHua, JINRisheng

*

(SchoolofFoodandBiologicalEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China)

Abstract:Objective:Aone-waytestwasperformedtoinvestigatetheimmobilizationprocessofsoybean

phospholipaseD (PLD)andtheoptimalprocessforimmobilizedPLDtocatalyzethesynthesisof

soybeanphosphatidylserine (PS).Methods:Firstly,nanoscale mesoporoussilicawaspreparedasa

carrierforimmobilizedenzymebynon-polarsolvent-assistedStöbermethod,andPLDwasimmobilized

byadsorption-precipitation-cross-linking,and the one-way test wascarried outto optimizethe

immobilizationconditionsandtostudythestructuralcharacterizationandthermalandstoragestability

ofimmobilizedPLD.Then,PSwascatalyticallysynthesizedfromimmobilizedPLDbyusingsoybean

lecithinandL-serineassubstrates,andtheoptimalsynthesisprocesswasdeterminedbyaone-waytest.

Finally,therecyclingperformanceofimmobilizedPLDwasinvestigated.Results:Thespecificsurface

areaofthe mesoporoussilicaBET preparedbythenon-polarsolvent-assistedStöber method was

948m2/g,thestomatalvolumewas1.35cm3/g,theporesizewas8.20nm,theaverageparticlesize

was335.10nm,andthemorphologyofthecarrierswasdeterminedtobeanear-sphericalstructureby

scanningelectron microscopy.Whenethanolwasaddedinavolumeof5.00 mL,temperaturewas

35℃,pHwas6.50,volumeofenzymewas1.00mL,andvolumeofglutaraldehydewas0.40mL,the

relativeenzymeactivityoftheimmobilizedPLDreachedamaximumof88.39%±1.00%,andthe

proteinimmobilizationratewas80.76%±1.30%.TherelativeenzymeactivityoffreePLDat70℃ was

15.30%remaining,whiletherelativeenzymeactivityofimmobilizedPLDwasstill66.40%,andthe

half-lifeoffreePLDwasprolongedfrom20to50daysafteritwasimmobilized.Whentheratioofethyl

acetatetosodiumacetate/aceticacidbuffersolutionwas6∶1,themassratiooflecithintoL-serinewas

1∶8,thereactiontemperaturewas40℃,thepHwas6.50,theamountofimmobilizedPLDaddedwas

40%,andthereactiontimewas12h,theyieldofPSreached86.60% ±1.40%,thepuritywas

90.30%,andtheyieldofPSremained61.70%±1.60%after7cyclesofimmobilizedPLD,whileonly

21.60%±1.80%ofPSyieldremainedafter4cyclesoffreePLD.Conclusion:Thestabilityandcatalytic

performanceofmesoporoussilica-immobilizedPLDweresignificantlyimproved,andtherecyclingand

reuseofPLD wasrealizedtoreducetheproductioncost.Atthesametime,technicalsupportwas

providedfortheindustrializedproductionofimmobilizedenzymemethodforPS.

Keywords:SoybeanphospholipaseD;Immobilizedenzyme;Transphosphorylation;Soybeanphosphatidylserine

大豆磷脂酶D(PhospholipaseD,PLD)即磷脂酰胆碱水解酶,是一种高效的生物酶催化剂,催化大豆

卵磷脂(PC)水解产生胆碱和磷脂酸(PA)[1-3],但高温、极端的pH 及有机溶剂会破坏酶蛋白的自身结构,

导致其催化效率降低[4-5];且反应结束后,游离酶很难回收和再利用,导致生产成本增加[6-7],使得酶促反应

发展十分缓慢。研究发现固定化技术可以解决上述游离PLD所存在的问题[8]。固定化酶的方法和载体

是影响酶比活和固定化速率的两个重要因素[9]。研究表明固定化后的PLD对pH 的耐受性、热稳定性、

储藏稳定性和运行稳定性都得到了明显的提升[10-11]。近几年纳米及带有多孔材料的载体成为了固定化

酶的研究热点[12]。由于介孔二氧化硅具有易于合成、可调节的孔径、较大的比表面积、化学和力学特性稳

定、生物相容性优异等特点,被广泛应用到固定化酶中[13-14]。磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)在自

然界中的含量极低[15-16],目前,其合成最有效的方法是利用PLD的转磷脂酰化反应在水-有机界面以大豆

卵磷脂和L-丝氨酸作为反应底物进行催化合成[17-18]。由于酶转化法合成PS发生在水-有机体系中,游离

磷脂酶D与有机溶剂接触会造成酶分子的变性,酶活性降低,导致催化合成PS的产率降低[19-20]。此外,

游离酶不易回收利用,会使PS的生产成本增加[21]。

因此,本研究首先通过非极性溶剂辅助Stöber法制备纳米级介孔二氧化硅作为固定化酶的载体,通

过吸附-沉淀-交联方式将PLD固定到介孔二氧化硅表面,优化固定化条件并对固定化后的PLD进行结构

表征和热稳定性及贮存稳定性研究;然后利用固定化PLD以大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物催化合成PS,

并确定最佳合成工艺;最后对固定化PLD的循环使用性能进行研究,旨在通过固定化技术提高PLD的稳

定性及催化性能,增加合成PS的产率,并实现磷脂酶D的回收重复使用,降低生产成本。

78 安徽科技学院学报 2024年

1材料与方法

1.1 仪器与设备

STA449F5同步热分析仪(德国耐驰有限公司);Nicolet5700傅里叶变换红外光谱仪(美国赛默飞世

尔有限公司);Masterizer2000激光粒度分析仪(上海善福电子科技有限公司);JEM-400LaB6透射电子

显微镜(日本电子公司);高分辨场发射扫描电子显微镜(日本 Hitachi公司);QuadraSorbSI(美国康塔仪

器公司);UV-1600紫外分光光度计(上海菁华仪器有限公司);Agilent-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦

有限公司)。

1.2 试剂与材料

卵磷脂(纯度为84.80%)由实验室制备;磷脂酶D(蛋白含量为8.12×10-4μmol/gprotein)、胆碱标

准品(纯度为98.00%)、磷脂酰丝氨酸标准品(纯度为98.00%)和L-丝氨酸均购于美国sigma公司;十六

烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正硅酸四乙酯、十二烷基硫酸钠(SDS)、牛血清蛋白(BSA)和乙酸钠均购于

上海阿拉丁试剂有限公司;甲醇和异丙醇为色谱纯,均购于美国sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 介孔二氧化硅的制备 参考非极性溶剂辅助Stöber法制备介孔二氧化硅的方法[22]。称取1.00g

