33

片较小，隆起，裂片峰较尖凸，果皮韧。果实较大，

平均单果质量 22.6 g，果实平均横径 3.40 cm、纵

径 3.30 cm，果皮厚 0.48 mm、质量 3.35 g，果肉较厚，

果实较硬，白蜡色，肉爽脆，汁液中，风味适甜，

有微香；TSS 含量 19.8%，可食率 75%。种子平

均质量 2.30 g，平均横径 1.48 cm、纵径 1.85 cm，

种子椭圆形，无焦核果。果实适宜采摘期为 7 月

5—15 日。树龄不详，树高 5.1 m，干周 140 cm，

冠幅南北 5.3 m× 东西 4.5 m，产量 40~50 kg，树

姿开张型，树冠不规则，生境溪边、山地下坡位，

树势旺，病虫害少，无环割历史。

2.3 古荔枝树资源调查

调查发现，当地古荔枝树大多分布在村落的

房前屋后、溪边河边、近山脚处，并且大多表现

为树体高大、枝叶繁茂、树冠不规则形，二级分

枝数多，有的紧凑、有的舒展，大部分均在幼树

时被嫁接换种过但未曾砍枝矮化，有一些已表现

出树势衰弱甚至干枯，产量大多中等偏下，仅部

分有人管理状态。相较于实生树而言，古树的果

实类型比较单一且品质优，多是‘糯米糍’‘桂

味’‘怀枝’，仅极少数古树未被嫁接过的果实

仍保留有实生树果实的性状特征。

2.3.1 古荔枝树立地环境 分析 18 个样本地的立

地条件（表 4、图 4~ 图 5），平均分布海拔约 130 m，

最低海拔 75 m、最高海拔 180 m，有 14 个样本地

海拔在 100 m 以上。坡位上，分布在下坡位的最

多（10 个），其次是中坡位（8 个），没有选取

上坡位的样地，也没有发现有分布在上坡位置的

表 4 广东增城兰溪 115 株古荔枝树的 18 个样本地的基本特征

Table 4 Basic characteristics of 18 sampling sites of 115 ancient litchi trees in Lanxi, Zengcheng, Guangdong Province

地点

Locaton

样本地

Sample site

海拔

Altitude (m)

坡位

Slope position

生境

Habitat

土壤类型

Soil type

地点

Location

样本地

Sample

site

海拔

Altitude

(m)

坡位

Slope position

生境

Habitat

土壤类型

Soil type

山吓村

Shanxia Village

SX1 105 下坡位 丘陵 黄壤 楼地村

Loudi Village

LD1 75 下坡位 溪边 红砂

SX2 120 中坡位 山地 红壤 LD2 85 中坡位 平地 黄壤

啤下村

Pixia Village

PX1 90 下坡位 河边 砂质 通坑村

Tongkeng Village

TK1 160 中坡位 山地 红砂

PX2 100 下坡位 溪边 砂质 TK2 180 中坡位 山地 红壤

PX3 110 下坡位 平地 红壤 TK3 150 下坡位 平地 砂壤

新村

Xincun Village

XC1 150 中坡位 山地 红壤

水美村

Shuimei Village

SM1 90 下坡位 河边 砂壤

XC2 140 下坡位 平地 黄砂 SM2 120 下坡位 平地 黄壤

XC3 180 中坡位 山地 红砂 SM3 100 下坡位 溪边 砂壤

XC4 180 中坡位 山地 黄壤 SM4 150 中坡位 山地 砂壤

A、F：山地石缝；B：平地草丛；C~D：山地黄壤；E：山涧小溪

A, F: Stone crevices in the mountain; B: Grass in the flat ground; C-D: Yellow soil in the mountain; E: Quebrada

图 4 广东增城兰溪古荔枝树分布生境

Fig. 4 Distribution habitat of ancient litchi trees in Lanxi, Zengcheng, Guangdong Province

34

表 5 广东增城兰溪古荔枝树性状特征

Table 5 Characteristics of ancient litchi trees in Lanxi, Zengcheng, Guangdong Province

地点

Location

统计量（株）

Quantity

(plant)

干高

Trunk height

(cm)

干周

Trunk girth

(cm)

树高

Tree height

(m)

树姿

Tree gesture

冠幅

（N·S×E·W）

Crown diameter (m)

一级分枝 Primany branches

数量

Quantity

粗度

Girth (cm)

山吓村 Shanxia village 9 40~500 210~410 7.0~25.0 多直立 （5.0×8.3）~（17.0×19.5） 2~5 110~230

楼地村 Loudi Village 15 0~250 165~340 5.8~12.4 多开张 （9.0×7.0）~（14.5×16.0） 2~5 100~290

啤下村 Pixia Village 11 45~450 178~245 6.0~10.5 开张 （8.5×8.5）~（16.0×14.0） 2~5 90~215

新村 Xincun Village 12 40~400 165~255 6.5~14.0 多半开张 （10.0×10.0）~（16.0×14.0） 2~4 85~170

通坑村 Tongkeng Village 24 45~450 130~310 4.7~14.0 多半开张 （3.0×5.0）~（16.0×17.0） 2~7 95~230

水美村 Shuimei Village 44 30~450 135~410 5.0~15.0 多半开张 （5.0×7.0）~（17.0×18.0） 2~5 40~180

平均 Average 16 170 220 9.8 - （11.5×12.0） 3 120

古树；所处的生境环境最多是山地（7 个），其

次是平地（5 个），其余分布在溪边（3 个）、河

边（2 个）、丘陵（1 个）；土壤类型以砂质土最

多（10 个），其次是红壤土（4 个）和黄壤土（4 个）。

2.3.2 古荔枝树生物学特点 由表 5 可知，115

株古荔枝树中统计数量最多的是水美村（44 株），

其次是通坑村（24 株）；树干高度最低 40 cm、

最 高 500 cm， 平 均 170 cm； 干 周 135~410 cm，

平均 220 cm；树高 5~25 m，平均 9.8 m；树体姿

势有直立、半开张或开张型；平均冠幅南北 11.5

m× 东西 12.0 m，最小冠幅南北 5.0 m× 东西 8.3 m，

最大冠幅南北 17.0 m× 东西 19.5 m；一级分枝数

有 2~5 条，平均 3 条；一级分枝粗度在 110~290

cm，平均 120 cm。此外，古荔枝树的花期多在 3

月下旬至 4 月上旬，成熟期在 6 月下旬至 7 月中旬。

较高海拔的相对要早开花、早成熟。在同等光照

条件下，已开花古荔枝树的保花保果能力较强于

其他荔枝树，并且其花穗明显比其他荔枝树的花

穗更长、更疏松。但由于缺乏管理，其大小年明

显和产量不稳定，有的甚至多年不结果。

图 5 广东增城兰溪部分古荔枝树及果实

Fig. 5 Some ancient litchi trees and fruits in Lanxi, Zengcheng, Guangdong Province

2.3.3 古荔枝树生长势及产能 从表 6 荔枝生长

势及生产能力看，树体生长势弱、中等或强的

各有 13、32、70 株，分别占比 11.3%、27.8%、

60.9%；生产能力上，下坡位、平地红壤生境类

型的产量最高（250~300 kg/株），其次是下坡位、

河边砂壤生境类型（200~250 kg/株），再次是中

坡位、山地黄壤生境类型（150~200 kg/株），样

地在中坡位、山地红壤和山地砂壤的产量最低

（25~50 kg/ 株）。从果实品种上看，每个样地的

古荔枝树均有优质品种‘桂味’和‘糯米糍’，

询问地方果农，推测优质品种的嫁接换种时期多

是在树苗时期进行。古树生长至今，嫁接口痕迹

已经消失，接穗能够稳定遗传表现在果实上。地

方果农认为，同一品种在同一栽培条件下，古树

的果实品质要高于非古树。从早期荔枝种植阶段

分析，古树嫁接的是优质品种‘糯米糍’和‘桂味’，

表明广东增城兰溪在历史上便朝着优产区的方向

发展，是增城兰溪荔枝兴旺发展的重要原因之一。

此外，16 个古树样地存在着数量分布不均的实生

果实类型。

35

3 讨论

荔枝是我国南方第二大经济水果，在推动地

区农业经济发展、农民增收、农业文化传承等方

面具有不可替代的作用［26-27］。广东荔枝总产量

占全国总产量的 50%，而增城是中晚熟优质产区，

常规年份产量稳定在 4 万 t 左右，年销售额可达

10 亿元以上。增城荔枝以优质闻名，历史上最高

拍卖价格的水果‘增城挂绿’便出自增城，这离

不开增城地区优越的地理位置［16,20,28］。比较前人

研究结果，文英杰等［29］总结了近 20 年来荔枝种

质资源收集保存现状，截至 2022 年 12 月 31 日，

国家果树种质广州荔枝香蕉圃共保存荔枝种质资

源 652 份，主要来源于广东、海南、广西和云南

等地；编目入圃保存总数 375 份，但其中野生资

源仅 22 份、占编目入圃的 5.8%；入圃的各类特

色资源有 15 份，其中特大果种质资源 5 份、特迟

熟种质资源 5 份、异季结果 2 份、单性结果资源

3 份。胡福初等［30］对 120 份荔枝种质资源进行矮

化分类，将枝梢、叶片等 8 个形态指标作为矮化

相关形态指标，利用除叶片厚度外的 7 个指标将

其划分成 5 个矮化等级，筛选出‘糯米糍’‘庙

种糯’‘紫娘喜’等矮化品种 9 份。Sun 等［31］

将分子标记与表型农艺性状（16 个）相结合，

用以构建来自 6 个不同区域的 96 份荔枝资源的

核心种质资源，结果表明仅使用分子标记方法在

构建核心种质过程中的代表性要低于分子标记与

表型农艺性状相结合的方法。与上述文献资料比

较，发现此次调查与评价的 26 份实生荔枝单株

中， 编 号 17-XC712、9-TK707、18-SM713、22-

SX712、26-SM714、24-XC715 的果实特性符合资

源类型评价上的特色资源或优质资源类型，这对

当下存在的果实留树期短、果实产期集中、不同

熟期优质品种缺乏等荔枝产业问题提供了很好的

育种材料，具有一定的实用价值和研究意义，下

一步可以采集其接穗作为特色资源保存并持续跟

踪调查。

古荔枝树资源最北分布地点位于四川岷江下

游地区［32］。刘忠等［32］调查了岷江下游四川地区

的古荔枝树，发现有 6 个古荔枝树分布点合计有

658 株，其中偶有分布点单独存在 1 株或 2 株，

他们依据果实综合性状将古树分成 6 类；研究者

进一步分析古荔枝树的生物学特点和生产能力，

发现其普遍生产能力低、果实品质中等偏下，最

高产量不超过 100 kg，焦核率最高仅 30.4%，这

与本研究中调查结果的古荔枝树生物学特点和生

产能力不相匹配，可能是品种、生境等差异性原

因导致。此外，刘忠等［32］测量树干周最大达到

308 cm，访谈当地老人认为古树树龄最大有 1 000

年以上，其推测最大树龄应该 300 年以上；然而，

位于福建的“宋香”古荔枝树树干周达到 710

cm，树龄也仅 1 250 年；本研究调查的古树最大

干周是 410 cm，但地方口传树龄有 1 600 年以上，

刘忠等［31］研究与本研究中访谈结果得到的古荔

枝树树龄偏大，可能是民间对古树树龄认识不清、

老人文化程度不高，导致存在夸大树龄的现象。

结合上述分析，推测增城兰溪荔枝古荔枝树龄大

多介于 100~500 年，最大不超过 1 000 年［13, 32］。

此外，调查发现增城古荔枝树数量庞大，大部分

有管理的古荔枝树产量高于青壮年树，但由于树

表 6 广东增城兰溪古荔枝树生长势及生产能力

Table 6 Growth potential and productivity of ancient litchi trees in Lanxi, Zengcheng, Guangdong Province

样本地

Sample site

树势（株）

Tree growth potential (plant)

产量

Yield

(kg)

果实品种

Fruit variety

样本地

Sample site

树势（株）

Tree growth potential (plant)

产量

Yield

(kg)

果实品种

Fruit variety

弱 中等 强 弱 中等 强

SX1 1 2 2 125~150 G、N、S LD1 2 2 3 100~125 G、N、H、S

SX2 0 2 2 50~75 G、N、S LD2 1 2 4 125~150 G、H、S

PX1 3 0 1 125~150 G、N、H TK1 1 0 7 25~50 G、N、H、S

PX2 0 0 3 75~100 G、N、H、S TK2 0 0 8 150~200 G、N、H、S

PX3 0 1 3 250~300 G、N、H、S TK3 1 1 6 125~150 G、N、H、S

XC1 0 1 2 25~50 G、N SM1 1 3 6 200~250 G、N、H、S

XC2 0 0 3 50~75 G、N、S SM2 0 6 4 150~200 G、N、H、S

XC3 0 2 1 125~150 G、N、H、S SM3 2 4 6 150~200 G、N、H、S

XC4 0 0 3 150~200 G、N、H、S SM4 1 5 6 25~50 G、N、H、S

注：G、N、H、B 分别代表‘桂味’‘糯米糍’‘怀枝’实生荔枝。

Note: The distribution of G，N，H and S represent ‘Guiwei’ ‘Nuomici’ ‘Huaizhi’ and seeding-litchi,respectively.

36

体大多高达 8 m 以上，采摘难度大，因此出现大

量弃果或无法采摘现象，没有发挥相应的经济价

值。在栽培技术方面，Li 等［33］系统调查了广东

和广西 567 户不同种植规模的果农，分析了其对

采用荔枝高接换种技术的影响因素，结果表明种

植规模越小的农户相对更少采用荔枝高接换种的

技术来更新品种，这与增城兰溪散户管理为主导

致的古荔枝树体高大、品种较单一的原因相符。

通过对古树适度的矮化管理，借鉴广州从化“家

庭订树”的旅游销售模式［34］，可以减少农户在

荔枝采收季的采摘难度，并能充分发挥出古荔枝

树果实品质更优的特点。基于此，下一步计划是

及时收集和保存实生荔枝种质资源，加强对这些

优异资源的研究和利用，向地方群众做好科普宣

传的工作；对古荔枝树开展更为全面的资源调查，

力图探索出一条适合当地长远发展的农业模式，

将资源优势转化为提高农民收入的经济效益，为

当地荔枝产业注入新动力。

4 结论

本研究对广东省广州市增城区 6 个自然村展

开荔枝种质资源系统调查，收集了 160 份包含实

生荔枝资源及古荔枝树资源信息，测定、描述和

鉴定评价了 26 份实生荔枝资源，依据果实特性鉴

定评价出 6 份特异性或优异实生荔枝种质资源，

其果实分别具有焦核率高（93%）、留树期长、

熟期较早、果皮紫色、浓香味、口感特异等特点。

抽样调查了 18 个地块的古荔枝树资源，收集到

115 株古荔枝树的生物学特点信息，结果表明古

树果实类型比较单一，以‘糯米糍’‘桂味’‘怀枝’

优质品种为主；树体最大高度 25 m、平均高度 9.8

m，最大干周 410 cm、平均干周 220 cm，平均冠

幅南北 11.5 m× 东西 12.0 m，古树树龄大多介于

100~500 年，估测最大不超过 1 000 年；古树产量

表现较好，分布在下坡位山脚和平地的产量较高，

大多 100 kg、最高可达 300 kg。本研究挖掘的 6

份优异性种质资源可能对荔枝种业的发展有较大

潜力，可为当地荔枝产业发展及科学研究提供材

料和参考依据。

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（责任编辑 张辉玲）

李建国，博士，二级研究员，

博士生导师，国务院特殊津贴专家，

“百千万人才工程”国家级人选，

被授予“有突出贡献中青年专家”

荣誉称号，全国农业科研杰出人才，

国家科技进步二等奖、广东省五一

劳动奖章和广东省丁颖科技奖获得

者，国家荔枝龙眼产业技术体系岗

位专家。现任广东省荔枝工程技术中心副主任，兼任中国园

艺学会热带亚热带果树分会秘书长、广东省园艺学会荔枝龙

眼科技协会会长。在荔枝果实发育调控机理与高效栽培技术

创新方面取得卓越成绩，主持的“荔枝高效生产关键技术创

新与应用”项目获国家科技进步二等奖。发表学术论文 130

多篇，其中以第一或通信作者在《Nature Genetics》《New

Phytologist》《Plant Journal》《 Journal of Experimental

Botany》《Horticulture Research》等 SCI 期刊发表学术论文

30 余篇；主编出版《荔枝学》《中国果树科学与实践 荔枝》

专著 2 部。主持研制香蕉和番木瓜 DUS 测试国家标准各 1 项；

主持选育荔枝新品种 2 个、香蕉新品种 1 个。

收稿日期：2023-07-27

基金项目：广东省重点领域研发计划项目（2020B02022001）；广东省乡村振兴战略专项资金种业振兴项目

（2022-NJS-00-005）；国家自然科学基金（32272713）

作者简介：金庆敏（1986—），女，硕士，助理研究员，研究方向为蔬菜分子育种与分子生物学，E-mail：

dzjinqingmin@126.com

通信作者：王瑞（1984—），女，硕士，副研究员，研究方向为蔬菜育种与分子生物学，E-mail：wrui_1999@163.com

广东农业科学 2023，50（9）：39-48

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.004

金庆敏，林毓娥，吴廷全，钟玉娟，王瑞 . 50 份黄瓜核心种质的 SSR 标记筛选与聚类分析［J］. 广东农业科学，2023，

50（9）：39-48.

50 份黄瓜核心种质的 SSR 标记筛选与聚类分析

金庆敏 1,2，林毓娥 1

，吴廷全 2

，钟玉娟 1

，王 瑞 2

（1. 广东省农业科学院蔬菜研究所 / 广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640；

2. 广东省农业科学院设施农业研究所，广东 广州 510640）

摘 要：【目的】分析 50 份来自全国各地的黄瓜核心种质资源的遗传多样性，为黄瓜育种提供依据和参考。【方

法】对 50 份黄瓜核心种质资源的重要外观农艺性状进行统计，并利用全基因组设计 66 对 SSR 引物对其进行分

子标记筛选及遗传多样性聚类分析。【结果】供试 50 份黄瓜核心种质材料的瓜皮颜色、刺瘤、瓜皮斑纹具有多

样性。66 对引物中有 32 对引物能够在不同黄瓜种质间扩增出清晰而稳定的多态性标记，这 32 对 SSR 引物共扩

增出 280 个等位基因片段，其中多态性片段 216 个、占片段总数的 77.1%，表明本研究筛选出的 32 对 SSR 引物

遗传多态性较高，适用于黄瓜种质材料的遗传多样性分析。聚类结果与所调查的种质资源性状表现结果较为一致。

50 份黄瓜核心种质遗传相似系数最低为 0.62、最高达 1.00。在遗传相似系数 0.754 处，50 份黄瓜种质材料聚为 7 类，

即 9 份华南型材料聚为 6 类：I 类、III 类、IV 类、V 类、VI 类、VII 类，其中 IV 类包含 1 份中间材料与 9 号华

南型材料；40 份华北型黄瓜材料聚为 1 类：II 类。表明华北型黄瓜材料和华南型黄瓜材料间相似系数低、亲缘

关系远；华北型黄瓜材料间相似系数高、亲缘关系近、遗传背景窄、遗传多样性差；而华南型黄瓜材料间相似

系数较低、亲缘关系较远、遗传背景宽、遗传多样性丰富。【结论】筛选出 32 对 SSR 引物可有效对 50 份黄瓜

核心种质材料进行聚类分析，遗传相似系数为 0.754 处 50 份黄瓜材料聚为 7 类，其结果与性状调查结果相吻合；

华北型黄瓜遗传背景窄、遗传多样性差，华南型黄瓜遗传背景相对较宽，遗传多样性丰富。

关键词：黄瓜；核心种质；SSR 标记；多态性分析；聚类分析；遗传多样性

中图分类号：S642.9 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2023）09-0039-10

Screening of SSR Markers and Cluster Analysis

in 50 Cucumber Core Germplasms

JIN Qingmin1,2, LIN Yu’e1

, WU Tingquan2

, ZHONG Yujuan1

, WANG Rui2

（1. Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory for

New Technology Research of Vegetables, Guangzhou 510640, China; 2. Institute of Faclity Agriculture,

Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China）

Abstract: 【Objective】This study aims to analyse the genetic diversity of 50 cucumber core germplasm resources

from all over the countryto provide a basis and reference for cucumber breeding. 【Method】 In this study, 66 pairs of SSR

primers were designed to screen 50 cucumber materials for molecular markers and cluster analyses of genetic diversity.

