吉林农业大学学报2024年第2期电子宣传册-电子书的制作-云展网在线书城

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吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

were significantly enriched in 10 and 14 KEGG metabolic pathways, respectively; Transcription fac⁃

tors predicted that 20 transcription factors in 13 families of NC95 changed significantly, and 38 tran⁃

scription factors in 20 families of SY04-3 changed significantly. This study provides reference for

the study on the early response of tobacco to potato Y virus infection mechanism.

Key words：tobacco； potato virus Y； transcriptome； differentially expressed genes

马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus）是最大的植物病

毒属，其代表种为马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y，

PVY），是侵染植物的 RNA 病毒［1-2］

。PVY 通过蚜

虫和汁液摩擦等非持久性方式侵染马铃薯、辣椒、

番茄和烟草等茄科作物［3-4］

。在我国烟草种植区域

流行的代表性PVY毒株至少有4种，分别是脉坏死

株系（PVYN

）、茎坏死株系（PVYNS）、点刻条纹株系

（PVYC

）和普通株系（PVYO

）［5-6］

。当烟草感染 PVY

后，叶脉呈暗褐色，叶片出现花叶型的斑驳，病叶烤

晒后香气和色泽较差，烟碱降低，硝酸盐和总氮含量

上升，烟叶品质明显降低，带来巨大的经济损失［7］

。

近年来，转录组测序技术在生物学研究领域

已经广泛应用，通过转录组测序可以快速、全面、

准确地了解植物基因总体表达情况，有利于挖掘

与防御、信号转导和次生代谢等重要的基因［8-9］

。

雷阳等［10］

对辣椒苗期抗感黄瓜花叶病毒病比较

转录组学分析发现，蛋白质代谢、防御反应、激素

调节等通路共同在辣椒体内对黄瓜花叶病毒进行

免疫；Liu 等［11］

利用转录组分析在蓝光下控制玉

米气孔发育的调节网络，确定了 6 个在 HY5 模块

和 MAPK级联调控中起作用的基因；Kong等［12］

对

甜椒冷胁迫后进行转录组测序，筛选出许多参与生

物膜稳定性、脱水和渗透调节以及植物激素信号转

导的差异表达基因，并鉴定出41个冷诱导转录因子

家族的250个转录因子。本研究通过对PVY高感

（NC95）和高抗（SY04-3）品种进行接种处理，利用

转录组测序技术深入了解烟草对 PVY 侵染的早

期响应的转录组信息，为进一步揭示烟草抗 PVY

的动态过程和培育抗病品种提供理论依据。

1　材料与方法

1. 1　试验材料

供试材料为 PVY高感品种 NC95与高抗品种

SY04-3。PVY 病毒叶由延边朝鲜族自治州农业

科学院烟草研究所提供，将病叶剪碎放入冰上预

冷的研钵中，加入磷酸缓冲液后研磨至浆液，用无

菌纱布过滤掉残渣，制成PVY病毒液，放在4 ℃冰

箱备用。

1. 2　方法

1. 2. 1 材料处理及转录组测序使用质量分数

为0.1％的AgNO3溶液对烟草种子进行消毒，用清

水浸洗 7~8 次。完成后将种子均匀撒在育苗盘

中，在延边大学农学院温室进行育苗，待烟苗长至

三叶期移栽至营养钵中。烟株长至 5~6 片叶时，

选取长势一致的烟株进行人工接种 PVY：用石英

砂在叶片背面划出伤口，用棉签蘸取病毒液涂抹

在伤口处，对照用清水代替病毒液。12 h 后对接

种和未接种的烟株进行取样，将取下的叶片迅速

包好放入液氮中，置于-70 ℃超低温冰箱冷藏，各

样品均取3次重复。所有样品由北京百迈克生物

科技有限公司进行转录组检测。

1. 2. 2 测序数据的分析为保证后续数据分析

的准确性，在进行数据分析前筛选出高质量的

Reads。通过去除含有接头的 Reads 和低质量的

Reads［包括去除w（N）>10%的Reads和质量值Q≤

10 的碱基数占整条 Read50% 以上的 Reads 等］对

原始数据进行过滤，得到高质量的 Clean reads 并

进行后续分析［13］

。

1. 2. 3 差异基因的筛选与生物信息学分析采

用DESeq软件对对照与接种处理的样本进行差异

表达基因的筛选，将差异倍数（fold change，FC）≥

1.5，P值≤0.01作为筛选标准。

将抗感2个品种的样品组间所选出的差异表

达基因在北京百迈客生物科技有限公司百迈客云

平台进行 GO 功能注释和 KEGG Pathway 显著性

富集分析［14］

。

根据差异表达基因与植物转录因子数据库

4.0（http：∥planttfdb. cbi. pku. edu. cn/）进行对

比，阈值设置为 E 值=1×10−5

，筛选差异表达基因

的转录因子分类及数目。

1. 2. 4 差异基因的 qRT-PCR 的验证为验证

转录组测序结果的准确性，随机挑选4个基因，进

行 qRT-PCR 验证，利用 Primer 6 软件设计扩增引

物（表1）。各处理的样品总RNA由北京百迈客生

220

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王平，等：2个抗感烟草品种响应马铃薯Y病毒早期胁迫的转录组分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

物科技有限公司提供，采用天根生化科技（北京）

有限公司的反转录试剂盒并按照说明书进行

反转录操作，获得的 cDNA 保存在-20 ℃。将获

得 cDNA 作为模板进行 qRT-PCR 反应，每个样

品进行 3 次重复。qRT-PCR 反应体系为 20 μL

（2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL，cDNA

2 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，50×ROX

Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.4 μL），反应程序为

95 ℃ 3 min；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 10 s，72 ℃延

伸 20 s，40 个循环；于 72 ℃条件下读取荧光值。

以烟草 Actin 基因为内参基因，通过 2-ΔΔCT方法计

算相对表达量。

2　结果与分析

2. 1　测序质量分析

采用高通量测序平台，对处理组及对照组

的样品进行了转录组数据统计和质量检测，结

果见表 2。由表 2 可知，去除含有接头的 Reads、

w（N）>10%的Reads和质量值Q≤10的碱基数占整

条 Read 50%以上的 Reads，在 12个样品中共获得

了 28 563 278~20 803 749 的 Clean reads。就每个

样品的 GC 含量来看，总体偏差很小，呈随机分

布，范围为42.71%~43.51%，其中A-12-2的GC含

量最多，为 43.51%，B1-12-3 的 GC 含量最少，为

42.71%。通过质量控制参数Q30的数值大小可以

判断测序质量，当 Q30≥80％时，测序质量可靠。

本研究的检测结果显示Q30的数值均>93%，表明

转录组测序具有较高的可信度，为后续分析结果

的准确性提供了保证。

2. 2　差异表达基因统计分析

对 NC95 和 SY04-3 接种 PVY 后 12 h 和未接

种的基因表达进行差异分析见表 3，结果表明，

NC95 接种 PVY 12 h 后，差异表达基因数量达到

了 317个，其中上调表达基因 206个，下调表达基

因 111 个；SY04-3 接种 12 h 后，上调表达基因

1 001 个，下调表达基因 423 个，差异表达基因共

有 1 424 个。接种后 SY04-3 的差异基因表达数

量远多于 NC95。由差异表达基因韦恩图（图 1）

可见，2 个品种接种 12 h 后共有的差异基因为

75 个，NC95 单独表达的差异基因数为 242，

SY04-3 单独表达的差异基因数为 1 349。NC95

单独表达的差异基因数少于 SY04-3 单独表达的

差异基因。

表1 qRT-PCR反应引物

Table 1 Primers for qRT-PCR

引物名称

ChiB-F

ChiB-R

Pti6-F

Pti6-R

FRK1-F

FRK1-R

WRKY33-F

WRKY33-R

Actin-F

Actin-R

序列（5′-3′）

CCGCAGAATGTTGGGTGGGATTTG

CTAGTCCGCCATTGCTGCATTGA

GCTCGGCGTCACATACTTCACACT

CATCAGCGCCAACTCAAGGTCCAT

CCAGGATGATGAAGGTGTTCTGCCG

TGCCACAAACTTCTCCACCCATTCG

TCAGCACCAGGAAGCAGAACAGTA

GGCATTGGCACCATTGTTGTAAGTA

AAGGGATGCGAGGATGGA

CAAGGAAATCACCGCTTTGG

表2 各样品测序质量

Table 2 Sequencing quality of each sample

样品

A-12-1

A-12-2

A-12-3

A1

-12-1

A1

-12-2

A1

-12-3

B-12-1

B-12-2

B-12-3

B1

-12-1

B1

-12-2

B1

-12-3

总Reads 数量

46 351 196

57 126 556

46 275 322

43 620 520

41 607 498

54 837 710

48 801 596

42 719 062

42 513 046

44 928 036

43 176 130

42 733 260

有效读序

23 175 598

28 563 278

23 137 661

21 810 260

20 803 749

27 418 855

24 400 798

21 359 531

21 256 523

22 464 018

21 588 065

21 366 630

多重比对

1 368 686 (2.95%)

2 154 578 (3.77%)

1 619 044 (3.50%)

1 548 345 (3.55%)

1 381 355 (3.32%)

2 441 272 (4.45%)

1 670 431 (3.42%)

2 938 916 (6.88%)

1 365 289 (3.21%)

1 749 560 (3.89%)

1 692 071 (3.92%)

1 414 396 (3.31%)

唯一比对

43 358 463 (93.54%)

52 823 512 (92.47%)

42 928 107 (92.77%)

40 598 927 (93.07%)

38 752 804 (93.14%)

50 415 221 (91.94%)

44 897 867 (92.00%)

37 804 305 (88.50%)

39 496 648 (92.90%)

41 504 014 (92.38%)

40 016 166 (92.68%)

38 857 259 (90.93%)

Q30含量/%

93.95

94.19

94.20

94.79

94.12

94.30

95.31

96.36

93.04

94.70

94.57

94.20

GC 含量/%

43.10

43.51

43.34

43.24

43.33

43.35

42.96

43.21

42.84

43.25

43.19

42.71

注：A. NC95接种处理12 h；A1

. NC95未接种处理12 h；B. SY04-3接种处理12 h；B1

. SY04-3未接种处理12 h。下表同

221

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吉林农业大学学报 2024 年 4 月

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2. 3　差异表达基因的GO功能注释分析

表 4 为 NC95 与 SY04-3 接种后 12 h 下调 GO

分类。由表 4 可知，NC95（A）和 SY04-3（B）上调

差异表达基因 GO注释分类，在生物学过程中，均

注释到细胞转化最多，分别为 116个和 628个；在

细胞组分中，均注释到细胞（细胞和细胞组分最多

的，分别为120个和679个；在分子功能中，注释到最

多的均为与蛋白结合有关，分别为104个和479个）。

总体来看SY04-3 比NC95注释到的GO条目略多，

且远多于NC95的上调差异表达基因数目。

NC95 和 SY04-3 下调差异表达基因 GO 注释

分类显示，在生物学过程中，NC95 注释到代谢过

程最多，为41个，而SY04-3注释到细胞转化最多，

为140个；在细胞组分中，2品种注释到细胞和细胞

组分均最多，但 SY04-3 比 NC95 的差异表达基因

数多 99个；在分子功能中，NC95与蛋白结合有关

和催化活性注释均最多，为38个，但SY04-3 只有

注释到催化活性最多，为158个。NC95比SY04-3

注释的下调差异表达基因数目少，2个品种注释到

上调差异表达基因要多于下调差异表达基因。

表4 NC95与SY04-3接种后12 h下调 GO分类

Table 4 Down regulation of GO classification 12 h after inoculation of NC95 and SY04-3

生物过程学

细胞进程

代谢过程

单生物过程

生物调节

应激反应

细胞成分组织或生物发生

定位

信号转导

发展进程

有机体多细胞进程

繁殖进程

繁殖

有机体进程

生长

免疫系统进程

节律进程

转运

行为

解毒

生物黏附

生物相

22 090

20 163

14 608

7 640

5 455

5 028

4 175

1 966

1 714

1 362

853

692

653

208

186

64

52

26

17

13

1

116

112

58

34

80

7

2

17

9

7

2

1

2

0

7

0

1

0

628

616

212

100

79

213

35

17

20

15

9

11

3

1

0

35

41

21

13

9

2

3

1

4

3

0

1

0

140

116

120

50

40

22

35

14

7

8

6

4

8

1

3

0

GO功能

名称 GO功能分类所有基因数

上调

A差异

基因数

B差异

基因数

下调

A差异

基因数

B差异

基因数

表3 差异基因表达数

Table 3 Number of differential gene expression

分组

A1

-12，A-12

B1

-12，B-12

差异基因总数

317

1 424

上调基因数

206

1 001

下调基因数

111

423

图1 NC95与SY04-3差异表达基因韦恩图

Fig. 1 Venn diagram of differentially expressed genes

of NC95 and SY04-3

222

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王平，等：2个抗感烟草品种响应马铃薯Y病毒早期胁迫的转录组分析

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细胞组分

分子功能

细胞

细胞成分

细胞器

膜

膜成分

细胞器成分

高分子复合物

膜关闭内腔

胞外区域

胞外区域成分

细胞连接

共质体

其他有机体

其他有机体成分

超级分子络合物

类核

突触

突触成分

结合

催化活性

转运活性

结合核酸转录活性

结构分子活性

分子转导活性

信号转导活性

抗氧化活性

电子载体活性

结合蛋白转录活性

营养储藏活性

分子功能调节剂

蛋白质标记物

转化调节活性

金属伴侣活性

24 544

17 883

15 050

12 924

6 740

6 268

1 780

1 469

534

502

481

373

57

37

13

9

25 150

21 143

2 869

2 032

1 043

515

379

375

284

106

68

52

13

7

120

101

78

64

59

51

5

4

3

2

3

0

3

0

104

69

6

2

1

8

0

1

0

679

602

151

116

382

442

58

38

25

9

24

1

6

0

479

251

29

8

277

6

7

2

0

2

7

3

0

37

31

19

9

3

0

4

2

1

2

0

38

8

3

0

2

0

136

67

96

89

29

23

9

7

0

2

0

141

158

37

5

2

3

4

3

4

1

0

Continued table 4

GO功能

名称 GO功能分类所有基因数

上调

A差异

基因数

B差异

基因数

下调

A差异

基因数

B差异

基因数

2. 4　差异表达基因的KEGG通路分析

2. 4. 1 上调差异表达基因的KEGG通路分析对

NC95和 SY04-3上调差异基因进行 KEGG通路分

析，结果见图 2。由图 2 可见，NC95 和 SY04-3 上

调差异基因富集到20条主要代谢通路，显著富集

到 7 条主要的代谢通路（q 值≤ 0.05），NC95 与

SY04-3 富集因子最多的途径均为光合-天线

蛋白。

NC95富集上调差异基因最多的途径为光合天线蛋白，其次是内质网中的蛋白质加工途径。

SY04-3在核糖体途径富集上调差异基因最多，其

次是内质网中的蛋白质加工途径。

续表4

223

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吉林农业大学学报 2024 年 4 月

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2. 4. 2 下调差异表达基因的KEGG通路分析对

NC95和 SY04-3下调差异表达基因进行 KEGG通

路分析，结果见图 3。由图 3可见，NC95和 SY04-

3下调差异表达基因富集到 20条主要代谢通路，

其中 NC95 显著富集到 10 条主要代谢通路（q≤

0.05），在组氨酸代谢途径富集因子最多；SY04-3

显著富集到14条主要代谢通路（q≤ 0.05），富集因

子最多的途径为光合有机物的碳固定。

NC95 富集下调差异基因最多的途径为光合

作用和氧化磷酸化途径，SY04-3富集差异基因最

多的途径为碳代谢。

接种 PVY 后，NC95 和 SY04-3 代谢途径中，

上调基因富集的代谢途径高于下调基因，由此可

见，烟草受到 PVY 胁迫后，生理响应过程主要与

上调相关基因表达有关。

2. 5　烟草PVY响应的转录因子分析

通过烟草接种 PVY后的转录因子表达变化，

对差异表达基因中的转录因子进行分析。接种

PVY 后，NC95 有 20 个转录因子的表达发生了改

变，SY04-3 有 38 个转录因子的表达发生改变。

NC95 的转录因子属于 13 个家族，其中数量最多

的为 Others、Pseudo ARR-B和TAZ，各有3个转录

因子，其次为 Jumonji，有 2 个转录因子。SY04-3

的转录因子属于20个家族，Others和SNF2的数量

最多，有 4 个转录因子，Mterf 的转录因子数量次

之，有3个（图4）。

注：圆点的位置代表代谢途径，圆点的大小代表基因的数量。

下图同

图2 NC95和SY04-3上调差异基因KEGG通路

Fig. 2 KEGG pathway for up-regulating differential

genes of NC95 and SY04-3

图3 NC95和SY04-3下调差异基因KEGG通路

Fig. 3 KEGG pathway for down-regulating differen⁃

tial genes of NC95 and SY04-3

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王平，等：2个抗感烟草品种响应马铃薯Y病毒早期胁迫的转录组分析