CTAB置于三角瓶中,加入160.00mL去离子水完全溶解;加入8.00mL(25.00%~28.00%)氨水溶液,搅拌

到溶液澄清透明;缓慢加入5.00mL正硅酸四乙酯和20.00mL正己烷的混合溶液;在35℃下200r/min磁

力搅拌器中将上述混合液搅拌成白色乳液状之后,继续搅拌12h。反应结束后,在6000r/min下离心

10min,收集固体,将收集的固体分别用无水乙醇和去离子水清洗3次,在真空干燥箱中40℃干燥12h,

收集固体;将收集的固体置于550℃马弗炉中高温煅烧6h,将模板剂CTAB脱除,即得介孔二氧化硅。

1.3.2 介孔二氧化硅的结构表征 将介孔二氧化硅在 180 ℃ 的真空中至少脱气 6h 后,使用

QuadraSorbSI分析仪测定介孔二氧化硅的比表面积、气孔体积及孔径。采用 KBr压片法测定介孔二氧

化硅的红外官能团,扫描波长为4000~400cm-1,扫描次数为64次。将介孔二氧化硅干燥后,在加速电

压为200kV的场发射扫描电子显微镜(SEM)下观察并拍照。将介孔二氧化硅分散在乙醇溶液中,在透射电

子显微镜(TEM)下观察并拍照。将介孔二氧化硅均匀分散在去离子水中并采用 Masterizer2000马尔文粒度

分析仪测定介孔二氧化硅的粒径大小并绘制曲线图。

1.3.3 PLD的固定 称取0.25g介孔二氧化硅,加入7.50mL20mmol/LpH6.50的乙酸钠-醋酸缓

冲溶液溶解;加入1.00mL20mmol/LpH5.50的PLD酶液,置于35℃下先物理吸附2h,加入5.00mL乙

醇沉淀剂,冰浴1h,将物理吸附未吸附的PLD分子固定在介孔二氧化硅的表面上;最后加入0.40mL25%

戊二醛交联剂,交联1.5h,在6000r/min下离心10min,收集固体,用pH6.50乙酸钠-醋酸缓冲溶液洗

涤3次,在真空干燥箱中35℃干燥12h,收集固体,得到固定化PLD。

1.3.4 PLD酶活性的测定 PLD酶活性的测定是根据D'Arrigo等[23]报道的方法,通过检测磷脂酰对硝

基苯酚(PpNP)在405nm 水解产生的对硝基苯酚来测定磷脂酶 D 的活性。取50μL 反应混合液

(5mmol/LSDS,10mmol/LPpNP 和5% TritonX-100在10 mmol/L Tris/HCl,pH8.00),加入

400μL(0.10mol/L,pH6.00,含2mmol/LCaCl2)乙酸钠-醋酸缓冲液和50μL2mg/mL游离PLD溶

液;在30℃下反应10min,加入100μL(pH8.00,1.00mol/LTris/HCl含0.10mol/LEDTA)缓冲液

终止反应。在405nm处测定磷脂酶 D的酶活性;酶活性的一个单位(U)定义为在合适的检测条件下,

1min内磷脂酶D释放1.00μmol对硝基苯酚的量。固定化磷脂酶D酶活性的终止反应通过将固定化酶

从反应中移除来实现。

1.3.5 固定化PLD蛋白固定化率的测定 酶蛋白的固定化率公式如下:蛋白固定化率=(初始酶液总蛋

白-固定后残余酶液总蛋白)÷初始酶液总蛋白。根据Bradford法测定酶液中蛋白质含量[24]。以牛血清

蛋白(BSA)的浓度为横坐标,595nm测得的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。取1mL酶液加入到10mL

考马斯亮蓝溶液中并充分混合均匀,在紫外吸收波长为595nm 处测定吸光度。根据标准曲线即可计算

PLD中蛋白质的浓度。每组试验平行做3次以减少酶液中蛋白质含量测定的试验误差。

第38卷第1期 孙红叶,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 79

1.3.6 固定化PLD的单因素试验 根据预试验结果,以相对酶活性和固定化速率为指标,以沉淀剂(甲

醇、乙醇、丙酮、异丙醇及PEG6000)、最佳沉淀剂加入量(2、3、4、5、6mL)、温度(30、35、40、45、50℃)、pH

(5.50、6.00、6.50、7.00、7.50)、酶液体积(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL)、戊二醛体积(0.20、0.40、

0.60、0.80、1.00mL)作为单因素对固定化PLD的固定化条件加以研究。

1.3.7 固定化PLD的结构表征 采用 KBr压片法测定介孔二氧化硅及固定化后磷脂酶 D的介孔二氧

化硅红外光谱,扫描波长为4000~400cm-1,扫描次数为64次。对介孔二氧化硅及固定化PLD的介孔

二氧化硅进行热重分析。样品量为6~8mg,Al2O3 坩埚,温度区间为30~800℃,升温速率为10℃/min,保

护气为 N2,气体速率为20mL/min。

1.3.8 磷脂酶D的稳定性 将游离和固定化PLD置于20~70℃下,每隔10℃保温20min后取出一定

量的酶液,对其进行酶活性测定。将游离和固定化PLD分别在4℃下贮存50d,每隔5天取出一定量的

酶液,对其进行酶活性测定。

1.3.9 PS的制备 称取20.00mg磷脂酰胆碱溶解在12mL乙酸乙酯中;称取160mgL-丝氨酸,加入

2mLpH6.50的乙酸钠-醋酸缓冲溶液溶解,加入35%的固定化PLD;将水相和有机相混合置于40℃的

恒温摇床中反应12h,并每隔2h从摇床中取出一定量的反应液用 HPLC检测,并根据标准曲线计算PS

的产率。反应结束后,离心收集反应液,回收固定化PLD;将反应液低温浓缩后冷冻干燥,得到PS产物。

1.3.10 PS产率的测定 称取适量PS产物用5.00mL甲醇溶解后倒入棕色容量瓶中,用甲醇定容至

25.00mL,0.22μm有机膜过滤后 HPLC上机检测。色谱条件:柱温为35℃,紫外吸收波长为205nm,

以异丙醇∶甲醇∶水(64∶26.4∶9.6,V∶V∶V)作为流动相等度洗脱,进样量为20μL,流速为

0.50mL/min时,采用EclipsePlusC18(4.60mm×250mm,5μm)色谱柱分离。以PS的峰面积为纵坐

标,PS的浓度为横坐标绘制标准曲线,根据标准曲线计算PS的产率。

1.3.11 PS产率的单因素试验 根据预试验结果,以磷脂酰丝氨酸产率为指标,以有机相(己烷、乙醚、石

油醚和乙酸乙酯)、缓冲液(磷酸二氢钠-磷酸一氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸钠-醋酸和 Tris-盐酸)、温度

(25、30、35、40、45℃)、pH(5.50、6.00、6.50、7.00、7.50)、底物质量比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、两

相体积比(1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8)作为单因素对磷脂酰丝氨酸合成条件加以研究。

1.3.12 固定化PLD的循环使用性研究 在相同的反应条件下测定游离PLD与固定化PLD分别在循

环使用(1、2、3、4、5、6、7次)后的PS产率。

2 结果与分析

2.1 介孔二氧化硅的结构表征

在相对压力为0.04~1.00、测定温度为77K时,介孔二氧化硅的N2 吸附-解吸等温线如图1A所示,

该等温线符合IUPAC 定义的IV 型等温线[25];根据测定结果计算介孔二氧化硅的总孔隙体积为

1.35cm3/g,表明介孔二氧化硅材料的孔隙率比较大;根据Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法计算介孔