【Result】50 cucumber core germplasms tested showed diversity in rind color, papilloma, and fruit stripe. The results

showed that 32 of the 66 primer pairs were effective to amplify clear and stable polymorphic markers among different

40

【研究意义】黄瓜（Cucumis sativus L.）是

世界各国普遍栽培的重要蔬菜作物之一［1-2］。我

国黄瓜种植面积约占世界种植总面积的 50% 以

上，黄瓜产量及种植规模均为世界第一［3-5］。此外，

黄瓜一年内可多茬栽培，供应时间长，经济价值

高，黄瓜产业在我国蔬菜中占有重要地位［1,6］。

目前市场上黄瓜品种众多、遗传背景狭窄、品种

间相似性高［7-8］，广泛收集黄瓜优质种质资源，

并进行系统的鉴定、评价、分类和保存，对黄瓜

新品种的选育、种质资源的保护及育种工作者

权益的维护均具有重要意义［9］。【前人研究进

展】随着生物科学的进步，SSR（Simple sequence

repeat）分子标记已成为一种较为成熟的生物技

术，可快捷有效地对主要作物及主要蔬菜种质资

源遗传背景进行分析及鉴定［10］，有助于研究植

物亲缘关系［11］。SSR 分子标记技术在水稻［12］、

小麦［13］、玉米［14］、油菜［15］、辣椒［16-17］、茄

子［18］、大白菜［19-20］、芥菜［21］、菜心［22］、黄

瓜［3,23-26］、苦瓜［27-28］、节瓜［29］、南瓜［30］、大

蒜［31］等多种作物中均有广泛应用。近年来，SSR

分子标记技术在黄瓜种子纯度鉴定［23,32-34］、种质

资源多样性分析［9,35］、重要功能基因定位等方面

发挥了重要作用［36-37］。Danin 等［38］利用 SSR 标

记研究了不同葫芦科蔬菜品系的多态性，发现 7

个 SSR 中有 4 个可用于黄瓜品系的多态性检测，

并在 11 个黄瓜品种上进行了验证。陈劲枫等［11］

综 合 109 个 SSR 位 点 和 398 个 RAPD 条 带 对 22

份黄瓜材料进行聚类分析，结果发现可分为两类：

CS 群（C. hytivus、黄瓜、西南野黄瓜 C. sativus

var. hardwickii 及野黄瓜 C. hystrix）和 CM 群（非

洲角黄瓜 C. metuliferus、甜瓜、菜瓜 C. melo var.

conomon 及野生小甜瓜 C. melo ssp. agrestis）。沈

镝等［39］利用 13 对来自黄瓜和甜瓜的 SSR、ESTSSR 引物，对 273 份西双版纳黄瓜种质群体进行

遗传分析，发现遗传不同样本、不同种质以及不

同来源地群体间均存在一定程度的差异。吕婧

等［40］通过来自不同国家和地区的 30 份代表性黄

瓜种质资源进行 SSR 扩增分析，发现 23 对引物

可以清晰检测出亚洲、欧美和印度群体遗传多样

性，较客观地反映了黄瓜群体结构和地域性差异

等信息。王蕾等［3］以来源不同的 32 份黄瓜栽培

品种为材料，利用筛选出的 17 对 SSR 引物构建

指纹图谱和分析遗传多样性，结果表明这 17 对引

物能有效区分出所有供试材料，在遗传相似系数

（GS）为 0.760 处可将 32 份黄瓜品种聚为 5 类。【本

研究切入点】目前黄瓜品种众多，但对黄瓜核心

种质资源遗传多样性的了解尚不充分。为进一步

了解本课题组所收集黄瓜种质资源的多样性，明

确黄瓜种质资源的遗传背景、分析其多态性及各

黄瓜材料之间的亲缘关系，促进黄瓜种质资源的

利用，本研究通过筛选有效的 SSR 标记来评估和

描述黄瓜核心种质资源的遗传多样性。基于筛选

cucumber core germplasms, and the 32 pairs of SSR primers amplified a total of 280 allelic fragments, of which 216 were

polymorphic, accounting for 77.1% of the total fragments. It indicated that 32 pairs of SSR primers screened have high genetic

polymorphism and are suitable for genetic diversity analysis of cucumber germplasm materials. The clustering results were

consistent with the results of the investigated germplasm resources. The lowest genetic similarity coefficient of 50 cucumber

core germplasms was 0.62, and the highest was 1.00. At the genetic similarity coefficient of 0.754, 50 cucumber germplasm

materials were clustered into 7 groups, that is, 9 South China type materials were clustered into 6 groups: I, III, IV, V, VI, VII,

of which IV included one intermediate material and No.9 South China type material. 40 North China cucumber materials were

clustered into one class: class II. This indicated that the similarity coefficient between North China type cucumber materials and

South China type cucumber materials was low and the genetic relationship was far. The cucumber materials of North China type

had high similarity coefficient, close genetic relationship, narrow genetic background and poor genetic diversity. The similarity

coefficient between the South China cucumber materials is low, the genetic relationship is far, the genetic background is wide,

and the genetic diversity is rich.【Conclusion】32 pairs of SSR primers were screened out, which could effectively cluster the

50 cucumber core germplasm materials. The 50 cucumber materials at the genetic similarity coefficient of 0.754 were clustered

into 7 groups, and the results were consistent with the results of trait investigation. In addition, the genetic background of North

China cucumber is narrow with poor genetic diversity. The genetic background of South China cucumber is relatively wide with

rich genetic diversity .

Key words: cucumber; core collection; SSR marker; polymorphism analysis; cluster analysis; genetic diversity

41

得到的 SSR 标记，对黄瓜核心种质资源进行聚类

分析，探索黄瓜核心种质资源之间的遗传关系及

群体结构，深入了解不同种质资源之间的相似性

和差异性，并揭示潜在的优良基因组合，为黄瓜

育种和种质资源保护提供重要参考和指导。【拟

解决的关键问题】本研究通过黄瓜基因组共设计

了 995 对 SSR 引物，从中筛选出 66 对引物对 50

份黄瓜核心种质资源的 11 个重要外观果实性状

进行调查，并通过 SSR 分子标记分析对 50 个黄

瓜核心种质进行聚类分析，以了解黄瓜种质资源

间的遗传相似性和差异性，分析其相关基因型、

群体结构及可能的亲缘关系，为黄瓜遗传改良和

种质资源管理及保存提供科学依据，为广东乃至

华南地区高品质黄瓜遗传育种组合提供重要理论

参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为广东省农业科学院蔬菜研究所收

集的来自全国各地的 50 份黄瓜核心种质，其中

华北型 40 份、华南型 9 份、华南型与华北型杂交

的中间型黄瓜材料 1 份。50 份种质材料均挑选 25

粒颗粒饱满且一致的种子，于 2021 年 2 月中旬浸

种催芽，播种于穴盘育苗；3 月上旬（长出 1~3

片真叶）移栽于该所白云基地。每份材料选取生

长一致的 20 株进行种植，采用深沟高畦，畦宽

1.8~2.0 m，畦高 30 cm，株距 30 cm，栽培管理按

常规进行。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 黄瓜核心种质的农艺性状调查 在黄瓜盛

果期对 50 份黄瓜种质材料进行性状调查统计，对

瓜型、瓜把性状、皮色、瓜斑纹、刺瘤、性型、

叶色等 11 个性状进行调查和登记。瓜型分为圆筒

型、棒型、短棒型、纺锤型等；瓜把性状分为钝圆、

溜肩、瓶颈型；皮色分为绿色、深绿、浅绿、乳白、

墨绿；瓜斑纹分为块状、条状或无；斑纹色分为

绿、黄或无；瓜斑纹分布分为顶部、底部或无；

瓜刺瘤大小分为中、小或无；瓜刺瘤密度分为稀、

密或无；瓜刺颜色分为白色或褐色；性型分为雌

雄株、雌全株、强雌株；叶色分为绿、深绿。分

类依据分参照李锡香等编著的《黄瓜种质资源描

述规范和数据标准》［41］。

1.2.2 黄瓜 DNA 的提取 每份材料随机选取 10

株，每株取嫩叶一片，混合后于研钵中加液氮

研磨，DNA 的提取参考姚春鹏等［42］ 改良版的

CTAB 提取方法。DNA 样品检测时各取 DNA 样品

原液 2 μL 并稀释至 100 μL，取稀释后的 DNA 样

品 1 μL，用 ddH2

O 作为空白对照，校正零点，

于核酸蛋白分析仪上测定 OD260、OD280 的值。取

5 μL 模板 DNA 原液，加入 2 μL 上样缓冲液，在

加入 Golden-View 染料的 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳，

电泳缓冲液为 1×TBE，电压为 5 V/cm，稳压电

泳 20 min，然后于凝胶成像系统下观察拍照。

1.2.3 SSR 分子标记的选择 在黄瓜基因组数据

库网站（http://www.cucurbitgenomics.org/）下载黄

瓜已经公布的 SSR 分子标记序列，设计 995 对

SSR 引物送生工生物公司合成，从中筛选出 66 对

SSR 引物对 50 份黄瓜种质资源进行遗传多样性分

析。选取表现形式差异大的 10 份黄瓜 DNA 样品

用于分子标记筛选，选用稳定性好、条带清晰且

多态性好的引物序列。

1.2.4 PCR 反应体系和扩增程序 PCR 扩增体系

为 20 μL 反应体系：2 μL 10×buffer，2 μL dNTPs（2.5

mmol/L），1.5 μL Mg2+（20 mmol/L），0.4 μL

上下游混合引物（10 mmol/μL），0.2 μL Taq DNA

聚合酶（5 U/μL），2 μL DNA 模板（50 ng/μL），

11.9 μL灭菌H2

O。 扩 增 程 序 为 94 ℃ 预 变 性 3

min，94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，

循环 40 次，72℃延伸 10 min。

1.2.5 SSR 标记的凝胶电泳 扩增产物在双垂直非

变性浓度为 8% 的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120 V

稳 压 1.5 h， 电 泳 结 束 后 进 行 0.1% AgNO3

银染

15 min；银染后用 2% NaOH、0.4% 甲醛、0.04%

Na2

CO3 显色，显色后在灯箱上拍照分析。

1.2.6 数据处理 根据电泳图谱进行数据统计与

整理，从上往下对等位基因数量进行统计。对每

个样品的条带，有条带记为“1”，无条带记为“0”，

由此形成 0 和 1 原始矩阵。利用 NTSYS2.10e 软

件进行分析得出遗传相似系数并进行聚类分析，

绘制聚类图。

2 结果与分析

2.1 50 份黄瓜核心种质的性状调查结果分析

对 50 份黄瓜种质资源的 11 个性状调查结果

（表 1）显示，40 份华北型黄瓜种质材料的瓜型

主要为棒型或短棒型，瓜把为溜肩或瓶颈型，条

42

表 1 50 份黄瓜核心种质农艺性状调查结果

Table 1 Results of agricultural traits investigation from 50 cucumber core germplasms

编号

No.

名称

Name

瓜型

Fruit

type

瓜把

形状

Neck

shape

皮色

Rind

color

瓜斑纹

Fruit

stripe

斑纹色

Stripe

color

瓜斑纹

分布

Stripe

distribution

瓜刺瘤

大小

Papilloma

size

瓜刺瘤

密度

Papilloma

density

瓜刺

颜色

Spine

color

性型

Genero

type

叶色

Leaf

color

来源

Origin

类型

Type

1 S-6 圆筒 钝圆 墨绿 无 无 无 无 无 白 雌雄株 深绿 中国台湾 华南型

2 B35-21 圆筒 钝圆 深绿 条 黄 底部 小 稀 白 雌全株 深绿 广东 华南型

3 金山新市 1-8-1 圆筒 钝圆 乳白 无 无 无 小 稀 褐 雌雄株 深绿 广东 华南型

4 吊 1-13-2 圆筒 钝圆 浅绿 块、条 黄 顶、底部 无 无 白 雌雄株 深绿 广东 华南型

5 吊 4-2-5 圆筒 钝圆 浅绿 块、条 黄 顶、底部 无 无 白 雌雄株 深绿 广东 华南型

6 吊 3-1-1 圆筒 钝圆 浅绿 块、条 黄 顶、底部 无 无 白 雌雄株 深绿 广东 华南型

7 冠农 -33-1 圆筒 钝圆 绿 块、条 黄 顶、底部 无 无 白 雌雄株 深绿 广东 华南型

8 33-1-3 短圆筒 钝圆 绿 块、条 黄 顶、底部 无 无 白 雌雄株 深绿 广东 华南型

9 31-0-2 圆筒 钝圆 浅绿 块、条 黄 顶、底部 无 无 白 雌雄株 深绿 广东 华南型

10 B80-3162-5 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 亚蔬中心 华北型

11 Yf-1031-2 棒型 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 深绿 山西 华北型

12 A118-h31-1 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 辽宁 华北型

13 Yjs-2532-1 棒型 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 深绿 广东 华北型

14 A139-321-1 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 亚蔬中心 华北型

15 A34-461141-4 棒型 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 韩国 华北型

16 A69-0-1 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 山西 华北型

17 A28—1333-3 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 深绿 天津 华北型

18 Y17-511175-1 短棒 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 强雌株 绿 四川 华北型

19 A116-11311-3 短棒 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 绿 辽宁 华北型

20 Y22-453443-1 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 广东 华北型

21 Y41-1211-1 棒型 瓶颈型 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 北京 华北型

22 Y25-h34-3 棒型 瓶颈型 绿 条 绿 底部 中 密 白 强雌株 绿 山东 华北型

23 C8-61-1 短棒 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 亚蔬中心 华北型

24 韩 88-214161-1 短棒 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 深绿 韩国 华北型

25 A16-11521-2 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 黑龙江 华北型

26 A50-191-1 棒型 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 北京 华北型

27 X12-5112-（普） 棒型 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 山东 华北型

28 A55-32122-1 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 绿 自有品种 华北型

29 Y13-413-3 棒型 瓶颈型 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 天津 华北型

30 A20-2143-2 棒型 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 山西 华北型

31 G153 短棒 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 绿 辽宁 华北型

32 G341 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 绿 北京 华北型

33 G3101 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 绿 河南 华北型

34 K1313 短棒 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 强雌株 深绿 重庆 华北型

35 G3120 棒型 瓶颈型 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 山东 华北型

36 G335 棒型 瓶颈型 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 广东 华北型

37 K-1570 棒型 瓶颈型 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 北京 华北型

38 G390 棒型 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 河南 华北型

39 G3112 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 绿 广东 华北型

40 G3107 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 绿 辽宁 华北型

41 G333 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 四川 华北型

42 G3123 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 河南 华北型

43 G342 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 北京 华北型

44 K1568 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 重庆 华北型

45 G3121 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 山东 华北型

46 G359 棒型 瓶颈型 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 四川 华北型

47 G338 棒型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 密 白 雌雄株 绿 河南 华北型

48 G3128 棒型 瓶颈型 绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 天津 华北型

49 G353 纺锤型 溜肩 绿 条 绿 底部 中 稀 白 雌雄株 深绿 自有品种 中间型

50 G336 棒型 溜肩 深绿 条 绿 底部 中 中 白 雌雄株 绿 广东 华北型

43

状瓜斑纹、瓜斑纹多为绿色且主要分布在瓜底部，

瓜刺瘤中等大小、密度中等或密、白色瓜刺，大

多为雌雄株（仅 3 份为强雌株），叶片大多为绿

色。9 份华南型黄瓜种质瓜型主要为圆筒型，只

有 1 份为短圆筒型；瓜把较为一致，全部为钝圆

型；皮色较为多样，其中墨绿 1 份、乳白 1 份、

浅绿 4 份、绿色 2 份、深绿 1 份；瓜斑纹块状条

状 6 份、无瓜斑纹 2 份、条状 1 份；瓜斑纹颜色

黄色 7 份，无色 2 份；瓜斑纹分布在顶部及底部

6 份、底部 1 份、无瓜斑纹 1 份；无瓜刺瘤 7 份、

具有小瓜刺瘤 2 份，且瓜刺瘤稀疏；瓜刺颜色与

华北型相同，大多为白色、但有 1 份为褐色；大

多为雌雄株，其中 1 份为雌全株；华南型黄瓜叶

片均为深绿色。中间型黄瓜瓜型为纺锤型，瓜把

形状为溜肩型，果皮绿色，条形绿色瓜斑纹、分

布于底部，瓜刺瘤中等大小但较为稀疏，雌雄株，

叶片深绿。

2.2 66 对 SSR 引物的多态性结果分析

66 对 SSR 引物在 50 份黄瓜核心种质资源进

行多态性检测，共获得 32 对稳定性好、条带清晰、

多态性高的引物（表 2）。本研究中 32 对 SSR 引

物在 50 份种质中共扩增出 280 条等位基因片段，

其中 216 条多态性片段、占片段总数的 77.1%，

平均每对引物产生 6.75 条多态性片段（图 1）。

根据数据统计得到 0-1 矩阵，利用 NTSYS2.10e

软件进行分析得出 50 份黄瓜种质资源最大遗传相

似性系数是 1.00，最小遗传相似性系数为 0.62。

其中，与其他材料相似性最小的为 3 号，是广东

地区的一个地方品种。相似性系数为 1.00 的材料

有 40、41、46，从来源看，41、46 来自四川，40

来自辽宁，虽然地区不同，但是材料相似。从图

1 所示的扩增结果来看，50 份黄瓜核心种质间多

态性非常明显，表明 32 对引物可有效区分种质。

在 所 选 出 的 32 对 引 物 中，4B-05、6B-26、6B27、6B-28、6B-32、6B-39、6B-48、6B-61、

6B-62 等 9 对引物扩增出的多态性片段较少，仅

为 1~3 条，但其在材料间的差异较大，可作为种

质鉴定及种子纯度鉴定的指纹标记引物。

表 2 32 对 SSR 分子标记引物序列信息

Table 2 Sequence information of 32 pairs of SSR molecular marker primers

引物名称

Primer name

正向引物

Forward primer (5'-3')

反向引物

Reverse primer (5'-3')

引物名称

Primer name

正向引物

Forward primer (5'-3')

反向引物

Reverse primer (5'-3')