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2. 6 qRT-PCR 验证

随机挑选 ChiB（碱性内切几丁质酶 B）、Pit6

（致病相关基因转录激活因子）、FPK1（衰老诱

导受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）和 WRKY33

（WRKY 转录因子 33）这 4 个基因进行 qRTPCR 扩增，并与转录组数据进行对比，结果见图5。

由图 5 可见，接种后 NC95 显著高于 SY04-3 的

ChiB 相对表达量（P<0.05），而 SY04-3 显著高

于 NC95 的 Pti6、FPK1 和 WRKY33 的相对表达量

（P<0.05），4 个基因均与转录组数据表达趋势一

致，说明此转录组数据可靠性较高。

3　讨论与结论

近年来，有关烟草抗 PVY 功能基因克隆、遗

传多样性和作用机理等方面的分子生物学研究正

在逐步开展，但是有关烟草抗 PVY转录组方面的

研究鲜有报道。本试验对2品种烟草接种后产生

的差异基因数进行统计分析，结果显示：与对照相

比，感病品种 NC95 中差异表达基因有 317 个，而

抗病品种 SY04-3 有 1 424 个，2 个烟草品种中表

达情况差异较大正说明早期接种 PVY后，抗性品

种通过调节相关基因的表达量响应 PVY 病毒的

侵染。

从差异表达基因的GO功能富集方面看，2个

品种烟草接种 PVY 12 h 后在生物学过程中以细

胞转化差异表达基因居多；在细胞组分中以注释

到细胞和细胞组分差异表达基因居多；在分子功

能中以与蛋白结合有关的差异表达基因居多，

KEGG 代谢途径分析结果显示，NC95 在光合-天

线蛋白途径差异表达基因最多，SY04-3差异表达

基因在核糖体途径最多，说明主要存在与蛋白质、

核糖体有关的途径。同时也说明这2条通路可能

是 PVY影响烟草生长的关键，推断这些基因可能

是影响烟草早期 PVY 胁迫调控的关键因子。从

富集差异表达基因的代谢途径数量角度可以看

出，接种 PVY 后，烟草代谢途径上调远高于下调

图4　烟草PVY响应转录因子

Fig. 4 Tobacco PVY virus response transcription factor

注：“*”表示 0.05 水平差异显著

图5 RNA测序与qRT-PCR基因相对表达量比较

Fig. 5 RNA sequencing and comparison of relative

expression levels of qRT-PCR genes

225

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吉林农业大学学报 2024 年 4 月

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差异基因，从某种程度上说明，烟草受 PVY 胁迫

后，生理响应过程主要以上调相关基因的表达为

主。这与谢冰等［15］

、鲁琳等［16］

利用转录组测序研

究烟草在生物胁迫以及非生物胁迫的逆境条件下

所得出的结论有相似之处。

PVY 是烟草在生长过程中易受到的主要生

物胁迫之一。烟株感染 PVY后，烟株体内会发生

一系列生理生化反应，来抵御 PVY对植物生长的

影响［17］

。转录因子通过调控基因的表达，调动相

关代谢途径产生级联反应，使烟株提高对病毒的

适应力［18-21］

。对差异表达基因进行转录因子预测

分析，结果表明，NC95受早期 PVY 胁迫调控的转

录因子家族主要有 MYB-related、bZIP、bHLH 等，

SY04-3 的转录因子家族主要有 AP2/ERF-ERF、

WRKY、bHLH等。李明［22］

研究发现，转ATMYB12

基因的烟草植株均少于对照野生型烟草植株上寄

生的蚜虫和烟粉虱的数量，而蚜虫是传播 PVY的

重要媒介。烟草 bZIP 转录因子 TGA1a 是第一个

被证明与 as-1 结合的重组蛋白，NPR1 是植物防

御反应的中心激活剂［23］

。Pontier 等［24］

构建了一

种转基因突变体，特异性地消除了转基因烟草植

物中这类 bZIP 蛋白的 DNA 结合活性，通过 NPR1

和 TGA之间的物理相互作用，表明这些转录因子

在通过调节防御基因介导 SAR 诱导方面发挥作

用，并且 TGA在调解植物防御反应方面起着消极

和积极的调节作用。bHLH转录因子参与植物对

病原菌抗攻击的反应，于静［25］

在本氏烟中发现了

28 个 bHLH 转录因子，它们被寄生疫霉侵染后而

强烈地上调，表明这些 bHLH 转录因子与植物防

御反应有关。AP2/ERFs是最重要的转录因子家

族之一，可调节植物中的应激、代谢和发育等多

种反应。Sonal 等［26］从罂粟花中分离出 PsAP2。

PsAP2过表达转基因烟草植物对非生物和生物胁

迫表现出增强的耐受性。转录表达分析显示，在

PsAP2 过表达烟草植物中，烟草替代氧化酶 1a 和

Myo-肌醇-1-磷酸合成酶的组成性上调。植物

WRKY 转录因子以前与响应各种病原体基因表

达的改变有关，Park等［27］

分离出一个WRKY基因，

使用含有假定的 W-box 序列的寡核苷酸分子作

为探针，证实了CaWRKY-a蛋白具有W-box结合

活性，CaWRKY-a 可能作为转录因子参与植物防

御相关的信号转导途径。在本研究中，接种后

NC95有13个家族的20个转录因子发生了显著变

化，SY04-3 有 20 个家族的 38 个转录因子发生了

显著变化。

综上，本研究利用高通量测序技术对 PVY不

同抗性烟草品种进行转录组测序和分析，筛选出

差异表达基因数量，通过 GO 功能注释、KEGG 代

谢通路富集分析和转录因子预测，发现接种 PVY

的 12 h后烟草就能对 PVY胁迫作出响应，这为进

一步探究烟草防御 PVY 关键基因及其分子调控

机制提供了有益参考。

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（责任编辑：王希）

227

第59页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（2）：228-238

Journal of Jilin Agricultural University

偏肿革裥菌 GMC 基因家族在木质条件下转录

表达分析*

池玉杰**，陈欣妍，杨旭欣，郝雅昕，赵予璐，贾子烨，苏文浩

东北林业大学林学院，哈尔滨 150040

摘要：为揭示偏肿革裥菌（Lenzites gibbosa）在分解木材过程中葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶（Glucosemethanol-choline oxidoreductases， GMCs）基因的功能，采用高通量测序技术对 L. gibbosa分解木屑过程中 0，3，

5，7，11 d的菌丝体进行转录组测序，以 Count值与校正后的 FPKM 值为表达量进行基因筛选。分析基因表达

量变化情况及在eggNOG，COG，GO，KEGG，NR，SwissProt和Pfam等数据库中的功能注释结果，通过qPCR验证

基因表达量。根据基因注释结果共筛选到23个GMCs基因，表达量变化表明其中有9个是差异基因。功能注

释及富集结果表明，L. gibbosa 的 GMCs 至少有 6 种，分别为纤维二糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖脱氢酶、

L-山梨糖1-脱氢酶、醇氧化酶、吡喃糖氧化酶，属于CAZy-AA3家族下的4个亚家族，在木材木质素与综纤维

素的降解过程中，它们主要参与能量转运和代谢有关的碳代谢、甲烷代谢、氨基酸代谢和脂质代谢；GMCs与木

质素降解过程中 H2

O2的形成有特定关系，可与 FAD结合，将初级醇基氧化形成醛并释放 H2

O2，为过氧化物酶

提供恒定反应底物。由于能在木质素和纤维素的降解过程中发挥重要的辅助作用，GMCs属于与木材降解相

关的重要辅助酶系，为白腐菌中GMC家族在木材降解过程中的功能研究提供了依据。

关键词：偏肿革裥菌；葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶；木质素降解；转录组；差异表达基因

中图分类号：S718. 81 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0228-11

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1817

引用格式：池玉杰，陈欣妍，杨旭欣，等 .偏肿革裥菌 GMC基因家族在木质条件下转录表达分析［J］.吉林农业

大学学报，2024，46（2）：228-238.

Transcriptional Expression Analysis of GMC Gene Family from Lenz⁃

ites gibbosa under Woody Condition *

CHI Yujie**，CHEN Xinyan，YANG Xuxin，HAO Yaxin，ZHAO Yulu，JIA Ziye，SU Wenhao

School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China

Abstract：In order to reveal the function of glucose-methanol-choline oxidoreductases (GMCs) genes

of Lenzites gibbosa (Trametes gibbosa) during wood decomposition, transcriptome sequencing was per⁃

formed on L. gibbosa mycelia at 0, 3, 5, 7 and 11 days during the decomposition of wood chips by

high-throughput sequencing technology. Count value and corrected FPKM value of each gene were

used as expression levels to screen genes and differentially expressed genes (DEGs) between the

samples of non-woody control group and the wood-treated samples at 3, 5, 7 and 11 d. The changes of

gene expression levels and the annotated results in function of genes in eggNOG, COG, GO, KEGG,

NR, SwissProt and Pfam databases were analyzed. The expression of five important DEGs was veri⁃

* 基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（202010225200），黑龙江省自然科学基金项目（C2016006）

作者简介：池玉杰，女，博士，教授，研究方向：林木病理学与菌物学；陈欣妍，女，博士研究生，研究方向：林木病理学。

陈欣妍与池玉杰同为第一作者。

收稿日期：2022-05-12

** 通信作者：池玉杰，E-mail：chiyujienefu@126.com

第60页

池玉杰，等：偏肿革裥菌GMC基因家族在木质条件下转录表达分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

fied by fluorescence quantitative PCR (qPCR).A total of 23 GMC genes were screened based on the

gene annotation results, and the change of expression showed that 9 of them were DEGs. Functional

annotation and enrichment results showed that at least 6 kinds of GMCs in L. gibbosa, namely cellobi⁃

ose dehydrogenase, glucose oxidase, pyranose dehydrogenase, L-sorbose 1-dehydrogenase, alcohol

oxidase and pyranose oxidase, belonged to four subfamilies of CAZy-AA3 family. In the process of

wood lignin and holocellulose degradation, they were mainly involved in carbon metabolism, methane

metabolism, amino acid metabolism and lipid metabolism related to energy transport and metabo⁃

lism. Various GMCs had a specific relationship with the formation of H2O2 during lignin and cellu⁃

lose degradation. They could bind with flavin adenosine dinucleotide (FAD) to oxidize the primary al⁃

cohol group to form aldehyde and release H2O2, providing a constant reaction substrate for peroxi⁃

dases. Due to their important auxiliary role in the degradation of lignin and cellulose, GMCs are im⁃

portant auxiliary enzymes related to wood degradation. This study provides a basis for the functional

study of GMC family in wood degradation of white rot fungi.

Key words：Lenzites gibbosa； glucose-methanol-choline oxidoreductases （GMCs）； lignin degrada⁃

tion； transcriptome； differentially expressed genes （DEGs）

木材细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质

素3种高分子组成。木质素是一种复杂且难以降

解的三维网状酚类高分子聚合物［1］

，是非常丰富

的生物可再生资源［2］

。白腐菌可以有效地降解木

材细胞壁的所有成分，除了具有纤维素酶和半纤

维素酶外，白腐菌能产生降解木质素的酶系统

（Lignin-degrading enzymes），该酶系统既包括一系

列能分解木质素的氧化酶和过氧化物酶，也包括

一些木质素降解辅助酶（Lignin-degrading auxil⁃

iary enzymes），如对过氧化物酶的活性至关重要

的产生 H2O2 的酶（H2O2 generating enzymes）［3-4］。

偏肿革裥菌（Lenzites gibbosa）作为一种分解木质

素能力较强、生长速度较快的白腐菌［5］

，可以产

生能用于高效分解木质素的锰过氧化物酶（Man⁃

ganese peroxidases，MnPs）和漆酶。已知 MnPs 是

一种依赖 H2O2的亚铁血红素糖蛋白酶［6］

，在木材

白腐菌降解过程中发挥重要作用。MnPs 基因受

Mn2+

调控表达［7- 8］

，MnPs 的酶学性质已有较多的

研究［9］，还有研究表明，产生 H2O2 的酶能促进

MnPs 对木质素的降解反应［3］

，但 H2O2作为过氧

化物酶的重要反应条件，其形成机制还不十分

明确。

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶（Glucosemethanol-choline oxidoreductases， GMCs）超家族