二氧化硅的BET比表面积为948m2/g。根据图1B吸附分支采用BdB球形模型计算出介孔二氧化硅的

孔径为8.20nm,孔径分布比较窄。介孔二氧化硅具有较大的 BET 比表面积、气孔体积以及与磷脂酶

D(7.60nm×4.80nm×5.70nm)[11]相近的孔径大小,不仅有利于吸附更多的酶分子,还不容易造成酶分

子在载体上的脱落。介孔二氧化硅的粒径测定结果如图 1C 所示,介孔二氧化硅的粒径分布为

100~1000nm,其平均粒径为335.10nm。介孔二氧化硅的粒径大小检测结果趋于正态分布,而且曲线

范围较为集中,说明非极性溶剂辅助Stöber法制备的介孔二氧化硅粒径比较均一。介孔二氧化硅的红外

光谱如图1D 所示,460cm-1 和800cm-1 附近的波段属于 Si—O—Si的弯曲振动峰和对称拉伸,

950cm-1 处的吸收峰为Si—OH 弯曲振动,1080cm-1 周围存在强烈的吸收带,对应Si—O—Si的不对

称拉伸振动。3429cm-1 处的吸收峰为 O—H 键的振动吸收峰。胡盛[26]研究得知CTAB的2个主要红

外吸收峰分别为2870cm-1 和2950cm-1,而图1D的红外光谱中没有这2个红外吸收峰,证明CTAB

模板剂经马弗炉高温煅烧被脱除。介孔二氧化硅的扫描电镜图和透射电镜图分别如图1E、1F所示,介孔

二氧化硅表面存在气孔结构,且介孔二氧化硅具有均匀的微球形结构可以为固定化磷脂酶D提供良好的

80 安徽科技学院学报 2024年

固定化条件。

图1 介孔二氧化硅的比表面积(A)、气孔体积及孔径(B)、粒径分布(C)、红外光谱图(D)、扫描电镜图(E)和透射电镜图(F)

Fig.1 Measurementsofspecificsurfacearea(A),porevolumeandporesize(B),particlesizedistribution(C),

infraredspectrum (D),SEM (E)andTEM (F)ofmesoporoussilica

2.2 沉淀剂和最佳沉淀剂加入量对PLD酶活性的影响

研究表明,在固定PLD时使用不同的沉淀剂会影响相对酶活性,使用沉淀剂不当时还会造成酶蛋白

分子发生不可逆的失活[11]。当温度为30℃、pH为6.00、酶液加入量为0.60mL、物理吸附时间为2.00h、戊

二醛加入量为0.60mL、交联时间为1.50h时,研究甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇及PEG6000作为沉淀剂对

PLD相对酶活性的影响。结果如图2A所示,当选用乙醇作为沉淀剂时,磷脂酶 D的相对酶活性为最大

值(85.30%±0.60%);而其它几种沉淀剂对磷脂酶D的相对酶活性都比乙醇作为沉淀剂时要低。因此,

选取乙醇作为固定PLD的最佳沉淀剂。确定了最优沉淀剂之后,还需要对沉淀剂的加入量进行优化。当

温度为30℃、pH 为6.00、酶液加入体积为0.60mL、物理吸附时间为2h、戊二醛加入体积为0.60mL、

交联时间为1.50h,乙醇作为沉淀剂时,研究乙醇加入量对固定化PLD相对酶活性的影响。结果如图2B

所示,随着乙醇沉淀剂加入量的增加,PLD的相对酶活性先上升后降低,在乙醇沉淀剂加入量为5.00mL

时达到最大值86.30%±0.50%。综上所述,乙醇沉淀剂最佳加入量为5.0mL。

第38卷第1期 孙红叶,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 81

图2 不同沉淀剂(A)和最佳沉淀剂乙醇加入量(B)对PLD酶活性的影响

Fig.2 Effectsofdifferentprecipitatingagents(A)andoptimalprecipitatingagentethanolvolume(B)ontheenzymaticactivityofPLD

2.3 温度和pH对固定化PLD的影响

当pH 为6.00、酶液加入体积为0.60mL、物理吸附时间为2h、戊二醛加入体积为0.60mL、交联时

间为1.50h、乙醇加入量为5.00mL时,研究温度对固定化PLD的影响。试验结果如图3A所示,固定化

PLD的相对酶活和蛋白固定化率均随着温度的升高先上升后下降。当温度为35℃时,固定化酶的相对

酶活性和蛋白固定化率均达到最大值,分别为86.50%±0.70%和81.80%±0.60%。当固定化温度为

50℃时,PLD的固定化速率及相对酶活性还分别为68.22%和72.77%,说明固定化技术提升了PLD对

温度的耐受性。当温度为35 ℃、酶液加入体积为0.60mL、物理吸附时间为2h、戊二醛加入体积为

0.60mL、交联时间为1.50h、乙醇加入量为5.00mL时,研究pH 对固定化PLD的影响。结果如图3B

所示,固定化PLD的相对酶活性和蛋白固定化率均随着pH 的增大先升高后降低。当pH 为6.50时,固

定化PLD的相对酶活性和蛋白固定化率均达到最大值,分别为87.27%±0.80%和82.57%±0.60%。

综上可知,在温度为35℃、pH 为6.50时,固定化PLD的蛋白固定化率和相对酶活性都达到最大值。

图3 温度(A)和pH(B)对固定化PLD相对酶活性和蛋白固定化率的影响

Fig.3 Effectsoftemperature(A)andpH (B)ontherelativeenzymeactivityandproteinimmobilizationrateofimmobilizedPLD

2.4 酶液和戊二醛加入量对固定化PLD的影响

在温度为35℃、pH 为6.50、物理吸附时间为2h、戊二醛加入体积为0.60mL、交联时间为1.50h、

乙醇加入量为5.00mL时,研究酶液加入体积对固定化PLD的影响。结果如图4A所示,当酶液加入体

积为0.60mL时,蛋白固定化率达到最大值(85.37%±1.10%)。当酶液加入体积为1.00mL时,相对酶

活性达到最大值(87.62%±1.20%)。当酶液加入体积过大时,PLD在介孔二氧化硅表面的排布会出现

多层聚集、传质阻力增大的现象,会导致PLD的相对酶活性下降,且由于介孔二氧化硅的比表面积有限,

酶液加入体积过多也会使部分游离的PLD不能固定在介孔二氧化硅上,导致蛋白固定化率降低。因此,

当酶液的加入体积为1.00mL时,相对酶活性达到最大;当酶液的加入体积为0.60mL时,蛋白固定化率

达到最大值。在温度为35℃、pH 为6.50、物理吸附时间为2h、酶液加入体积为1.00mL、交联时间为

1.50h、乙醇加入体积为5.00mL时,研究戊二醛交联剂加入体积对固定化PLD的影响。结果如图4B

82 安徽科技学院学报 2024年

所示,当戊二醛加入体积为0.40mL时相对酶活性达到最大值88.89%±1.00%;当戊二醛加入量为

1.00mL时蛋白固定化速达到最大值86.36%±1.30%。综上可知,戊二醛加入体积为0.40mL时,相对

酶活性最大;戊二醛加入体积为1.00mL时,蛋白固定化率最大。

图4 酶液(A)和戊二醛(B)加入量对固定化PLD相对酶活性和蛋白固定化率的影响

Fig.4 Effectsofenzymesolutionamount(A)andadditionvolumeofglutaraldehyde(B)ontherelative