4B-05 CAACTCCGGTTCAAAAGTTCA TGTCTTCAATGCCCTTTCAG 6B-33 CGATTTTCCAGCATTGATGT TAGTTTTGGGCTTTCGATGG

4B-07 ACACCCCGCTCTAGGTTTTT CCATACAAGGGTGGAATTGTG 6B-35 CGATTGGAAAATATCGGCAC CGAATCGCCTTCAGTTCTTT

4B-10 GGAATGAATAAGTTCTGGAAGAAG CTTCCCATCAAAAAGCCTCA 6B-39 TCAGAGAAATGGAGAGGGAAA CAGGATTTTTGTTTGGGGAA

4B-13 TCTTTTGTTGGTGAAAATTGAAA CCTTCTCATGTGTATTGTCTTTTG 6B-41 TCCAATGATTAGCAGGGTCA TCGATGCGTCTCTTCTGCTA

6B-18 CTATGGGATCTGGCTCTGGA GGGTTCACGCCAGTATTGTT 6B-45 TTCGTTCATCAAAGTTGGGA TTCGTTCATCAAAGTTGGGA

6B-21 TGAAGCAAAGTAACCCCACA CACAAATGGATTACAGAGCGAA 6B-47 GGTTGGAGGTGTTGCTGATT GGCAAAAGGAAAACTCAAAAA

6B-22 ACAATGTTGAGTGGGTGGTT TGGTTCACTGATGATGACCTG 6B-48 GGGGTTCGTTCGATCCTATC TGGGGAAAGTTAGAAGAGGAAA

6B-23 ATTCTCGTGAACCATCACCC ACTTTTGCCACTTGGCACTT 6B-49 CAAAGAGGCCAATTCTCCAG TGGTGGAAGATCAAAGAGGC

6B-24 GGAGCCATTGAAGAACAAGC AAAAGGTCCAACCCAAAACC 6B-50 TTTGAGCCTTGAGGCAAAGT GCAATTCAACGTAATGGGCT

6B-26 GAGGTGGCAGCTGAAAAGAG TTCATTCGAATAACCTGCCTC 6B-52 TCCACTCTTGACCAATTTTGAG CACAAGAGGAAGCTATCGCA

6B-27 ACACCATTTTTCATCGAGATTT GGGATGAGGAGCAAATGGTA 6B-53 TGTCTAACTATTGCTTCCCCG GGACTCGACCCTTCGATTTT

6B-28 CGCTCTCTCTCCACTTTTGG AAAAGTGACCGTTGGAGTGC 6B-54 ATGGAGCCCTAATCACGTTG CCGGCCAAACCCTATAAGAG

6B-29 TTTGAGCAACACTTCGCAAC GCATGTTTTCATGTCATTGGA 6B-61 AAAGCAATTCTCATGTTTTCCC TTCGTCCTATTTGTACGACGTG

6B-30 GATTCTCCGGAAACGGATTT GTCGTTTTCCGCGATTCTAC 6B-62 TTGATAATACTGGGCGGGAG TTGATAATACTGGGCGGGAG

6B-31 GACACCCCATTCCTCATCAT GCTTCATCACTCCCAATTCAG 6B-63 ATACCTTGCCGGAGCCTTAT ACTTTTTCAGCAGAGCAGCC

6B-32 CGTGGCATAAAACCACGAAT TTTCATCAAATTCAACAAAACCC 6B-64 CACTCCTACCTCTCTGTTTTTGG TTTCCAATAATCCCCCATCC

2.3 50 份黄瓜核心种质的聚类结果分析

利用 NTSYS2.10e 软件对多态性片段进行聚

类分析，结果（图 2）表明，50 份黄瓜种质的遗

传相似系数（GS）最低为 0.62，最高达 1.00。

相似系数为 0.620 处，50 份黄瓜种质在聚类

图上聚为 I 类。

相似系数为 0.754 处，50 份黄瓜种质可聚为

7 类：（1）I 类仅包含来源于我国台湾省的 S-6，

果皮墨绿、无瓜斑、白刺的华南型黄瓜材料，是

50 份黄瓜种质材料中唯一果皮墨绿、且既无瓜斑

纹也无刺瘤的材料；（2）II 类包含 40 份材料，

分为两个亚组，包含所有华北型材料，40 份材料

44

瓜型均为棒型或短棒型、瓜把为溜肩型或瓶颈型、

瓜皮为绿色或深绿色、瓜斑纹绿色且位于底部、

均有瓜刺瘤、刺瘤密度中等或密、瓜刺瘤大小均

为中等、叶片颜色绝大部分为绿色；（3）III 类

仅包含华南型 1 份材料，50 份材料中唯一一个性

型为雌全株的是华南型黄瓜中唯一瓜皮色为深绿

色的材料；（4）IV 类包含华南型 1 份、华南型

与华北型黄瓜杂交后中间型材料 1 份，其中中间

型材料是 50 份材料中唯一一份瓜型为纺锤型的材

料，瓜把表现为华北型黄瓜的溜肩型，瓜刺瘤大

小为中型，但瓜刺瘤密度则表现为华南型的稀疏

型；（5）V 类包含华南型材料 1 份，是 50 份材

料中唯一一份皮色为乳白色且瓜刺颜色为褐色的

黄瓜材料；（6）VI 类包含华南型材料 3 份，分

两个亚组，瓜皮色均为浅绿色；（7）VII 类包含

华南型材料 2 份，VII 类与 VI 类的区别在于瓜的

图 1 部分 SSR 分子标记扩增产物电泳检测图

Fig. 1 Electrophoresis detection diagram of amplified

products labeled with partial SSR markers

图 2 50 份黄瓜核心种质的遗传多样性聚类分析

Fig. 2 Clustering analysis for genetic diversity of 50 cucumber core germplasms

皮色，该组材料的皮色均为绿色。

相似系数为 0.851 处，50 份黄瓜材料则可聚

为 9 类：I 类包含华南型材料 1 份；II 类包含华

北型材料 40 份，分为 2 个亚组；III 类包含华南

型材料 1 份；IV 类包含华南型材料 1 份；V 类包

含中间型材料 1 份；VI 类包含华南型材料 1 份；

VII 类包含华南型材料 3 份，分为 2 个亚组；VIII

类包含华南型材料 1 份；IX 类包含华南型材料

1 份。

从种质来源上看，50 份黄瓜种质材料并没有

严格按照东北、华北、华中、华南、西南等地域

因素聚为一类，同一来源的各类群种质均有一定

45

差异，表明 SSR 分子标记可在一定程度上反映种

质资源亲缘关系及遗传多样性。从类型上看，所

有华北型黄瓜聚为一类，而华南型黄瓜则比较分

散，表明华北型黄瓜材料间相似系数较高、亲缘

关系较近、遗传背景较窄；华南型黄瓜材料间相

似系数较低、亲缘关系较远、遗传背景较宽、遗

传多样性丰富。

3 讨论

种质资源是遗传育种的基础，黄瓜品种间多

态性远低于同属甜瓜［43］。市面上的黄瓜栽培品

种更是存在遗传背景狭窄、遗传多样性差等问题，

收集、鉴定、保存多态性丰富的种质资源，拓展

黄瓜的遗传多样性对黄瓜的遗传育种及生产有着

极为重要的意义。本研究利用筛选出的 32 对 SSR

引物在 50 份黄瓜种质资源中共检测出 280 个基因

位点，每个引物平均检测出 6.75 个位点，多态性

位点 216 个，引物多态性达 77.1%，均高于王蕾

等［3］、李翔等［44］、苗晗等［45］研究结果，其中

王蕾等［3］利用 17 对引物对 32 份黄瓜品种进行聚

类分析，发现每条引物平均检测基因数仅为 4.59

个，引物多态性仅为 71.8%，表明本研究所筛选

的 SSR 引物具有较高的多态性，可用于 50 份黄

瓜种质材料的遗传多样性分析和鉴定。

遗传相似系数越小，变幅越大、物种的遗传

分化越大、遗传多样性越高、遗传背景越复杂［45］。

本研究中 50 份黄瓜种质材料的遗传相似系数分布

于 0.62~1.00 之间，遗传相似系数变化范围高于

杨福强等［46］研究结果，表明其具有较为丰富的

多态性。本研究中，在遗传相似系数为 0.754 处

的 40 份华北型黄瓜材料聚为一类，此结果与所

调查黄瓜材料的性状特征表现较为一致。40 份华

北型黄瓜材料性状调查结果显示，其瓜型多为棒

型，瓜把多为溜肩型或瓶颈型，皮色多为绿色或

深绿，瓜斑纹绿色条形，多分布在底部，瓜刺瘤

大小中等，密度中等，绝大多数为雌雄株。9 份

华南型黄瓜材料聚为 6 类，具体为 I 类、III 类、

IV 类、V 类、VI 类、VII 类，此结果与所调查华

南型黄瓜性状表现结果也较为一致。本研究所调

查华南型黄瓜材料的瓜皮颜色、瓜刺瘤、瓜皮斑

纹等性状具有多样化，表明华南型黄瓜种质资源

具有丰富的遗传多样性，且与史建磊等［5］、苗晗

等［45］等研究结果一致。史建磊等［5］研究得出，

48 份华南型黄瓜材料的遗传相似系数（GS）介于

0.375~1.000 之间，本研究遗传相似系数结果仅为

0.620~1.000 之间，可能与本研究中华南型材料特

异性不明显有关，本研究所用的大部分材料为华

北型，华南型黄瓜材料仅有 9 份，同时也表明我

国华北型黄瓜遗传背景狭窄。

从聚类图上看，与本研究大多数黄瓜种质材

料遗传距离较远的为 3 号材料，这是广东省的地

方品种，该材料与其他黄瓜材料基因交换较少。

1 号黄瓜材料来自我国台湾省，其单独聚为一类，

表明 1 号材料与其他材料遗传距离较远。由华北

型黄瓜材料与华南型黄瓜杂交所得的中间型黄瓜

材料，为 50 份材料中唯一一份果型为纺锤型的材

料，该材料瓜把表现为华北型黄瓜的溜肩型，瓜

刺瘤大小为中型，但瓜刺瘤密度则表现为华南型

的稀疏型，另在遗传相似系数为 0.705 处，49 号

中间型材料及 1、2、9 号华南型黄瓜材料与华北

型黄瓜材料聚为一类，表明 9 份华南型黄瓜材料

中，1、2、9 号材料与华北型黄瓜材料的亲缘性

高于 3、4、5、6、7、8 号材料。聚类分析结果

可为利用这些种质资源进行黄瓜育种组合提供依

据和参考，为品种种子纯度鉴定提供可靠的技术

支撑。

4 结论

本研究通过 66 对引物对 50 份黄瓜核心种质

材料进行筛选，得到 32 对稳定性好、条带清晰、

多态性高的 SSR 引物。50 份黄瓜材料的遗传相似

系数在 0.620~1.000 之间，在遗传相似系数为 0.754

处，50 份黄瓜材料聚为 7 类；在遗传相似系数为

0.851 处，50 份黄瓜材料聚为 9 类。聚类分析结

果表明，50 份黄瓜核心种质材料中，华北型黄瓜

材料和华南型黄瓜材料间相似系数低、亲缘关系

远；华北型黄瓜材料间相似系数高、亲缘关系近、

遗传背景窄、遗传多样性差；而华南型黄瓜材料

间相似系数较低、亲缘关系较远、遗传背景宽、

遗传多样性丰富。本研究结果可为黄瓜种质材料

遗传结构研究及广东乃至华南地区高品质黄瓜育

种组合选育提供依据和参考。

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（责任编辑 马春敏）

王瑞，硕士，副研究员，华南

农业大学硕士研究生校外导师。主

要从事蔬菜遗传育种与分子生物学

研究，特别在瓜类疫病抗性机理方

面有深入研究。近 5 年主持国家自

然科学基金面上项目、青年基金等

6 项，参与国家重点研发计划、省

部级项目等 5 项。以第一或通信作

者在国内外期刊发表学术论文 11

篇；获广东省农业技术推广奖一等

奖 1 项；授权专利 13 件；获得审定或登记的蔬菜品种 5 个，

植物新品种权 3 个。

收稿日期：2023-07-29

基金项目：国家自然科学基金（32272713）；广东省重点领域研发计划项目（2020B02022001）；广东省农业科

学院协同创新中心项目（XTXM202203）

作者简介：金庆敏（1986—），女，硕士，助理研究员，研究方向为蔬菜分子育种与分子生物学，E-mail：

dzjinqingmin@126.com

通信作者：吴廷全（1976—），男，博士，研究员，研究方向为蔬菜作物抗性与品质，E-mail：tingquanwu@

sina.com

广东农业科学 2023，50（9）：49-58

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.005

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东农业科学，2023，50（9）：49-58.

基于 SSR 分子标记的‘粤秀 3 号’黄瓜

杂交种子纯度及真实性鉴定

金庆敏 1,2，林毓娥 2

，王 瑞 1

，钟玉娟 2

，吴廷全 1

（1. 广东省农业科学院设施农业研究所，广东 广州 510640

2. 广东省农业科学院蔬菜研究所 / 广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640）

摘 要：【目的】‘粤秀 3 号’黄瓜具有生长势强、产量高、抗病及抗逆性强的特点，是华南地区推广面

积较多的品种，本研究以期为其建立一套快速、准确、有效的种子纯度鉴定方法。【方法】利用 200 对 SSR 引物，

根据杂种带为父母本互补带型的原则，对‘粤秀 3 号’黄瓜及其亲本进行特异性 SSR 标记物的筛选。将种子纯

度鉴定结果与田间生物学鉴定结果进行比较，鉴定所筛选 SSR 引物的准确性。选取‘中农 108’‘园丰 6 号’‘津

绿 5 号’‘中农 8 号’‘津研四号’5 个黄瓜品种种子及其他 49 份黄瓜种质材料，与‘粤秀 3 号’黄瓜品种同

时检测，对所筛选的 SSR 引物特异性进行鉴定。【结果】从 200 对引物中筛选出符合父母带间成互补带要求的

两对 SSR 引物（3B-10 和 2B-41）。3B-10 引物经 PCR 扩增后产生 160 bp 的母本特异条带（P1

-A）及 190 bp 的

父本特异条带（P2

-B），测序比对这两条特异性条带，发现 P2

-B 在 49~79 bp 处比 P1

-A 多了 5 个 6 碱基的简单

重复序列。2B-41 引物经 PCR 扩增后产生 218 bp 的母本特异条带（P1

-C）和 206 bp 的父本特异条带（P2

-D），

经测序比对后发现，与 P2

-D 相比，P1

-C 在 120~131 bp 处有 12 个碱基的缺失。表明两对 SSR 引物均可有效区分‘粤

秀 3 号’杂交种子及其父母本，可快速准确地鉴定‘粤秀 3 号’黄瓜种子纯度。此外，两对 SSR 引物的种子纯

度鉴定结果均与田间生物学鉴定结果一致。两对引物均可有效区分‘粤秀 3 号’黄瓜种子与‘中农 108’‘园丰

6 号’‘津绿 5 号’‘中农 8 号’‘津研四号’5 个黄瓜品种种子及其他 49 份黄瓜种质资源。但 3B-10 在 49 份

种质资源中多态性较高，故 SSR 标记 2B-41 更适用于‘粤秀 3 号’的真实性鉴定。【结论】3B-10 和 2B-41 两

对 SSR 引物可快速、准确、有效地对‘粤秀 3 号’杂交种子纯度进行鉴定，鉴定操作较简单、成本较低，可替

代传统杂交种子纯度鉴定的方法，其商业应用价值极高。

关键词：黄瓜；‘粤秀 3 号’；种子纯度；SSR 分子标记；真实性鉴定；田间性状鉴定

中图分类号：S642.9 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2023）09-0049-10

Purity and Authenticity Identification of ‘Yuexiu No.3’

Cucumber Hybrid Seeds Based on SSR Molecular Markers

JIN Qingmin1,2, LIN Yu’e2

, WANG Rui1

, ZHONG Yujuan2

，WU Tingquan1

（1.Institute of Faclity Agriculture, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;

2. Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences /

Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables, Guangzhou 510640, China）

50

【研究意义】黄瓜（Cucumis sativus L.）为

葫芦科黄瓜属植物，起源于喜马拉雅山南麓的印

度北部、锡金、尼泊尔和中国云南地区［1-2］，是

世界上重要的蔬菜作物。中国为黄瓜最大的种植

区，根据联合国粮农组织最新统计结果（https://

www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL/visualize），2021

年全球黄瓜种植面积为 217.22 万 hm2

，中国种植

面积达 129.25 万 hm2

，占比 59%；全球黄瓜总产

量为 9 352.88 万t，中国黄瓜产量达 7559.77 万t，

占比 81%。因此，黄瓜在我国具有重要的农业经

济价值［3］。世界范围内主要作物的优良品种大多

通过杂交育种的方法育成［4］。传统的品种纯度和

真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法

从农业生产角度看具有稳定可靠的优点［5］，但从

遗传学角度看，品种的纯度和真伪鉴定实质上是

对品种基因型的鉴定，且只有通过鉴定 DNA 分

子本身才能准确可靠地鉴定品种的基因型［3,6-7］。

有限的亲本资源和杂交品种的不断涌现，使得品

种尤其是杂交种子之间的遗传差异越来越小，蔬

菜种子的真实性与品种纯度鉴定也越来越难［8］，

加之黄瓜为自花授粉作物，人工去雄不及时，常

会出现假杂种，导致种子遗传纯度降低，给生产

造成巨大损失［9］。为保证优良品种能够产生最大

的经济效益，开发快速、准确、有效的品种鉴定

方法显得尤为重要。【前人研究进展】DNA 分子

标记技术是随着分子生物学发展而兴起的新型鉴

定方法，具有简便、快速、准确的特点［10］。目

前常用的分子标记技术包括扩增片段长度多态性

（Amplified fragment length polymorphism，

AFLP）、相关序列扩增多态性（Sequence related

amplified polymorphism，SRAP）、序列特征化扩

增 区 域（Sequence characterized amplified region，

SCAR）和简单重复序列（Simple sequence repeat，

SSR）等［6,11］。SSR 分子标记具有共显性、分布

广泛、多态性高等特征，且 SSR 分子标记稳定性

高、操作简单、重复性好，且对 DNA 质量要求

低，可准确高效地鉴别大量等位基因［12-13］。鉴

于以上优势，SSR 分子标记已在水稻［14-18］、玉

Abstract: 【Objective】‘Yuexiu No.3’ cucumber is a variety that is widely promoted in the South China region due to its

strong growth, high yield, disease resistance, and stress tolerance. This study aims to establishing a rapid, accurate and effective

method for seed purity identification.【Method】200 pairs of primers were used to select SSR markers with specificity based

on the principle of complementary band pattern between the parents and ‘Yuexiu No.3’. The seed purity identification results

obtained using these primers were compared with the field biological identification results to verify their accuracy. The seeds

of five cucumber varieties ‘Zhongnong 108’, ‘Yuanfeng No.6’, ‘Jinlv No.5’, ‘Zhongnong No.8’ and ‘Jinyan No.4’ and other

49 cucumber germplasm materials were selected and detected simultaneously with ' Yuexiu 3 ' cucumber varieties to identify

the specificity of the selected SSR primers.【Result】Two pairs of SSR primers (3B-10 and 2B-41) were screened out from

200 pairs of primers that met the requirement of forming complementary bands between parental bands, PCR amplification

using the 3B-10 primer produced a 160 bp maternal-specific band (P1

-A) and a 190 bp paternal-specific band (P2

-B). By

comparing the sequencing results of the specific bands (P1

-A, P2

-B), it was found that the P2

-B had an additional 6-base

simple repeat sequence compared to the P1

-A at positions 49-79 bp. PCR amplification using the 2B-41 primer produced a

218 bp maternal-specific band (P1

-C) and a 206 bp paternal-specific band (P2

-D). By comparing the sequencing results of

the specific bands(P1

-C, P2

-D), it was found that the P1

-C had a deletion of 12 bases compared to the P2

-D at positions 120-

131 bp. The results showed that these two pairs of SSR primers were able to effectively distinguish ‘Yuexiu No.3’ hybrid seeds

from their parents and accurately identify the seed purity of ‘Yuexiu No.3’ cucumbers. In addition, the seed purity identification

results of the two pairs of SSR primers were consistent with the field biological identification results. Both pairs of primers were

capable of effectively distinguishing the ‘Yuexiu No.3’ cucumber seeds from the seeds of five other cucumber varieties, namely

‘Zhongnong 108’, ‘Yuanfeng No.6’, ‘Jinlv No.5’, ‘Zhongnong No.8’and ‘Jinyan No.4’, as well as 49 other germplasm resources.

However, among these 49 germplasm resources, 3B-10 displayed a higher level of polymorphism. Therefore, SSR marker 2B41 was more suitable for confirming the authenticity of the ‘Yuexiu No.3’ cucumber variety.【Conclusion】The 3B-10 and 2B41 pairs of SSR primers can rapidly, accurately and efficiently identify the purity of ‘Yuexiu No.3’ hybrid cucumber seeds. The

identification is simple and low cost, which can replace the traditional method of hybrid seed purity identification, and has high

commercial application value.

Key words: Cucumber; ‘Yuexiu No.3’; purity identification; SSR molecular marker; authenticity identification; field trait identification

51

米［19-21］、小麦［22-23］、棉花［24-25］、茄子［26］、

白菜［27-31］、冬瓜［8］、节瓜［32］、丝瓜［33］、苦瓜［34］

等多种作物上得到应用。近年来，SSR 标记也被

广泛应用于黄瓜［1,3,35-38］，如在黄瓜纯度鉴定［3,35］、

重要基因定位［39-41］、种质资源多样性分析［42-45］

等方面应用较多。周胜军等［12］在 699 对 SSR 引

物中筛选出 3 对引物在‘浙秀 1 号’杂交种及其

父母本之间表现出稳定的共显性，其在‘浙秀 1

号’黄瓜杂交种的带型均为父母本的互补带，

表明 3 对引物可用于‘浙秀 1 号’黄瓜杂交种的

种子纯度鉴定，且与田间鉴定结果一致。孟淑

春等［1,38］利用 66 对 SSR 引物对‘京研绿翡翠’

黄瓜品种进行分子标记筛选，得到 10 对稳定的

SSR 引物可用于该品种种子的纯度鉴定；利用 72

对 SSR 引物对‘京研冬美 9 号’黄瓜品种进行分

子标记筛选，得到 2 对引物可用于该品种种子的

纯度鉴定，且上述筛选到的引物鉴定结果均与田

间鉴定结果一致。李春等［36］从 240 个黄瓜 SSR

分 子 标 记 筛 选 到 2 对 SSR 分 子 标 记（Cs100 和

Cs109），可对‘川绿 15 号’华南型黄瓜品种进

行种子纯度鉴定，且 2 对标记的分子鉴定结果与

田间形态鉴定结果一致，并可将‘川绿 15 号’与

其他品种的黄瓜种子区分开。以上均为发掘利用

SSR 分子标记、建立快速高效的黄瓜种子纯度鉴

定方法提供了重要的理论依据。【本研究切入点】

黄瓜种子纯度和真实性鉴定一直是黄瓜商业化制

种中亟待解决的科学问题。传统的种子纯度鉴定

方法存在一定的局限性和不足之处，无法完全确

保黄瓜种子的纯度和真实性［38］。目前，市场上

黄瓜品种居多，存在一品多名或一名多品的情况，

且黄瓜遗传背景狭窄，尤其是华北型黄瓜，遗传

相似性较高，用传统方法鉴定存在一定难度，利

用分子标记的方法可从根本上解决这个问题。同

时，本单位所育成的‘粤秀 3 号’黄瓜品种具有

生长势强、产量高、抗病抗逆性强的特点，是华

南地区推广面积较多的品种［46］。为实现‘粤秀 3 号’

黄瓜在生产制种中增质提效，以进一步推广该黄

瓜品种，本研究拟采用 SSR 分子标记技术，以‘粤

秀 3 号’及其父母本为试验材料，建立一种准确、

快速和可靠的方法，用于检测和鉴定‘粤秀 3 号’

黄瓜杂交种子的纯度和真实性。【拟解决的关键

问题】本研究围绕如何选择适合的 SSR 分子标记，

以最大程度地提高‘粤秀 3 号’黄瓜杂交种子鉴

定的准确性和稳定性；如何建立一套标准化的实

验流程，确保不同实验室和操作人员之间的结果

具有一致性；如何验证该方法在不同批次和环境

下的适用性和稳定性，以确保其在实际种子鉴定

中的可行性等关键问题展开试验。为降低‘粤秀

3 号’黄瓜种子纯度鉴定成本，提高种子纯度鉴

定时效性及稳定性，利用公开的 SSR 标记引物资

源，筛选用于‘粤秀 3 号’纯度和真实性鉴定的

特异性引物，并建立一套高效准确的黄瓜品种种

子纯度鉴定方法，为 SSR 标记在黄瓜品种鉴定和

‘粤秀 3 号’的市场化推广提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用黄瓜品种为广东省农业科学院蔬

菜研究所育成的华北型黄瓜杂种一代‘粤秀 3 号’，

其父本材料为 C-8，母本材料为 A-2。父本 C-8

植株生产强势，叶色深绿，叶片较小，抗病性强，

皮色深绿有光泽，为长春密刺系统变异植株中所

选出的单株。母本 A-2 是在 100 多份资源材料鉴

定的基础上选出的，原始材料来源于亚洲蔬菜中

心，主要表现为早熟、分支强、主侧蔓结果［46］。‘粤

秀 3 号’黄瓜早熟，主侧蔓结瓜，连续结果性强，

回头瓜多，瓜型呈长棒状，匀称，外形美观，皮

色深绿有光泽，刺瘤密，白刺，单瓜重 400~450 g，

肉厚，味甜脆嫩，商品性好，耐贮运，较抗枯萎病、

霜霉病、炭疽病、白粉病等多种病害，是华南地

区推广面积较多的品种。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组 DNA 的提取 所有材料均于 2022

年 7 月中旬浸种催芽播种于穴盘，在蔬菜研究所

重点实验室培养，待种子发芽后取两片子叶用于

DNA 提取。采用德国进口研磨仪 RETSCH（莱驰）

MM400 将样品研磨后，参考姚春鹏等［34］DNA 提

取方法提取黄瓜基因组 DNA，用 DL2000 核酸蛋

白分析仪测定 OD260、OD280 的值，1% 琼脂糖电泳

检测 DNA 质量。

1.2.2 SSR 分子标记引物的筛选 在黄瓜基因组

数据库网站（http://www.cucurbitgenomics.org/）下

载 SSR 分子标记序列，选用 200 对均匀分布在黄

瓜染色体上的 SSR 分子标记引物送生工生物工程

（上海）股份有限公司合成。参考‘粤秀 3 号’

黄瓜及其父母本材料，将所提取基因组 DNA 各取

52

10 份混合，分别形成‘粤秀 3 号’及其父母本材

料的混合池，按照父母本带型互补的原则用于筛

选‘粤秀 3 号’黄瓜的特异性 SSR 分子标记。

1.2.3 PCR 扩增及丙烯酰胺电泳 PCR 扩增反

应体系为 20 μL：基因组 DNA（100 ng/μL）：1.0

μL，Mg2+（20 mmol/L）：1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）：

2.0 μL，SSR 上下游引物（10 mmol/μL）：0.4 μL，

Taq 酶（5U/ μL）：0.2 μL，10×PCR buffer：2.0

μL，加 ddH2

0 补足至 20 μL。

PCR 扩增程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃

变性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 40 s，35 个循

环；72 ℃保持 7 min，4℃保存待检测。扩增产物

经 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（120 V，1.5 h）；

电泳结束后，丙烯酰胺凝胶经 0.1% AgNO3

银染

15 min， 然 后 用 2% NaOH、0.4% 甲 醛、0.04%

Na2

CO3 显色，清水冲洗干净后在灯箱拍照分析。

1.2.4 DNA 片段的回收及测序 将父母本互补的

两条差异条带在丙烯酰胺凝胶上用手术刀割下，

然后用 DNA 回收试剂盒（全式金 EasyPure Quick

Gel Extraction Kit）将 DNA 片段回收，然后将所回

收条带连接至 T 载体（全式金 pEASY-T1 Cloning

Kit）， 转 化 DH5α（ 全 式 金 Trans5α Chemically

Competent Cell）大肠杆菌，挑取阳性单克隆菌落

送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.5 种子纯度鉴定 随机选取 42 粒‘粤秀 3 号’