是指存在于生物有机体中的一大类，以黄素腺嘌

呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD）为

辅酶的氧化还原酶类，广泛存在于昆虫、真菌等生

物体中［10-11］

。1991 年，在对果蝇葡萄糖脱氢酶、

胆碱脱氢酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶、多型甲醇氧化

酶的序列比对中，GMC家族被发现并定义［12］

。其

后，不断有新的酶被发现并归类于 GMC 家族，如

吡喃糖氧化酶［12］

、芳基醇氧化还原酶［13］

、醇氧化

酶、纤维二糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶［14］

、葡萄糖脱

氢酶、吡喃糖脱氢酶等［15］

，显示出该家族的功能

多样化特征。

GMCs 一般催化某些反应导致 H2O2的产生，

因此在 L. gibbosa 降解木材的过程中，由 GMCs 表

达并参与的反应可能作为其产生 H2O2的重要机

制之一，为MnPs在木材白腐菌降解过程中的作用

提供必需的反应条件。本研究首次在偏肿革裥菌

（L. gibbosa）中开展 GMC 基因家族表达规律与功

能研究，利用高通量测序技术对L. gibbosa无木屑

和木屑处理3，5，7，11 d条件下的菌丝体进行转录

组测序，并分析白腐菌在木材降解过程中的所有

GMC基因和差异表达基因，为深入研究白腐菌中

GMC 家族在木材降解过程中的功能提供理论依

据，也为提高偏肿革裥菌降解木材效率的研究提

供基础。

1　材料与方法

1. 1　菌丝培养与转录组文库构建

供试菌株 CB-1 分离自吉林省长白山的偏肿

革裥菌（L. gibbosa）子实体，PDA 斜面培养基上的

菌种保存于东北林业大学林学院森林保护学科森

229

第61页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

林病虫病理实验室 4 ℃冰箱内。去皮的小黑杨

（Populus simonii × P. nigra）木片削成薄木屑，灭菌

后备用。将保藏菌种复壮后，接种至 PDA平板培

养基上，在 26 ℃下培养 7 d，至菌丝长满平板。在

平板菌落边缘用5 mm打孔器提取菌饼，接种至装

有 70 mL 低氮天冬酰胺琥珀酸（Low nitrogen as⁃

paragine succinic acid，LNAS）培养基和 5 mL 过滤

除菌的 15% 葡萄糖的 250 mL 三角瓶中，每个三

角瓶中接种 5 个菌饼，26 ℃静置培养 10 d 后，随

机取 15 瓶没有加入木屑的作为对照组（ck），其

他为处理。其中每个三角瓶内加入 2 g 木屑，

分别静置培养 3，5，7，11 d，记为 D3，D5，D7，

D11。每组设 3 次重复，随机提取 5 瓶内的菌丝

体作为 1 次重复。将混合后的菌丝体置于 8 层

纱布中，用无菌水冲去培养基杂质，过滤拧干。

将得到的干菌丝体转入冻存管内封口，以液

氮速冻并置于-80 ℃冰箱内保存。将冷冻的菌

丝样品送至北京百迈克生物科技有限公司，利用

Illumina HiSeq X Ten高通量测序平台进行转录组

双端测序。

1. 2 GMC 基因和差异基因的筛选与功能注释

分析

转录组测序得到的原数据（Raw data）进行质

量调控后得到待分析的纯数据（Clean reads）。使

用 Hisat2 软件将纯数据与 JGI 的 Trametes gibbosa

参考基因组序列（http：∥genome.jgi.doe.gov/Tra⁃

gib1/Tragib1.home.html）进行比对。根据参考基

因组的 GFF 文件使用 StringTie 软件对比，将对比

后的转录本进行组装并合并，得到一整套转录本

信息和每个基因的表达量值。使用 BLAST 软

件［16］对转录组基因在 COG，KOG，eggNOG，GO，

KEGG，NR，Pfam，SwissProt 这 8 个基因功能数据

库中进行功能注释。根据在数据库中对基因功能

注释的结果，在L. gibbosa所有基因集中进行GMC

基因搜索获得所有 GMC基因。根据 GMC基因的

表达量，用 edgeR 软件进行差异基因（DEGs）表达

分析，以差异倍数 Fold Change≥2、错误纠偏率

FDR<0.05为标准，筛选出 GMC 差异表达基因，分

析差异表达情况和表达量的变化规律，表达量值

以 Count 值与校正后的 FPKM 值表示，Count 值是

比对到参考基因组上的每个基因的reads数；根据

差异基因在 COG 和 GO 中的注释结果分析其功

能；根据差异基因在 KEGG 代谢通路中的注释结

果分析GMC基因参与的代谢通路。

1. 3　重要差异基因表达量的qPCR验证

根据GMC基因的表达差异和功能分析，筛选

出在降解木材过程中可能发挥重要作用的9个差

异基因。根据其基因序列使用 Primer5 设计扩增

长约为200 bp的qPCR上下游特异性引物（表1），

送至上海生工生物工程有限公司进行引物合

成，使用 gpd 基因作为相关差异基因表达的内参

照，在与本文“1.1”中同样的分解木屑和无木屑

处理条件下，提取菌丝体进行 qPCR 验证。以

Revert Aid Premium Reverse Transcriptase 试剂盒

（Thermo Fisher Scientific 公司）及其方法合成

cDNA 第一链。以 2X SYBR Green qPCR Master

Mix （Low Rox）试剂盒（Bimake 生物科技有限公

司）及其说明书进行荧光定量 PCR 反应，每个样

品 3 次生物学重复，每个生物学重复 3 次机械重

复。以目的基因与内参基因的差值作为处理组和

对照组的 ΔCt 数值，根据公式：基因相对表达量=

2−［∆Ct（处理组）-∆Ct（对照组）］，计算不同基因的起始相对表

达量并进行分析。试验的表达量数据在 Excel 下

进行方差分析，用IBM SPSS Statistics 24进行显著

性分析。

表1 9个重要基因的qPCR引物

Table 1 Primers for qPCR of 9 important genes

基因ID

gene_10147

gene_10240

gene_11129

gene_11344

gene_11714

gene_2965

gene_438

gene_5916

gene_9842

引物序列（5′-3′）

TCGCCTGCTTTCCTTT

CCTGGTAACCCTTCTTGAC

CTGAACGCCCAATACG

CCCGCCATACATCTGA

TGGGGTTTCTGTTGGG

CGTGTTCTTGATTTTCGTC

CCGCAAAAGCACATAA

GGAAGAGGGAGGGATAG

CCGTGGGTTGACTGAT

CGCCCCTGATTATGAC

CATTTCTGTTGCTTCGC

TCGTTCGTGCTTTTCAT

GGACTTTTCGGGCATA

TTCAGGTTCGGTCTACG

GTCCAAGGCAAGGTCA

GTGGGTCGGCATAGAG

ACAGTCTGGGTGGAAAA

CCGAAAACTTGCATCTC

用途

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

230

第62页

池玉杰，等：偏肿革裥菌GMC基因家族在木质条件下转录表达分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2　结果与分析

2. 1 GMC基因与差异基因的筛选

根据在 COG，eggNOG，GO，KEGG，NR，Swis⁃

sProt 等多个数据库中对转录组文库基因注释的

结果及表达量数据，在所有L. gibbosa基因中筛选

出23个GMC基因（表2），以基因差异表达倍数的

log2FC 绝对值>1.0，FDR<0.05 为标准筛选出 9 个

差异表达基因，其他 14 个为非差异基因。在 D3

与 ck，D5 与 ck，D7 与 ck 组中，都是有 5 个相同的

差异基因表达上调，有 4 个相同的差异基因表达

下调；但在D11与ck组中，有4个差异基因表达上

调，有 5 个差异基因表达下调（“log2FC”是以 2 为

底的2组样品间差异表达基因表达量比值的对数

值）。可见，在木屑处理条件下，部分GMC基因表

达量存在变化，在木屑处理3，5，7 d的木材降解过

程中上调表达基因多，下调表达基因相对少。

2. 2　偏肿革裥菌（L. gibbosa）的GMC类别

GMC 超家族的真菌成员包括芳基醇氧化还

原酶、醇氧化酶、纤维二糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、

葡萄糖脱氢酶、吡喃糖脱氢酶、吡喃糖氧化酶和寡

糖脱氢酶 8 类（http：∥www. cazy. org/AA3_struc⁃

ture.html），它们共同构成碳水化合物活性酶数据

库中辅助活性的 AA3 家族（Carbohydrate-Active

enZYmes Database-Auxiliary Activity Family 3，

CAZy-AA3）。根据 GMCs 基因在 NR，Swiss Prot，

Pfam 数据库中的注释结果，L. gibbosa 的 GMCs 类

别见表 3（有基因产物被注释到不同的类别中），

其中，纤维二糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖脱

氢酶、L-山梨糖 1-脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶 citC、

醇氧化酶和吡喃糖氧化酶等 GMCs归属于 CAZyAA3 家族下的 4 个亚家族（CAZy-AA3_1，2，3，

4）。杂色曲菌素 B 合酶也属于 CAZy-AA3 家族，

但未明确具体属于哪个亚家族。据此可推测，以

上对应基因产物属于 CAZy-AA3 家族，都属于

GMC 家族。gene_5916 在 GMC 家族中无明确注

释，归属于FAD依赖型氧化还原酶大类。

表2　偏肿革裥菌的GMC基因及其表达

Table 2 GMC genes and their expression of L. gibbosa

分组

D3 与ck

D5 与 ck

D7 与 ck

D11与ck

差异表达基因ID

上调基因ID/表达量的log2

FC

gene_10147/1.061 9

gene_11714/1.596 5

gene_438/3.210 6

gene_5916/1.228 4

gene_9842/1.268 3

gene_10147/1.241 5

gene_11714/1.121 3

gene_438/1.815 8

gene_5916/1.718 3

gene_9842/1.197 2

gene_10147/1.322 8

gene_11714/1.132 3

gene_438/2.711 7

gene_5916/1.899 4

gene_9842/1.613 1

gene_11714/1.004 9

gene_438/3.432 0

gene_5916/1.587 4

gene_9842/1.586 0

下调基因ID/表达量的log2

FC

gene_10240/0.967 8

gene_11129/0.628 8

gene_11344/0.519 4

gene_2965/0.245 7

gene_10240/0.570 7

gene_11129/0.515 8

gene_11344/0.432 6

gene_2965/0.211 1

gene_10240/0.710 7

gene_11129/0.454 7

gene_11344/0.400 9

gene_2965/0.214 2

gene_10147/0.793 7

gene_10240/0.548 3

gene_11129/0.329 6

gene_11344/0.253 4

gene_2965/0.140 1

非差异表达基因ID

gene_10202

gene_10331

gene_10573

gene_1060

gene_11097

gene_11130

gene_11929

gene_2960

gene_2963

gene_3440

gene_4352

gene_4371

gene_8844

gene_9918

231

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吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 3 GMC基因在 COG和 eggNOG 数据库中的

注释和分析

偏肿革裥菌 GMC 基因在 COG 数据库中的功

能注释结果见图 1。在筛选到的 GMC 基因中，共

有 20 个基因得到注释，其中注释到“［I］：脂质运

输和代谢”以及“［R］：一般功能预测”中的基因均

为 19 个，都占总数的 48.72%；注释到“［E］：氨基

酸转运和代谢”中的基因 1 个，是 gene_5916，占

总数的 2.56%。在差异基因中，除 gene_5916 被

注释到［E］外，其他都被注释到脂质运输和代谢

［I］和一般功能预测［R］类目中。在 eggNOG 数据

库中的注释结果见表 3，除 gene_8844 被注释到

“O：翻译后修饰、蛋白质折叠、伴侣”；gene_9842、

9918 被注释到“［S］：功能未知”外，其他基因都

被注释到了“［E］：氨基酸转运和代谢”中。以上

结果表明，GMC 除一般生物体功能外，主要参与

氨基酸和脂质的运输和代谢，与能量的转运、代谢

有关。

2. 4 GMC基因在GO数据库中的分类注释与富

集分析

在 GO 数据库中，将偏肿革裥菌基因产物分

类在“生物学过程”“细胞组分”和“分子功能”3个

一级类目下。对处理组与对照组的 21个 GMC 基

因进行GO分类注释，结果见图2。其中共有18个

GMC 基因得到 GO 注释，分类到 3 大功能类目的

10个二级类目中，其中7个为差异基因；而得到的

转录组共有 5 341个基因得到 GO 注释，被注释到

3大功能类目的44个二级类目中。在18个GMC基

因中，注释到“生物学过程”的基因有13个，它们同时

被注释到二级功能类目“代谢过程（GO：0008152）”

和“单机体过程（GO：0044699）”中，其中有 1个基

因被注释到“细胞过程”中；注释到“细胞组分”的基

因有4个，其中2个相同的基因被分别注释到二级

类目“膜（GO：0016020）”和“膜部分（GO：0044425）”

中，其他 2 个基因被分别注释到“细胞”与“细胞部

分”和“细胞外区域”中；注释到“分子功能”的有18个，

均被注释在二级类目“催化功能（GO：0003824）”

中，其中有12个也被注释到“结合”中。

表3　偏肿革裥菌的GMCs类别及GMC基因在eggNOG数据库中的功能注释结果

Table 3 Types of GMCs of L. gibbosa and functional annotation results of GMC genes in eggNOG database

基因产物类别

纤维二糖脱氢酶（Cellobiose dehydrogenase; AA3_1）

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase; AA3_2）

吡喃糖脱氢酶（Pyranose dehydrogenase; AA3_2）

L-山梨糖1-脱氢酶（L-sorbose 1-dehydrogenase; AA3_2）

异柠檬酸脱氢酶citC（Isocitrate dehydrogenase citC; AA3_2）

杂色曲霉素B合酶（Versicolorin B synthase; AA3）

醇氧化酶（Alcohol oxidase; AA3_3）

吡喃糖氧化酶（Pyranose oxidase; AA3_4）

FAD依赖型氧化还原酶（FAD dependent oxido-reductase; GMC）

基因ID

差异基因ID

gene_10240[E]

gene_10147[E]

gene_2965[E]

gene_11344[E]

gene_438[E]

gene_11129[E]

gene_11714[E]

gene_9842[S]

gene_5916[E]

非差异基因ID

gene_11929[E]

gene_8844[O]

gene_9918[S]

gene_10573[E]

gene_10331[E]

gene_11130[E]

gene_11097[E]

gene_4371[E]

gene_1060[E]

gene_4352[E]

gene_4371[E]

gene_11097[E]

gene_10202[E]

gene_10331[E]

gene_2960[E]

gene_2963[E]

gene_3440[E]

注：gene_ID后的标注为eggNOG数据库中的注释，［E］：氨基酸转运和代谢；［S］：功能未知；［O］：翻译后修饰、蛋白质折叠、伴侣

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池玉杰，等：偏肿革裥菌GMC基因家族在木质条件下转录表达分析

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图1 GMC基因在COG数据库中的注释结果

Fig. 1 Annotation results of GMC genes in COG database

每对图柱左侧为此 GO Term 相关的所有基因数，右为GMC基因数。右纵轴数值上为GMC基因数，下为所有基因数

图2 GMC基因的GO功能分类

Fig. 2 Function classification of GMC genes in Go database

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将 21 个 GMC 基因进行 GO 富集分析，在 3 大

功能类目中以校正P值<0.05为标准，筛选出二级

条目及对应基因，以实际注释的目的基因个数与

期望个数的差值作为富集程度的标准，筛选结果

见表 4。在 3 大功能分类中，共有 12 个 GMC 基因

被显著富集到5个功能类目中，其中1个纤维二糖

脱氢酶基因（gene_11929）富集在“生物学过程”中

的 3个类目“细胞碳水化合物分解代谢过程（GO：

0044275）”“葡聚糖分解代谢过程（GO：0009251）”