enzymeactivityandproteinimmobilizationrateofimmobilizedPLD

2.5 固定化PLD的结构表征

固定化PLD的红外光谱及热重分析如图5所示,图5A为介孔二氧化硅固定化PLD的红外光谱图,

460cm-1 和800cm-1 附近的波段属于Si—O—Si的弯曲振动和对称拉伸,950cm-1 处的吸收峰为Si—OH

弯曲振动,1080cm-1 周围存在强烈的吸收带对应Si—O—Si的不对称拉伸振动;这4个吸收峰也是介孔

二氧化硅和介孔二氧化硅固定化 PLD 所共有的吸收峰。肽键的红外吸收峰分别为1580cm-1 和

1620cm-1[27],而介孔二氧化硅固定化PLD有1580cm-1 和1620cm-1 红外吸收峰,表明PLD被固定

在介孔二氧化硅载体上。图5B为介孔二氧化硅固定化PLD的热重分析(TGA),在30~100℃时,介孔

二氧化硅及固定化PLD的介孔二氧化硅均发生了下降,分别下降了4.90%和8.10%,这一部分的损失是

因为介孔二氧化硅中水分的蒸发。在100~500℃时,介孔二氧化硅的 TGA 曲线趋于一条直线,说明在

该温度范围内介孔二氧化硅的质量没有损失;但介孔二氧化硅固定化的PLD的 TGA曲线的质量却下降

了5.30%,这一部分的损失可以归结为酶蛋白的损失,通过 TGA再次验证PLD被固定在介孔二氧化硅

载体上。

图5 固定化PLD的结构表征

Fig.5 StructuralcharacterizationofimmobilizedPLD

注:A为FT-IR;B为TGA。

2.6 固定化PLD的稳定性

PLD的热稳定性和贮存稳定性的测定结果如图6所示,固定化PLD和游离PLD的初始酶性活均为

100%。从20℃开始,每隔10℃取出一定量的酶液,分别测定游离及固定化磷脂酶D的相对酶活性。其

结果如图6A所示,在70℃时,固定化PLD的相对酶活性依然有66.40%;而游离PLD的相对酶活性只

第38卷第1期 孙红叶,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 83

剩余15.30%。将游离及固定化PLD分别在4℃冰箱下贮存50d,每隔5天取出一定量的酶液,分别测定

游离及固定化磷脂酶 D的相对酶活性。其结果如图6B所示:游离的PLD在贮存50天时相对酶活性只

剩余17.30%;而固定化PLD在贮存50d时相对酶活性依然保留50.10%;固定化后的PLD的半衰期由

20d增加到了50d。

图6 固定化PLD的稳定性(A:热稳定性;B:贮存稳定性)

Fig.6 StabilityofimmobilizedPLD(A:thermalstability;B:storagestability)

2.7 有机溶剂和缓冲溶液对PS产率的影响

当选用水-有机体系作为合成磷脂酰丝氨酸的反应体系之后,需要对有机相进行筛选。当卵磷脂与

L-丝氨酸的质量比为1∶8、温度为35℃,pH 为6.00、有机相与水相的比为4∶1、固定化PLD的加入量

为35%时,研究有机相对PS产率的影响。结果如图7A所示,当选用己烷、石油醚、乙醚和乙酸乙酯作为有

机试剂时,PS的产率分别为52.30%±1.40%、47.60%±1.60%、83.40%±1.70%和80.80%±1.50%。因

乙醚比乙酸乙酯毒性高,所以选择乙酸乙酯作为合成磷脂酰丝氨酸的有机相。当卵磷脂与L-丝氨酸的质

量比为1∶8、温度为35℃、pH 为6.00、有机相与水机的比为4∶1、固定化PLD的加入量为35%时,研究

缓冲溶液对PS产率的影响。结果如图7B所示,当选用乙酸钠-醋酸作为缓冲溶液时,磷脂酰丝氨酸的产

率达到最大值(82.20%±1.50%),因此选取乙酸钠-醋酸作为合成磷脂酰丝氨酸产率的缓冲溶液。

图7 有机溶剂(A)和缓冲溶液(B)对PS产率的影响

Fig.7 Effectsoforganic(A)andbuffersolution(B)ontheyieldofPS

2.8 两相体积比、底物质量比、温度和pH对PS产率的影响

当卵磷脂与L-丝氨酸的质量为1∶8、反应温度为35℃、pH 为6.00、固定化PLD的加入量为35%

时,研究两相体积比对PS产率的影响。结果如图8A所示,随着有机相的增加,PS产率逐渐增大,当有机

相与水相的比例为8∶1时,PS的产率达到最大值(83.40%±1.60%),而当有机相与水相的比例从6∶1

增加到8∶1时,PS产率增加很小。综合考虑PS转化率和成本,选取有机相与水相的体积比为6∶1作为

该合成体系的最佳体积比。当有机相与水相的比为6∶1、反应温度为35℃、pH 为6.00、固定化磷脂酶D

的加入量为35%时,研究底物质量比对PS产率的影响。试验结果如图8B所示,当磷脂酰胆碱与L-丝氨

酸的比例为1∶10时,PS的产率达到最大值(83.70%±1.80%),在卵磷脂与L-丝氨酸的比例为1∶8和

1∶10时,PS的产率相接近。综合考虑生产成本的因素,选取卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8是较为

84 安徽科技学院学报 2024年

合理的比例。在有机相与水相的比为6∶1、卵磷脂与 L-丝氨酸的质量比为1∶8、pH 为6.00、固定化

PLD的加入量为35%时,研究温度对PS产率的影响。试验结果如图8C所示,在温度为40℃时,PS产率

达到最大值(84.10%±1.70%)。在有机相与水相的比为6∶1、卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8、反

应温度为40℃、固定化PLD的加入量为35%时,研究pH 对PS产率的影响。试验结果如图8D所示,在

pH 为6.50时,PS产率达到最大值(85.10%±1.60%)。综上可知,合成PS的pH 为6.50,温度为40℃

比较适宜。

图8 两相体积比(A)、底物质量比(B)、温度(C)和pH(D)对PS产率的影响

Fig.8 Effectsoftwophasevolumeratio(A),molarratioofsubstrate(B),temperature(C)andpH (D)onPSyield

2.9 固定化PLD的加入量和循环使用次数对PS产率的影响

当有机相与水相的比为6∶1、卵磷脂与 L-丝氨酸的质量比为1∶8、反应温度为40℃、pH 为6.50

时,研究了固定化PLD的加入量对PS产率的影响。结果如图9A所示:随着加酶量的增加,PS的产率先

快速上升后趋于平缓的状态。当加酶量为40%时,PS的产率达到最大值(86.60%±1.40%),在最佳条

件下测得副产物胆碱的含量为6.30%±1.70%、PS的纯度为90.30%。因此,综合考虑磷脂酰丝氨酸的

转化率,选取固定化PLD的加入量为40%时为最佳。酶的可重复使用性不仅可以影响经济效益,也是实

现工业化的重要前提[28]。对固定化PLD和游离PLD的催化性能进行比较和研究,结果如图9B所示,介

孔二氧化硅固定化PLD重复使用7次,PS的产率依然有61.30%±1.60%,而游离PLD重复使用4次,

PS的产率只有21.60%±1.80%。综上所述,固定化PLD在制备PS时具有纯度高、催化性能好,可实现

酶的多次重复使用的优点。

3 结论与讨论

本研究利用大豆PLD的转磷脂酰化反应在水-有机界面,以大豆卵磷脂和L-丝氨酸作为反应底物合

成PS。但游离PLD在高温、极端的pH 及有机溶剂中不稳定,容易发生变性,造成酶活性的降低;此外,

游离PLD难以回收再利用,会增加PS的生产成本。

本研究制备的介孔二氧化硅的BET比表面积为948m2/g、气孔体积为1.35cm3/g,孔径大小与磷脂

酶D相接近,为8.20nm,平均粒径为335.10nm,且形貌为近球形结构,因此,选用介孔二氧化硅作为固

定化PLD的载体。当温度为35℃、pH为6.50、物理吸附时间为2h、酶液加入体积为1.00mL、交联时间为

第38卷第1期 孙红叶,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 85

图9 固定化PLD的加入量(A)和循环使用次数(B)对PS产率的影响

Fig.9 Effectsofadditionvolume(A)andrecyclingnumber(B)ofimmobilizedPLDadditionvolumeonPSyield