黄瓜种子提取基因组 DNA，用筛选出的 SSR 分子

标记对‘粤秀 3 号’黄瓜种子及其父母本参照 1.2.4

方法进行 PCR 扩增及丙烯酰胺电泳，染色并读带，

判定‘粤秀 3 号’黄瓜种子纯度。

1.2.6 田间形态鉴定 选取‘粤秀 3 号’黄瓜种

子 260 粒，于 2022 年 7 月中旬浸种催芽，播种于

穴盘育苗。8 月上旬（长出 1~3 片真叶）移栽 238

株‘粤秀 3 号’黄瓜于广东省农业科学院蔬菜研

究所白云基地。采用深沟高畦，畦宽 1.8~2.0 m，

畦高 30 cm，株距 30 cm，进行常规化管理。在盛

果期随机选取 100 株‘粤秀 3 号’黄瓜植株，通

过田间性状（主要包括瓜型、瓜长、皮色、刺瘤、

瓜重等）鉴定其种子纯度。

1.2.7 SSR 分子标记特异性鉴定 选取市场上同

种类型的黄瓜品种（‘中农 108’‘园丰 6 号’‘津

绿 5 号’‘ 中 农 8 号’‘ 津 研 四 号’） 种 子 及

其他 49 份黄瓜种质材料提取 DNA，用所筛选的

SSR 引物对‘粤秀 3 号’及其亲本进行 PCR 扩

增实验。并对扩增条带进行检测，检验所筛选的

SSR 分子标记对‘粤秀 3 号’黄瓜种子纯度鉴定

的特异性和有效性。

2 结果与分析

2.1 ‘粤秀 3 号’黄瓜基因组 DNA 提取结果分析

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，所提取的‘粤

秀 3 号’黄瓜基因组 DNA 条带清晰，无明显拖带

和降解现象（图 1）。DNA 质量检测结果显示，

其 OD260/OD280 比值在 1.79~1.98 之间，且琼脂糖

胶的条带单一，表明所提取的 DNA 纯度高、杂质

少、质量好，满足本试验对基因组 DNA 的质量

要求。

2.2 黄瓜 SSR 分子标记的筛选

以‘粤秀 3 号’黄瓜父母本为模板，利用合

成的 200 对 SSR 引物进行 PCR 扩增及检测，筛选

出 12 对父母本条带差异性引物。将此 12 对引物

在 F1 中进行验证，经多次重复比较，筛选杂交种

与父母本呈现共显性互补带型分离的引物组合，

最终筛选出 3B-10、2B-41 两对 SSR 引物（表 1）。

这两对引物所扩增出的条带清晰、稳定性和重复

性好，在父母本中有共显性差异。3B-10 引物在

母本 A-2 材料中扩增到特异性条带 P1

-A，在父本

C-8 材料中扩增到特异性条带 P2

-B（图 2A）；

2B-41 引物在母本 A-2 材料中扩增到特异性条带

P1

-C，在父本 C-8 材料中扩增到特异性条带 P2

-D

（图 2B）。

M：DNA Marker；1~14：DNA 样品

M: DNA Marker; 1-14: DNA sample

图 1 ‘粤秀 3 号’基因组 DNA 检测

Fig. 1 Genomic DNA testing of ‘Yuexiu No.3’

表 1 ‘粤秀 3 号’SSR 分子标记的引物序列

Table 1 Sequences for SSR molecular markers of ‘Yuexiu No.3’

引物名称

Primer name

引物序列

Primer sequence (5'-3')

长度

Length (bp)

3B-10-F CATCACGACCCTCTCCATCT 20

3B-10-R GGGTTTGATAGTGGAGATTATTCA 24

2B-41-F CACCGAGAACGAAAGAAGGA 20

2B-41-R TCTAAGGTGGGAGGGAAACC 20

53

2.3 黄瓜 SSR 分子标记纯度鉴定

取‘粤秀 3 号’黄瓜材料基因组 DNA，用

3B-10、2B-41 两 对 SSR 引 物 进 行 PCR 检 测。

3B-10 引物在 44 份‘粤秀 3 号’黄瓜 F1 代基因

组 DNA 扩增结果中，43 株具有父母本双方的特

异条带 P2

-B 与 P1

-A（图 3），1 株仅具有母本特

异性条带 P1

-A，得出‘粤秀 3 号’黄瓜种子纯度

为 97.73%；2B-41 引物的检测结果与 3B-10 引物

P1

：母本 A-2；P2

：父本 C-8；F1

：‘粤秀 3 号’

P1

: Female parent A-2；P2

：Male parent C-8；F1

: ‘Yuexiu No.3’

图 2 引物 3B-10（A）和 2B-41（B）对‘粤秀 3 号’

及其亲本的 PCR 扩增

Fig. 2 PCR amplification of ‘Yuexiu No.3’ and

its parents with primers 3B-10 (A) and 2B-41 (B)

M：DNA Marker； P1

：母本 A-2；P2

：父本 C-8；1~44：‘粤秀 3 号’F1 代

M: DNA Marker; P1

: Female parent A-2；P2

: Male parent C-8；1-44: F1

generation of ‘Yuexiu No.3’

图 3 引物 3B-10 对‘粤秀 3 号’亲本及其杂交 F1 代种子的纯度鉴定

Fig. 3 Purity identification for the seeds from ‘Yuexiu No.3’ parents and their hybrid F1

generation by primer 3B-10

M：DNA Marker； P1

：母本 A-2；P2

：父本 C-8；1~44：‘粤秀 3 号’F1 代

M: DNA Marker; P1

: Female parent A-2；P2

: Male parent C-8；1-44: F1

generation of ‘Yuexiu No.3’

图 4 引物 2B-41 对‘粤秀 3 号’亲本及其杂交 F1 代种子的纯度鉴定

Fig. 4 Purity identification for the seeds from ‘Yuexiu No. 3’ parents and their hybrid F1

generation by primer 2B-41

结果一致（图 4）。综上，本研究所筛选的两对

SSR 分子标记均可稳定、准确地对‘粤秀 3 号’

黄瓜进行种子纯度鉴定。

2.4 ‘粤秀 3 号’黄瓜田间性状鉴定

田间性状（主要包括瓜型、瓜长、皮色、刺

瘤、瓜重等）鉴定结果显示，随机选取的 100 株‘粤

秀 3 号’黄瓜植株中有 98 株为杂交种，2 株性

状表现为母本类型，其田间纯度为 98%；用 3B10、2B-41 两对 SSR 分子标记对 44 份‘粤秀 3 号’

黄瓜种子纯度鉴定，结果显示，43 份为杂交种，

1 份为母本类型，种子纯度为 97.73%，与田间性

状鉴定结果一致。表明这两对 SSR 分子标记可准

确地对‘粤秀 3 号’黄瓜进行分子纯度鉴定。

2.5 黄瓜 SSR 分子标记特异性鉴定

在‘粤秀 3 号’黄瓜中增加性状相似的‘中

农 108’‘园丰 6 号’‘津绿 5 号’‘中农 8 号’‘津

研四号’黄瓜品种种子作为假种子，同时使用

3B-10、2B-41 两对 SSR 分子标记对‘粤秀 3 号’

及其他 49 份种质材料进行鉴定。结果显示，3B10、2B-41 两对引物在‘粤秀 3 号’中为杂合互

补带型，在‘中农 108’‘园丰 6 号’‘津绿 5 号’‘中

农 8 号’中为父本或母本的纯合条带，在‘津研

四号’中则无条带显示（图 5），表明 3B-10、

2B-41 为‘粤秀 3 号’的特异性分子标记，可明

显区分 ‘粤秀 3 号’种子与其他参试黄瓜品种。

利用 3B-10 及 2B-41 对‘粤秀 3 号’黄瓜与

其他 49 份黄瓜种质资源的真实性进行鉴定，结

果（图 6、图 7）发现，仅‘粤秀 3 号’黄瓜具

有父母本的两个条带，其他 49 份黄瓜种质资源

均未出现该两条电泳条带。但 3B-10 在 49 份黄

54

A B

M：DNA Marker；P1

：母本 A-2；P2

：父本 C-8

M: DNA Marker; P1

: Female parent A-2；P2

: Male parent C-8

图 5 引物 3B-10（A）和 2B-41（B）对‘粤秀 3 号’的特异性鉴定

Fig. 5 Specificity verification of primers 3B-10 (A) and 2B-41 (B) for ‘Yuexiu No.3’

M：DNA Marker；P1

：母本 A-2；P2

：父本 C-8；F1

：‘粤秀 3 号’F1 代；1~49：49 份黄瓜种质资源

M: DNA Marker; P1

: Female parent A-2；P2

: Male parent C-8；F1

: F1 generation of ‘Yuexiu No.3’；1-49: 49 cucumber germplasm resources

图 6 引物 3B-10 对‘粤秀 3 号’的真实性鉴定

Fig. 6 Authenticity identification of ‘Yuexiu No.3’ by primer 3B-10

M：DNA Marker；P1

：母本 A-2；P2

：父本 C-8；F1

：‘粤秀 3 号’F1 代；1~49：49 份黄瓜种质资源

M: DNA Marker; P1

: Female parent A-2；P2

: Male parent C-8；F1

:F1 generation of ‘Yuexiu No.3’；1-49: 49 cucumber germplasm resources

图 7 引物 2B-41 对‘粤秀 3 号’的真实性鉴定

Fig. 7 Authenticity identification of ‘Yuexiu No.3’ by primer 2B-41

瓜种质资源中多态性较高，未能有效区分 7×8、

24×25、36×37 等组合的杂交种。表明本研究所

筛选的两对 SSR 分子标记中，2B-41 对‘粤秀 3 号’

黄瓜具有更好的特异性，可用于‘粤秀 3 号’黄

瓜真实性鉴定。

2.6 SSR 分子标记差异性条带序列的鉴定分析

为明确 3B-10、2B-41 两对 SSR 分子标记在

‘粤秀 3 号’黄瓜及其父母本中所扩增到的 DNA

序列及其差异，本研究对父母本中所扩增到的差

异条带进行胶回收，将 DNA 片段连接至 T 载体测

序并对比分析。结果（图 8、图 9）表明，3B-10

在父母本中所扩增到的差异条带 P1

-A（160 bp）

比 P2

-B（190 bp）在 49~79 bp 处缺少 5 个 6 碱基

（GTGAGG）的简单重复序列；2B-41 在父母本

图 8 引物 3B-10 扩增父母本 DNA 差异片段的序列比对

Fig. 8 Sequence alignment of parental DNA differential

fragments amplified by primer 3B-10

55

中所扩增到的差异条带 P1

-C（218 bp）则比 P2

-D

（206 bp）在 120~131 bp 处缺少 12 个碱基。

3 讨论

目前，我国蔬菜种子市场处于瓶颈期，种

子质量是农业生产中的重要元素，其质量的优

劣程度直接影响到农产品的质量和产量。种子

纯度鉴定不仅是保证种子质量不可或缺的一部

分，而且在品种权保护、品种登记管理、种质

资源多样性分析及种子生产中有重要价值［38］。

相对于周期长、成本高、易受环境影响的传统

种 子 纯 度 鉴 定 方 法， 以 SSR 分 子 标 记 为 基 础

的种子纯度鉴定方法快速、高效、低成本且操

作 简 单， 是 目 前 商 品 种 种 子 纯 度 鉴 定 的 理 想

方法［8］。

随着黄瓜产业发展及生产的需求，越来越多

的新品种涌入市场，同时也存在劣种、假种等现

象，在黄瓜育种及制种过程中黄瓜品种纯度的鉴

定显得尤为重要［9］。利用 SSR 分子标记对黄瓜

进行分子纯度鉴定，结果更为准确，且与田间鉴

定结果一致。李海梅等［9］基于黄瓜线粒体父系

遗传特性，从线粒体基因组中的 72 对 SSR 引物

中筛选出 4 对引物，在 30 份黄瓜品种中呈现多

态性，其中利用引物 mtSSR4 和 mtSSR10 对 4 份

黄瓜 F1 种子纯度进行鉴定，结果显示黄瓜 F1 种

子的带型与其父本一致，可将掺入杂交组合中的

假种子区分开。但其种子鉴定结果有一定的局限

性，不能排除 F1 种子中掺入杂交种父本的情况，

而本研究所筛选到的引物可严格区分出杂交种子

的父母亲本。周胜军等［12］从 699 对 SSR 引物中

筛选出 3 对引物，其可有效鉴定出‘浙秀 1 号’

黄瓜杂交种及其父母亲本，引物稳定性良好且种

子纯度鉴定结果与田间鉴定结果一致，但其未对

所筛选引物的特异性进行鉴定，仅限于对父母本

的区分，不能与其他品种黄瓜种子相区分。本研

究使用与‘粤秀 3 号’黄瓜田间性状类似的 5 个

黄瓜品种及其他 49 份黄瓜种质资源对 3B-10、

2B-41 两对 SSR 分子标记的特异性进行验证，结

果表明所筛选到的 SSR 分子标记 2B-41 不仅可鉴

定其纯度，也可有效地将‘粤秀 3 号’与其他相

似黄瓜品种区分开来，说明该标记对‘粤秀 3 号’

黄瓜品种有良好的特异性，实现了其对品种的真

实性鉴定。陈鸿鸵等［37］利用 100 对 SSR 引物对

黄瓜品种‘SH23’及其亲本进行筛选，得到 5 对

在‘SH23’及其亲本和对照品种间多态性较高的

SSR 引物，均可有效鉴别出‘SH23’及其他品种，

表明 SSR 标记可用于黄瓜品种的真实性鉴定。本

研究所建立的‘粤秀 3 号’黄瓜种子纯度鉴定方法，

在科学取样的基础上得到种子纯度鉴定结果，其

准确率可达 100%。此外，本研究解析了 3B-10、

2B-41 两对 SSR 分子标记在‘粤秀 3 号’黄瓜父

母本中的差异条带，与前人已报道的黄瓜种子纯

度鉴定相比，丰富了 SSR 分子标记的内涵，明确

了具体的 DNA 差异片段序列信息，增强了 SSR

分子标记在鉴别和区分黄瓜品种遗传背景差异的

能力。‘粤秀 3 号’为华南地区主要的黄瓜栽培

品种，该分子标记的开发可有效解决制种后的种

子质量检测滞后问题，大幅节约时间及人工成本，

为‘粤秀 3 号’在华南地区的推广提供技术支撑。

4 结论

本研究从 200 对 SSR 分子标记引物中筛选得

到可用于‘粤秀 3 号’黄瓜种子纯度鉴定的两对

引物 3B-10 和 2B-41。3B-10 引物在父、母本中

可分别扩增出 190 bp 和 160 bp 的特异性条带，而

2B-41 引物在父、母本中则分别能够扩增出 206

bp 和 218 bp 的特异性条带，这些条带均可作为特

异标记使用；两对引物均能够有效区分 ‘粤秀 3

号’杂交种子与其父本、母本，且该结果与田间

生物学鉴定结果一致。2B-41 可用于‘粤秀 3 号’

图 9 引物 2B-41 扩增父母本 DNA 差异片段的序列比对

Fig. 9 Sequence alignment of parental DNA differential

fragments amplified by primer 2B-41

56

的真实性鉴定，可有效地将其与其他品种种子所

区分。本研究所开发的 3B-10 和 2B-41 两对 SSR

分子标记引物可快速、准确、有效地对黄瓜‘粤

秀 3 号’杂交种子的纯度进行鉴定，且操作简单、

成本较低，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方

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2007.06.026.

（责任编辑 马春敏）

吴廷全，博士，研究员，广东

省农业科学院设施农业研究所设施

新技术研究室主任，主要从事设施

蔬菜抗性与品质性状研究。主持国

家自然科学基金面上项目、博士后

基金、广东省科技计划、广东省自

然科学基金、广州市重点研发计划

项目等 9 项；参加国家、省部级及

市级项目 30 余项。发表学术论文

100 余篇，其中 SCI 论文 40 余篇。

获广东省科技进步二等奖和广东省

农业科学院一等奖各 1 项；授权国家发明专利 25 件；参与

育成瓜类新品种 7 个。主持和参与农业农村部成果评价各 1

项，成果均达到国际先进及以上水平。担任《Plant Disease》

《Scientia Horticulturae》《International Journal of Biological》

《Macromolecules》《Gene》等国际期刊审稿专家。带领课

题组创立的瓜类蔬菜疫病抗性鉴评技术、叶菜霜霉病抗性鉴

评技术及蔬菜种子纯度鉴定技术已广泛服务于各农业企业和

科研单位，创造了较好的经济和社会效益。

收稿日期：2023-07-30

基金项目：广西重点研发计划项目（桂科 AB18221047）；广西农业科技创新联盟科技先锋队专项（桂农科盟

202308-2）

作者简介：李宏月（1996—），女，硕士，助教，研究方向为食用菌种质资源利用，E-mail：1747651866@qq.com

通信作者：刘斌（1966—），男，博士，教授，研究方向为食用菌种质资源利用，E-mail：liubin@gxu.edu.cn

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野生香菇菌株鉴定及其与栽培菌株的

生物学特性比较

李宏月1,2，欧小云 1

，刘 斌 1

（1. 广西大学农学院 / 广西大学食用菌研究所，广西 南宁 530004；

2. 广东茂名农林科技职业学院生物技术系，广东 茂名 525000）

摘 要：【目的】对野生香菇进行鉴定，并比较其与栽培菌株的生物学特性，为野生香菇种质资源的应用

提供理论基础。【方法】采用形态特征和分子序列分析方法对野生食用菌进行鉴定，并分析温度、碳源、氮源

等因素对菌丝生长的影响，并比较其与 6 株栽培香菇的生物学特性。【结果】2 株野生食用菌（林香 18 和林香

19）鉴定为香菇，所有供试菌株均能在 15~30 ℃条件下生长，其中，林香 18 在 15~30 ℃范围内菌丝生长速度为

2.5~4.7 mm/d，菌丝生长力极强；林香 19 在 15~20 ℃时菌丝生长缓慢，生长速度为 0.5~1.6 mm/d，在 25~30 ℃时

生长速度显著加快，为 2.58~3.08 mm/d，说明林香 19 不耐低温。2 株野生菌株在 30 ℃时菌丝生长速度最快，分

别为 4.7、3.08 mm/d，且明显高于栽培菌株，属于耐高温菌株；其余 6 株栽培菌株在 25 ℃时生长速度最快，为

3.18~4.91 mm/d，均属于中温菌株。供试菌株 L12、L26、林香 19、申香 34、申香 60 和浦香 08 以可溶性淀粉为

最适碳源，林香 18 和 L808 的最适碳源为蔗糖，以乳糖为碳源时菌丝生长最差；供试菌株以尿素为氮源时均不

能生长，以牛肉膏为氮源时菌丝生长最好，以硝酸钾为氮源时菌丝生长最差；林香 18、林香 19、申香 60 和 L26

最佳 C/N 为 10/1，申香 34、L12 最佳 C/N 为 30/1，浦香 08 和 L808 最佳 C/N 分别为 40/1 和 50/1，由此可知，申

香 34、林香 18 和林香 19 菌丝生长不受 C/N 的影响，其余菌株均受 C/N 的影响。【结论】野生香菇菌株林香 18

和林香 19 均为耐高温菌株，但林香 19 对低温较敏感。林香 18 和林香 19 的最适碳源分别为蔗糖和可溶性淀粉，

最适氮源分别为牛肉膏和蛋白胨，最适 C/N 均为 10/1。研究明确了野生香菇林香 18 和林香 19 菌丝生长的营养

需求和条件，研究结果可为耐高温香菇新品种的选育提供新材料。

关键词：野生香菇；形态学和分子生物学；生物学特性；温度；氮源；碳源；C/N

中图分类号：S646.1+

2 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2023）09-0059-09

Identification of Two Wild Lentinula edodes Strains and

Their Biological Characteristics Comparing with the

Cultivated Strains

LI Hongyue1,2, OU Xiaoyun1

, LIU Bin1

（1. College of Agriculture, Guangxi University/Institute of Edible Fungi，Guangxi University,

Nanning 530004, China; 2. Department of Biotechnology, Guangdong Maoming Vocational College of

Agriculture and Forestry Science and Technology, Maoming 525000, China）

Abstract: 【Objective】To identify wild shiitake and compare their biological characteristics with cultivated strains,

60

【研究意义】香菇（Lentinula edodes）又名

香蕈、冬菇，在分类归属方面一直存在许多探讨

和争论，曾先后被归入过 12 个不同的属，1983

年从韧伞属 Lentinus 转入香菇属 Lentinula，即担

子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricales）光

茸 菌 科（Omphalotaceae） 香 菇 属（Lentinula），

延续至今。中国是香菇第一大生产国，也是最大

的消费国。据中国食用菌协会统计，2020 年我国

香菇的总产量为 1 188.21 万 t，占食用菌总产量的

29.25%，为我国食用菌年产量最大、创汇额较高

的单品［1］。香菇野生种质资源主要分布在澳大利

亚、日本、韩国、马来西亚、朝鲜、越南、泰国

等国家，其中属日本记载最多［2］。我国香菇属的

种类及分布较广，主要分布于热带及亚热带地区，

温带地区较少［3］；野生香菇的多样性中心分布于

西北和西南地区［2］。开展野生香菇种质资源的收

集、鉴定和评价利用，挖掘优良野生香菇种质可

促进香菇产业的发展［4］。分析对比野生香菇和栽

培香菇的生物学特性，可为香菇优良品种的选育

提供理论基础。【前人研究进展】我国香菇种质

资源丰富，但香菇栽培品种的命名比较混乱，出

现不少同名异物、同物异名等现象，因此香菇菌

株的准确鉴定和命名极有必要。以往的香菇鉴定

主要依赖形态学方法，但单纯的形态鉴定无法提

供准确的物种信息［5］。目前认为形态学在食用菌

鉴定中可作为辅助手段，但不能作为唯一的鉴定

方法［6］。近年来基于分子标记的分子生物学鉴定

方法应用越来越广泛［4,7］，由于此方法不易受外

界环境的影响，具有特异性强、稳定性好、样品

需求量少等特点，可直接利用菌丝体或子实体提

取 DNA 进行鉴定［8-10］。Song 等［11］ 研究表明，

采用核糖体基因转录间隔区（Internal transcribed

spacers，ITS）序列分析是鉴定香菇的理想分子标

记。袁思明等［12］对采自云南的 1 株野生香菇进行

了鉴定和菌丝生长条件试验，其最适碳源为麦芽

糖，最适氮源为牛肉膏。熊雪等 ［13］对分离自贵

州马桑树的野生香菇进行生物学研究，该菌菌丝

生长的最优碳源为蔗糖，最优氮源为蛋白胨，培

养温度以 23~25 ℃最优，最适 pH 为 7~10；方志

荣等［14］研究了不同碳源、氮源、温度以及 pH 对

分离自四川的2株野生香菇菌株菌丝生长的影响，

其最佳碳、氮源分别为玉米粉和酵母膏，最适培

养温度为 25 ℃，最适 pH 为 6.0；刘元涛等［15］通

过单因素试验和正交试验的方法，研究中华小香

菇生长发育过程中所需碳源、氮源等营养条件和

温度、pH 等环境条件，从而得出其菌丝体生长的

最佳条件。【本研究切入点】我国香菇种质资源

丰富，但功能性栽培品种较少，目前缺少适宜在

南方高温地区栽培的优良香菇品种。利用形态学

和分子生物学鉴定方法，对香菇野生种质进行鉴

定。【拟解决的关键问题】本研究旨在对采集自

广西的 2 株野生香菇菌株进行分离、鉴定，通过

which provides a theoretical basis for the application of wild germplasm resources. 【Method】 Wild edible fungi were

identified by the morphological characteristics and sequences analysis, their biological characteristics were investigated and

compared with the other six cultivated strains. 【Result】Two wild strains of edible fungi were identified as Lentinula edodes.