“细胞多糖分解代谢过程（GO：0044247）”中，细胞

碳水化合物、葡聚糖和细胞多糖与构成木材细胞

壁综纤维素的成分相一致，表明该基因产物能参

与木材的分解代谢，纤维二糖脱氢酶可以直接氧

化纤维二糖，并在纤维二糖存在的条件下氧化纤

维素、蛋白质、脂类等分子，同时释放出H2O2

［17-18］

，

为过氧化物酶提供反应条件；12个GMC基因富集

在“分子功能”中的“氧化还原酶活性，作用于供体

的CH-OH基团（GO：0016614）”和“黄素腺嘌呤二

核苷酸结合（GO：0050660）”2 个类目下，表明这

12 个基因可与黄素腺嘌呤二核苷酸结合，并发

挥氧化还原酶活性，它们作为氧化还原酶，是

以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶参加氧

化还原反应。这 12个基因特别是 gene_11929及

其中的 5 个差异基因 gene_10147，gene_10240，

gene_11129，gene_11714，gene_9842 被显著富集

于“分子功能”中的 2 个类目中，应是 L. gibbosa 在

降解木材过程中发挥重要作用的基因。

GO分类和富集分析表明，GMC在细胞内、膜

上和细胞外参与L. gibbosa的代谢过程，具有与黄

素腺嘌呤二核苷酸结合功能，具有氧化还原酶活

性与催化功能，可以参与木材纤维素的直接降解

和对木质素的降解有辅助功能。

2. 5 GMC基因在 KEGG 数据库中分类、富集及

关键通路分析

在 KEGG 分类中，有 5 个醇氧化酶基因 gene_

10202，gene_11714，gene_2960，gene_2963，gene_

3440 得到 KEGG 通路注释，这 5 个基因被同时注

释到了碳代谢通路和甲烷代谢通路中，见图 3，其

中gene_11714是差异基因；其他GMC基因都没有

被注释到通路中。对这2个通路进行目的基因是

否发生显著富集的分析结果见图 4，以 Q 值<0.01

为标准，结果显示 2 条通路均显著富集，表明这

5个醇氧化酶参与了与能量代谢有关的碳代谢和

甲烷代谢。比较 2 条通路的富集因子，甲烷代谢

通路富集因子约为82.96，高于碳代谢通路富集因

子 19.14，表明甲烷代谢通路是最显著富集通路，

实际上甲烷代谢通路属于碳代谢通路的范畴。

GMCs 在甲烷代谢通路中的功能见图 5，GMCs 在

该通路中参与将甲醇氧化成甲醛的过程，作用于

供体的 CH-OH 基团并以氧为受体同时产生

H2O2，可推测在 L. gibbosa 降解木材过程中，GMCs

能参与初级醇基氧化形成相应醛的反应，并同时

将氧气还原为 H2O2，从而为锰过氧化物酶等降解

木质素提供反应底物［11，19］

，促进木质素的降解。

表4 显著性富集的GMC基因及对应的GO功能类目

Table 4 Significantly enriched GMC genes and corresponding GO function categories

GO一

级类目

生物学

过程

分子

功能

GO序号

GO:

0044275

GO:

0009251

GO:

0044247

GO:

0016614

GO:

0050660

GO功能类目

细胞碳水化合物分解代谢

过程

葡聚糖分解代谢过程

细胞多糖分解代谢过程

氧化还原酶活性，作用于

供体的CH-OH基团

黄素腺嘌呤二核苷酸结合

差值

0.95

0.96

11.70

11.71

校正P值

0.045 8

0.049 9

0.011 2

0.007 4

基因_ID

gene_11929

gene_10147; gene_10202; gene_10240; gene_1060

gene_11097; gene_11129; gene_11130; gene_11714

gene_11929; gene_2960; gene_2963; gene_9842

gene_10147; gene_10202; gene_10240; gene_1060

gene_11097; gene_11129; gene_11130; gene_11714

gene_11929; gene_2960; gene_2963; gene_9842

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池玉杰，等：偏肿革裥菌GMC基因家族在木质条件下转录表达分析

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2. 6　重要差异基因表达量的荧光定量PCR验证

根据差异基因在 eggNOG，GO 和 KEGG 中功

能分类与注释的结果，并与参考文献比较［7，11］

，筛

选出9个可能影响L. gibbosa降解木材过程的关键

酶基因：1 个葡萄糖氧化酶（AA3_2）基因：gene_

10240；2 个吡喃糖脱氢酶（AA3_2）基因：gene_

10147 和 gene_2965；2 个异柠檬酸脱氢酶 citC

（AA3_2）基因：gene_11344 和 gene_438；2 个醇氧

化酶（AA3_3）基因：gene_11129 和 gene_11714；

1 个吡喃糖氧化酶（AA3_4）基因：gene_9842；1 个

FAD 依赖型氧化还原酶基因：gene_5916，采用

qPCR 试验验证基因相对表达量，结果见图 6［图

中柱形图上方显著性标识的不同小写字母表示不

同处理之间差异显著（P<0.05）］。相比于 ck 组，

有 5 个基因 gene_10147，gene_11714，gene_438，

gene_5916 和 gene_9842 的表达在木屑条件下受

促进而呈现上调趋势，其中 gene_10147各木屑处

理组（3，5，7，11 d）的表达量分别是对照组表达量

的 1.06 倍，1.24 倍，1.32 倍，0.79 倍；gene_11714 为

1.60倍，1.12倍，1.13倍，1.00倍；gene_438为3.21倍，

1.82 倍，2.71 倍，3.43 倍；gene_5916 为 1.23 倍，

1.72 倍，1.90 倍，1.59 倍；gene_9842 为 1.27 倍，

1.20 倍，1.61 倍，1.59 倍；但 gene_10147 和 gene_

11714的各木屑处理和ck之间表达量没有显著差

异。有 4 个基因 gene_10240，gene_11129，gene_

11344 和 gene_2965 的表达在木屑条件下受抑制

而呈下调和显著下调趋势，gene_10240 对照组表

达量分别是各木屑处理组（3，5，7，11 d）表达量的

1.03 倍，1.75 倍，1.41 倍，1.82 倍；gene_11129 为

1.59 倍，1.94 倍，2.20 倍，3.03 倍；gene_11344 为

1.93倍，2.31倍，2.49倍，3.95倍；gene_2965为4.07

倍，4.74倍，4.67倍，7.14倍。qPCR 验证基因表达

量的结果与转录组测序的基因表达量结果在表达

量差异倍数上存在一些偏差，但多数基因的整体

趋势基本一致。

图3 GMC基因的KEGG分类

Fig. 3 Classification of GMC genes in KEGG database

图中右侧颜色条带对应图中圆点颜色，颜色越红表明 Q 值越小。

圆点大小代表基因数目，圆点越大表明数目越多

图4　在KEGG中GMC基因富集的通路

Fig. 4 Pathways for GMC gene enrichment in KEGG

注：图中紫色部分代表有GMC注释其中

图5　甲烷代谢通路中GMCs参与的步骤

Fig. 5 Involvement of GMCs in methane metabolism

pathway

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3　讨论

本研究中的白腐菌偏肿革裥菌其拉丁学名

“Lenzites gibbosa”与“Trametes gibbosa”是同物异

名。纤维素与半纤维素的降解主要是通过糖基水

解酶的水解作用［17］

，但木质素是一种复杂的三维

长链高分子化合物，其降解途径主要是氧化作用

而不是水解作用，包括芳香基、烷基醚键和碳-碳

键的断裂，脱甲氧基化、烷化和缩合反应等［20］

。

通常白腐菌可形成有效降解木材各成分的过氧化

物酶类、氧化酶类、糖基水解酶类和细胞色素

P450 类［21］

。在偏肿革裥菌中主要降解木质素的

酶有漆酶和 MnPs，MnPs 参与反应时需要以 H2O2

作为底物。本研究通过对非木质和木质处理 3，

5，7，11 d条件下的偏肿革裥菌进行转录组测序与

分析，筛选出23个葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶

（GMC）基因。在含有偏肿革裥菌菌丝体的 LNAS

液体培养基中，加入木屑、混匀后继续静置培养，

于 3 d时有少量菌丝在木屑上生长并开始分解木

屑，5，7，11 d时在木屑上及周围的菌丝逐渐增多，

表明菌丝生物量的增长，菌丝对木屑的分解也在

缓慢增强，而在 1 d时菌丝尚未在木屑上定植，因

此选择了无木屑作为对照和加入木屑处理后 3，

5，7，11 d 的菌丝体进行转录组测序，目的是获得

在 0，3，5，7，11 d时，菌丝体内基因的表达和差异

表达情况，探索加入木屑处理的最初一段时间内

与无木屑处理之间基因在表达上的差异。11 d以

后的情况还有待今后进一步探究。GMC 作为在

真菌中广泛存在的一个大家族，归属于一组具有

图6　无木屑（对照）和木屑处理条件下9个差异基因的表达量

Fig. 6 Expression of 9 DEGs under woody environment in LNAS medium

236

第68页

池玉杰，等：偏肿革裥菌GMC基因家族在木质条件下转录表达分析

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特殊“辅助活性”（Auxiliary activities，AA）的酶，即

CAZy-AA3家族，L. gibbosa的这23个GMC基因至

少有 6 种，它们以 FAD 作为辅酶，通过其产物

H2O2或对苯二酚辅助其他 AA 家族酶发挥作用，

或支持糖苷水解酶在纤维素降解中发挥作

用［11，19］

，或能促进 MnPs对木质素的降解［3］，如纤

维二糖脱氢酶，既可直接参与木材细胞壁中纤维

素的氧化降解，又可与醇氧化酶等 GMCs 同时介

导氧化还原反应，并释放出 H2O2，为过氧化物酶

氧化木质素提供反应条件。在木屑处理条件下，

自木屑开始降解并随时间延长降解程度的逐渐增

强，在3 ~5 d和5～7 d，GMC差异基因表达情况呈

上调的居多，至11 d一直有上调的表达基因，表明

一直都有 H2O2的产生，这个结果为 GMCs 在木材

降解过程中发挥的作用提供了依据，也符合MnPs

降解木屑的规律［22］

。可见，作为与木材降解相关

的重要辅助酶系，由于 GMCs 在白腐菌对木材木

质素和纤维素的降解过程中能发挥重要的辅助作

用而不可或缺。

GMCs与木材中木质素和纤维素降解过程中

H2O2的形成有特定的关系。现有研究表明，多孔

菌中的各类GMCs都能产生H2O2

［23］

。葡萄糖氧化

酶（GOD，EC1.1.3.4），系统名称为 β-D-葡萄糖氧

化还原酶，是一种需氧脱氢酶，在有氧条件下能

专一性地氧化 β-D-葡萄糖生成 D-葡萄糖-1，5-

内酯至葡萄糖酸和 H2O2

（C6H12O6+O2→C6H12O7+

H2O2

），在食品工业、纺织漂染、医药等行业、生物

燃料、饲料、葡萄糖生物传感器等领域都有广泛的

应用［14］

。吡喃糖氧化酶（PROD， EC1.3.10，）能催

化一类碳水化合物在第2个碳原子上发生反应生

成 2-酮基类衍生物和 H2O2

［24］

，例如来自 Trametes

multicolor 的吡喃糖 2-氧化酶（P2O）是一种黄素

酶，它利用O2作为电子受体，催化C2位的D-葡萄

糖和其他醛吡喃糖的氧化，形成相应的2-酮糖和

H2O2

［25-27］

。

有一个现象需要指出，虽然这些基因在 egg⁃

NOG，COG，GO数据库中得到了注释，但是只有5个

醇氧化酶基因得到 KEGG 通路注释，其他的 GMC

基因都未被注释到 KEGG 通路中，其参与的通路

还不明确，还有部分基因在 NR，SwissProt 数据库

中得到的注释也不完全。关于本研究已筛选得到

的重要 GMC 基因，其基因结构、功能和作用机制

还有待进一步探索。

4　结论

本研究共筛选到白腐菌偏肿革裥菌 23 个

GMC基因，其中9个为差异表达基因，在木材刚刚

开始分解时 GMC 即稳步参与降解反应。这些

GMC 归属于碳水化合物活性酶数据库中辅助活

性 3 家族下的 4 个亚家族（CAZy-AA3_1，2，3，

4），至少有 6 种，分别为纤维二糖脱氢酶、葡萄糖

氧化酶、吡喃糖脱氢酶、L-山梨糖1-脱氢酶、醇氧

化酶、吡喃糖氧化酶。在L. gibbosa对木材降解过

程中，GMCs 在细胞内、膜上和细胞外参与 L. gib⁃

bosa 的代谢过程，具有与辅酶黄素腺嘌呤二核苷

酸结合的功能和催化氧化还原反应的功能，参与

了与能量代谢有关的碳代谢、甲烷代谢中的醇氧

化反应，以及与能量转运、代谢有关的氨基酸和脂

质的运输和代谢，在偏肿革裥菌降解木材木质素

和纤维素的过程中发挥重要的辅助作用，是与木

材降解相关的重要辅助酶系。本研究为白腐菌中

GMC 家族在木材降解过程中的功能研究提供了

依据。

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（责任编辑：王希）

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吉林农业大学学报 2024，46（2）：239-245 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

林下栽培灵芝主要活性成分与生态因子的关系*

石云龙，韩梅，孙卓**，杨利民**

吉林农业大学中药材学院，长春130118

摘要：环境条件是影响药用真菌活性成分形成和积累的重要因素，利用灰色关联度、典范对应分析（CCA）、

主成分分析（PCA）等分析法探究生态因子对林下栽培灵芝主要活性成分积累的影响。在吉林省和龙市落叶

阔叶林，采集灵芝、土壤样品各 30份，采用分光光度法测定灵芝主要活性成分含量，常规法测定土壤温度、含

水量、有机质等，空气温湿度计测定空气温、湿度，光照计测定透光率。结果表明：生态因子对灵芝多糖、总三

萜、总蛋白含量的影响较大，对氨基酸含量的影响较小；土壤温度、含水量对灵芝主要活性成分积累具有显著

影响，土壤温度在 19. 50~24. 25 ℃，土壤含水量在 22. 65%~49. 49%，有利于灵芝多糖、总三萜、总蛋白含量的

积累。

关键词：灵芝；活性成分；生态因子；林下栽培模式

中图分类号：S567. 31 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0239-07

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.5642

引用格式：石云龙，韩梅，孙卓，等 . 林下栽培灵芝主要活性成分与生态因子的关系［J］. 吉林农业大学学报，

2024，46（2）：239-245.

Relationship between Main Active Components of Ganoderma lu⁃

cidum Cultivated under Forests and Ecological Factors *

SHI Yunlong，HAN Mei，SUN Zhuo**，YANG Limin**

College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China

Abstract：Environmental conditions are important factors that affect the formation and accumulation

of active components of medicinal fungi. Grey correlation degree, CCA, PCA and other analysis meth⁃

ods were used to explore the effects of ecological factors on the accumulation of main active compo⁃

nents of Ganoderma lucidum cultivated under forests. Thirty samples of G.lucidum and thirty samples

of soil were collected from deciduous broad-leaved forest in Helong city, Jilin province, and associated

plants were recorded. The main active components of G.lucidum were determined by spectrophotom⁃

etry. Soil temperature, water content, organic matter, etc. were determined by conventional methods. Air

temperature and humidity meter and light meter were used to measure air temperature, humidity and

light transmittance. The results showed that ecological factors had greater effects on polysaccharide, trit⁃

erpene and protein content of G.lucidum, but less effects on amino acid content. Soil temperature and wa⁃

ter content had significant effects on the accumulation of main active components of G.lucidum. Soil

temperature was 19.50-24.25 ℃, and soil water content was 22.65%-49.49%, which is conducive to

the accumulation of G.lucidum polysaccharide, total triterpenes and total protein content.