1.50h、乙醇加入体积为5.00mL、戊二醛加入体积为0.40mL时,固定化PLD的相对酶活性达到最大值

(88.89%±1.00%),蛋白固定化率为80.76%±1.30%。使用制得的介孔二氧化硅固定PLD催化合成PS

的最佳工艺条件:有机相与水相的比为6∶1、卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8,反应温度为40℃,pH为

6.50、加酶量为40.00%,此条件下PS的产率为86.60%±1.40%,HPLC测定PS的纯度为90.30%。

70℃时游离PLD的相对酶活只剩余15.3%,而固定化PLD的相对酶活性仍然有66.4%;贮存50%

时游离PLD的相对酶活性只剩余11.2%,而固定化PLD的相对酶活性依然有50.1%。游离PLD被固

定化后酶的半衰期由20d延长到50d。固定化PLD循环使用7次,PS的产率依然有61.70%±1.60%;

游离PLD循环使用4次,PS的产率只有21.60%±1.80%。综上可知,介孔二氧化硅作为固定化酶的载

体时,PLD分子通过交联作用可以形成坚固的酶网覆盖在介孔二氧化硅表面上,使PLD的热稳定性、贮

存稳定性、对pH 的耐受性以及催化性能均得到明显的提升,并实现了PLD的多次回收重复使用。

本研究以高纯度的大豆卵磷脂作为反应底物,利用PLD的转磷脂酰化反应合成大豆PS。生物酶法

制备的PS的产品纯度较高,具有一定的工业化应用前景。李冰麟[1]选用纳米二氧化硅作为固定化PLD

的载体,通过吸附-沉淀-交联固定化PLD,酶蛋白的固定化速率可高达80%;而本研究使用制备的介孔二

氧化硅固定的PLD蛋白固定化率为80.76%±1.30%,表明本研究制备的介孔二氧化硅是较为理想的固

定PLD材料。Zhang等[29]将PLD固定在用十八烷基三甲氧基硅烷修饰的有序介孔硅立方体(OMSC)

中,固定后的PLD在40℃下相对酶活性为90%以上,固定化后,PLD的半衰期从25d延长到40d;本研

究中使用制备的介孔二氧化硅固定的PLD在40℃下相对酶活性在91%以上,在70℃下相对酶活性仍

然有66.4%,且游离PLD被固定化后酶的半衰期由20d延长到50d,表明使用本研究制备的介孔二氧化

硅固定PLD可以显著提高PLD的热稳定性、贮存稳定性、对pH 的耐受性以及催化性能。但本研究在酶

催化制备PS时虽然选用了毒性比乙醚小的乙酸乙酯作为有机相,但是还具有一定的毒性,后续可以考虑

其他绿色试剂替代乙酸乙酯有机溶剂。本研究只选用了纳米级介孔二氧化硅作为固定化PLD的载体,固

定化后的酶活性和固定化速率较为理想,后续还可考虑将介孔二氧化硅用其他官能团修饰作为固定化酶

的载体制备固定化印迹PLD,尽可能使固定化的PLD的酶活性大于初始酶活性,加快PLD的催化性能,

降低生产成本,提高成品的纯度。本研究以卵磷脂和L-丝氨酸作为反应底物,利用PLD的转磷脂酰化反

应在乙酸乙酯-水反应体系合成PS只是一个初步的探究,后续可以通过设计流化床式反应器,对该反应连

续生产PS进行放大试验。

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(责任编辑:顾文亮)

第38卷第1期 孙红叶,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 87

安徽科技学院学报,2024,38(1):88-96

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-06-14

基金项目:国家自然科学基金(31860437);安徽省大学生创新创业训练计划项目(S202312926034);食品科学与工程安徽省高峰培育学

科项目;亳州学院一流学科项目(BYXKA202202)。

作者简介:吴翠芳(1991-),女,安徽亳州人,硕士,工程师,主要从事药食同源功能食品开发与安全评价研究,E-mail:1151041169@qq.com。

通信作者:王俊钢,研究员,E-mail:wjgang728@126.com。

沙棘中黄酮类化合物提取及抗氧化活性

吴翠芳1,2, 刘雅宣1, 李宇辉3, 郝奇奇1, 何旭豪1, 王俊钢1,2*

(1.亳州学院 生物与食品工程系,安徽 亳州 236800;

2.亳州市天然产物分离纯化工程技术研究中心,安徽 亳州 236800;

3.新疆农垦科学院 农产品加工研究所,新疆 石河子 832000)

摘 要:目的:优化沙棘中总黄酮提取工艺,明确其抗氧化性能。方法:以沙棘为研究对象,以沙棘黄酮得

率为指标值,使用乙醇溶液作为提取剂,采用超声波辅助萃取法,对提取时间(A)、提取温度(B)、乙醇体积

分数(V乙醇/V总 )(C)、料液比(D)进行单因素试验和响应面分析,考察4个因素对总黄酮得率的影响,并对

沙棘黄酮的体外抗氧化活性进行检测。结果:在提取时间23min、提取温度80 ℃、50%乙醇、料液比

1∶20条件下沙棘黄酮得率最高,为2.316mg/g。各因素对沙棘黄酮得率的影响大小依次为:料液比、乙

醇体积分数、提取时间、提取温度。体外抗氧化结果表明,沙棘黄酮具有很好的DPPH 自由基和羟自由基

清除能力,当沙棘黄酮粗提取物质量浓度达到5mg/mL时,沙棘黄酮对DPPH自由基的清除率达87.5%,对

羟自由基的清除率达到了77.7%。结论:沙棘中含有丰富的黄酮类物质,且具有较好的抗氧化性能。

关键词:沙棘;黄酮;提取工艺;响应面法;抗氧化

中图分类号:TS255.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)01-0088-09

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0014

Extractionandantioxidantactivityofflavonoidsfromsea-buckthorn

WUCuifang

1,2, LIUYaxuan1, LIYuhui3, HAOQiqi1, HEXuhao1, WANGJungang

1,2*

(1.BiologyandFoodEngineeringDepartment,BozhouUniversity,Bozhou236800,China;

2.BozhouNaturalProductsSeparationandPurificationEngineeringTechnologyResearchCenter,Bozhou236800,China;

3.InstituteofAgro-productsProcessingScienceandTechnology,XinjiangAcademyof

AgriculturalandReclamationScience,Shihezi832000,China)

Abstract:Objective:Inordertooptimizetheextractionprocessoftotalflavonoidsinsea-buckthornand

clarifyitsantioxidantproperty,sea-buckthornwasselectedastheresearchobjectinthisexperiment.

Methods:Theyieldofsea-buckthornflavonoidswasusedastheindexvalue,andethanolsolutionwas

usedastheextractantandcombinedwithultrasonic-assistedextractiontechnology,singlefactortestand

responsesurfacemethodwerecarriedoutonthefourfactorsofextractiontime,extractiontemperature,

ethanolconcentrationandsolid-liquidratio,andtheantioxidantpropertyofsea-buckthornflavonoids

werestudied.Results:Theoptimumextractionconditionswereasfollows:extractiontime23 min,

extractiontemperature80 ℃ ethanolconcentration50%,solid-liquidratio1∶20g/mL.Underthe

conditions,theyieldofsea-buckthornflavonoidswasthehighest,whichwas2.316mg/g.Theeffects

ofvariousfactorsontheyieldofflavonoidsweresolid-liquidratio,ethanolconcentration,extraction

timeandextractiontemperature.Theantioxidantresultsshowedthatsea-buckthornflavonoidshad

excellentscavengingeffectsonDPPHfreeradicalsandhydroxylradicals.Whentheconcentrationofseabuckthornflavonoidsreached5mg/mL,thescavengingrateofDPPHfreeradicalreached87.5%,and

thescavengingrateofhydroxylradicalsreached77.7%.Conclusion:Sea-buckthornisrichinflavonoids,and

undercertainconcentrationconditions,sea-buckthornflavonoidshavegoodantioxidantproperties.