All test strains can grow at 15-30 ℃ . The mycelium growth rate of LX18 was 2.5-4.7 mm/d at 15-30 ℃ , the mycelium growth

rate of LX 19 was 0.5~1.6 mm/d at 15-20 ℃ and 2.58~3.08 mm/d at 25~30 ℃ , which indicated that the mycelium growth of

LX 18 was very strong, and LX 18 was intolerant in low temperatures. Two wild strains (LX18 and LX 19) showed the highest

mycelial growth rates at 30 ℃ , which were 4.7 and 3.08 mm/d, respectively. But the six cultivated strains showed the highest

mycelial growth rate at 25 ℃ , from 3.18 to 4.91 mm/d. Therefore, it was concluded that the wild strains were high-temperature

tolerant, while those cultivated strains were moderate temperature varieties. The optimal C/N of LX18, LX19, SX60 and L26

was 10/1, the optimal C/N of SX34 and L12 was 30/1, and the optimal C/N of PX08 and L808 was 40/1 and 50/1, respectively.

The mycelium growth of SX34, LX18 and LX19 were not affected by C/N, and that of the other strains was influenced by C/N.

【Conclusion】LX18 and LX19 are heat-resistant strains, but LX19 is more sensitive to low temperatures. The optimal carbon

sources for LX18 and LX19 are sucrose and soluble starch, respectively. Their optimal nitrogen sources are beef extract and

peptone, and the optimal C/N is 10/1. In the study, the nutritional requirements and conditions for the growth of wild strains

LX18 and LX19 of L. edodes are clarified, and the results provide new materials for breeding new heat-tolerant varieties of L. edodes.

Key words: wild shiitake mushrooms; morphology and molecular biology; biological characteristics; temperature; nitrogen

source; carbon source; C/N

61

与香菇主要栽培菌株的生物学特性进行比较研究，

探讨分析影响香菇菌丝生长的因素，在此基础上，

根据不同菌株的综合表现，以期筛选出适宜当地

高温气候条件的香菇种质资源和育种材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供 试 野 生 菌 株 林 香 18（LX18）、 林 香 19

（LX19），栽培菌株 L12、L26 和 L808，均由广

西大学食用菌研究所提供，其中 LX18、LX19 由

采集于广西上林县大明山的野生子实体分离获

得。申香 34（SX34）、申香 60（SX60）和浦香

08 （PX08）由上海市农业科学院食用菌研究所陈

明杰研究员惠赠。

PDA 培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、

琼脂 20 g，水 1 000 mL。

基本培养基：葡萄糖 2%、蛋白胨 0.5% 、磷

酸二氢钾 0.2%、硫酸镁 0.1%、琼脂 1.5%、水 1 L、

pH 自然。

1.2 试验方法

1.2.1 形态鉴定 香菇子实体由菌盖、菌柄和菌

褶组成。通过观察子实体的外观特征，如子实体

大小、菌盖表面平整度、菌盖厚薄、菌柄长度、

菌盖颜色、菌褶、菌环等进行鉴定。

1.2.2 分子鉴定 采用 CTAB 法提取 DNA，随后

用两对引物 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG

-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），

LR0R（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'） 和 LR5

（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'），进行 PCR 扩增，

反应体系：总体系为 25 μL，分别为 GO Taq green

master mix (2×) 13 μL；ITS1 和 ITS4 或 LR0R

和 LR5 (10 pmol/L) 各 1 μL；DNA 模 板 1 μl；

Nucleasr-free water 9 μL。反应条件：预变性 94 ℃

5 min；变性 94 ℃ 1 min，退火 50 ℃ 1 min，延伸

72 ℃ 1 min，共 35 个循环；补平 72 ℃ 10 min，

10 ℃ 30 min。扩增完成后 4 ℃保存并进行电泳检

测，PCR 产物送生物公司进行测序。所得序列于

GenBank 数据库进行 BLAST 比对，下载相关序列

并用 Clustal X 软件进行对比，并用 MEGA 6.06 中

的 Maximum Likelihood 法构建系统发育树。

1.2.3 香菇生物学特性对比分析 （1）菌种活化。

取保藏菌种接入斜面 PDA 培养基，于 25 ℃下培

养，待菌丝长好后再转接到 PDA 平板中心位置，

25 ℃下培养，菌丝长满皿后备用。

（2）菌丝观察测定。长满菌丝的 PDA 平板，

用直径 0.5 cm 的打孔器打孔取菌饼，接种到基础

培养基平板中央，每个菌株 3 次重复，培养 3 d

后开始进行观察和测定。每个菌株取 3 个平板，

以接种中心点为起点，测量菌落半径，计算平均

值。长势以菌落圆整程度、菌丝浓密程度以及菌

丝洁白程度来表示。

菌丝生长速度（mm/d)=［( 平均菌落半径 -5 mm)/2］/

生长天数

（3）温度对菌丝生长的影响。用直径 0.5 cm

的打孔器打取菌饼，接入无菌 PDA 培养皿中央，

每个菌株 3 个重复，分别放入 15、20、25、30 ℃

培养箱中培养，记录菌丝萌发、生长时间及满皿

天数。

（4）碳源对菌丝生长的影响。以基础培养

基作对照，将基础培养基中的葡萄糖分别换成麦

芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉等，观察不同碳

源对菌丝生长速度及长势的影响。

（5）氮源对菌丝生长的影响。以基础培养

基作对照，将基础培养中的蛋白胨分别换成尿素、

牛肉膏、酵母膏、硝酸钾等，观察不同氮源对菌

丝生长速度及长势的影响。

（6）C/N 对菌丝生长的影响。将基础培养基

中葡萄糖用量固定为 20 g，改变蛋白胨的用量，

配制 7 个培养基处理，使葡萄糖与蛋白胨比例依

次为 10/1、20/1、30/1、40/1、50/1、60/1、70/1。

观察不同 C/N 对菌丝生长速度及长势的影响。

1.2.4 数据处理 试验数据分析采用 SPSS 20.0 软

件，应用邓肯氏新复极差法（Duncan）进行差异

显著性分析。

2 结果与分析

2.1 野生香菇菌株的形态鉴定

林香 18 野生子实体见图 1 A。子实体稍小，

菌盖直径为 3.0~3.5 cm，最大可达 4.0 cm，扁平

球形至稍平展，表面浅褐色，光滑无鳞片，无毛

状物；厚度 1.1~1.5 cm，菌肉白色，细密；菌褶

白色，弯生，不等长；菌柄长 4.5~4.8 cm，粗 0.6~1.0

cm，中生，白色，直立；菌环以下无纤毛状鳞片，

纤维质，内实，菌环易消失，白色。

林香 19 子实体见图 1 B。子实体中等，菌盖

直径为 3.5~4.0 cm，最大可达 4.5 cm，扁平球形

62

至稍平展，表面深褐色、棕褐色，光滑无鳞片，

无毛状物，厚度 0.9~1.5 cm；菌肉白色，细密；

菌褶白色，弯生，不等长；菌柄长 4.8~5.3 cm，

粗 0.7~1.2 cm，中生至偏生，白色，常弯曲；菌

环以下无纤毛状鳞片，纤维质，内实，菌环易消失。

从形态学上可将野生食用菌初步鉴定为香菇属。

2.2 分子序列分析

香 菇 野 生 菌 株 经 PCR 扩 增、 测 序 后 获 得

的 ITS 和 LSU 序 列， 通 过 BLAST 在 GenBank 数

据库中进行相似性检索和比对，下载其他香菇

序 列 进 行 对 比， 用 MEGA 6.0 构 建 系 统 发 育 树

（ 图 2）。 由 图 2 可 知， 野 生 菌 株 林 香 18、 林

A：林香 18；B: 林香 19

A: Linxiang 18; B: Linxiang 19

图 1 野生香菇子实体

Fig. 1 Fruiting bodies of wild Lentinula edodes

图 2 基于 ITSLSU 和序列采用极大似然法构建的系统发育树

Fig. 2 Phylogenetic tree generated from maximum likelihood based on ITS and LSU sequences

香 19 与 MH868346 Lentinula edodes CBS225.51 和

AF356159 Lentinula lateritia TMI 1633 聚 集 在 一

个分支上，且该分支的最大似然引导支持率高达

100%，因此把这两个菌株鉴定为香菇 Lentinula

edodes。

2.3 香菇生物学特性对比分析

2.3.1 不同温度对香菇菌丝生长的影响 由表

1 可知，8 株供试菌株在温度 15~30 ℃下均能生

长，但菌丝生长速度存在较大差异。15 ℃时，

L12 和 L26 的菌丝生长速度最快、表现出耐低温

的特性，而 L808 和林香 19 生长最慢、对低温比

较敏感；20 ℃时，菌丝生长速度居前 3 位的分别

为 L26、林香 18 和 L12；25 ℃为 6 株栽培菌株的

最适生长温度，其中 L808 的菌丝生长速度最快、

达 4.91 mm/d；而 30 ℃下，野生菌株林香 18 的菌

表 1 不同温度对香菇菌丝生长速率的影响

Table 1 Effect of different temperature on mycelial growth

rate of Lentinula edodes (mm/d)

菌株

Strains 15 ℃ 20 ℃ 25 ℃ 30 ℃

L26 3.16±0.24aAB 3.20±0.12aA 3.29±0.24aC 2.09±0.24bDE

L12 3.19±0.85abA 2.80±0.01abBC 3.43±0.15aC 1.44±0.15bF

L808 0.57±0.13dC 1.70±0.06cE 4.91±0.12aA 3.71±0.12bB

SX34 1.90±0.06bB 2.50±0.06abCD 3.30±0.29aC 2.43±0.29bCD

SX60 2.20±0.08bAB 2.43±0.08bD 3.24±0.18aCD 2.04±0.18bDE

LX18 2.50±0.12bAB 2.90±0.05bAB 4.20±0.20aB 4.70±0.20aA

LX19 0.50±0.05dC 1.60±0.12cE 2.58±0.14bD 3.08±0.14aBC

PX08 2.10±0.48bAB 2.20±0.20bD 3.18±0.23aCD 1.98±0.23bDE

注：同行数据后小写英文字母不同者表示不同温度下菌丝体生长速

率差异显著，同列数据后大写英文字母不同者表示不同菌株间菌丝体生

长速率差异显著。

Note: Different lowercase letters after data in the same row indicate

significant differences in the growth rate of mycelium at different temperature,

different capital letters after data in the same column indicate significant

differences between different strains.

63

丝生长速度最快，其次为 L808 和林香 19。综上，

L808、林香 18 和林香 19 具有较强的耐高温特性，

其他 5 个菌株均不耐高温。

2.3.2 不同碳源对香菇菌丝生长的影响 从表 2

可以看出，当碳源为葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、

麦芽糖时，香菇 L26、申香 60 和申香 34 的菌丝

生长速度无显著差异，但当碳源为乳糖时三者的

菌丝生长速度较慢。香菇 L12 在含葡萄糖培养基

中菌丝生长速度最快、达 4.17 mm/d，与其他碳源

差异显著，而在含麦芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性

淀粉培养基中，乳糖的利用效果最差；香菇 L808

在含蔗糖的培养基上菌丝生长速度最快、为 4.03

mm/d，其次是可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖，乳

糖最慢、菌丝生长速度仅 2.42 mm/d；林香 18 在

不同碳源培养基上菌丝生长速度差异显著，以蔗

糖利用效果最好、菌丝生长速度达 3.43 mm/d，乳

糖利用效果最差、菌丝生长速度仅 2.19 mm/d；林

香 19 在所有碳源中，对可溶性淀粉的利用效果最

好、菌丝生长速度最快、为 3.75 mm/d，乳糖利用

效果最差、菌丝生长速度最慢、仅 3.18 mm/d；浦

香 08 在所有碳源中，以麦芽糖培养基上菌丝生长

速度最快、约为乳糖的 2 倍。

表 2 不同碳源对香菇菌丝生长速率的影响

Table 2 Effect of different carbon source on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

菌株 Strains 葡萄糖 Glucose 乳糖 Lactose 可溶性淀粉 Soluble starch 蔗糖 Sucrose 麦芽糖 Maltose

L26 3.75±0.01aB 3.65±0.04bA 3.75±0.01aC 3.75±0.01aB 3.70±0.01abC

L12 4.17±0.01aA 2.27±0.04cDE 4.06±0.01abA 4.00±0.05bA 4.11±0.01abA

L808 3.84±0.02bB 2.42±0.04cD 3.91±0.05abB 4.03±0.08aA 3.84±0.01bBC

SX34 3.73±0.02aB 3.36±0.01bB 3.75±0.01aC 3.71±0.03aB 3.73±0.01aC

SX60 3.75±0.01aB 2.94±0.14bC 3.79±0.01aBC 3.79±0.01aB 3.79±0.01aBC

LX18 2.86±0.14bC 2.19±0.01cDE 3.40±0.09aD 3.43±0.01aC 3.09±0.01bD

LX19 3.64±0.01aB 3.18±0.02bBC 3.75±0.01aC 3.63±0.06aB 3.63±0.11aC

PX08 3.63±0.12aB 2.07±0.18bE 3.79±0.06aBC 3.75±0.07aB 3.97±0.14aAB

注：同行数据后小写英文字母不同者表示不同碳源下菌丝体生长速率差异显著，同列数据后大写英文字母不同者表示不同菌株间菌丝体生长速率

差异显著。

Note: Different lowercase letters after data in the same row indicate significant differences in the growth rate of mycelium with different carbon sources, while

different capital letters after data in the same column indicate significant differences in the growth rate of mycelium between different strains.

表 3 不同碳源对香菇菌丝长势的影响

Table 3 Effect of different carbon source on mycelial growth

density of Lentinula edodes

菌株

Strains

葡萄糖

Glucose

乳糖

Lactose

可溶性淀粉

Soluble starch

蔗糖

Sucrose

麦芽糖

Maltose

L26 +++ +++ +++ +++ +++

L12 +++ +++ +++ ++ ++

L808 ++ ++ ++ ++ ++

SX34 +++ +++ +++ +++ +++

SX60 ++ ++ ++ ++ ++

LX18 +++ +++ +++ +++ +++

LX19 ++ ++ ++ ++ ++

PX08 ++ +++ +++ ++ ++

注：“++”表示菌丝体较浓密；“+++”表示菌丝体极浓密。

Note: “++” indicates that the mycelium is denser; “+++” indicates

that the mycelium is extremely dense.

从表 3 可以看出，不同碳源条件下，L26、

L808、申香 34、申香 60、林香 18 和林香 19 的

菌丝长势无显著差异，只有 L12 和浦香 08 的菌

丝长势存在差异。在碳源为葡萄糖、乳糖和可溶

性淀粉时，L12 菌落圆整、菌丝较浓密、洁白，

且在乳糖培养基上菌丝最为浓密；在可溶性淀粉

培养基上菌丝浓密但老化快，存活时间较短。浦

香 08 在乳糖和可溶性淀粉培养基上，菌丝极浓密，

菌落圆整、洁白；在葡萄糖、蔗糖和麦芽糖培养

基上菌丝较浓密，菌落圆整、浅白色。L26 在 5

种碳源培养基上菌丝长势均表现极浓密，除了乳

糖以外，其他 4 种碳源菌丝长势均为圆整、洁白。

L808 菌丝生长速度快，菌丝老化速度也较快，菌

丝长势无显著差异，均为稀疏、灰白色、菌落完整。

申香 34 菌丝长势均为浓密、菌落圆整，在葡萄糖、

乳糖培养基上菌丝呈灰白色，在可溶性糖和蔗糖

上菌丝颜色更为洁白。申香 60 菌丝长势无显著差

异，菌丝长势较浓密、菌落圆整、浅白色。相比

其他菌株，林香 18 在不同碳源培养基上的菌丝萌

发及生长速度慢，但菌丝长势浓密、洁白、菌落

圆整。林香 19 菌丝长势均表现稀疏圆整、浅白色，

在 5 个碳源培养基上生长无显著差异。

2.3.3 不同氮源对香菇菌丝生长速度的影响 由

64

表 4 可知，L26 在不同氮源培养基上生长速率的

表现依次为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏 > 硝酸钾 >

尿素，在蛋白胨、牛肉膏、酵母膏上菌丝生长速

度最快、达 3.75 mm/d；L12 在不同氮源培养基上

生长速率的表现依次为蛋白胨、牛肉膏 > 酵母膏

> 硝酸钾 > 尿素，在蛋白胨、牛肉膏上菌丝生长

速度最快、达 4.17 mm/d；L808、林香 18、林香

19 和浦香 08 在不同氮源培养基上生长速率的表

现依次为牛肉膏 > 酵母膏 > 蛋白胨 > 硝酸钾 > 尿

素，以上 4 种菌株在牛肉膏培养基上利用效果相

对最好，生长速度分别为 4.17、3.34、3.74、4.14

mm/d；申香 34 和申香 60 在不同氮源培养基上生

长速率的表现依次为牛肉膏、酵母膏 > 蛋白胨 >

硝酸钾 > 尿素，两菌株对牛肉膏、酵母膏的利用

效果较好，菌丝生长速度分别为 3.75、3.8 mm/d。

总体来看，8 个菌株在尿素培养基上均无法

生长，在牛肉膏培养基上生长速度最快，在硝酸

钾培养基上菌丝生长速度最慢，L12 菌株菌丝生

长速度最快，林香 18 生长速度明显低于其他 7 个

菌株。

从表 5 可以看出，8 个菌株在尿素培养基上

均不能生长，在硝酸钾培养基上长势无明显差

异，均表现为菌落较圆整，菌丝稀疏、浅白色。

L26、L12、L808、申香 34 和林香 18 等 5 个菌株

在其他 3 种氮源培养基上表现一致，菌丝均极为

浓密、洁白，菌落圆整；申香 60 在蛋白胨、牛肉膏、

酵母膏培养基上菌丝长势较浓密，无明显差异；

林香 19 和浦香 08 在 5 种氮源培养基上表现一致，

均在蛋白胨和牛肉膏上表现菌丝较浓密、洁白、

菌落完整，在酵母膏上表现菌丝极浓密。综上，

在酵母膏培养基上除申香 60 外其他 7 个菌株长势

均为菌丝浓密、洁白、菌落圆整。

2.3.4 不同 C/N 对菌丝生长速度的影响 不同

C/N 条件下，香菇菌丝生长表现出明显差异。由

表 6 可看出，香菇菌丝可以在 7 个不同的 C/N 培

养基中生长，其生长情况各有不同。香菇 L26 在

C/N 为 10/1、20/1、50/1、60/1、70/1 条件下菌丝

生长速度相同，为 3.75 mm/d；L12 在 C/N 为 30/1

条件下，菌丝生长速度最快，为 4.08 mm/d；L808

在 C/N 为 50/1 时菌丝生长速度最快，为 3.97 mm/d；

申香 34 在 C/N 为 30/1 时菌丝生长速度最快，为 3.8

mm/d；申香 60 在 C/N 为 10/1 和 50/1 生长速度相

对较快，为 3.8 mm/d；林香 18 在 10/1 时菌丝生

长最快，为 3.7 mm/d，林香 18 的总体生长速度低

于其他 7 个品种；林香 19 在 70/1-10/1 的 C/N 条

件下，菌丝生长范围在 3.48~3.8 mm/d，10/1 时菌

丝生长速度最快，50/1 速度最慢；浦香 08 在 C/N

为 40/1 时菌丝生长速度最快，为 4.15 mm/d。

由表 7 可知，在不同 C/N 的 7 个处理中，申

香 34、林香 18 与林香 19 无显著差异，申香 34

和林香 18 菌丝极为浓密、洁白，菌落圆整，而林

香 19 菌丝较浓密、浅白色，菌落圆整；L808 在

C/N 为 30/1 时菌丝生长表现浓密洁白，菌落圆整，

其他 6 个处理菌丝生长表现稀疏，为浅白色，菌

落圆整；L12 只在 C/N 为 70/1 时菌丝长势表现稀

表 4 不同氮源对香菇菌丝生长速率的影响

Table 4 Effect of different nitrogen source on mycelial

growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

菌株

Strains

尿素

Urea

蛋白胨

Peptone

牛肉膏

Beef extract

酵母膏

Yeast extract

硝酸钾

Potassium nitrate

L26 0 3.75±0.01aB 3.75±0.01aABC 3.75±0.01aC 3.07±0.10bAB

L12 0 4.17±0.01aA 4.17±0.01aA 4.11±0.01aA 2.84±0.10bAB

L808 0 3.84±0.02cB 4.17±0.01aA 3.98±0.01bAB 2.71±0.05dB

SX34 0 3.73±0.01aB 3.75±0.01aABC 3.75±0.01aC 3.23±0.05bA

SX60 0 3.75±0.01aB 3.80±0.01aAB 3.80±0.01aBC 3.06±0.04bAB

LX18 0 2.86±0.14aC 3.34±0.10aC 3.29±0.10aD 1.76±0.29bC

LX19 0 3.65±0.01aB 3.74±0.01aBC 3.73±0.01aC 2.71±0.10bB

PX08 0 3.63±0.12aB 4.14±0.32aAB 4.06±0.13aA 2.89±0.07bAB

注：同行数据后小写英文字母不同者表示不同氮源下菌丝体生长速

率差异显著，同列数据后大写英文字母不同者表示不同菌株间菌丝体生

长速率差异显著。

Note: Different lowercase letters after data in the same row indicate

significant differences in the growth rate of mycelium with different nitrogen

sources, while different capital letters after data in the same column indicate

significant differences in the growth rate of mycelium between different strains.