Key words：Ganoderma lucidum； active component； environmental factor； cultivation under forest

* 基金项目：吉林省科技发展计划重点科技研发项目（20180201038YY），国家中药材产业技术体系建设专项（CARS-21）

作者简介：石云龙，男，在读硕士，研究方向：药用植物生态学。

收稿日期：2020-02-11

** 通信作者：孙卓，E-mail：329575668@163.com；杨利民，E-mail：ylmh777@126.com

第71页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

灵芝原植物主要为赤芝［Ganoderma lucidum

（Leys. Ex Fr.） Karst.］，隶属于多孔菌科（Polypora⁃

ceae）灵芝属（Ganoderma）［1］

，素有“仙草”“神芝”

等美誉，是我国珍贵的传统药材［2］

。按其外部形

态及颜色，可分为青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝和

紫芝 6类［3］

。世界范围内目前可确认的灵芝属物

种共有 137 种，中国目前可确认的灵芝属物种共

有 24 种［4］

。灵芝的栽培大致分为固体培养和液

体培养两大方式。其中，固体培养又分为椴木栽

培和代料栽培等［5］

。目前，我国大部分灵芝栽培

为椴木栽培模式，主要分布于西南、华南、西北、东

北等地区［6］

。目前灵芝研究主要集中在化学成

分、栽培、药理及临床应用等方面［7-9］

，近年来，随

着人们生活水平的提高和保健意识的增强，对灵

芝产品的需求呈日益增加的趋势［10］

。林下栽培

灵芝作为市场获取灵芝的主要方式之一，与其他

栽培灵芝比，其优势在于较少人工干预和环境无

污染的条件下自然生长，且品质好［11-12］

，但由于灵

芝对生态环境要求很高，盲目地引种栽培和扩大

生产规模可能会导致灵芝品质的不稳定，因此研

究灵芝活性成分与生态因子的相关性，对提高灵芝

品质，保障灵芝产业的可持续发展具有重要意义。

灵芝多糖、总三萜、总蛋白和氨基酸是灵芝的

主要活性成分，这些活性成分是灵芝在长期的进

化过程中与环境相互作用的结果，温度、水分、光

照等作为主要的生态因子直接或间接影响着灵芝

的品质［13-15］

。有研究表明，不同产地灵芝的品质

差异较大［16-17］

，且受培养基质的影响［18-19］

。目前

关于林下栽培灵芝与生态因子的关系研究较少。

为此，本研究以吉林省和龙市10个不同样地林下

栽培灵芝的多糖、总三萜、总蛋白、氨基酸含量与

各样地10个生态因子指标为参数，采用综合分析

法建立灵芝品质与生态因子之间的量化关系，旨

在明确影响灵芝品质的主导生态因子及其作用特

征和规律，以期为林下栽培灵芝的规范化生态种

植技术提供科学依据。

1　材料与方法

1. 1　试验地概况

研究样地位于吉林省和龙市，地理坐标东经

129° 01′12.3″，北纬 42° 47′20.1″，平均海拔约

550 m。吉林省和龙市属温带季风半湿润气候，年

日照时数 2 387.2 h，年平均气温 5.6 ℃，年均降雨

量 573.6 mm。植被以温带山地落叶阔叶林为主。

土壤为棕色森林土，地被层较深厚，土质肥沃。

1. 2　供试材料

研究材料来自于以蒙古栎为建群种的落叶阔

叶林，林下采用椴木木段人工栽培的灵芝。于

2019 年 8 月灵芝开片期，根据微地形、透光率、地

被层和伴生植物种类等差异设 10 个样地。每个

样地随机采集灵芝样品3株及土样3份，并记录灵

芝的菌盖长、菌柄长等生物学指标；室内烘干各样

地灵芝样品，粉碎，过0.25 mm（60目）筛，备用；土

壤样品采用环刀法采集，剔除杂质，装入密封带混

匀。灵芝材料经吉林农业大学韩梅教授鉴定为赤

芝（G.lucidum）。

1. 3　主要药品及试验仪器

齐墩果酸标准品（质量分数 >98%，批号

SO8030）购自北京索莱宝科技有限公司；pH 测试

仪［SevenMulti，梅特勒-托利多（上海）仪器公司］，

紫外分光光度计［SHIMADZU（日本）制造公司］，

酶标仪［SpectraMax 190，美谷分子仪器（上海）

有限公司］，高速离心机和微量离心机［Thermo

（美国）制造公司］；恒温培养摇床（KYC-100B，上

海新苗医疗器械制造有限公司），电子天平

（AVY220，上海精密仪器仪表有限公司）等。

1. 4　灵芝多糖含量的测定

相关试剂盒测定灵芝多糖含量，具体步骤参

考科铭生物技术（苏州）有限公司的灵芝多糖含量

测定试剂盒（ZDT-1-Y）。

1. 5　灵芝总三萜含量的测定

采用香草醛-高氯酸-分光光度法测定灵芝

总三萜含量［20］

。标准曲线的绘制：以齐墩果酸

为标准品，齐墩果酸含量 x 为横坐标，吸光度y为

纵坐标，回归方程为 y=52.714x+0.010 1，R2

=

0.997 8。

1. 6　灵芝总蛋白含量的测定

相关试剂盒测定灵芝总蛋白含量，具体步骤

参考科铭生物技术（苏州）有限公司的总蛋白含量

试剂盒（BCAP-1-W）。

1. 7　灵芝氨基酸含量的测定

相关试剂盒测定灵芝氨基酸含量，具体步骤

参考索莱宝科技（北京）有限公司的灵芝氨基酸含

量检测试剂盒（BC1575）。

240

第72页

石云龙，等：林下栽培灵芝主要活性成分与生态因子的关系

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

1. 8　生态因子的测定

共测定 10个主要生态因子，包括土壤 pH、电

导率、有机质、含水量、容重、孔隙度、土壤温度、空

气温度、空气湿度和透光率。土壤因子测定方法

参照《土壤农化分析》［21］

，空气温度及湿度采用空

气温湿度计测定，透光率采用光照计测定。

1. 9　数据分析

数据分析采用 SPSS 23.0，DPS，Simca-p 14.1

和 Canoco5.0 软件；图表绘制采用 Origin 2018 和

graphpad Prism 8软件。

2　结果与分析

2. 1　灵芝生物学性状测定结果

对不同样地林下栽培灵芝的菌盖长、菌柄长、

鲜质量、干质量比较分析，结果表明，灵芝样品平

均鲜质量最大每株 180.52 g，最小每株 63.75 g；

平均干质量每株最大 160.66 g，每株最小 50.76 g

（图 1-A）；平均菌盖长每株最大 49.39 cm，每株最

小 13.87 cm；平均柄长每株最大 7.15 cm，每株最

小3.32 cm（图1-B）。综合4项指标，样地4、样地5、

样地6、样地7灵芝的生物学性状较优（图1）。

2. 2　灵芝主要活性成分含量分析

灵芝活性成分分光光度计测定结果显示，不

同样地灵芝主要活性成分存在明显差异，结果见

图 2。灵芝多糖平均含量为 7.58 mg/g，样地 6 最

高，为 11.66 mg/g；样地 1最低，为 4.34 mg/g；多糖

含量样地 6 是样地 1 的 2.69 倍。2015 版《中国药

典》［22］

规定，灵芝多糖含量≥9 mg/g（0.90%），本研

究 10 个样地中灵芝多糖含量只有样地 5、样地 6

和样地 8 超过国家药典标准，最高灵芝多糖含量

是药典的1.30倍（图2-A）。灵芝总三萜平均含量

为23.74 mg/g，样地4最高，为32.03 mg/g；样地10

最低，为 19.64 mg/g；总三萜含量样地 4是样地 10

的1.63倍。2015年《中国药典》［22］

规定，灵芝总三

萜含量≥5 mg/g（0.50%），本研究10个样地灵芝总

三萜含量均超过国家药典标准，且最低灵芝总三

萜含量是药典的 3.686 倍（图 2-B）。灵芝总蛋白

平均含量为9.81 mg/g，样地1最高，为12.50 mg/g；

样地 4 最低，为 5.69 mg/g；灵芝总蛋白含量最高

是最低样地的 2.20 倍（图 2-C）。灵芝氨基酸平

均含量为 624.92 μmol/g，其中，样地 5 最高，为

1 056.20 μmol/g；样地 7 最低，为 141.01 μmol/g；

灵芝总蛋白含量最高样地是最低样地的 7.49 倍

（图2-D）。

综上，以蒙古栎为建群种的林下栽培灵芝，不

同样地间灵芝差异明显。在 2015 版《中国药

典》［22］

规定的多糖含量与总三萜含量 2项标准中，

总三萜含量 10 个样地均达到标准，且多数样地

远超药典标准，质量优异；而多糖含量只有 3 个

样地达到标准，说明林下栽培灵芝药材质量受环

境条件影响较大。另外，灵芝总蛋白和氨基酸

含量各样地间差异明显，特别是氨基酸含量多

数样地间差异达到显著水平（图2）。采用SPSS软

件对灵芝4种活性成分进行聚类分析，结果表明，

10个样地可划分为4类，样地4单独为一类，其总

三萜含量显著高于其他样地；样地 9、样地 10、样

地 1 和样地 2 聚为一类，其灵芝总蛋白含量高于

其他样地；样地 3、样地 7和样地 8聚为一类，其灵

芝氨基酸含量显著低于其他样地；样地5和样地6

聚为一类，其灵芝多糖含量显著高于其他样

地（图3）。

图1　不同样地灵芝生物学性状比较

Fig. 1 Comparison of biological characteristics of G.lucidum from different soil samples

241

第73页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 3　灵芝活性成分含量与生态因子的灰色关联

度分析

对灵芝主要活性成分含量与生态因子进行灰

色关联度分析，结果表明，土壤温度处于 19.50~

24.25 ℃，土壤温度越低越有利于灵芝多糖、总三

萜、总蛋白含量的提高；土壤含水量在 22.65%~

49.49%，灵芝多糖、总三萜、总蛋白含量随含水量

升高呈递增趋势；在 23.68~25.00 ℃，空气温度升

高可有效促进灵芝多糖的积累；空气湿度在

73.42%~80.06%，空气湿度越高越有利于灵芝总

三萜、总蛋白含量的积累（表1）。土壤温度、空气

温度、空气湿度对灵芝总三萜及总蛋白含量影响

最大；灵芝氨基酸含量与土壤容重存在相关

性（表2）。

2. 4　灵芝采样点生态因子分析

为更加全面分析采样点灵芝的生态因子，采

用 Simca-p 软件对灵芝生长环境中的生态因子

（表 1）进行 PCA 分析，结果显示：样地 7 和样地 8

集中在 PCA图上的左上部，土壤容重显著低于其

他样地，灵芝氨基酸含量较低；样地 1，2，9，10 分

散在 PCA图的右下部分，土壤温度显著高于其他

样地，灵芝总三萜含量和总蛋白含量较高；样地

3~6 分散在 PCA 图的右上部分，空气温度显著低

于其他样地（图 4）。与灵芝活性成分聚类分析的

分类形式比较相似（图 3），说明生态因子在一定

程度上影响灵芝活性成分含量的积累。

图2　不同样地灵芝活性成分比较

Fig. 2 Comparison of active components of G.lucidum from different soil samples

图3　灵芝活性成分的聚类分析

Fig. 3 Cluster analysis of active components from

G.lucidum

242

第74页

石云龙，等：林下栽培灵芝主要活性成分与生态因子的关系

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采用 Canoco 软件对灵芝活性成分与生态因

子进行 CCA 分析，结果表明：对灵芝活性成分影

响最大的生态因子为土壤温度，与灵芝多糖、总三

萜、总蛋白呈负相关关系；其次是土壤含水量，与

灵芝多糖、总三萜、总蛋白呈正相关关系。灵芝多

糖、总三萜、总蛋白位于不同象限，说明三者对生

态因子变化的敏感性较强，灵芝氨基酸位于距坐

标轴中心点较近的位置，说明灵芝氨基酸含量不

易受环境因子的影响。此外，土壤有机质、孔隙

度、容重、空气湿度对灵芝活性成分含量的积累也

存在一定的影响，但土壤 pH、电导率及空气温度

对灵芝活性成分含量的积累影响较小。灵芝多糖

与土壤有机质、孔隙度、空气湿度呈正相关关系，

与土壤容重呈负相关关系；灵芝总三萜及总蛋白

与土壤有机质、孔隙度呈正相关关系，与空气温

度、土壤容重呈负相关关系（图 5）。与灵芝活性

成分与生态因子的灰色关联度分析结果相

似（表2）。

表1 林下栽培灵芝不同样地的主要生态因子

Table 1 Major ecological factors of G.lucidum cultivated under forests from different soil samples

样地

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

土壤pH

5.43±0.03d

5.22±0.14ef

5.02±0.17g

4.82±0.07h

5.24±0.04e

5.18±0.06fg

5.67±0.08c

5.26±0.08ef

6.57±0.03a

5.89±0.03b

土壤电导率/

（μS·cm-1

）

56.32±5.40f

78.55±5.00f

50.44±7.80f

87.51±14.60ef

117.52±9.20c

105.05±7.40cd

63.46±1.50f

93.17±3.80de

592.05±10.60a

146.48±6.90b

土壤含水

量/%

34.52±0.20bcd

28.23±0.10cd

22.65±0.20d

28.84±0.20cd

33.37±0.20bcd

40.43±0.40bc

59.07±0.20a

49.49±0.10ab

48.31±0.10ab

28.12±0.10cd

土壤容重/

（g·cm-3

）

0.76±0.08a

0.75±0.23a

0.80±0.10a

0.80±0.13a

0.67±0.27a

0.69±0.12abc

0.39±0.06ab

0.44±0.03c

0.57±0.06bc

0.73±0.13abc

土壤

孔隙度

68.84±1.20h

68.92±4.40g

67.33±2.10j

67.57±2.50i

71.64±1.40d

70.95±2.70e

80.87±2.10a

79.22±7.60b

74.82±2.50c

69.79±2.30f

土壤温度/

℃

24.25±0.25a

23.75±0.63a

23.25±0.25ab

23.75±0.29a

22.50±0.13b

20.88±0.13b

19.50±0.20d

23.75±0.25a

24.25±0.25a

土壤有机

质/%

9.09±0.75f

10.03±0.74g

9.04±0.81e

10.64±0.49a

10.53±2.07c

11.51±1.16c

11.13±0.42b

10.15±1.47d

11.35±0.28c

8.21±1.15fg

空气温度/

℃

25.00±0.05a

24.44±0.05d

24.10±0.04e

23.68±0.08f

24.80±0.05b

24.64±0.05c

24.08±0.44e

23.96±0.05f

24.12±0.04e

空气湿度/

%

73.42±1.21f

76.38±0.36c

73.50±0.56f

73.78±0.42f

74.46±0.05e

74.46±0.21e

75.58±0.22d

77.76±0.13b

75.88±0.46cd

80.06±0.34a

透光率/%

3.75±0.001f

2.06±0.001g

7.61±0.011e

24.69±0.008a

12.28±0.011c

11.13±0.004c

19.90±0.006b

9.63±0.003d

11.07±0.001c

2.81±0.001fg

表2 灵芝活性成分与生态因子灰色关联度分析

Table 2 Grey correlation analysis of active components of G.lucidum and ecological factors