Keywords:Sea-buckthorn;Flavones;Extractionprocess;Orthogonaltest;Antioxidation

沙棘(HippophaerhamnoidesL.),也称为沙枣、吉汉、酸柳、达普,是胡颓子科沙棘属的一种重要的

落叶树种,具有很好的防风固沙作用。目前,沙棘果的营养保健及医疗作用被广泛关注[1]。中国沙棘资源

占全世界上95%以上,素有“沙棘王国”之称[2]。沙棘果是一种药食同源食品,具有极高的营养和药用价

值,在治疗咳嗽、改善胃肠功能、抗炎、抗病毒、提高免疫力、激发细胞新陈代谢等方面作用显著[3]。沙棘富

含黄酮、类胡萝卜素、甾醇激素、生育酚等[4],其中黄酮类化合物是其最重要的活性成分。研究表明,黄酮

类化合物可以保护肠道上皮屏障[5-7]、参与免疫调节[8-10]、调节肠道菌群结构[11-12]、维持细胞的健康和保护

内皮功能[13]等重要的生理活性。陈薇伊等[14]研究发现,山楂黄酮能显著提升糖尿病小鼠血清和肝脏中

SOD、T-AOC、GSH-PX酶活性;李雪涵等[15]研究发现榆荚仁黄酮可显著增强慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝

脏、十二指肠中SOD、GPX活性和T-AOC。随着科技的进步和人们对健康的重视程度不断增加,越来越

多对人体健康有益的功能性物质被挖掘,并验证其功效[16]。张峰等[17]通过构建氧化应激条件下花青素

对小鼠脂代谢及抗氧化性能的模型,发现花青素可以显著提高小鼠肝脏的抗氧化能力和细胞的免疫机能,

从而保护肝脏功能。吴冕等[18]将滁菊总黄酮和滁菊多糖进行配伍,发现合理的配比可以显著增强其体内

外抗氧化活性。总之,黄酮类化合物的抗氧化活性和增强动物体内抗氧化物质的表达等作用使得其研究

被逐渐重视,而沙棘鲜果中含有1500~3000mg/kg总黄酮,其更具研究价值。

植物中黄酮类化合物的提取通常选用乙醇法,借助超声波[19]、表面活性剂[20]等处理手段可增加黄酮

得率。为优化沙棘中黄酮的提取方法,提高沙棘黄酮得率,本试验借助超声辅助提取技术,在单因素试验

基础上,通过响应面方法确定沙棘中黄酮的最佳提取工艺,并对得到的沙棘黄酮类化合物的体外抗氧化活

性进行研究,可为沙棘黄酮的抗氧化性质和抗氧化能力提供基础数据,为下一步开发功能性食品、保健食

品等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料与试剂

沙棘全果冻干粉(新疆红蚂蚁农业科技有限公司);芦丁(上海源叶生物科技有限公司);无水乙醇

(AR,海博生物技术有限公司);亚硝酸钠,硝酸银,氢氧化钠(AR,国药集团化学试剂科技有限公司);亚硫

酸铁,水杨酸(AR,天津市兴复精细化工研究院);DPPH(AR,上海源叶生物科技有限公司);抗坏血酸

(AR,郑州市化学试剂三厂)。

1.2 仪器与设备

KQ-200VD超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);HH-4B恒温水浴锅(国华(常州)仪器制造有

限公司);SY204C电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司);FCD-2000恒温鼓风干燥箱(上海琅轩实验设

备有限公司);UV-6000T紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线绘制及回归方程建立 采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法,将20mg芦丁标准品溶解于

第38卷第1期 吴翠芳,等:沙棘中黄酮类化合物提取及抗氧化活性 89

少量的60%乙醇中,加60%乙醇定容至100mL,得到0.2mg/mL芦丁标准溶液。参照林继辉等[21]方

法,分别吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL0.2mg/mL芦丁标准溶液,分别加入6mL30%乙醇溶

液、1mL5%亚硝酸钠溶液,混匀后放置6min,加入1mL30%硝酸银溶液,混匀静置6min,加入10mL

10%氢氧化钠溶液,加入30%乙醇溶液至25mL,混匀后静置15min,在510nm 处测定吸光度。得出回

归方程y=9.8906x+0.0137,R2=0.9981,表明芦丁标准品的含量与吸光度有良好的线性关系(图1)。

图1 标准曲线与回归方程

Fig.1 Standardcurveandregressionequation

1.3.2 单因素试验 准确称取2.00g沙棘粉末,固定其他提取因素分别考察提取时间(20、30、40、50、

60min)、提取温度(40、50、60、70、80℃)、乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶15、

1∶20、1∶25、1∶30、1∶35g/mL)对黄酮得率的影响。

1.3.3 响应面优化设计试验 利用Design-Expert8.0.6设计响应面优化试验方法,提取时间(A)、提取

温度(B)、乙醇体积分数(V乙醇/V总 )(C)、料液比(D)等4个影响因素为自变量,黄酮得率为因变量,设计四

因素三水平的响应面试验(表1)。

表1 响应面试验因素水平表

Table1 Responsetoflourtestfactorleveltable

因素 水平

提取时间(A)/min 15 20 25

提取温度(B)/℃ 60 70 80

乙醇体积分数(C)/% 40 50 60

料液比(D)/(g/mL) 1∶20 1∶25 1∶30

1.3.4 黄酮得率的测定 通过准确吸取已经处理好的沙棘黄酮溶液,在510nm 处测定吸光度 A,获得

沙棘黄酮质量浓度,计算沙棘黄酮得率。

1.3.5 DPPH 自由基清除率的测定 参考田建华等[22]方法。准确称将沙棘黄酮粗提取物和 Vc对照品

各0.5g,用75%乙醇定容至100mL,配制成5mg/mL沙棘黄酮粗提取物溶液和 Vc对照品溶液。然后

分别用75%乙醇溶液将其稀释配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL样品溶液。称取0.79gDPPH 粉

末加蒸馏水定容至1000mL配制成2mmol/L的DPPH 溶液。分别吸取2.0mL上述不同质量浓度的

沙棘黄酮粗提取物样液,加入2mL2mmol/LDPPH 溶液,将溶液在常温下遮光30min后,于517nm下

测得吸光度 A1;分别吸取2.0mL上述不同浓度的沙棘黄酮粗提取物样液,加入2.0mL75%乙醇于相同

波长下分别测定其吸光度A2;吸取2.0mL2mmol/L的DPPH 溶液加2.0mL75%乙醇在517nm下测

定吸光度 A0,使用相同的方法测定 Vc进行阳性对照试验。DPPH 自由基清除率计算公式如式(1)所示:

DPPH 自由基清除率=(1-

A1 -A2

A0

)×100% (1)

其中,A1 为2.0mL样品溶液+2.0mL2mmol/L的DPPH溶液吸光度;A2 为2.0mL样品溶液+2.0mL

75%乙醇溶液吸光度;A0 为2.0mL2mmol/L的DPPH 溶液+2.0mL75%乙醇溶液吸光度。

1.3.6 羟自由基清除率的测定 参考田建华等[22]方法,略有改进。准确称将沙棘黄酮粗提取物和 Vc对

照品各0.5g,用75%乙醇定容至100mL,配制成5mg/mL沙棘黄酮粗提取物溶液和 Vc对照品溶液。

然后分别用75%乙醇将其稀释成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL样品溶液。准确称取1.3910g硫酸亚