表 5 不同氮源对香菇菌丝长势的影响

Table 5 Effect of different nitrogen source on mycelial

growth density of Lentinula edodes

菌株

Strains

尿素

Urea

蛋白胨

Peptone

牛肉膏

Beef paste

酵母膏

Yeast extract

硝酸钾

Potassium nitrate

L26 - +++ +++ +++ +

L12 - +++ +++ +++ +

L808 - +++ +++ +++ +

SX34 - +++ +++ +++ +

SX60 - ++ ++ ++ +

LX18 - +++ +++ +++ +

LX19 - ++ ++ +++ +

PX08 - ++ ++ +++ +

注： “-”代表菌丝不生长；“+”表示菌丝体稀疏；“++”表示菌

丝体较浓密；“+++”表示菌丝体极浓密。

Note: “-” indicates that the mycelium does not grow; “+” indicates

sparse mycelium; “++” indicates that the mycelium is denser; “+++”

indicates that the mycelium is extremely dense.

65

疏、灰白色、菌落圆整，其他处理中菌丝生长表

现差异不大，表现为浓密、浅白色，菌落圆整；

L26 在 C/N 为 10/1 时菌丝长势最好，菌丝洁白、

极为浓密，菌落圆整，其他 6 个处理菌丝较浓密、

洁白、菌落圆整；浦香 08 在 C/N 为 10/1 和 30/1

时菌丝极浓密、菌丝洁白、菌落圆整；申香 60 在

C/N 为 20/1 和 40/1 时菌丝稀疏、浅白色、菌落圆

整， 当 C/N 为 10/1、50/1、60/1、70/1 时 菌 丝 均

较浓密且洁白，菌落圆整，当 C/N 为 30/1 时菌丝

极浓密、洁白、菌落圆整。综合看来，申香 34、

林香 18、林香 19 菌丝长势不受 C/N 的影响，其

他 5 个菌株菌丝长势受 C/N 的影响。

3 讨论

本研究对采自广西大明山的 2 份野生食用

菌标本进行形态特征观察和分子序列分析，发

现从野生标本分离的菌株林香 18 和林香 19 与香

菇 Lentinula edodes 相 似 度 最 高， 在 ITS 构 建 的

系统发育树上聚集在一起，因此将其鉴定为香菇

Lentinula edodes。两份材料的子实体外观形态差

异不大，区别为林香 18 菌盖颜色为浅褐色，而林

香 19 菌盖颜色为深褐色。广西野生香菇的研究报

道较少，陈丽新［16］等曾对十万大山的野生香菇

进行组织分离，认为分离部位不同，菌丝的生长

速度和长势有差异。

野生菌的驯化栽培通常有赖于其菌种的生

物学特性研究。本研究以香菇的 2 株野生菌株和

6 株栽培菌株为试材，测定不同温度、氮源、氮

源、C/N 对菌丝生长的影响，结果显示，供试的

8 株香菇菌丝在 15~30 ℃条件下均可以生长，生

长速度具有一定规律，多数菌株的菌丝生长速度

在 15~25 ℃呈上升趋势，25~30 ℃菌丝生长速度

缓慢，6 株栽培菌株生长的最适合温度均为 25 ℃，

而 2 株野生菌株在 30℃时的菌丝生长速率最高。

同时得出供试 8 个菌株菌丝生长的最适营养条件，

其中 L26 最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨、

牛肉膏或酵母膏，在 7 种不同 C/N 中无显著差别；

L12 最适碳源为葡萄糖，最适氮源是蛋白胨或牛

肉膏，最佳 C/N 是 30/1；L808 最适碳源为蔗糖，

最适氮源为牛肉膏，最适 C/N 为 50/1；申香 34 最

适碳源为可溶性淀粉，最适氮源为酵母膏或牛肉

膏，最适 C/N 为 30/1；申香 60 最适碳源是可溶

性淀粉、麦芽糖或蔗糖，最适氮源为酵母膏或牛

肉膏，最适 C/N 为 10/1、50/1；林香 18 最适碳源

是蔗糖，最适氮源为牛肉膏，最适 C/N 为 10/1；

表 7 不同碳氮比对香菇菌丝长势的影响

Table 7 Effect of different carbon to nitrogen ratios on

mycelial growth density of Lentinula edodes

菌株

Strains 10/1 20/1 30/1 40/1 50/1 60/1 70/1

L26 +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

L12 ++ ++ ++ ++ ++ ++ +

L808 + + ++ + + + +

SX34 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

SX60 ++ + +++ + ++ ++ ++

LX18 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

LX19 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

PX08 +++ ++ +++ + + + +

注： + 表示菌丝体稀疏，++ 表示菌丝体较浓密，+++ 表示菌丝体极

浓密。

Note: “+” indicates sparse mycelium, “++” indicates that the

mycelium is denser, “+++” indicates that the mycelium is extremely dense.

表 6 不同碳氮比对香菇菌丝生长速率的影响

Table 6 Effect of different carbon to nitrogen ratios on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

菌株 Strains 10/1 20/1 30/1 40/1 50/1 60/1 70/1

L26 3.75±0.01aD 3.75±0.01aB 3.73±0.01aABC 3.52±0.02bB 3.75±0.01aBCD 3.75±0.01aABC 3.75±0.01aAB

L12 4.04±0.01aB 3.94±0.05aA 4.08±0.26aA 4.06±0.01aA 3.91±0.04aAB 3.90±0.03aAB 3.94±0.05aA

L808 3.79±0.01abC 3.63±0.1bB 3.72±0.08abABC 3.53±0.11bcB 3.97±0.01aAB 3.55±0.07bcCD 3.33±0.11cC

SX34 3.75±0.01aD 3.75±0.01aB 3.80±0.01aAB 3.61±0.08bcB 3.56±0.05cCD 3.73±0.01abABC 3.75±0.01aAB

SX60 3.80±0.01aC 3.75±0.01bB 3.75±0.01bAB 3.75±0.01bB 3.80±0.01aBC 3.75±0.01bABC 3.75±0.01bAB

LX18 3.70±0.01aE 3.61±0.05abB 3.05±0.06cD 2.98±0.10cC 3.01±0.19cE 3.32±0.07bcD 3.31±0.08bcC

LX19 3.80±0.01aC 3.75±0.01aB 3.58±0.08bcBC 3.71±0.03abB 3.48±0.04cD 3.67±0.06abBC 3.71±0.03abAB

PX08 4.10±0.01aA 3.61±0.02bcB 3.35±0.12cCD 4.15±0.08aA 4.12±0.10aA 3.97±0.18abA 3.64±0.16bcB

注：同行数据后小写英文字母不同者表示不同 C/N 下菌丝体生长速率差异显著，同列数据后大写英文字母不同者表示不同菌株间菌丝体生长速率

差异显著。

Note: Different lowercase letters after data in the same row indicate significant differences in the growth rate of mycelium with different C/N, while different capital

letters after data in the same column indicate significant differences in the growth rate of mycelium between different strains.

66

林香 19 最适碳源是可溶性淀粉，最适氮源为牛肉

膏，最适 C/N 为 10/1；浦香 08 最适碳源为麦芽糖，

最适氮源为牛肉膏，最适 C/N 为 40/1。本研究结

果与已往的文献报道相似，如袁思明等［12］对野

生香菇菌丝最佳生长条件进行研究，菌丝在牛肉

膏上生长最好。熊雪等［13］指出，野生马桑香菇

菌丝的最优碳源为蔗糖，最优氮源为蛋白胨，培

养温度以 23~25 ℃最优。方志荣等［14］认为，香

菇属的最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为酵母膏，

最适培养温度为 25 ℃；伍燕等［17］研究发现，香

菇菌丝在葡萄糖培养基上生长更好，而在尿素上

不能生长。推测多数食用菌菌丝均无法直接利用

尿素，可能是因为尿素在高压灭菌时发生了缩合

反应，生成的缩二脲、缩三脲等无法被菌丝吸收

利用，导致菌丝无法生长。曾茜等［18］发现，野

生香菇黔香筛 5 号母种培养基的最佳碳氮源为葡

萄糖和硫酸铵，最适培养温度 25~30 ℃。廖真等［19］

研究表明，野生香菇菌丝生长的最适碳源为果糖，

最适氮源为牛肉膏，最适生长温度 25 ℃，而在尿

素培养基上菌丝无法生长。本研究结果野生香菇

林香 18 和林香 19 菌丝生长的最适氮源是牛肉膏，

这与袁思明等［12］、廖真等［19］的研究结果一致。

由此推测在蛋白胨和牛肉膏为氮源的处理下，菌

丝长势较好，可能是因为这种复合氮源中营养较

为丰富，能够满足菌丝生长的营养需求。温度方

面，本研究试材野生香菇林香 18、林香 19 与曾

茜等［18］研究的“野生香菇黔香筛 5 号”均为耐

高温野生香菇，与熊雪等［13］研究的野生马桑香

菇、方志荣等［14］研究的野生微香菇属 (Lentinula)

真菌存在差异。

本研究中，8 株香菇在 7 种不同 C/N 培养基

上的菌丝生长速度没有任何规律，但多数菌株在

C/N 为 10/1 时菌丝生长速度最快，而张权［20］研

究发现 5 种香菇（931-9，灵仙一号，南山一号，

9608，L808）的最适 C/N 为 20/1，由此推测不同

品种的香菇在碳源、氮源需求上差异较小，但在

C/N 需求上存在较大差异，同一菌种不同菌株之

间利用碳氮的能力也有所不同。

4 结论

本研究通过形态学和分子学相结合的方法，

将来自广西上林县大明山的两份野生食用菌鉴定

为香菇。通过与 6 个主要栽培菌株进行生物学特

性的比较分析，结果表明，两株野生菌株在 30 ℃

条件下的菌丝生长速度均高于 25 ℃，表现出较强

的耐高温特性，说明野生菌株为耐高温菌株，其

他菌株为中温性品种，生长最适合温度在 25 ℃。

本试验筛选出适宜当地高温气候条件的香菇种质

资源为林香 18 和林香 19，为野生香菇种质资源

的应用，特别是耐高温香菇新品种的选育提供了

新材料及重要参考依据。

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（责任编辑 邹移光）

刘斌，博士，现任广西大学

农学院教授、博士生导师，广西

大学食用菌研究所所长，兼任中

国菌物学会理事、广西食用菌协

会副会长、广西食用菌学会副理

事长。曾任国家现代农业产业技

术体系广西创新团队食用菌产业

首 席 专 家（2011—2020 年 ），

美国哈佛大学访问学者。主要

从事真菌系统分类、食用菌种质

资源评价利用、食用菌病虫害防控等研究，主持国家自然

科学基金、广西自然科学基金重点项目、广西重点研发计

划等项目 20 余项，发现新物种 30 余个。发表学术论文 100

余篇，其中以第一或通信作者在《Fungal Diversity》《Pest

Management Scienc》《Plant Disease》《Journal of Cleaner

Production》等 SCI 期刊发表论文 30 余篇，获授权专利 8 件。

收稿日期：2023-07-13

基金项目：广东省自然科学基金（2023A1515012102）；广东省教育厅青年创新项目（2022KQNCX078）；韶关学

院博士科研启动经费项目（202112）

作者简介：叶红（1988—），女，博士，讲师，研究方向为植物生理，E-mail：19881212hong@163.com

通信作者：王玉昆（1985—），男，博士，副教授，研究方向为植物生理，E-mail：wangyu_kun1@163.com

广东农业科学 2023，50（9）：68-78

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.007

叶红，王斌，任飞，朱云娜，肖艳辉，何金明，王玉昆 . 园艺植物 WRKY 基因功能研究进展［J］. 广东农业科学，2023，50（9）：

68-78.

园艺植物 WRKY 基因功能研究进展

叶 红，王 斌，任 飞，朱云娜，肖艳辉，何金明，王玉昆

（广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室 / 韶关学院生物与农业学院，广东 韶关 512005）

摘 要：WRKY 转录因子是植物中特有的一类反式作用因子。WRKY 基因家族成员众多，是植物中最大的

转录因子家族之一。目前，已在多种园艺植物中对该家族进行了全基因组鉴定。大量研究表明，WRKY 转录因

子参与了植物中多种生物学过程，如营养剥夺、胚胎发生、种子发育、毛状体发育、叶片衰老及其他发育和激

素调节的过程，是许多调控信号网络的重要组成部分。WRKY 转录因子还可参与植物适应各种逆境的转录调控，

已被证明其在生物应激反应中发挥重要作用并参与植物的防御机制，其在植物防御病菌、病毒和虫害调控过程

中的重要作用正被逐步揭示。此外，WRKY 转录因子在植物响应环境中非生物胁迫方面的作用也被不断解析，

其可参与调控植物对干旱、温度、盐及渗透的响应，并在此过程中发挥正向或负向调节作用。本文基于近年来

的相关研究成果，重点综述了 WRKY 转录因子在园艺植物生长发育、胁迫响应和代谢合成方面所发挥的作用和

调控机理，进一步明确园艺植物 WRKY 转录因子的重要生物学功能，阐明 WRKY 转录因子介导的转录调控网络，

为园艺植物优良性状相关的遗传资源挖掘和分子育种提供理论支撑。

关键词：园艺植物；WRKY 转录因子；生物胁迫；非生物胁迫；生长发育

中图分类号：S601 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2023）09-0068-11

Research Progress of WRKY Gene Functions in

Horticultural Plants

YE Hong, WANG Bin, REN Fei, ZHU Yunna, XIAO Yanhui, HE Jinming, WANG Yukun

（Guangdong Key Laboratory of Utilization and Conservation of Food and Medicinal Resources in

Northern Region /School of Biology and Agriculture, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China）

Abstract: WRKY transcription factors are a class of trans-acting factors unique to plants. WRKY gene family has

many members and is one of the largest families of transcription factors in plants. At present, the WRKY transcription factor

family has been genome-wide identified in various horticultural plants. A large number of studies have shown that WRKY

transcription factors are involved in various biological processes in plants, such as nutrient deprivation, embryogenesis,

seed development, trichome development, leaf senescence, and other developmental and hormonal regulation processes.

They are important components of many regulatory signal networks. WRKY transcription factors play an important role in

the transcriptional regulation mechanism of plant adaptation to various stress environments. It has been shown to play an

important role in biological stress response and participate in plant defense mechanisms. Its important role in the regulation

of plant defense against pathogens, viruses and pests is gradually being revealed. In addition, the role of WRKY transcription

factors in plant response to environmental abiotic stresses has been continuously analyzed. WRKY transcription factors are

involved in regulating plant response to drought, temperature, salt and osmosis, and plays a positive or negative regulatory

69

由于植物无法移动，因此生存环境的变化几

乎对其各生长发育阶段均有影响。为适应环境变

化，植物进化出复杂的信号系统来感知各种生物

和非生物刺激，并将这种能力保存并延续到下一

代［1］。 转 录 因 子（Transcription Factors, TF） 是

生物体各种信号通路的重要组成部分，除了能对

胞内信号进行响应外，还介导了植物对生物和非

生物刺激的应答过程。WRKY TF 是植物中最大

的转录调控家族之一，其成员已在多种植物基因

组 中 被 鉴 定。 如 萝 卜（Raphanus sativus）［2］、

空 心 菜（Ipomoea aquatica）［3］ 和 苹 果（Malus

domestica）［4］等园艺植物的基因组中分别含有

126、82、127 个 WRKY 基因家族成员。

典型的 WRKY DNA 结合域的特征是在蛋白

序列的 N 端有 1 个“WRKYGQK”的氨基酸基

序，在其 C 端含有非典型的锌指结构基序。随着

WRKY 成员在不同植物中被鉴定，发现 WRKY

蛋白的结构和功能具有明显的多样性，其基因

和蛋白质数量、内含子数量及 DNA 结合序列在

不同植物之间存在差异。依据 WRKY 蛋白的一

级结构，该家族成员可聚类到 7 个亚组，即Ⅰ、

Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe 和Ⅲ亚组。WRKY 基

因通过其两端的特异性结构域结合靶基因启动

子中的 W-box 顺式元件，从而激活或抑制靶基

因转录［5］。越来越多的研究表明，WRKY TF 几

乎参与了植物所有的生长发育调控过程，且单个

WRKY TF 可能参与多个信号调节通路［6］。相比

模式植物拟南芥和其他主要粮食作物，WRKY 基

因家族成员及其生物学功能在园艺植物中的挖掘

和揭示还不够深入，但也取得了一些进展，因此

有必要对已取得的成果进行归纳总结。本文综述

了目前园艺植物中 WRKY 基因家族的研究进展，

以期为今后更加深入研究该家族成员功能提供

参考。

1 WRKY 基因在园艺植物生物胁迫应答

中的作用

1.1 WRKY 基因在园艺植物病害中的作用

植物在生长发育过程中会遭受一系列生物胁

迫，而病原体攻击是其面临的一大威胁。在长期

的进化过程中，植物获得了多种免疫应答能力，

通过相应的免疫应答通路对病原体进行抵抗。

WRKY TF 相关研究结果（表 1）表明，该家族的

许多成员在植物免疫应答相关的转录调控中发挥

重要作用［5］。

在辣椒（Capsicum annuum）中，CaWRKY40b

能够调控一系列免疫相关基因的表达对青枯菌

（Ralstonia solanacearum）作出应答［7］，过表达

CaWRKY40基因能够调节超敏反应（Hypersensitive

response, HR）相关基因和发病相关基因，从而

增强辣椒对青枯菌的抗性［8］。CaWRKY6 基 因

通过与 CaWRKY40 的启动子结合从而激活其表

达，进而增强辣椒对青枯菌的抗性［9］。此外，

CaWRKY41 基因的表达受到青枯病菌的诱导，

瞬时沉默该基因的表达使辣椒对青枯菌的感病

性增强，说明该基因参与正向调控辣椒对青枯

菌的抗性［10］。黄单胞菌外蛋白 S（Xanthomonas

outer protein S） 能 够 与 CaWRKY40a 蛋 白 结 合

并增强其稳定性，从而降低辣椒对黄单胞菌的

抗 性［11］。CaWRKY50 基因的表达受到炭疽菌

（Colletotrichum musae） 侵 染 的 诱 导， 沉 默 该

基因的表达增加了辣椒对炭疽菌的抗性，说明

该基因是辣椒抗炭疽菌的负调控因子［12］。在中

国野生葡萄（Vitis pseudoreticulata）中克隆到的

VpWRKY1 和 VpWRKY2 基因在其异位表达的拟

南芥中增强了其对白粉病菌的抗性［13］。此外，

白粉病菌侵染能上调 VpWRKY53 基因的表达，

在拟南芥中异源过表达 VpWRKY53 基因增加了

role in this process. Based on the relevant research results in recent years, the roles and regulatory mechanisms of WRKY

transcription factors in the growth and development, stress response and metabolic synthesis of horticultural plants are reviewed

in this paper. Meanwhile, the important biological functions of WRKY transcription factors in horticultural plants are further

clarified as well. Furthermore, the transcriptional regulation network mediated by WRKY transcription factors is elucidated,

which will provide theoretical supports for genetic resources and molecular breeding related to excellent traits of horticultural

plants.

Key words: horticultural plants; WRKY transcriptional factor; biotic stress; abiotic stress; growth and development