活性成分

灵芝多糖

灵芝总三萜

灵芝总蛋白

灵芝氨基酸

土壤pH

0.506 7

0.716 4

0.741 1

0.464 2

土壤电导

率

0.434 7

0.442 7

0.527 8

0.424 5

土壤含

水量

0.555 3

0.539 7

0.553 3

0.407 8

土壤容重

0.462 7

0.697 6

0.641 4

0.551 8

土壤孔

隙度

0.537 2

0.747 0

0.744 1

0.452 0

土壤温度

0.511 0

0.774 7

0.745 0

0.491 2

土壤有

机质

0.535 9

0.717 1

0.717 0

0.486 7

空气温度

0.538 5

0.770 8

0.767 1

0.470 3

空气湿度

0.535 2

0.793 4

0.795 7

0.470 9

透光率/%

0.456 3

0.484 0

0.482 9

0.377 9

图4　采样点生态因子主成分分析

Fig. 4 Principal component analysis of ecological fac⁃

tors in sampling sites

243

第75页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

3　结论

生态因素是药材质量形成的原始特征［23］

。

生态环境差异是导致药材质量差异的主要原因，

其对药用真菌的产量和品质具有显著影响［24-33］

。

本研究采用灰色关联度分析、典范对应分析法，考

察了不同样地灵芝活性成分含量与生态因子的相

关性，结果表明：灵芝活性成分的含量不同程度地

受生态因子的影响，其中灵芝多糖、总三萜、总蛋

白含量受生态因子的影响较大，相同生态因子对

三者含量积累的影响存在差异，但生态因子对灵

芝氨基酸含量影响较小，仅受土壤容重的影响。

土壤含水量、土壤温度、空气温度、空气湿度是影

响灵芝活性成分的主要生态因子，其中灵芝多糖

与土壤含水量、空气温度呈正相关，与土壤温度、

空气湿度呈负相关；灵芝总三萜、总蛋白与土壤含

水量、空气湿度呈正相关，与土壤温度、空气温度

呈负相关。

基于聚类分析、灰色关联度分析、PCA 分析、

典范对应分析，本研究揭示了土壤温度、含水

量、空气湿度、空气温度在灵芝活性成分形成中

起重要作用。结果表明：土壤温度处于 19.50~

24.25 ℃，越低越有利于灵芝多糖、总三萜、总蛋白

含量的提高；土壤含水量在22.65%~49.49%，灵芝

多糖、总三萜、总蛋白含量随含水量升高呈递增趋

势，表现为活性成分积累状态；空气温度在23.68~

25.00 ℃，空气温度升高可有效促进灵芝多糖的积

累，但一定程度限制了灵芝总三萜、总蛋白的积

累；空气湿度在73.42%~80.06%，空气湿度越高越

有利于灵芝总三萜、总蛋白含量的积累，对灵芝多

糖的积累不利。综上，林下栽培灵芝选择土壤温

度较低、土壤含水量较高的生境，可显著提高灵芝

多糖、总三萜、总蛋白的积累，从而提高林下栽培

灵芝品质。

参考文献：

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图5　灵芝多糖、总三萜、总蛋白、氨基酸含量与环境因子

的CCA二维排序

Fig. 5 CCA two-dimensional sequencing of G. lu⁃

cidum polysaccharides， total triterpenes， total

proteins， amino acid contents and environmen⁃

tal factors

244

第76页

石云龙，等：林下栽培灵芝主要活性成分与生态因子的关系

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

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（责任编辑：王希）

245

第77页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（2）：246-254

Journal of Jilin Agricultural University

天然阔叶次生林下不同年生人参根际微生物群

落多样性*

刘丽娟1，2

，佟爱仔1，2

，秦佳梅1，2**

1. 通化师范学院生命科学学院，通化 134001；2. 吉林省长白山生物种质资源评价与应用重点

实验室，通化 134001

摘要：为探讨天然阔叶次生林下人参根际细菌和真菌的群落组成和分布规律，以不同生长年限人参根际土

壤为研究对象，采用 Illumina HiSeq 高通量测序技术分析天然阔叶次生林下不同生长年限人参根际微生物菌

群落多样性。结果表明：人参根际细菌和真菌的OTU数目，随着人参生长年限的增长普遍增加，其中，11年生

（K11）人参的根际微生物OTU数目最多。α多样性分析结果表明，相对于未种植人参土壤（Kck），生长年限分

别为7年（K7）和11年（K11）的土壤细菌群落的丰富度和多样性明显增加（P<0. 05），15年（K15）的细菌群落α

多样性指数没有明显差异，而真菌群落的丰富度和多样性指数，随着人参的生长年限变化不大。β多样性分

析表明，相同年生人参根际细菌和真菌群落距离较近，其中，15 年生（K15）人参根际细菌和真菌群落与对照

（Kck）样本完全分开，群落差异明显。优势细菌门的相对丰度随着人参生长年限的增长发生改变。放线菌门

数量随着种植年限有大幅变化，呈现先升高后降低的趋势，4年生（K4）数量达到最大值。优势真菌门的相对

丰度随着人参生长年限的增长发生改变。天然阔叶次生林下，生长年限对人参根际土壤微生物有较大影响，

可为林下人参科学种植提供理论依据。

关键词：阔叶林；人参；根际微生物；高通量测序技术

中图分类号：S154. 3；S567. 51 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0246-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1875

引用格式：刘丽娟，佟爱仔，秦佳梅.天然阔叶次生林下不同年生人参根际微生物群落多样性［J］.吉林农业大

学学报，2024，46（2）：246-254.

Diversity of Rhizosphere Microbial Community of Different Age

Panax ginseng in Natural Broad-leaved Secondary Forests *

LIU Lijuan1，2

，TONG Aizi1，2

，QIN Jiamei1，2**

1. School of Life Sciences， Tonghua Normal University， Tonghua 134001， China；2. Key Laboratory

of Evaluation and Application of Changbai Mountain Biological Gerplasm Resources of Jilin Prov⁃

ince， Tonghua 134001， China

Abstract：To explore the community composition and distribution patterns of bacteria and fungi in

the rhizosphere of Panax ginseng under natural broad-leaved secondary forests, taking ginseng rhizo⁃

sphere soil with different growth years as the research object, Illumina HiSeq high-throughput se⁃

quencing technology was used to analyze the microbial community diversity of ginseng rhizosphere

soil at different growth years in natural broad-leaved secondary forest. The results showed that the

number of OTUs of bacteria and fungi generally increased with the ginseng planting years. Among

* 基金项目：吉林省科技发展计划项目（20190304012YY）

作者简介：刘丽娟，女，硕士，教授，研究方向：药用植物营养与栽培。

收稿日期：2022-08-12

** 通信作者：秦佳梅，E-mail：th-qjm@163.com

第78页

刘丽娟，等：天然阔叶次生林下不同年生人参根际微生物群落多样性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

them, the number of OTUs of 11-year-old ginseng rhizosphere microorganisms was the largest.The α

diversity analysis showed that compared with the soil without planting ginseng, the richness and di⁃

versity of soil bacterial communities with growth years of 7 years (K7) and 11 years (K11) were sig⁃

nificantly increased (P<0.05), and there was no significant difference in α diversity index of bacterial

communities with 15 years, while fungi richness and diversity indexes of the community did not

change signifcantly with the growth years of ginseng. β diversity analysis showed that the rhizosphere

bacterial and fungal communities of the same year-old ginseng were relatively close. Among them,

the 15-year-old ginseng rhizosphere bacterial and fungal communities were completely separated

from the control samples, indicating that the community differences were significant. The abundance

of dominant bacteria phyla changed with the increase of ginseng age.The number of Actinomycetes

changed significantly with the planting years of ginseng, showing a first increasing and then decreas⁃

ing trend. The number of Actinomycetes in the 4-year-old ginseng reached the maximum value. The

abundance of dominant fungi phyla changed with the increase of ginseng age. Under the natural

broad-leaved secondary forest, the microbial community of ginseng rhizosphere under the broadleaved forest changed significantly with the growth of ginseng, which can provide a theoretical basis

for the scientific planting of ginseng under the forest.

Key words：broad-leaved forest；Panax ginseng； rhizosphere microorganism； high-throughput se⁃

quencing technology

人参（Panax ginseng C. A. Mey.）为五加科多

年宿根草本植物，按照生长环境不同，分为野山

参、林下参和园参三类［1］

，按栽培模式可分为林下

种参、伐林栽参和农田栽参［2］

，其中，园参主要有

农田栽参和林地种参 2 种生产方式，伐林种参给

森林资源和生态环境造成负担，也易造成水土流

失，农田栽参一定程度上虽缓解了参林矛盾，但由

于人参连作障碍，栽过一茬人参的土壤要30年后

才能再栽参，产区宜参农田数量急剧减少。参地

资源紧张已成为阻碍人参产业发展的主要瓶

颈［3］

。林下护育栽培的人参与野山参外形相似，

有效成分相近，品质优于其他 2种栽培模式［4］

，是

目前人参产业发展的主要方向。

土壤是人参赖以生存的物质基础，人参根系

与土壤有极大的接触面，且与土壤之间不断进行

着物质交换［5］

。人参是多年生宿根植物，长期栽

培导致土壤劣变，质量下降，影响土壤微生物群落

结构［6］

。根系分泌释放的有机物对根际微生物群

落组成与结构有显著影响［7］

，人参栽培改变了森

林土壤的原核微生物群落结构，部分土著微生物

种群消亡的同时，外来微生物种群增加［8］

，重茬人

参真菌病害发病率升高与其根际分泌物对其病原

真菌的拮抗细菌、拮抗放线菌的生长受到抑制明

显相关［9］

。为了促进人参产业健康有序发展，解

决随着生长年限的延长，天然阔叶次生林下栽参

留存率极低的问题，采用Illumina HiSeq高通量测

序技术，分析天然阔叶次生林下不同种植年限人

参根际微生物多样性和群落结构，为人参林下种

植应对措施提供理论支撑。

1　材料与方法

1. 1　土壤样品采集

2020 年 7 月，采用常规方法从通化县石湖乡

天然阔叶次生林下人参栽培基地，采集种植年限

分别为 2，4，7，11，15 年的人参根际土壤样品，用

K2，K4，K7，K11 和 K15 表示，以未种植人参的地

块为对照（Kck）。从土壤中采集人参根，去掉表

面大块土，然后用棉签轻轻刮取靠近根部表面的

土壤（至少采集8份样本），从中随机抽取4个样本

进行测序和后续分析。

1. 2 DNA提取与扩增

采用 E.Z.N.A.

®Soil DNA Kit 提取人参根际土

壤样品中微生物的总 DNA，利用 NanoDrop 2000

超微量紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，

然后使用1％琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。

细菌以 16S rRNA 基因的 V3-V4 区为目标序

列，用通用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGC

AGCAG-3′）/806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT

247

第79页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

AAT-3′）进行扩增，扩增产物 468 bp。真菌以内

源转录间隔ITS区为目标序列，用通用引物ITS1F

（5′-CTTGGTCATTTAGAGAGGAAGTAA-3′）/ITS

2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）进行扩

增，扩增产物300 bp。PCR产物通过2％琼脂糖凝

胶电泳进行检测，然后利用 AxyPrep DNA Gel Ex⁃

traction Kit和QuantiFluorTM-ST进行纯化和均一化。

1. 3　扩增产物高通量测序

根据 Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.

的标准程序，将纯化的扩增子等摩尔合并，并在

Illumina MiSeq 平台上进行双末端测序（PairedEnd）。对测序原始数据进行质控和拼接，过滤掉

低质量 Reads，将得到的双端序列拼接成 Tags，同

时去除低质量 Tags和嵌合体，得到高质量的 Tags

数据（Clean Tags）。

1. 4　数据统计与分析

使用 UPARSE 对高质量序列，按 97％的序列

相似性进行操作分类单位（Operational Taxonomic

Units，OTU）聚类，基于 Silva 16S rRNA 数据库和

Unite ITS基因数据库对OTU进行分类学注释，置信

度阈值为70％。依据OTU鉴定结果，利用Mothur计

算α多样性指数；使用Bray-Curtis距离算法计算样

本之间的距离，并进行β多样性分析；利用ANOSIM

对PCoA分析进行检验。本研究使用t检验比较不同

分组的α多样性指标，统计显著性设置为“*”表示

P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。

2　结果与分析

2. 1　测序深度分析

从 24 个土壤样品中共获得 1 265 109 个细菌

16S rRNA V3-V4 有效序列和 1 466 124 个真菌

ITS有效序列。细菌和真菌序列的平均长分别为

415.37 bp和250.96 bp，高质量序列分别以97％的

序列相似性共聚类 7 945 个细菌操作分类单位

（OTUs）和 5 292 个真菌 OTUs。阔叶林下人参根

际真菌群落的有效序列高于细菌群落，但 OTU数

目明显低于细菌群落。

通过构建细菌和真菌稀释曲线发现，每个样

品的OTUs稀释曲线接近饱和（图1-A，B），表明测

序数据可用于后续分析土壤细菌和真菌的多样性

分析，与细菌相比，真菌的稀疏曲线形状变化程度

更高。从微生物 OTU 数目 Venn 图可见（图 1-C，

D），与 Kck 相比，人参根际细菌和真菌的 OTU 数

目普遍增加（K2 细菌除外），其中，K11 微生物

OTU 数目最多。种植年限 10 年以上的人参根际

细菌 OTU 数目为 2 602~2 612，而种植年限<10 年

的人参根际细菌OTU数目为2 442~2 506，表明种

植年限超过 10 年人参根际细菌 OTU 数目增加。

人参根际真菌除K7的OTU数目为684外，其他年

限人参根际真菌的 OTU数目均>818，且差异不显

著。6 组样本共有细菌 OTU 占比 28.14%，独有占

比分别为 2.81%（Kck），2.59%（K2），3.40%（K4），

3.26%（K7），4.73%（K11），4.63%（K15），由此可

见，共有细菌OTU较多，独有OTU较少。6组样本

共有真菌 OTU 占比 8.14%，独有占比分别为

4.04%（Kck），7.67%（K2），8.48%（K4），4.78%

（K7），11.39%（K11），7.31%（K15），即共有真菌

OTU 较少，独有 OTU 较多，其中 K11 真菌独有

OTU最多。

2. 2 α多样性分析

为估计人参根际微生物群落的 Alpha（α）多

样性，从数据中按最小样本序列数对样本序列进

行抽评。Chao和Shannon指数分别反映人参根际

土壤微生物群落的丰富度和多样性（图 2）。由

图2可见，与Kck相比，K7和K11的土壤细菌群落

Chao和Shannon指数显著增加（P<0.01，P<0.001），

K11 的 Chao 指数与 Kck 相比差异显著，K15 的土

壤细菌群落Chao和Shannon指数无明显差异。而

真菌群落的Chao和Shannon指数随着种植人参的

年限变化不大。

2. 3 β多样性分析

对土壤微生物群落的细菌科与真菌科水平进

行 β 多样性分析（图 3）。由图 3-A，B 可见，相同

年生人参根际细菌和真菌群落组内距离较近，说

明样本的物种分类和丰富度上相似性较高，而不

同年生人参根际微生物群落组间距离较远，但不

完全分开。其中，K15 细菌微生物群落与 Kck 完

全分开，群落差异明显。

由图 3-C，D 可见，种植年限>10 年的细菌群

落与种植年限2年、4年、7年的细菌和真菌群落距

离较远，说明细菌和真菌群落组成发生变化。

K15真菌群落组成与Kck被分为2个不同的簇，说

明真菌群落组成变化明显。随种植年限增加，不

同年生真菌群落组成变化不明显。

248

第80页

刘丽娟，等：天然阔叶次生林下不同年生人参根际微生物群落多样性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