90 安徽科技学院学报 2024年

铁加蒸馏水配制成5mmol/L硫酸亚铁溶液。准确称取0.6900g水杨酸加无水乙醇配制成5mmol/L

水杨酸的乙醇溶液、再配制0.1%过氧化氢溶液。分别吸取上述不同质量浓度的沙棘黄酮粗提取物样液

2.0mL,加入5mmol/L硫酸亚铁溶液、5mmol/L水杨酸乙醇溶液、0.1%过氧化氢溶液各2mL,混匀后

于530nm处测定其吸光度 A1;分别吸取2.0mL上述不同浓度的沙棘黄酮粗提取物样液,加入蒸馏水、

0.1%过氧化氢溶液、5mmol/L水杨酸乙醇溶液各2.0mL,混匀后于530nm 处测定其吸光度 A2;吸取

蒸馏水、5mmol/L硫酸亚铁溶液、0.1%过氧化氢溶液、5mmol/L水杨酸乙醇溶液各2.0mL,混合均匀

后,于530nm处分别测定其吸光度 A0,然后使用相同的方法测定 Vc进行阳性对照试验,根据式(2)计算

沙棘黄酮粗提取物和 Vc的羟自由基清除率:

羟自由基清除率=(1-

A1 -A2

A0

)×100(%) (2)

其中,A1 为2.0mL样品溶液+2.0mL硫酸亚铁溶液+2.0mL过氧化氢溶液+2.0mL水杨酸乙醇溶

液吸光度;A2 为2.0mL样品溶液+2.0mL蒸馏水+2.0mL过氧化氢溶液+2.0mL水杨酸乙醇溶液

吸光度;A0 为2.0mL蒸馏水+2.0mL硫酸亚铁溶液+2.0mL过氧化氢溶液+2.0mL水杨酸乙醇溶

液吸光度。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析,所有试验均测定3次,结果以“平均值±标准差”表示。

P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。采用 Origin8.0软件作图。

2 结果分析

2.1 单因素试验结果

由图2A结果可以看出,提取时间为10~20min时,沙棘黄酮得率随着提取时间延长呈递增趋势,当

提取时间为20min时沙棘黄酮提取效果最佳,黄酮得率显著高于(P<0.05)其他水平,为1.44mg/g。

然而当提取时间超出20min后,则黄酮得率逐渐下降(P<0.05),这可能是由于提取时间太久,黄酮类物

质受到热量的影响而分解、聚集等一系列化学反应会影响黄酮得率;另一方面,由于乙醇在提取过程容易

挥发,导致黄酮得率降低[23]。因此选取20min为本试验的最佳提取时间。

从图2B中可以看出,随着提取温度的升高,沙棘黄酮得率整体表现出了先升高后下降的趋势。在提

取温度70℃时,得率达到了2.09mg/g,显著高于(P<0.05)其他温度条件。一般来说,温度越高,化学

反应越快,提取效果越好,沙棘黄酮得率也就越高,但试验结果却显示在70℃后随温度升高黄酮得率反而

下降。其原因是提取液在适宜温度条件下,液体分子运动的增加促使了黄酮分子溶出率增高,但是在过高

温度条件下,沙棘黄酮的结构也可能会被破坏,也更容易被氧化而生产其他物质[24],从而降低沙棘黄酮得

率,故选取70℃为后续试验的提取温度。

如图2C所示,沙棘黄酮的得率会因乙醇的比例而发生变化,黄酮得率随乙醇体积分数的增大呈现出

先增高后降低的趋势,在乙醇体积分数为50%时,黄酮得率最高,为1.72mg/g,显著高于其他水平(P<

0.05)。Munhoz等[25]研究表明,溶剂的极性对黄酮的提取萃取有一定的影响,黄酮类化合物在乙醇溶液

中的溶解度比在水溶液中的溶解度高,就是因为水的极性高,而乙醇的极性低,将乙醇溶液和水溶液混合,

降低溶剂极性可以提高黄酮类化合物等酚类化合物的提取率,所以乙醇溶液在溶剂中的浓度越高,极性就

越低,提取效果就越好,沙棘黄酮得率越高。当乙醇体积分数大于50%时,黄酮得率显著降低(P<0.05),

这可能是沙棘果中其他醇溶性物质的溶出影响了沙棘黄酮类物质的溶出[26],从而导致沙棘黄酮得率降

低,故选择乙醇体积分数为50%条件进行后续试验。

由图2D可知,沙棘黄酮得率随料液比比值的增大总体呈现出增加趋势,料液比在1∶15~1∶25g/mL

时,沙棘黄酮得率增长最快,而1∶30~1∶35g/mL时黄酮得率增长速度减缓。一般来说,溶剂量添加越

多,沙棘黄酮得率也越高,但当料液比增加到一定的比值后,溶液中的黄酮类成分已经基本被溶出,故沙棘

黄酮得率增加非常缓慢[27]。为了节约成本,减少黄酮类化合物干燥过程中的能耗,因此选择料液比为

1∶25g/mL为最佳料液比。

第38卷第1期 吴翠芳,等:沙棘中黄酮类化合物提取及抗氧化活性 91

图2 不同提取条件对沙棘黄酮提取率的影响

Fig.2 Effectsofdifferentextractionconditionsontheextractionrateofseabuckthornflavonoids

注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 沙棘黄酮提取工艺响应面结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 采用 DesignExpert8.0.6软件,对沙棘黄酮的提取进行Box-Behnken

设计,响应面试验及结果见表2。

表2 响应面试验及结果

Table2 Experimentaldesignandresultsforresponsesurfaceanalysis

编号 提取时间(A)/min 提取温度(B)/℃ 乙醇体积分数(C)/% 料液比(D)/(g/mL) 黄酮得率/(mg/g)