70

转基因拟南芥对番茄丁香假单胞菌 PstDC3000

的抗性［14］。 从 中 国 野 生 毛 葡 萄（Chinese wild

V. quinquangularis）中克隆到的 VqWRKY52 基

因也与白粉病菌的抗性有关，其在受到白粉病

菌侵染 24 h 后显著表达。在拟南芥中异位表达

VqWRKY52 基因增强了转基因拟南芥对白粉病

菌的抗性［15］。VqWRKY31 基因也能对白粉病菌

侵染作出响应，并促进代谢途径中基因的表达

和许多抗病相关代谢产物的积累，包括二苯乙

烯、类黄酮和原花青素，从而增强葡萄的白粉病

抗性［16］。中国野生毛葡萄 VqWRKY6 能够和转

录因子 VqbZIP1 互作形成转录复合体。共同过

表达 VqWRKY6 和 VqbZIP1 后，叶片表面白粉菌

菌丝扩繁速率显著慢于单独过表达 VqWRKY6 和

单独过表达 VqbZIP1 的叶片，说明 VqWRKY6 和

VqbZIP1 协同作用能抑制白粉菌的生长，从而提

高葡萄对白粉病的抗性［17］。VqWRKY56 基因的

表达受到白粉菌侵染的显著诱导，其在葡萄中的

过表达降低了对白粉病的易感性［18］。另外，在

拟南芥中过表达野生二倍体林地草莓（(Fragaria

vesca）WRKY46 基因增强了转基因拟南芥对白粉

病菌的抗性［19］。在黄瓜（Cucumis sativus）中，

CsWRKY10 在 黄 瓜 对 灰 霉 菌（Botrytis cinerea）

的抗性中起关键作用。CsWRKY10 的过表达显著

增加了黄瓜对灰霉菌的敏感性。病原菌侵染后，

转基因黄瓜植株过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和

过氧化物酶活性受到影响，导致活性氧 (Reactive

oxygen species, ROS) 含量降低。同时，CsWRKY10

的过表达促进了灰霉菌的孢子萌发和菌丝伸

长［20］。另一个黄瓜基因 CsWRKY50 参与了黄瓜

对霜霉病（Pseudoperonospora cubensis）的响应。

CsWRKY50 在黄瓜中的过表达增强了该植物对黄

瓜霜霉病的抗性［21］。香蕉（Musa acuminata）中

的2个 WRKY 基 因（MaWRKY1 和 MaWRKY2）

能够在病害反应中调节特定发病相关基因的表

达来增加对炭疽菌的抗性［22］。在苹果抗病品种

‘Sushuai’中，MdWRKY75d 和 MdWRKY75e 基因

的 表 达 受 到 链 格 孢 菌（Alternaria alternata） 的

诱导，其瞬时表达增强了转基因烟草和苹果对

链格孢菌感染的抗性［23］。苹果 MdWRKY15 通

过直接与 MdICS1 启动子结合来激活 MdICS1 的

转录，增加了水杨酸（Salicylic acid, SA）的积累

和疾病相关基因的表达，从而通过 SA 生物合成

途径增强对轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）

的抗性［24］。 类 似 的 研 究 表 明，MdWRKY46 通

过激活 MdPBS3.1 的表达，从而依赖 SA 信号途

径增强了苹果对轮纹病的抗性［25］。MdWRKY100

是 苹 果 炭 疽 病 抗 性 的 正 调 控 因 子， 过 表 达

MdWRKY100 增 加 了 苹 果 对 炭 疽 菌 的 抗 性， 而

利 用 RNAi 沉 默 的 转 基 因 植 株 对 炭 疽 菌 更 敏

表 1 参与园艺植物生物胁迫应答的 WRKY 基因

Table 1 WRKY genes involved in biotic stress responses in

horticultural plants

基因名称

Gene name

物种

Species

胁迫类型

Stress type

参考文献

Reference

CaWRKY6 辣椒 病害（青枯菌） ［9］

CaWRKY40 辣椒 病害（青枯菌） ［8］

CaWRKY40a 辣椒 病害（黄单胞菌） ［11］

CaWRKY40b 辣椒 病害（青枯菌） ［7］

CaWRKY41 辣椒 病害（青枯菌） ［10］

CaWRKY50 辣椒 病害（炭疽菌） ［12］

VpWRKY1 中国野生葡萄 病害（白粉菌） ［13］

VpWRKY2 中国野生葡萄 病害（白粉菌） ［13］

VpWRKY53 中国野生葡萄 病害（PstD3000） ［14］

VqWRKY6 中国野生毛葡萄 病害（白粉菌） ［17］

VqWRKY31 中国野生毛葡萄 病害（白粉菌） ［16］

VqWRKY52 中国野生毛葡萄 病害（白粉菌） ［15］

VqWRKY56 中国野生毛葡萄 病害（白粉菌） ［18］

FvWRKY46 野生二倍体林地草莓 病害（白粉菌） ［19］

CsWRKY10 黄瓜 病害（灰霉菌） ［20］

CsWRKY50 黄瓜 病害（霜霉菌） ［21］

MaWRKY1 香蕉 病害（炭疽菌） ［22］

MaWRKY2 香蕉 病害（炭疽菌） ［22］

MdWRKY15 苹果 病害（轮纹病菌） ［24］

MdWRKY31 苹果 病害（PstD3000） ［27］

MdWRKY46 苹果 病害（轮纹病菌） ［25］

MdWRKY75d 苹果 病害（链格孢菌） ［23］

MdWRKY75e 苹果 病害（链格孢菌） ［23］

MdWRKY100 苹果 病害（炭疽菌） ［26］

CsWRKY14 茶树 病害（茶饼病菌） ［28］

SlWRKY30 番茄 病害（青枯菌） ［29］

ShWRKY81 多毛番茄 病害（白粉菌） ［30］

SmWRKY65 茄子 病害（青枯菌） ［31］

CsWRKY23 柑橘 病害（绿霉菌） ［32］

CsWRKY25 柑橘 病害（绿霉菌） ［33］

CsWRKY33 柑橘 病害（绿霉菌） ［34］

RcWRKY41 月季 病害（灰霉菌） ［35］

CmWRKY15 菊花 病害（链格孢菌） ［36］

CmWRKY15-1 菊花 病害（白锈病菌） ［37］

CmWRKY8-1 菊花 病害（尖孢镰刀菌） ［38］

CmWRKY48 菊花 虫害（蚜虫） ［40］

CmWRKY53 菊花 虫害（蚜虫） ［39］

VvWRKY46 葡萄 虫害（根瘤蚜） ［41］

71

感［26］。苹果 MdWRKY31 能够在转录和翻译水

平调控 MdHIR4 的 表 达， 并 依 赖 于 SA 信 号 途

径增强转 MdWRKY31 基因拟南芥和烟草对病

原 菌 PstDC3000 的 抗 性［27］。 在 茶 树（Camellia

sinensis）中，一个属于 IIb 亚组的 CsWRKY14 基

因能够响应茶饼病菌（Exobasidium vexans），且

CsWRKY14 基因沉默的植物对茶饼病菌的敏感性

增加［28］。此外，研究人员在 WRKY 基因参与番

茄抗病应答方面也取得了一些进展。SlWRKY30

基因受到青枯菌的强烈诱导，过表达该基因可

降 低 番 茄 对 青 枯 菌 的 易 感 性， 并 促 进 H2

O2 的

积累和细胞坏死，表明 SlWRKY30 正向调节番

茄对青枯菌的抗性［29］。在多毛番茄（Solanum

habrochaites） 中，ShWRKY81 在抗白粉病株系

LA1777 中的表达水平高于易感株系。利用 VIGS

沉默该基因导致宿主对白粉菌的抵抗力下降，表

明 ShWRKY81 正向调控多毛番茄对白粉菌的抗

性［30］。研究人员在茄子（Solanum melongena）

中克隆到与青枯病相关的 SmWRKY65 基因，该基

因在根中的表达水平最高且响应青枯菌的诱导。

利用 VIGS 技术沉默 SmWRKY65 基因的植株对青

枯菌的感病性明显升高，表明该基因是调控茄子

青枯病的正向调节子［31］。此外，研究人员在柑

橘抗绿霉菌（Penicillium digitatum）方面取得进展，

研究表明 CsWRKY23、CsWRKY25 和 CsWRKY33

参与了柑橘响应绿霉菌的调控。CsWRKY23 能够

对外源 SA 诱导产生应答，其在柑橘果皮中的瞬

时过表达增强了对绿霉菌的抗性［32］。CsWRKY25

的转录水平在感染绿霉菌的柑橘皮中上调，其过

表达能增强柑橘对绿霉菌的抗性［33］。CsWRKY33

通过结合自身启动子的W-box元件进行自我调节，

其瞬时过表达显著增强了宿主对绿霉菌的抗性［34］。

除上述蔬菜瓜果类植物外，一些研究表明

WRKY TF 也参与了观赏花卉对生物胁迫应答的

调 控。 在 月 季（Rosa chinensis） 中， 通 过 VIGS

技术敲低 RcWRKY41 基因的表达导致转基因月季

花瓣产生严重的灰霉病症状且其病斑大小显著增

加，说明RcWRKY41基因对月季抗灰霉病有正向调

控作用［35］。菊花（Chrysanthemum morifolium）

CmWRKY15 属于 IIa 亚组 WRKY TF，其表达受

到 链格孢菌的强烈诱导。与对照相比，过表达

CmWRKY15 增强了菊花对链格孢菌的易感性，

表明 CmWRKY15 基因是菊花抗链格孢菌的负调

控因子［36］。抗病基因 CmWRKY15-1 能直接调控

CmNPR1 （Non-expressor of pathogenesis-related

genes 1）基因的表达，二者互作激活了下游发病

机制相关基因的表达并通过 SA 途径增强对菊花

白锈病菌（Puccinia horiana）的抗性［37］。从菊

花品种‘Jinba’中克隆到的 CmWRKY8-1 基因参

与了菊花对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）

的响应，过表达 CmWRKY8-1-VP64 融合基因降低

了菊花对尖孢镰刀菌的抗性［38］。

1.2 WRKY 基因在园艺植物虫害中的作用

植食性昆虫对植物的生存构成威胁，植物在

生长过程中与植食性昆虫的相互作用及其调控机

制是植物研究方面的重要问题。近年来的一些研

究揭示了 WRKY 转录因子在园艺植物抵御虫害中

的调控作用。菊花容易受到蚜虫的侵袭，研究发

现菊花 CmWRKY53 基因表达受到蚜虫侵扰的诱

导。与对照和 CmWRKY53 基因敲低植株相比，

过表达 CmWRKY53 基因导致蚜虫数量显著增加，

表明该基因是菊花抗蚜虫的负调节因子［39］。

相反地，在菊花中过表达 CmWRKY48 基因显著

降低了蚜虫的生长数量，说明 CmWRKY48 基因

是菊花抗蚜虫的正向调节因子［40］。葡萄（Vitis

vinifera）VvWRKY46 基因能够响应葡萄根瘤蚜攻

击，过表达 VvWRKY46 显著降低葡萄根瘤蚜的侵

袭性，减缓若虫发育［41］。

2 WRKY 基因在园艺植物非生物胁迫应

答中的作用

2.1 WRKY 基因在园艺植物干旱胁迫应答中的

作用

干旱是常见的非生物胁迫之一，也是世界

性的环境难题。干旱严重影响植物的分布区域、

生长状态、产量和最终品质，深入研究园艺植

物耐旱抗旱的分子机制十分必要。WRKY TF 在

园艺植物响应干旱胁迫中具有十分重要的作用

（表 2）。山葡萄（Vitis amurensis）VaWRKY14 基

因 编 码 1 个 IIa 亚 组 WRKY TF。 在 拟 南 芥 中 过

表达 VaWRKY14 基因增强了转基因植株的耐旱

能力。进一步的转录组分析表明，该基因可能

通过调控胁迫相关基因的表达从而增强转基因

拟南芥的抗旱性［42］。另一个在葡萄中克隆的基

因 VvWRKY18 受到干旱和脱落酸（Abscisic acid,

ABA） 的 诱 导。VvWRKY18 过表达的拟南芥叶

72

片表现出气孔密度增加和失水率提高，导致对

干旱的耐受性降低［43］。在拟南芥中过表达枇杷

（Eriobotrya japonica）EjWRKY17 基因，在干旱

胁迫下可促进 ABA 介导的气孔关闭，显著上调转

基因植株中 ABA 的生物合成和胁迫相关基因的表

达，从而增强转基因拟南芥的耐旱性［44］。苹果

MdWRKY17 基因表达受到缺水的显著诱导。在中

度干旱胁迫下，过表达 MdWRKY17 的转基因苹果

植株叶绿素含量和光合作用速率显著高于对照，

而在 MdWRKY17 敲低株系中则显著低于对照，

表明该基因对苹果耐旱性有正向调控作用［45］。

苹果 MdWRKY3 基因受到干旱胁迫诱导，能够提

高转基因烟草的相对含水量等生理指标，增强转

基因烟草的耐旱性［46］。FcWRKY70 基因从金柑

（Fortunella crassifolia）克隆获得，在烟草和柠

檬中过表达该基因可增强相关转基因植物的耐寒

能力。进一步分析表明 FcWRKY70 能够与精氨

酸脱羧酶基因（FcADC）互作。在金桔中敲低

FcWRKY70 的表达降低 FcADC 的表达水平，表

明 FcWRKY70-FcADC 模块可能参与了金桔的抗

旱调控［47］。在菊花中，CmWRKY10 的表达受到

干旱的诱导。与野生型相比，过表达 CmWRKY10

提高了菊花对干旱胁迫的耐受性且促进了 ABA 信

号通路相关基因的表达［48］。

2.2 WRKY 基因在园艺植物盐胁迫应答中的作用

土壤盐渍化是植物生长发育和农业生产面临

的重大环境问题。研究表明，预计到 21 世纪中叶，

全球将有 50% 以上的耕地受到土壤盐渍化的影

响［49］。近年来的研究表明，WRKY TF 在园艺植

物盐胁迫应答以及耐盐调控方面发挥重要作用（表

2）。在辣椒中，CaWRKY27 基因的表达受盐胁迫

的诱导。过表达 CaWRKY27 基因的拟南芥和烟草

对盐胁迫更加敏感，其根长和地上部分生长受到

明显抑制。利用 VIGS 技术瞬时沉默 CaWRKY27

基因增强了辣椒对盐胁迫的抗性，表明该基因负

调控辣椒对盐胁迫的抗性［50］。在受到盐胁迫的

不结球白菜中，BcWRKY33A 基因在根组织中显

著表达。沉默 BcWRKY33A 基因的表达使不结球

白菜对盐胁迫更加敏感［51］。在盐处理的番茄中，

SlWRKY23 基因表达水平升高。SlWRKY23 在拟南

芥中过表达增强了对 NaCl 的胁迫耐受性，并影响

根系生长和侧根数［52］。在苹果中，MdWRKY55

能够和 MdNHX1 形成复合体参与盐胁迫的调控。

过表达 MdWRKY55 显著提高了苹果对盐胁迫的抗

性［53］。MdWRKY100 的表达受到 miR156/SPL 模

块的激活和调控。过表达 MdWRKY100 显著增强

了苹果对盐胁迫的抗性［54］。苹果 WRKY Ⅱa 亚

组成员 MdWRKY30 的表达受到盐处理的诱导，

其过表达可通过调控胁迫相关基因增强转基因苹

果愈伤组织对盐胁迫的耐受性［55］。此外，菊花

耐盐研究也取得了一些进展，DgWRKY2 在菊花

中的过表达增强了对盐胁迫的耐受性，该基因通

过增强抗氧化和渗透调节，赋予转基因菊花耐盐

性［56］。DgWRKY4 受盐胁迫诱导，是一个响应盐

胁迫的正调控基因，其通过提高光合能力、促进

活性氧清除系统的运行、维持膜稳定性、增强渗

透调节和上调胁迫相关基因的转录水平增加菊花

对盐胁迫的耐受性［57］。DgWRKY5 在菊花耐盐调

控上发挥正向调控作用。在转 DgWRKY5 基因的

菊花中，根长、鲜重、叶绿素含量和叶片气体交

换参数等指标均优于野生对照 ［58］。与之相反，

DgWRKY17 在菊花耐盐调控上发挥负调控作用。

在盐胁迫下，转 DgWRKY17 基因的菊花叶片中超

氧化物歧化酶、过氧化物酶和脯氨酸含量显著低

于对照，而叶片电导率则有所增加［59］。

表 2 参与园艺植物非生物胁迫应答的 WRKY 基因

Table 2 WRKY genes involved in abiotic stress responses

in horticultural plants

基因名称

Gene name

物种

Species

胁迫类型

Stress type

参考文献

Reference

VaWRKY14 山葡萄 干旱 ［42］

VvWRKY18 葡萄 干旱 ［43］

EjWRKY17 枇杷 干旱 ［44］

MdWRKY3 苹果 干旱 ［46］

MdWRKY17 苹果 干旱 ［45］

FcWRKY70 金柑 干旱 ［47］

CmWRKY10 菊花 干旱 ［48］

CaWRKY27 辣椒 盐 ［50］

BcWRKY33A 不结球白菜 盐 ［51］

SlWRKY23 番茄 盐 ［52］

MdWRKY30 苹果 盐 ［55］

MdWRKY55 苹果 盐 ［53］

MdWRKY100 苹果 盐 ［54］

DgWRKY2 菊花 盐 ［56］

DgWRKY4 菊花 盐 ［57］

DgWRKY5 菊花 盐 ［58］

DgWRKY17 菊花 盐 ［59］

CsWRKY46 黄瓜 低温 ［60］

VvWRKY28 葡萄 低温 ［61］

CaWRKY27 辣椒 高温 ［62］

LlWRKY22 百合 高温 ［63］

LlWRKY39 百合 高温 ［64］

73

2.3 WRKY 基因在园艺植物温度胁迫应答中的

作用

温度胁迫属于重要的非生物胁迫类型，能

够从生长发育、产量和地理分布范围方面对植物

产生影响。近年来，全球气候的不稳定导致极端

高温和低温事件频发。因此，探究植物对温度

胁迫的响应机理具有十分重要的意义。研究表

明，WRKY 基因参与了园艺植物对温度胁迫的调

控途径（表 2）。研究者从黄瓜中克隆并鉴定了

CsWRKY46，其在冷胁迫和外源 ABA 处理下表达

上调。与野生型相比，过表达 CsWRKY46 的转基

因拟南芥在低温处理后具有更高的幼苗存活率。

此外，CsWRKY46 过表达系在种子萌发过程中对

ABA 敏感，表明 CsWRKY46 以 ABA 依赖的方式

正向调节低温信号通路［60］。葡萄 VvWRKY28 基

因在叶片中高表达，并受到低温胁迫的诱导。

VvWRKY28 过表达可影响转基因拟南芥丙二醛、

叶绿素和脯氨酸含量等指标，从而提高转基因拟

南芥对低温的耐受性［61］。在辣椒中，CaWRKY27

的表达水平在高温胁迫期间升高，并在温度恢复

期间持续表达。CaWRKY27 过表达的拟南芥和烟

草在高温胁迫下存活率降低，而 CaWRKY27 沉默

的辣椒在高温胁迫下存活率升高。此外，在 H2

O2

清除剂存在下，CaWRKY27 的表达在热胁迫下

受到抑制，而 CaWRKY27 沉默减少了 H2

O2 在辣

椒叶片中的积累。因此，CaWRKY27 为 H2

O2 介

导高温应激反应的下游负调节因子［62］。在百合

（Lilium longifl orum） 中，LlWRKY22 的表达被

热刺激持续激活。同时，LlWRKY22 在百合中的

过表达提高了百合的耐热性，并激活了与热相关

的 LlDREB2 基 因 的 表 达。LlWRKY22 的沉默导

致百合耐热性下降，说明 LlWRKY22 可能参与百

合耐热性调控［63］。百合 LlWRKY39 基因也受到

高温的诱导。LlWRKY39 的异位表达提高了转基

因百合和拟南芥的耐热性。此外，LlWRKY39、

LlMBF1c、LlCaM3 形成反馈调节通路来调控百合

对高温的应答［64］。

3 WRKY 基因在园艺植物生长发育和物

质合成中的作用

3.1 WRKY 基因在园艺植物生长发育中的作用

大量研究表明，WRKY TF 广泛参与植物的

各种生长发育调控（表 3）。在园艺植物果实

成熟和器官衰老调控方面的相关研究也取得了

一 些 进 展。 在 草 莓（Fragaria × ananassa）

中，FaWRKY71 在 所 有 组 织 中 都 有 表 达， 尤 其

是在全红果实中。此外，FaWRKY71 促进类黄

酮途径结构基因 FaF3’H、FaLAR、FaANR 及

运输因子 FaTT19 和 FaTT12 的表达，并通过上

调 FaPG19 和 FaPG21 的表达丰度来软化草莓

的质地，促进草莓果实成熟［65］。在野生草莓

（Fragaria vesca） 中， 过 表 达 FvWRKY48 导 致

果实中果胶细胞壁聚合物高半乳糖醛酸的降解

加 剧。 此 外，FvWRKY48 能够结合 FvPLA 的 启

动子对其进行调控。FvPLA 过表达果实的软化

和果胶降解程度比对照果实更高，故 FvWRKY48

可能通过促进 FvPLA 的表达来调控野生草莓果

胶降解和果实软化［66］。在番茄中，SlBRG3 在

Cys206 和 Cys212 处发生过硫化，导致泛素化活

性降低，与 SlWRKY71 转录物的相互作用减少，

导致 SlWRKY71 与 SlCAS1 启动子的结合活性增

加，导致其转录抑制，从而延迟番茄成熟［67］。

休眠是植物在不合适的条件下暂时停止生长的常

见生存策略。在葡萄中，VvWRKY37 基因在休眠

芽中高度表达。VvWRKY37 的异位过表达显著延

迟了转基因杨树植株的萌芽。VvWRKY37 还抑制

了 ABA 分解代谢基因 CYP707As 的表达，并提高

内源 ABA 在转基因杨树中的积累，表明该基因可

能通过 ABA 介导的信号通路调节萌芽［68］。在观

赏植物芍药（Paeonia lactifl ora）中，PlWRKY41a

表 3 参与园艺植物生长发育和代谢物合成的 WRKY 基因

Table 3 WRKY genes involved in growth, development,

and metabolite biosynthesis in horticultural plants

基因名称

Gene name

物种

Species

参与过程

Participation process

参考文献

Reference

FaWRKY71 草莓 果实成熟 ［65］

FvWRKY48 野生草莓 果实软化 ［66］

SlWRKY71 番茄 果实成熟 ［67］

VvWRKY37 葡萄 萌芽 ［68］

PlWRKY41a 芍药 次生细胞壁发育 ［69］

SlWRKY37 番茄 叶片衰老 ［70］

BrWRKY12 菜心 硫代葡萄糖苷合成 ［71］

CsWRKY70 茶树 EGCG 合成 ［72］

CmWRKY41 菊花 倍半萜烯合成 ［73］

PpWRKY44 梨 花青素合成 ［74］

MdWRKY71-L 苹果 花青素合成 ［75］

MdWRKY75 苹果 花青素合成 ［76］

PpWRKY44 梨 苹果酸合成 ［77］

MdWRK31 苹果 苹果酸合成 ［78］

74

基因在茎组织中高度表达。此外，PlWRKY41a 能

与木聚糖内转葡糖基化酶 / 水解酶 E4（PlXTH4）

的 启 动 子 结 合， 并 激 活 PlXTH4 表 达。 过 表 达

PlXTH4 的烟草具有较厚的次生细胞壁，导致茎

强度增加，而 PlXTH4 沉默的芍药具有较薄的次

生细胞壁，茎强度降低，表明 PlWRKY41a 在芍

药次生细胞壁发育过程中有重要调控作用［69］。

番茄 WRKY 转录因子 SlWRKY37 能够对茉莉酸

（Jasmonic acid, JA）和暗诱导的叶片衰老过程进

行调控。SlWRKY37 的敲除抑制了 JA 诱导和暗诱

导的叶片衰老［70］。

3.2 WRKY 基因在园艺植物代谢物合成过程中的

作用

WRKY TF 在园艺植物代谢物质合成调控中也

具有重要作用（表 3）。硫代葡萄糖苷是一种含硫、

氮的次生代谢产物，广泛存在于芸苔属植物中。

在菜心（Brassica campestris）中，BrWRKY12 可

以直接与 BrLOX4 启动子区结合并激活其转录。

沉默 BrWRKY12 降低了 JA 含量、下调了 BrLOX4

表达，并减少了硫代葡萄糖苷的积累［71］。表没

食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate,

EGCG）是造成茶（Camellia sinensis）苦涩的重

要因素。CsWRKY70 是从茶中克隆的一个 WRKY

TF，能够结合 EGCG 生物合成关键酶基因 CsLAR

和 CsUGT84A 的启动子并调控其表达，从而影响

EGCG 在茶中的生物合成［72］。萜类化合物是挥

发油的主要成分，在菊花中含量丰富。3- 羟基 -3-

甲基戊二酰 -CoA 还原酶 2（CmHMGR2）和法尼

基焦磷酸合成酶 2（CmFPPS2）在菊花萜类化合

物的生物合成中起着关键作用。CmWRKY41 可以

通过 GTGACA 或 CTGACG 元件直接与 CmHMGR2

或 CmFPPS2 的启动子结合，并激活其表达以促

进倍半萜烯（Sesquiterpenes）的生物合成［73］。

花青素是人类饮食中抗氧化剂的来源，有助于水

果 着 色。PpWRKY44 基 因 是 从 梨（Pyrus L.） 中

鉴定到的一个光诱导 WRKY 基因家族成员。在梨

叶片和果皮中瞬时过表达 PpWRKY44 显著增强了

花青素的积累，而在梨果皮中沉默 PpWRKY44 则

削弱了光对花青素积累的诱导［74］。MdWRKY75

的过表达促进了苹果‘Orin’愈伤组织中花青素

的积累。进一步研究表明，MdWRKY75 主要通过

与 MYB 转录因子 MdMYB1 的启动子结合来调控

苹果花青素的积累［75］。此外，MdWRKY71-L 的

过表达促进了花青素在苹果愈伤组织中的积累。

MdWRKY71-L 主要通过与 MdMYB1 和 MdUFGT

的启动子相互作用来调控花青素积累［76］。苹果

酸盐会影响果实酸度，在植物抗逆方面起至关重

要的作用。在梨中，PpWRKY44 通过直接结合苹

果酸相关基因 PpALMT9 启动子上的 W-box 元件

来激活其表达，从而参与盐诱导的苹果酸积累［77］。

最 近 的 研 究 表 明， 在 苹 果 中 存 在 MdWRKY31-

MdERF72-MdALMT9 基因模块，能够调节果实中

苹果酸的积累［78］。

4 展望

近 年 来， 关 于 WRKY TF 参 与 调 控 园 艺 植

物生长发育以及抗逆机制的研究已取得长足进

步，但相比在其他作物中的研究［79-80］依然不够

丰富。越来越多的园艺植物进行了多类型的高通

量测序，获得了大量的高质量基因组信息和基因

表达信息，为园艺植物分子生物学的研究提供了

有力支撑。此外，得益于生理学、化学遗传学和

生物信息学等技术手段的应用，园艺植物 WRKY

TF 介导的信号转导和调控的细节被逐步揭示，

使得人们对园艺植物应对自身及外界刺激的复杂

机制有了进一步了解。但相对于模式植物和主要

农作物，园艺植物依然受转基因难度大、效率低

的限制，许多研究只能在一些模式植物中进行基

因过表达，且很难获得本体稳定转基因的株系，

严重影响了园艺植物的分子育种研究。因此，加

速园艺植物转基因技术的研究，建立高效、稳定