A,C.细菌；B,D.真菌

图1　人参根际细菌和真菌的稀释曲线和OTU水平韦恩图

Fig. 1 Rarefaction curves and Venn diagram of bacterial and fungal communities in ginseng rhizospheric soil

图2　人参根际细菌和真菌群落α多样性分析

Fig. 2 Alpha diversity analysis of bacterial and fungal communities in ginseng rhizospheric soil

249

第81页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

A，B.基于Bray-Curtis距离算法的微生物层次聚类；C，D.根际微生物主成分分析（PCoA）；A，C.细菌；B，D.真菌

图3　人参根际细菌和真菌群落科水平的β多样性分析

Fig. 3 Beta diversity analysis of bacterial and fungal communities in ginseng rhizospheric soil

续图2

Continued fig. 2

250

第82页

刘丽娟，等：天然阔叶次生林下不同年生人参根际微生物群落多样性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 4　细菌群落组成与结构

根据97％的物种相似性，从细菌16S rRNA基

因序列中共鉴定出 36 门，116 纲，281 目，452 科，

832属，1 928种和7 945个OTU。在36个细菌门类

中，占比0.5%以上的类群有12个（图4），依次为变

形菌门（Proteobacteria，35.37%），放线菌门（Acti⁃

nobacteriota，19.25%），酸杆菌门（Acidobacteriota，

15.61%），疣微菌门（Verrucomicrobiota，6.81%），绿

弯菌门（Chloroflexi，5.13%），浮霉菌门（Planctomy⁃

cetota，3.23%），粘球菌门（Myxococcota，3.08%），

拟杆菌门（Bacteroidota，2.52%），厚壁菌门（Fir⁃

micutes，2.17%），甲基杆菌门（Methylomirabilota，

2.08%），芽单胞菌门（Gemmatimonadota，1.24%）和

脱硫杆菌门（Desulfobacterota，0.66%）。

A.不同样品优势细菌门的相对丰度；B.单因素方差分析样品间的群落组成差异（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001）

图4　细菌群落的组成和结构

Fig. 4 Composition and structure of bacterial communities

251

第83页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

单因素方差分析（One-way ANOVA）表明，

12 个优势细菌门中有5个类群的相对丰度随着人

参生长年限发生明显差异，分别为放线菌门，绿弯

菌门，厚壁菌门，芽单胞菌门。6组样本进行两组

比较并进行Student′s T检验，结果显示，优势细菌

门的相对丰度随着人参生长年限的增长发生改

变，K2 与 Kck，K15 与 K11，K15 与 Kck 分别有 6，

3，6 个优势细菌门发生明显改变（P<0.05），而

K4 与 K2，K7 与 K4，K11 与 K7 优势细菌门没有明

显改变。放线菌门相对丰度 K4（22.57%）>K7

（20.76%） >K2 （20.7%） >Kck （19.74%） >K11

（17.59%）>K15（14.16%），放线菌门数量随着种植

年限变化呈现先升后降趋势，K4放线菌数量达最

大值 22.57%，K7 和 K2 数值相近，种植 4 年后，随

种植年限增加逐年降低，种植年限>10年时，放线

菌门数量降低幅度较大且小于Kck。

在不同年生人参根际土壤中芽孢杆菌属（Ba⁃

cillus）相对丰度 Kck（1.24%）>K11（1.23%）>K15

（1.13%）>K4（0.64%）>K2（0.62%）>K7（0.61%），未

种植人参地块芽孢杆菌属数量均大于种植人参地

块，K4、K2 和 K7 数相近，种植年限>10年时，芽孢

杆菌属数回升至>1.1%，K15略低于 K11。天然阔

叶次生林下种植人参后，芽孢杆菌属（Bacillus）数

量均低于未种人参地块，10年以内不同年限间差

异不显著，与 Kck 组相比明显下降；10 年以上恢

复到对照状态，总体呈现先低后高趋势。

2. 5　真菌群落组成与结构

人参根际土壤样品的真菌 OTUs 代表序列经

比对鉴定得到16门，67纲，169目，390科，926属，

1 601 种和 5 292 个 OTU。在门水平上，将相对丰

度<0.1%以及在该水平上没有注释结果的真菌归

于其他，林下人参根际真菌门主要有 6 个类群

（图5），分别为担子菌门（Basidiomycota，49.92%），

子囊菌门（Ascomycota，33.68%），被孢霉门（Mor⁃

tierellomycota，9.56%），罗兹菌门（Rozellomycota，

3.54%），壶菌门（Chytridiomycota，0.28%）和球囊

菌门（Glomeromycota，0.23%）。

One-way ANOVA 分析结果表明，6 个优势真

菌门中有3个类群的相对丰度随着人参生长年限

发生明显改变，分别为担子菌门，子囊菌门，球囊

菌门。6 组样本进行两组比较并进行 Student′s T

检验，结果显示，优势真菌门的相对丰度随着人参

生长年限的增长发生改变，球囊菌门在 Kck

（0.043%），K2（0.574%）， K4（0.132%）中先增加后

减少，K15 的球囊菌门与 Kck 相比，没有明显变

化；K7 的担子菌门相对丰度最高（66.97%），

大于 Kck（58.2%），其他年限均小于 Kck，K15

（55.51%） >K2 （46.14%） >K11 （39.36%） >K4

（33.34%），呈现先降低后增加，再降低的趋势，规

律性不明显，K15与对照相比，差异不明显。

A.不同样品优势真菌门的相对丰度；B.单因素方差分析样品间的群落组成差异（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001）

图5　真菌群落的组成和结构

Fig. 5 Composition and structure of fungal communities

252

第84页

刘丽娟，等：天然阔叶次生林下不同年生人参根际微生物群落多样性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3　讨论

随着科学技术的不断发展，土壤微生物群落

结构研究方法也在不断改进。利用稀释平板法进

行土壤微生物的分离，因培养基组成和分离条件

有一定局限性，培养所使用的培养基针对性较强，

且能纯培养的土壤微生物的菌株数只占微生物总

数的 0.1%~1.0%［10］

，故分离出的微生物种类和数

量不完全。平板稀释法是一种产孢真菌的分离方

法，分离到的真菌几乎全部为丝孢纲真菌，难以真

实反映土壤真菌的生存状态与种群分布［11］

。高

通量测序技术应用于探究并揭示土壤中微生物物

种和群落结构的多样性［12］

。

利用稀释平板法进行土壤微生物的分离，认

为种植年限越长，人参根区土壤真菌浓度越高，细

菌和放线菌的含量越低［13］

，根际微生物种类和数

量呈增多趋势［14］

。与本试验结果不同的原因是

此法分离出的微生物不全面。野生抚育模式人参

根部内生细菌和内生真菌的群落丰富度和物种多

样性较高，而农田栽参模式较低［15］

。林下参生长

根区土壤微生物总量、细菌生物量、真菌生物量及

放线菌生物量与对照相比均有提高，且15年以后

提高的幅度更加明显［16］

。张鸿雁等［17］

采用稀释

平板法及皿内琼脂块法研究不同种植年限（1，5

和7年）人参地土壤样品中的放线菌生态得出，随

种植年限的增加放线菌总数呈增加趋势的结果，

与本试验结果不同。分析原因，一是样品数量

差别，本试验样本种植年限（2，4，7，11和 15年），

有>10 年样本，张鸿雁等的试验无此类样品；二

是测试方法，高通量测序技术得出的放线菌门数

量远大于稀释平板法。人参栽培引起参地土壤

有机质含量［18］

及pH值下降［19］

，土壤酸化严重，不

利于人参的生长发育。放线菌为原核生物生长的

适宜 pH 7.5~8.5

［20］

，种植年限增加引起土壤酸碱

度变化，使环境不利于放线菌生长，故种植年限>

10年时放线菌数量降低幅度较大，且低于未种人

参地块。

天然阔叶次生林下种植人参后，芽孢杆菌属

（Bacillus）数量均低于未种人参地块，10年以内不

同年限间差异不显著，与对照相比下降；10 年以

上恢复到对照状态，总体呈现先低后高趋势。分

析变化原因，与人参生长改变土壤中养分、酸碱

度、土壤酶活性等有关，具体原因需进一步研究。

天然阔叶次生林下种植人参后，根际土壤中

的细菌、放线菌和真菌数量比未种人参有所增加；

种植年限>10 年时，根际细菌群落组成发生明显

续图5

Continued fig. 5

253

第85页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

变化，数量增加；真菌数目随着种植年限增加，但

不呈现明显趋势，不同年生真菌群落组成变化不

明显。K15的细菌和真菌群落组成与 Kck差异明

显。不同年生放线菌数量变化较大，总趋势是先

升后降，种植年限>10 年时降低幅度较大且小于

Kck。

本试验样品只采集一个地点的样品，有一定

的局限性，以后的研究中会增加样品采集地点，特

别是不同林相。与传统分子生物学方法相比，高

通量测序技术能够更加全面地揭示土壤微生物群

落结构的相关信息，所得结果更准确。本研究采

用高通量测序技术分析土壤微生物，可以详细、准

确地描述阔叶林下不同年生土壤微生物群落结

构，可为科学合理开展林下人参种植提供参考。

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（责任编辑：林海涛）

254

第86页

吉林农业大学学报 2024，46（2）：255-263 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

栽培年限的增加对人参根区土壤养分及微生物

群落结构的影响*

王天佑1，2

，丁万隆2

，尹春梅1**，王蓉2

，李勇2**

1. 吉林农业大学中药材学院，长春 130118；2. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研

究所，北京 100193

摘要：参照相关行业标准对不同栽培年限人参根区土壤pH、电导率及各种营养成分进行测定，并使用分离

培养基对土壤中的真菌、细菌和放线菌进行培养，利用高通量测序技术对土壤微生物基因组进行分析。结果

表明：人参的种植会导致土壤酸化，且随栽培时间的延长，土壤各项营养成分均呈现不同程度降低的趋势；相

同情况下，土壤微生物群落结构也会产生一些变化，其中土壤真菌随栽培年限的升高其数量呈升高趋势，细

菌和放线菌数量呈现降低趋势；通过皮尔逊相关性分析可知，土壤养分因子与微生物之间关系密切，具有统

计学意义（≥0. 2）的相关性系数占试验总数据的 84. 62%；测序结果显示，变形菌门（Proteobacteria）等是试验

土壤中的主要细菌门类，栽参会显著影响土壤细菌群落结构，导致常见的优势菌群相对丰富度降低，并促使

细菌性假丝酵母念珠菌（WPS-2）等有害菌大量繁殖；子囊菌门（Ascomycota）等是真菌群落结构中的主要门

类，栽参会导致真菌的群落构成受到影响，常规菌种相对丰度降低，腐质霉属（Humicola）、镰刀菌属（Fusarium）

及土赤壳属（Ilyonectria）等致病真菌类群大量繁殖且彼此存在共生关系。综上，土壤微生物对土壤养分的调节

具有积极作用，明确人参根区土壤微生物的生命活动以及发展规律，为促进人参种植产业的优化升级提供理

论依据。

关键词：人参；根区土壤；土壤养分；微生物数量；微生物群落结构

中图分类号：S154. 3；S567. 51 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）02-0255-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1298

引用格式：王天佑，丁万隆，尹春梅，等.栽培年限的增加对人参根区土壤养分及微生物群落结构的影响［J］.吉

林农业大学学报，2024，46（2）：255-263.

Effects of Increasing Cultivation Years on Soil Nutrients and Micro⁃

bial Community Structure in Root Zone of Ginseng *

WANG Tianyou1，2

，DING Wanlong2

，YIN Chunmei1**，WANG Rong2

，LI Yong2**

1. College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118，

China；2. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Pe⁃

king Union Medical College， Beijing 100193， China

Abstract：Soil pH, electrical conductivity and various nutrients were measured in the root zone of

ginseng with reference to relevant industry standards, and soil fungi, bacteria and actinomycetes were

cultured using isolation media. In the same situation, soil microbial community structure also showed

some changes, among which the number of soil fungi tended to increase with the increase of cultiva⁃

tion years, and the number of bacteria and actinomycetes tended to decrease; Pilsen correlation

* 基金项目：国家中药标准化项目（ZYBZH-C-JL-27），中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2016-I2M-3-017）

作者简介：王天佑，男，在读硕士，研究方向：中药学。

收稿日期：2021-06-01

** 通信作者：尹春梅，E-mail：18943009604@163.com；李勇，E-mail：liyong@implad.ac.cn

第87页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

analysis showed that there was a close relationship between soil nutrient factors and microorganisms,

and the correlation coefficients with statistical significance (≥0.2) in this study accounted for 84.62%

of the overall data. The results of sequencing showed that Proteobacteria were the main bacterial

phyla in the test soils, and planting ginseng had a significant impact on soil bacterial community

structure, leading to a decrease in the relative abundance of common dominant groups and promoting

the proliferation of harmful bacteria such as WPS-2; Ascomycota were the main bacterial phyla in

the test soils. Ascomycota, which is the main fungal community structure, was affected by planting

ginseng, and the relative abundance of conventional species was reduced, and pathogenic fungal

groups such as Humicola, Fusarium, and Ilyonectria proliferated had symbiotic relationships with

each other. In conclusion, the regulation of soil nutrients by soil microorganisms is positive, and it is

important to clarify life activities and development rules of soil microorganisms, which can provide

theoretical basis for promoting the optimization and upgrading of ginseng cultivation industry.