1 -1 -1 0 0 2.142

2 1 -1 0 0 1.782

3 -1 1 0 0 1.951

4 1 1 0 0 1.977

5 0 0 -1 -1 2.057

6 0 0 1 -1 1.781

7 0 0 -1 1 2.150

8 0 0 1 1 2.159

9 -1 0 0 -1 2.049

10 1 0 0 -1 1.708

11 -1 0 0 1 2.084

12 1 0 0 1 2.113

13 0 -1 -1 0 1.951

14 0 1 -1 0 2.117

15 0 -1 1 0 1.889

16 0 1 1 0 1.873

17 -1 0 -1 0 1.978

18 1 0 -1 0 1.958

19 -1 0 1 0 1.784

20 1 0 1 0 1.784

21 0 -1 0 -1 1.920

22 0 1 0 -1 1.986

23 0 -1 0 1 2.120

24 0 1 0 1 2.329

25 0 0 0 0 2.298

26 0 0 0 0 2.113

27 0 0 0 0 2.110

28 0 0 0 0 2.007

29 0 0 0 0 2.043

92 安徽科技学院学报 2024年

2.2.2 模型建立及显著性分析 采用DesignExpert8.0.6统计软件,对表2中的数据进行多元回归分

析,获得沙棘黄酮得率对提取时间(A)、提取温度(B)、乙醇质量分数(C)和料液比(D)的二次多元回归模

型为:黄酮得率=2.07-0.056×A+0.036×B-0.078×C+0.12×D+0.097×AB+0.0051×AC+

0.093×AD-0.045×BC+0.036×BD+0.071×CD-0.11×A2-0.018×B2-0.087×C2+0.035×

D2。对该模型进行方差分析(表3)。由表3可知,该回归模型P<0.0001,极显著,失拟项P=0.4119,

>0.05,不显著,表明模型具有较高可靠性。R2=0.9328,R2

Adj=0.8656,试验结果说明,拟合程度高,误

差小,因此模型成立,可用于分析、预测沙棘中黄酮提取的最佳条件[27]。经方差分析,各因素对黄酮得率

的影响程度为D>C>A>B。其中,一次项中 A、C、D对沙棘黄酮得率影响极显著(P<0.01),B对沙棘

黄酮得率影响显著(P<0.05);AB、AD之间交互效应极显著(P<0.01),CD之间交互效应显著(P<0.05),

AC、BC和BD之间交互效应不显著(P>0.05)。

表3 响应面结果方差分析

Table3 Analysisofvarianceforthefittedregressionmodel

方差来源 平方和 自由度 均方 F P

模型 0.54 14 0.039 13.88 <0.0001**

A 提取时间 0.037 1 0.037 13.25 0.0027

B 提取温度 0.015 1 0.015 5.50 0.0343

C 乙醇体积分数 0.074 1 0.074 26.43 0.0001

D 料液比 0.180 1 0.180 62.91 <0.0001

AB 0.037 1 0.037 13.37 0.0026**

AC 0.000104 1 0.000104 0.037 0.8501

AD 0.034 1 0.034 12.27 0.0035**

BC 0.00826 1 0.00826 2.96 0.1076

BD 0.00507 1 0.00507 1.81 0.1993

CD 0.02 1 0.02 7.25 0.0175*

A2 0.076 1 0.076 27.18 0.0001

B2 0.00201 1 0.00201 0.72 0.4105

C2 0.049 1 0.049 17.59 0.0009

D2 0.00784 1 0.00784 2.8 0.1162

残差 0.039 14 0.002803

失拟项 0.030 10 0.00302 1.36 0.4119

纯误差 0.0089 4 0.00223

总离差 0.58 28

注:* 为差异显著(P<0.05);** 为差异极显著(P<0.01)。

2.2.3 各因素之间交互效用分析 图3为影响沙棘黄酮提取各因素之间的交互效应图,从图中可以直观

看出个响应面最大值所对应的因素水平,另外,还可以通过响应面投影的等高线判断这两个因素之间是否

存在显著的交互效应[28]。由图3a可知,当乙醇质量分数和料液比一定时,随着提取时间(A)和提取温度

(B)的增加,黄酮得率呈现先增加后减小的趋势,从图形中各因素边缘曲线的陡峭程度可以看出,提取时

间对沙棘中黄酮得率影响要高于提取温度,且当提取时间和提取温度之间有一定的拮抗作用,提取时间会

限制提取温度对沙棘黄酮得率的影响。从图3c可以看出,提取时间和料液比(D)之间也有一定的拮抗作

用,当提取时间较小且料液比过大时,沙棘黄酮得率会明显增加。图3f中,乙醇体积分数(C)和料液比之

间也存在拮抗作用,随着乙醇体积分数的过高的乙醇体积分数反而会影响沙棘黄酮得率,限制了料液比增

加对沙棘黄酮得率的影响。

2.2.4 验证试验 结合响应面模型分析结果,利用软件 Design-Expert8.0.6对所求极值与边界值分析

可得出沙棘总黄酮提取工艺的最佳参数为:提取时间23.16min、提取温度79.95 ℃、乙醇体积分数

48.62%、料液比1∶20,在此工艺条件下,沙棘黄酮得率为2.329mg/g。考虑到提取沙棘黄酮工艺的可

操作性,将提取参数修正为:提取时间为23min、提取温度为80℃、乙醇体积分数为50%、料液比为1∶20。

以此工艺条件进行3次验证试验,得到沙棘黄酮提取率分别为:2.295mg/g、2.315mg/g、2.338mg/g,与

模型所得理论值平均误差仅为0.5%,说明该数学模型能够很好的模拟沙棘中黄酮类化合物的提取工艺。

第38卷第1期 吴翠芳,等:沙棘中黄酮类化合物提取及抗氧化活性 93

图3 两因素相互作用对沙棘黄酮提取率影响的响应面图

Fig.3 Responsesurfacediagramoftheeffectoftwofactorsontheextractionrateofseabuckthornflavonoids

2.3 沙棘黄酮抗氧化能力的测定

2.3.1 DPPH 自由基的清除能力 人体机能通过代谢会产生大量自由基,自由基会对生命大分子如蛋

白质、核酸等进行攻击,从而影响身体健康[29]。如果体内的自由基过多,则可引起某些疾病,如肿瘤,心脑

血管疾病等等,并且已有科学研究证明人体衰老和自由基引起的氧化损伤有关,其中DPPH 自由基,是一

个很稳定的自由基,在实验室研究中常被用于抗氧化成分的体外抗氧化性测定[30]。由图4可知,沙棘黄

酮粗提取物与 VC对照品对DPPH 自由基的清除作用呈明显的量效关系,并且呈现出相同的上升趋势,

沙棘黄酮粗提取物和 VC的浓度越高,对 DPPH 自由基的清除效果越佳,当沙棘总黄酮粗提取物浓度达

到5mg/mL时,对羟自由基的清除率达到了87.5%,说明沙棘黄酮有较强的抗氧化能力。

2.3.2 羟自由基的清除能力 羟自由基有着极强的毒性,是最活泼的自由基,羟自由基作用于人体内的

核酸、蛋白质、脂类等生物大分子,易对其细胞组织结构和功能造成一定的损伤,造成各类疾病的发生以及

机体衰老,影响人体的健康[31]。黄酮类物质抗氧化作用的实现主要是通过酚羟基与自由基反应,形成一

种稳定共振的半醌式自由基来阻断氧化链式反应[32]。由图5可知,沙棘黄酮粗提取物和 Vc浓度越高,对

94 安徽科技学院学报 2024年

羟自由基的清除效果越佳,当沙棘总黄酮粗提取物质量浓度达到5mg/mL时,对羟自由基的清除率达到

了77.7%,说明本试验中得到的沙棘黄酮具有较好的抗氧化作用。

图4 沙棘黄酮对DPPH自由基清除能力的影响

Fig.4 Effectofsea-buckthornflavonoidson

DPPHfreeradicalscavengingability

图5 沙棘黄酮对羟自由基清除能力的影响

Fig.5 Effectofseabuckthornflavonoidson

hydroxylradicalscavengingability

3 结论

采用沙棘粉末作为原料,乙醇溶液作为提取剂,并与超声波辅助提取技术相结合的方法,分别就提取

时间(A)、提取温度(B)、乙醇体积分数(C)和料液比(D)等4个因素进行单因素试验,确定最佳因素水平

为提取时间20min、提取温度70℃、乙醇体积分数50%、料液比1∶25g/mL。响应面试验结果表明,影

响沙棘黄酮得率的因素顺序为D>C>A>B,即料液比>乙醇体积分数>提取时间>提取温度,最优工艺

参数为:提取时间为23min、提取温度为80℃、乙醇体积分数为50%、料液比为1∶20,在此条件下黄酮得

率为2.316mg/g。

沙棘黄酮粗提取物的抗氧化活性研究表明沙棘黄酮对 DPPH 自由基和羟自由基都具有较好的清除

效果,当沙棘总黄酮粗提取物质量浓度达到5mg/mL时,对DPPH 自由基和羟自由基的清除率分别达到

87.5%和77.7%。

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