的园艺植物转基因体系是亟待解决的热点问题。

CRISPR/Cas9 基因编辑技术已在许多植物中实现

高效稳定的应用，未来应大力发展该技术在园艺

植物中的研究和应用。

此外，WRKY 家族作为植物中特有的转录因

子家族，其在园艺植物中的数量相对庞大。现有

对园艺植物 WRKY TF 的功能研究只是冰山一角，

更重要的是，许多 WRKY 家族成员的功能并不单

一。目前多数研究仅对 WRKY 基因进行单一方面

的研究，并不能很好地揭示其更多的功能。因此，

未来应该挖掘单一 WRKY TF 的多种功能，挖掘

并鉴定一些具有主效、核心功能的 WRKY 基因。

同时，由于全球环境不稳定，极端气候频发，园

艺植物的生长发育和品质形成面临来自环境的巨

大挑战。极端温度、干旱、盐碱和病虫害可能进

75

一步影响甚至危害园艺植物的生长发育。因此，

未来应该加速挖掘 WRKY TF 在园艺植物抗逆方

面的重大作用，鉴定一些具有明显效用的 WRKY

候选基因，为园艺植物分子育种提供优良的遗传

资源，加速园艺植物分子育种进程。

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（责任编辑 陈丽娥）

叶红，博士，讲师，韶关学院

生物与农业学院专任教师。主要从

事植物免疫机制、园艺植物品质形

成机理、植物遗传学等研究。主持

广东省自然科学基金面上项目 1 项、

广东省教育厅青年创新人才项目 1

项，参与国家级、省级和韶关市级项

目多项。以第一作者在《Frontiers in

Plant Science》《Plant Physiology and

Biochemistry》《广东农业科学》《分

子植物育种》等国内外期刊上发表学术论文多篇。

王玉昆，博士，副教授，现任

职于韶关学院广东省粤北食药资源

利用与保护重点实验室。主要从事

园艺植物品质形成机理、植物遗传

学等研究。主持广东省教育厅特色

创新项目 1 项、韶关市科技计划项

目 1 项，参与国家级、省级和韶关

市级项目多项。已在 SCI 剘刊发表

学术论文 20 余篇，中文核心期刊发

表论文数篇。现为中国植物学会会

员、中国作物学会会员。

收稿日期：2023-05-29

基金项目：海南省自然科学基金（321MS077）；国家重点研发计划项目（2019YFD1000900）；中央级公益性科

研院所基本科研业务专项（1630042022004，1630062023017）；国家荔枝龙眼产业技术体系专项（CARS-32-20）

作者简介：钱义容（2000—），女，在读本科生，研究方向为果树生物学，E-mail：204870970@qq.com

通信作者：董晨（1981—），女，硕士，副研究员，研究方向为果树生物学，E-mail：nysdongchen@sina.com；

李伟才（1975—），男，研究员，研究方向为荔枝栽培生理研究，E-mail：lwc-619@163.com

广东农业科学 2023，50（9）：79-88

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.008

钱义容，王弋，全振炫，郑雪文，李伟才，董晨 . 荔枝铝激活苹果酸转运蛋白基因家族的鉴定及表达分析［J］. 广东农业科学，

2023，50（9）：79-88.

荔枝铝激活苹果酸转运蛋白基因家族的

鉴定及表达分析

钱义容 1,2，王 弋 1

，全振炫 1

，郑雪文 1

，李伟才 1

，董 晨 1

（1. 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 / 农业农村部热带果树生物学重点实验室，

广东 湛江 524091；2. 云南农业大学热带作物学院，云南 普洱 665099）

摘 要：【 目 的】 挖 掘 参 与 荔 枝 生 长 发 育 的 铝 激 活 苹 果 酸 转 运 蛋 白（Al-activated malate transporter，

ALMT）基因家族成员，探究其生物学功能。【方法】基于荔枝基因组数据库，借助 META SEARCH 工具和

NCBI 的 CDD 数据库鉴定荔枝ALMTs成员，利用生物信息学方法系统分析LcALMT基因家族成员的蛋白理化性质、

亚细胞定位预测、系统发育、基因结构、保守基序、染色体定位、启动子顺式作用元件、蛋白结构和表达模式

等，通过 qPCR 方法分析荔枝 LcALMTs 的表达情况。【结果】荔枝 LcALMT 基因家族有 16 个成员，CDS 长度为

118~803 bp，等电点在 5.16~9.07 之间。亚细胞定位预测显示，LcALMTs 均定位于质膜上，根据系统进化树将该

家族划分为 5 个亚族。荔枝 LcALMTs 外显子数目在 3~10 个，有 4 个 LcALMTs 基因均不含非编码区。染色体定

位分析发现，LcALMTs 只定位在荔枝 15 条染色体中的 6 条上，且主要定位在 13 号染色体上。保守基序分析发现，

荔枝 ALMT 家族成员含有 ALMT 和 ALMT superfamily 两个结构域。顺式作用元件中，光响应元件占比最多，其

次是激素响应元件。表达模式分析发现，荔枝 LcALMTs 在各个组织中的表达存在较大差异，其中 LcALMT5 和

LcALMT15 在各个组织中均有表达且表达量较高，qPCR 结果表明 LcALMT5 的表达水平与转录组结果较为一致。

【结论】16 个荔枝 ALMTs 具有保守的基因结构和蛋白结构域，组织表达存在差异。

关键词：荔枝；ALMT 基因家族；系统进化；生物信息学；表达分析

中图分类号：S667.1 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2023）09-0079-10

Identification and Analysis of the ALMT Gene Family in Litchi

QIAN Yirong1,2, WANG Yi1

, QUAN Zhenxuan1

, ZHENG Xuewen1

, LI Weicai1

, DONG Chen1

（1. South Subtropical Corp Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science / Key Laboratory of

Tropical Fruit Biology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhanjiang 524091, China;

2. School of Tropical Crops, Yunnan Agricultural University, Puer 665099, China）

Abstract: 【Objective】This study aims to discover members of the Al-activated malate transporter ALMT gene

family that may be involved in the growth and development of litchi and to investigate their biological functions.【Method】

The physicochemical properties of proteins, subcellular localisation predictions, phylogeny, gene structure, conservative

motifs, chromosomal positioning, promoter cis-acting elements, protein structure and expression patterns of litchi ALMT

gene family members were systematically analysed using bioinformatics methods, expression of the litchi LcALMTs was

80

【研究意义】铝激活苹果酸转运蛋白（Alactivated malate transporter，ALMT）是植物中重要

的一类膜蛋白，在植物有机酸的跨膜转运中起着

重要作用，如参与苹果酸积累和转运、重金属胁

迫、矿质营养、渗透势和 pH 值调节、果实品质形成、

气孔运动、种子发育等过程［1-4］。【前人研究进

展】在植物的生长过程中，酸性土壤中的铝离子

（Al3+）会对植物根部造成毒害，ALMT 作为阴离

子通道能够释放苹果酸盐有机阴离子并以此为螯

合剂，与 Al3+ 形成稳定无毒的复合物，从而降低

其毒性［5］。最早 Sasaki 等［6］在耐铝小麦（ET8）

根尖中分离得到铝诱导表达的一个 ALMT1 基因

（TaALMT1），是植物中克隆获得的第一个铝激

活苹果酸转运基因。ALMT 蛋白大多定位于细胞

质膜、液泡膜等细胞器上，N 端和 C 端均位于膜

的外侧，其 N 端通常包含 5~7 个跨膜结构域，参

与 Al3+ 结合的苹果酸运输，C 端有一个跨膜输水

区来维持运输功能所必需［7-8］。基于 ALMT 的重

要性，拟南芥 AtALMT1 和小麦 TaALMT1 基因的

鉴定引起人们对该家族的研究兴趣，目前，已知

在拟南芥基因组中有 14 个 ALMTs 蛋白，其相关

功能基因的表达也有一些报道［9］。AtALMT1 参

与 AL3+ 的耐受，主要在拟南芥根中表达，其表达

水平受过氧化氢、pH 值、植物激素的影响［10］；

AtALMT4 主要在叶肉和保卫细胞中表达［11］；

AtALMT6 主要在保卫细胞中表达，其表达水平受

苹果酸、液泡 pH 值和胞质钙离子的影响［11-12］。

据报道，多种植物 ALMT 家族基因的生物学功能

也相应被鉴定，如橡胶树（Hevea brasiliensis）中

鉴定出 17 个 ALMTs 基因［13］；普通烟草（Nicotiana

tabacum）中鉴定出 30 个 ALMTs 基因，该基因受

AL3+ 的诱导影响，大多数在茎中表达较高而在根

部表达相对较低［14］；苹果（Malus domestica）基

因组中鉴定出 25 个 ALMTs 成员，其中 MaALMT1

影响果实酸度、主要在果实中表达［15］；大豆

中鉴定出 34 个 ALMTs 基因，GmALMT5 在低磷

环境下显著表达［8］；中国白梨中鉴定出 27 个

ALMTs 基因，其中 Pbr020270.1 作为候选基因可

能在梨果实苹果酸的积累中发挥重要作用［16］。

综上，ALMT 基因家族成员在不同植物中均起着

重要作用。荔枝（Litchi chinensis）是无患子科

荔枝属常绿乔木，产于亚热带地区，喜高温高湿

气候，在历史上有“百果之王”等美称。但荔枝

产业中仍存在一些问题，如大小年、缺乏特早熟

优质荔枝、早熟荔枝偏酸等。【本研究切入点】

ALMT 蛋白与植物生长发育和逆境响应有密切关

系，荔枝果实酸度的研究目前集中在生理水平，

分子水平的研究较少，ALMT 参与果实酸度调节，

但在荔枝中 ALMT 基因家族的全基因组鉴定尚未

见报道。【拟解决的关键问题】本研究基于全基

因组水平对荔枝 ALMT 基因家族成员进行鉴定与

分析，为 ALMT 基因家族在荔枝果实有机酸生物

学功能研究方面提供初步依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为‘妃子笑’荔枝，种植于中国

热带农业科学院南亚热带作物研究所荔枝种植园

（21°10′02″N、110°16′34″E，海拔 21.32 m），

试验基地地势平坦、水源充足、灌溉条件优良，

analysed by qPCR.【Result】The results showed that the litchi LcALMT gene family has 16 members with CDS lengths ranging

from 118 to 803 bp and isoelectric points between 5.16 and 9.07. Subcellular localisation predictions showed that the LcALMTs

were all localised to the plasma membrane, and the family was divided into five subclades based on a phylogenetic tree. The

number of exons of the LcALMTs ranged from 3 to 10, and four LcALMT genes did not contain any non-coding regions.

Chromosomal localisation analysis revealed that LcALMTs was localised on only six of the 15 chromosomes of litchi, and mainly

on chromosome 13. Conservative motif analysis revealed that litchi ALMT family members contain both ALMT and ALMT

superfamily structural domains. Among the cis-acting elements, light-responsive elements accounted for the largest proportion,

followed by hormone-responsive elements. Expression pattern analysis revealed that the expression of Litchi LcALMTs was

highly variable in different tissues, with LcALMT5 and LcALMT15 being expressed at high levels in all tissues, the qPCR

results showed that the expression level of LcALMT5 was more consistent with the results of the transcriptome.【Conclusion】

There are 16 members of the litchi ALMT Gene family, which has a conservative gene structure and protein domain, and there

are differences in tissue expression.

Key words: litchi; ALMT gene family; phylogenetic evolution; bioinformatics; expression analysis

81

土壤为红壤、肥力中等，土肥水管理一致。采集‘妃

子笑’不同组织样品，取秋梢新抽发的嫩梢叶片，

老熟梢的成熟老叶，盛花期的雄花、雌花和根（新

生长的须根），果实成熟期的果皮、果柄，用液

氮速冻后于 -80 ℃保存，用于后续 RNA 提取。

1.2 荔枝 LcALMT 家族成员鉴定及其蛋白理化

性质、亚细胞定位分析

荔枝品种‘妃子笑’（Litchi chinensis Sonn.

cv. Feizixiao）的基因组来源于荔枝基因组数据库

（http://www.sapindaceae.com/），META SEARCH

工具搜索 Al-activated malate transporter（铝激活苹

果酸转运蛋白），搜索注释为 Al-activated malate

transporter 的 基 因， 进 一 步 通 过 NCBI Conserved

Domains Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）

验证搜索到的蛋白序列是否含有保守 ALMT 结构

域，得到含有完整保守结构域的蛋白，并将其命

名为 LcALMT，最终从荔枝全基因组中确定有 16

个 LcALMTs。 运 用 ExPASy（https:web.expasy.org/

protparam/）预测家族成员对应蛋白质的长度（aa）、

分子量（kD）、等电点（pI）、不稳定系数和亲

水指数，运用在线网站（https:wolfpsort.hgc.jp/）

进行亚细胞定位预测。

1.3 荔枝 LcALMTs 系统进化关系与蛋白结构分析

为进一步了解 LcALMTs 蛋白，利用公开发

表模式植物拟南芥（14 个）和水稻（8 个）中

的 ALMTs 蛋白序列，拟南芥 AtALMTs 蛋白序列

从拟南芥官网 TAIR（https://www.arabidopsis.org）

下载获得，水稻 OsALMTs 蛋白序列从网站 Rice

Genome Annotation Project（http://eice.plantbiology.

msu.edu/）获得。16 个荔枝 ALMTs 蛋白序列，使

用 MEGA 11 软件采用邻接法（Neighbor-Joining，

NJ），保持其他参数不变，设置 Bootstrap 值为

1 000，构建系统进化树。

利用 GORIV（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/

npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html）预测

蛋 白 质 二 级 结 构， 然 后 利 用 在 线 工 具 SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）预测蛋白

质三级结构。

1.4 荔枝 LcALMTs 的基因结构与保守基序分析

从荔枝基因数据库中获取 ALMT 家族成员的

基因序列和对应的 CDS 序列，运用 GSDS（http:gsds.

cbi.pku.edu.cn/）在线软件进行荔枝 ALMTs 成员编

码区、内含子和非编码区的结构分析。

使用 MEME（http:meme-suite.org/tools/meme）

在线软件设置基数为 12，其余为默认参数下预测

分析荔枝 ALMT 家族成员编码蛋白的保守基序。

1.5 荔枝 LcALMTs 启动子上顺式作用元件分析

利 用 在 线 网 站 Plantcare（http:bioinformatics.

psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对 LcALMTs 5'

端上游 2 000 bp 的序列进行顺式作用元件分析。

1.6 荔枝 LcALMTs 的染色体定位

根据荔枝全基因组注释信息得到染色体基因

位置信息，借助 TBtools 软件实现可视化。

1.7 荔枝 LcALMTs 的组织表达

从荔枝基因组数据库获取 LcALMTs 基因在

不 同 组 织 中 的 表 达 量（http://www.sapindaceae.

com/），通过 TBtools 绘制热图。

1.8 部分 LcALMTs 的实时荧光定量 PCR

使用植物 RNA 提取试剂盒（华越洋生物科

技有限公司），提取妃子笑不同组织（根、嫩

叶、老叶、雄花、雌花、果皮、果柄）RNA。

取 1 μL 检测 RNA 质量和浓度，样品符合要求后

利 用 M-MLV 逆 转 录 酶（TaKaRa） 反 转 录 合 成

cDNA。利用在线软件 Primer 3.0 设计荧光定量引

物，以 LcActin 为内参（表 1），通过 Blast 分析

引物的特异性，并交由广州艾基生物技术有限公

司合成引物序列。

使 用 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa） 试 剂

盒制备反应体系，其中 cDNA 1 μL（相当于 25

ng 总 RNA），2 μL 基 因 特 异 性 引 物，10 μL

2×SYBR Premix ExTaq，用去 RNA 酶的 ddH2

O 补

足 20 μL。使用 Roche 480 Ⅱ定量 PCR 系统（瑞士）

进行 RT-PCR，反应条件为：94℃预变性 2 min，

94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环。

每个样品 3 次重复。采用 2-ΔΔ ct 法计算目标基因

相对表达量，以根为对照。

表 1 RT-PCR 引物序列

Table 1 Primer sequences for RT-PCR used in this study

基因名称

Gene name

正向引物

Forward primer (5'-3')

反向引物

Forward primer (5'-3')

LcActin GTGGTTCTACTATGTTCCCTG CTCGTCGTACTCATCCTTTG

LcALMT4 GTGGTTCTACTATGTTCCCTG CTCGTCGTACTCATCCTTTG

LcALMT5 GTGGTTCTACTATGTTCCCTG CTCGTCGTACTCATCCTTTG

LcALMT15 GTGGTTCTACTATGTTCCCTG CTCGTCGTACTCATCCTTTG

82

2 结果与分析

2.1 荔枝 LcALMT 家族成员基本信息及蛋白理

化性质、亚细胞定位分析

本研究共鉴定出16个荔枝LcALMTs（LcALMT1~

LcALMT16），其基本信息如表 2。理化性质分析

发现，LcALMTs 蛋白编码的氨基酸数目在 118~803

aa， 分 子 量 大 小 在 12.60~89.54 kD， 等 电 点 在

5.16~9.07 之间，其中碱性蛋白（pI>7）10 个、酸性

蛋白（pI<7）6 个，不稳定系数介于 25.57~45.17，

且 LcALMT1、LcALMT13、LcALMT14、

LcALMT16 属于不稳定蛋白（不稳定系数 >40）。

亚细胞定位预测显示，该家族成员蛋白均定位于

质膜上。

表 2 荔枝 LcALMTs 基本信息及其蛋白理化性质、亚细胞定位分析

Table 2 Basic information of LcALMTs in litchi and analysis of its protein physicochemical properties and subcellular localization

基因名称

Gene name

基因组登录号

Gene accession

No.

蛋白理化性质 Protein physicochemical properties 亚细胞定位预测

Protein subcellular

localizition prediction

氨基酸数 Number

of amino acids (aa)

分子量

Mw (kD)

等电点

pI

不稳定性指数

Instability index

平均亲水性系数

GRAVY

LcALMT1 LITCHI026263 423 46.86 6.68 41.22 0.239 质膜

LcALMT2 LITCHI026839 325 36.55 5.77 36.25 0.257 质膜

LcALMT3 LITCHI021918 491 54.21 8.84 26.88 0.116 质膜

LcALMT4 LITCHI022008 534 59.40 8.38 32.95 0.029 质膜

LcALMT5 LITCHI023203 576 64.15 6.46 36.03 0.037 质膜

LcALMT6 LITCHI020401 537 59.93 8.19 35.02 0.027 质膜

LcALMT7 LITCHI024288 392 43.33 7.23 29.27 0.063 质膜

LcALMT8 LITCHI024355 504 56.24 7.23 36.11 0.056 质膜

LcALMT9 LITCHI024356 481 53.46 9.07 36.73 0.129 质膜

LcALMT10 LITCHI024359 448 49.67 6.51 30.87 0.142 质膜

LcALMT11 LITCHI024360 118 12.60 7.89 25.57 0.919 质膜

LcALMT12 LITCHI024361 803 89.54 8.39 37.13 0.069 质膜

LcALMT13 LITCHI024362 312 34.99 8.37 45.17 0.011 质膜

LcALMT14 LITCHI024363 181 19.99 5.16 41.16 -0.039 质膜

LcALMT15 LITCHI005502 567 63.70 7.02 32.99 0.002 质膜

LcALMT16 LITCHI018976 399 43.29 6.61 41.66 0.080 质膜

2.2 荔枝 LcALMTs 系统进化树及蛋白结构分析

使用 MEGA 11 生成荔枝 LcALMTs 系统进化

树图，由图 1 可知，该家族成员可分为 5 个亚族。

第Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ亚族均包含 2 个 LcALMT 成员，第

Ⅳ亚族包含 3 个 LcALMT 成员，第Ⅲ亚族包含 7

个 LcALMT 成员。荔枝 LcALMTs 成员在 5 个亚族

中分布不均匀，主要在第Ⅲ亚族。从进化树来看，

荔枝 ALMT 家族成员与拟南芥的 ALMT 家族成员

亲缘关系更近。

对荔枝 LcALMTs 蛋白二级结构进行分析发

现，该家族蛋白二级结构包含 α- 螺旋、延伸链、

无规则卷曲和 β 转角（表 3）。其中 α- 螺旋占比

最高、均大于 50%，延伸链占比为 9.69%~19.50%，

无规则卷曲占比为 18.64%~57.32%，β 转角占比

为 1.94%~7.73%。蛋白质三级结构（图 2）预测

显示，位于同一亚族的 LcALMTs 蛋白结构相似，

如亚族 I 中的 LcALMT3 和 LcALMT5，亚族Ⅲ中

的 LcALMT12、LcALMT13 和 LcALMT16 均 具 有

相似结构。

2.3 荔枝 LcALMTs 基因结构及保守基序分析

运用 GSDS 软件对荔枝 ALMT 家族成员编码

图 1 荔枝、拟南芥和水稻 ALMTs 系统进化树

Fig. 1 Phylogenetic tree of ALMT proteins in Litchi chinesis,

Arabidopsis thaliana and Oryza sativa L.