Key words：ginseng； root zone soil； soil nutrient； quantity of soil microorganisms； soil microbial

community structure

人参（Panax ginseng C. A. Meyer）为五加科多

年生宿根草本植物，为我国传统名贵中药材，素有

“百草之王”的美誉［1］

。然而，极强的忌地性制约

了人参产业的稳定发展，传统的“伐林栽参”模式

已不适用于当今的社会现况［2］

，老参地重复利用

已然成为人参种植产业面临的一大难题。因此，

深入研究人参连作障碍形成机理，加快老参地循

环再利用，不仅能促进中药材生产与自然生态环

境和谐发展，还有助于推动人参种植模式优化

升级。

大量研究表明［3-6］

，栽参会导致其根区土壤营

养失衡，而土壤微生物是地上植物群落和土壤养

分循环联系的关键纽带，可以起到维系植物体自

身健康的重要作用，若土壤微生物的群落结构骤

变或多样性降低，将导致土壤营养的转化效率降

低，影响植物体对于养分的吸收与利用［7］

。本研

究通过对我国人参主产区不同栽培年限人参根区

土壤pH、电导率、养分含量及菌群动态进行测定，

利用高通量测序技术探究土壤微生物的群落结构

及物种多样性，分析人参栽培过程中土壤因子的

动态变化及其相互联系，为阐明人参连作障碍发

生时其根区土壤的微观动态变化以及为老参地的

重复再利用提供科学的理论依据。

1　材料与方法

1. 1　试验样品采集及前处理

供试2~5年生栽参农田土（SP2~SP5）及对照农

田土（SPck）均采自辽宁省丹东市宽甸满族自治县

双山子乡四平村（北纬41°5′14″，东经124°45′15″）。

全部土壤样本采用五点法［8］

取样，每个样点随机

选取 6 株健康生长的人参，小心挖出人参根并收

集根围土（与主根距离<5 cm），将土壤中石块、植

物残体、杂草等剔除干净，将5点采集的土壤合并

装入无菌自封袋，记录对应的人参生长年限。将

冰袋带回实验室，立即过 2 mm 筛，鲜样进行微生

物试验，风干样品进行营养元素试验。

本研究中的试验地块实施了集免疫调节、促

生拮抗、生物刺激、杀菌剂及植物营养类剂于一体

的肥药调控，以保持土壤的养分供给。多数肥药

剂量以每 75 m2

施用一单位体积（瓶、袋）为基准

（健达、哈茨木霉和荣亚每3 m2

施用一单位体积）；

所有药剂均按照使用说明溶解，并以喷灌的方式

施用。除池面消毒外，1~2年生各进行9次肥药喷

灌，3~5年生进行10次。

1. 2　土壤养分测定

土壤 pH 测定参照 NY/T 1377—2007［9］

；土壤

电导率用电导率仪测定；土壤有机质测定参照

NY/T 1121.6—2006［10］

；土壤总氮及总碳测定采用

高温燃烧法［11］

；土壤全磷及全钾测定采用ICP定量

法［12］

；土壤碱解氮测定参照 LY/T 1228—2015［13］

；

土壤有效磷测定参照 NY/T 1121.25—2012［14］

；土

壤速效钾测定参照NY/T 889—2004［15］

。

1. 3　土壤微生物数量

土壤微生物数量采用平板稀释计数法［16］

测

定。牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌、高氏一号合

成培养基培养放线菌、马丁-孟加拉红-链霉素培

256

第88页

王天佑，等：栽培年限的增加对人参根区土壤养分及微生物群落结构的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

养基培养真菌。细菌、放线菌每皿 30~300 个菌

落，真菌每皿 10~100 个菌落为宜。接菌后 28 ℃

恒温培养（细菌1~2 d，放线菌3~4 d，真菌3~6 d），

菌落计数并根据稀释倍数折算原始浓度。

微生物浓度（CFU/g）=（相同稀释度菌落平均

数×稀释倍数）/土壤质量。

1. 4　样品基因组总DNA提取

使用Ultra Clean Soil DNA Isolation Sample Kit

提取土壤样品微生物总基因组 DNA，具体步骤参

照试剂盒说明书，并将提取后的样本DNA统一稀

释至20 ng/μL进行后续试验。

1. 5 PCR扩增

以 1% 的凝胶、170 V 电压和 30 min电泳时间

为基础条件，进行 25 μL 反应体系［17］和扩增程

序［17］。对细菌 16S V3-V4 区域扩增的引物序

列［18］：338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC

AG-3′）和 806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT

CTA AT-3′）；对真菌 ITS1（ITS1-ITS2）区域扩增

引物序列［19］

：ITS1-F（5′-CTT GGT CAT TTA GAG

GAA GTA A-3′）和 58A2R（5′-TGC GTT CTT CAT

CGA TGC-3′）。

25 μL PCR反应体系包括模板DNA样品 1.5 μL，

Forward Primer （5 μmol/L） 1 μL，Reverse Primer

（5 μmol/L）1 μL，BSA（2 ng/μL）3 μL，2×Taq Plus

Master Mix 12.5 μL，ddH2O 6 μL。

扩增程序：16S V3-V4 区为 94 ℃ 预变性

5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸

60 s，28 个循环；72 ℃维持 7 min，程序结束后在

4 ℃下保存； ITS1（ITS1-ITS2）区为 94 ℃预变性

5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸

60 s，34 个循环；72 ℃维持 7 min，程序结束后在

4 ℃下保存。

1. 6 Illumina PE300高通量测序

按指定测序区域［细菌16S V3-V4，真菌ITS1

（ITS1-ITS2）］，合成带有 barcode 的特异引物，或

带有错位碱基的简并引物。

全部样本按照正式试验条件进行，每个样本

3 次重复，将同一样本 PCR 产物混合，2% 琼脂糖

凝胶电泳检测，AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒

（Axygen公司）切胶回收 PCR产物，Tris HCl洗脱；

2% 琼脂糖电泳检测。通过 Miseq PE300 平台进

行测序（奥维森基因科技有限公司，北京）。

1. 7　数据分析

利用 Excel 2016 和 SPSS 20.0 软件进行数据

处理和统计分析；单因素方差分析（ANOVA）比较

不同处理间土壤因子的显著性差异；皮尔逊

（Pearson）相关分析推测土壤因子间的相互关系；

土壤微生物独立丰富度指数及综合指数［20］

计算

方法：土壤微生物独立丰富度指数=土壤中某类

型微生物数/全部土壤样品中该微生物数的平均

值；土壤微生物丰富度综合指数=（土壤细菌丰富

度指数+土壤真菌丰富度指数+土壤放线菌丰富

度指数）/3。

利用Trimmomatic（v0.36）、Pear（v0.9.6）、Flash

（v1.20）和Vsearch（v2.7.1）软件对测序后下机得到

的原始数据进行质控处理，去除具有N的序列，对

数据拼接从而得到Fasta序列，最终与已知数据库

（uchime 方法）和未知数据库（Denovo 方法）完成

比对，以 97% 的相似水平为标准，对序列进行分

类并生成 OTUS，最终采用 RDP Classifier 算法对

OTU 代表序列进行比对，并在不同分类水平上注

释其群落的物种信息［21-24］

。

2　结果与分析

2. 1　土壤养分分析

由表 1 可知，本研究中土壤样品整体偏弱酸

性（pH 5.1~5.4），非栽参土壤（pH 5.4）相较于栽

参农田土壤略有改观，但仍未达到人参最适生长

pH（5.5~6.5）。随栽培年限增加，土壤 pH 变化极

小；土壤电导率呈现先升高后降低、再升高再降低

的波动性变化；土壤有机质、总碳、总氮、全磷和

全钾的含量均大致呈现降低趋势；土壤碱解氮的

含量呈先降低后上升再降低趋势，在人参栽种

3 年后达到峰值（240.42 mg/kg），人参栽种 5 年后

降至 176.90 mg/kg；土壤有效磷和速效钾的含量

随栽培年限增加两者的变化趋势一致，均呈先降低

后升高趋势，栽种 4 年后最低（88.01 mg/kg 和

154.77 mg/kg），栽种5年后突然升高（166.79 mg/kg

和606.62 mg/kg）。

257

第89页

吉林农业大学学报 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 2　土壤微生物量分析

由不同土壤样本三类微生物的统计结果可知

（表 2），在土壤样本中细菌是土壤环境中最主要

的微生物，占据三者总量的83.51%~90.98%；随着

栽培年限的增加，真菌在土壤环境中占据的比例

逐渐增加，且不同栽培年限下其含量具有显著性

差异（P<0.05）；土壤细菌含量随栽培年限的增加

呈逐渐降低的趋势，栽参土壤细菌含量显著低于

非栽参土壤（P<0.05），栽培3年与栽培4年的土壤

细菌含量差异不显著（P>0.05）；土壤放线菌的含

量随栽培年限的增加，其在土壤环境中的比例呈

先升高后降低趋势，而含量呈逐渐降低趋势，非栽

参土壤放线菌含量显著高于栽参土壤（P<0.05），

栽培 2年与栽培 3年的土壤放线菌含量差异不显

著（P>0.05），栽培4年与栽培5年的土壤放线菌含

量差异不显著（P>0.05）。

研究发现（表 3），供试土壤真菌丰富度指数

随栽培年限的增加呈逐渐升高趋势，细菌丰富度

指数呈逐渐降低趋势，放线菌丰富度指数呈逐渐

降低趋势。供试土壤的整体微生物丰富度指数随

栽培年限的增加呈逐渐降低趋势，其中非栽参土

壤微生物丰富度指数最高（1.21），栽培5年后土壤

微生物丰富度指数最低（0.87）。

表1 土壤pH、电导率及养分分布

Table 1 Soil pH， electrical conductivity and nutrient distribution

处理

SPck

SP2

SP3

SP4

SP5

pH

5.43±0.03a

5.12±0.51b

5.11±0.44b

5.22±0.11b

5.21±0.26b

电导率/

(μS·cm-1

)

50.19±0.32d

103.19±0.28b

88.80±0.22c

128.04±0.06a

90.51±0.36c

有机质/

(g·kg-1

)

56.47±0.66a

45.41±0.02b

55.09±0.51a

42.92±0.24c

42.93±0.37c

总碳/

(g·kg-1

)

20.77±0.33d

24.39±0.17b

28.12±0.12a

22.90±0.39c

23.34±0.19bc

总氮/

(g·kg-1

)

3.43±0.55a

2.83±0.42c

3.08±0.11b

2.72±0.09c

2.71±0.20c

全磷/

(g·kg-1

)

0.48±0.12a

0.37±0.22c

0.47±0.07a

0.31±0.11d

0.43±0.06b

全钾/

(g·kg-1

)

9.62±0.77a

9.19±0.62c

9.08±0.59c

9.70±0.69a

9.53±0.08b

碱解氮/

(mg·kg-1

)

223.71±0.13b

211.09±0.05c

240.42±0.16a

185.48±0.43d

176.90±0.59e

有效磷/

(mg·kg-1

)

122.33±0.14b

96.87±0.53c

92.12±0.21d

88.01±0.26e

166.79±0.01a

速效钾/

(mg·kg-1

)

444.44±0.27b

400.31±0.66c

176.19±0.15d

154.77±0.04e

606.62±0.89a

注：表中数据为平均值±标准差（n=3），同列不同小写字母表示在 0.05 水平上差异显著（P<0.05）。下表同

表2　人参根围土壤微生物种类及数量

Table 2 Species and quantity of microorganisms in ginseng rhizosphere soil

处理

SPck

SP2

SP3

SP4

SP5

微生物总数/

(×104

CFU·g

-1

)

519.88

321.04

213.15

180.65

106.26

真菌

数量/(×104

CFU·g

-1

)

0.18±0.05e

1.34±0.14d

2.25±0.23c

3.35±0.38b

4.26±0.24a

比例/%

0.03

0.42

1.06

1.85

4.00

细菌

数量/(×106

CFU·g

-1

)

4.73±0.19a

2.78±0.11b

1.78±0.09c

1.59±0.06c

0.92±0.25d

比例/%

90.98

86.59

83.51

88.02

86.58

放线菌

数量（/ ×105

CFU·g

-1

）

4.67±0.89a

4.17±0.36ab

3.29±0.36b

1.83±0.12c

1.00±0.21c

比例/%

8.98

12.99

15.43

10.13

9.41

表3　土壤微生物丰富度指数

Table 3 Soil microbial richness index

处理

SPck

SP2

SP3

SP4

SP5

独立指数

真菌

0.08

0.59

0.99

1.47

1.87

细菌

2.00

1.18

0.75

0.67

0.39

放线菌

1.56

1.39

1.10

0.61

0.33

综合指数

1.21

1.05

0.95

0.92

0.87

258

第90页

王天佑，等：栽培年限的增加对人参根区土壤养分及微生物群落结构的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3　土壤因子相关性分析

由表 4 可知，具有统计学意义的相关系数（≥

0.2）数据占到全部相关系数的 84.62%，其中土壤

pH与土壤电导率呈显著负相关（P<0.05），与总氮

及细菌的含量呈显著正相关（P<0.05），与土壤全

钾含量呈极显著正相关（P<0.01）；土壤电导率与

土壤有机质、总碳和细菌含量呈显著负相关（P<

0.05），与土壤真菌含量呈显著正相关（P<0.05），

与土壤总氮以及全磷含量呈极显著负相关（P<

0.01）；土壤有机质含量与土壤总碳、总氮、全磷以

及碱解氮含量呈极显著正相关（P<0.01），与土壤

真菌含量呈显著负相关（P<0.05），与土壤细菌以

及放线菌含量呈显著正相关（P<0.05）；土壤总碳

含量与土壤总氮、全磷以及碱解氮含量呈极显著

正相关（P<0.01），与土壤放线菌含量呈显著正相

关（P<0.05）；土壤总氮含量与土壤全磷、碱解氮以

及放线菌含量呈显著正相关（P<0.05），与土壤真

菌含量呈极显著负相关（P<0.01），与土壤细菌含

量呈极显著正相关（P<0.01）；土壤全磷的含量与

碱解氮含量呈显著正相关（P<0.05）；土壤碱解氮

的含量与土壤真菌含量呈显著负相关（P<0.05），

与放线菌含量呈显著正相关（P<0.05）；土壤速效

钾含量与土壤细菌含量呈显著负相关（P<0.05）；

土壤真菌含量与土壤细菌以及放线菌含量呈极显

著负相关（P<0.01）；土壤细菌含量与土壤放线菌

含量呈极显著正相关（P<0.01）。

2. 4　下机数据分析

5 个土壤样品 16S rDNA V3-V4 区测序后，对

其下机数据进行筛选，共得到 437 653 条优质序

列，其中 99.79% 分布于 400~440 bp；将优质序列

用聚类的方式生成 OTUS，以 97% 的相似水平为

标准，共产生 3 727个 OTU，经过抽平处理后剩余

3 694 个，其中 SPck~SP5 独有的 OUT 个数分别为

705，22，49，50，69，5 个样本中有 876 个 OUT 发生

重叠（图1-A）。

5 个土壤样品进行 ITS1 测序后，通过筛选得

到 429 137 条优质序列，其中 88.73% 分布于 200~

260 bp；以同样的方法将优质序列生成 OTUS，共

产生1 342个OTU，经过抽平处理后剩余1 335个，

其中 SPck~SP5 独有的 OUT 个数分别为 144，45，

56，112，62，5 个样本中有 233 个 OUT 发生重叠

（图1-B）。

表4 土壤因子间的皮尔逊相关性分析

Table 4 Pearson correlation analysis between soil factors

吉林农业大学学报2024年第2期

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