安 徽 科 技 学 院 学 报

第38卷 第2期 (总第177期) 2024年4月

目 次

动物科学

平衡赖氨酸和蛋氨酸的低蛋白日粮对育雏期皖西白鹅血液生化和胸腺结构的影响

…… 张 鑫, 张 康, 史文龙, 程 露, 胡倩倩, 李小金, 靳蒙蒙, 任 曼, 李升和(1)

褪黑素对牛卵巢颗粒细胞发育相关基因表达的作用

………………………… 李 瑞, 郑梦浩, 王佳琪, 刘彦彦, 庞训胜, 刘文举, 王淑娟(13)

安徽省部分地区山羊羔瘫软综合征调查与分析……………… 汪来香, 郭大伟, 江喜春, 周金星(19)

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备

……………… 罗昕雨, 赵 磊, 陈玉晴, 缪欣怡, 石家鑫, 顾有方, 李文超, 刘欣超(25)

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用 …………… 孙 栋, 宋忠锋,

倪君丽, 方肆云, 王定爱, 申翰钦, 严专强, 戚南山, 孙铭飞, 顾有方(31)

植物科学

脲甲醛与尿素配比对盆栽玉米养分吸收及氮肥利用效率的影响

……………………………………………………………… 江鑫鑫, 吴中原, 方俊超, 李孝良(39)

铜陵白姜茎基腐的病原鉴定及其噬菌体的分离纯化 …………………… 花 月, 汪菁森, 周 成(46)

不同类型除草剂对直播稻田碎米知风草的活性及防效评价

……………………………………… 项 晶, 王 慧, 熊浩钧, 李 诚, 程 睿, 毕亚玲(53)

食品药品科学

食品级米糠粉开发工艺优化及营养消化特性

……………………………………… 颜 榕, 刘旭华, 孙强强, 王俊颖, 杨丽萍, 翟立公(59)

滁菊米酒发酵工艺优化 …………………………………………………… 林春寅, 李雅丽, 杜传来(70)

工程技术

基于改进 YOLOv5算法的密集动态目标检测方法

………………………………………………… 刘懿平, 何 欢, 彭 丰, 朱家旺, 江本赤(79)

基于改进 YOLOv5的草莓病害及养分状况识别与检测

………………………………………………… 刘苏杭, 张 华, 朱婷倩, 吴 凡, 童 以(87)

鲜食玉米果穗的物理力学特性 …………………… 高朋飞, 张新伟, 易克传, 苑凤霞, 马战伟(95)

基于CFD的双导轮液力变矩器流场模拟与试验研究 ………………… 李绍玲, 张春燕, 刘登水(103)

基于 Ansys的移动式秸秆颗粒机车架稳定性的有限元分析

…………………………………………………………… 彭 正, 姜春霞, 张立勇, 夏显明(110)

(本期执行编辑:顾文亮)

期刊基本参数:CN34-1300/N*1984*b*A4*120*zh*p*$10*1000*15*2024-04

JOURNALOFANHUISCIENCE

ANDTECHNOLOGYUNIVERSITY

Vol.38No.2(Sum177)Apr.2024

CONTENTS

AnimalScience

EffectsoflowproteindietwithbalancedlysineandmethionineonbloodbiochemistryandthymusstructureofWanxiwhitegeeseatbroodingstage …… ZHANGXin, ZHANGKang, SHIWenlong,

CHENGLu, HUQianqian, LIXiaojin, JIN Mengmeng, REN Man, LIShenghe(1)

Roleofmelatoninonexpressionofgenesrelatedtoovariangranulosacelldevelopment

…………………………………… LIRui, ZHENG Menghao, WNAGJiaqi, LIUYanyan,

PANGXunsheng, LIU Wenju, WANGShujuan(13)

InvestigationandanalysisofFloppyKidSyndromeinsomeareasofAnhuiProvince

………………………… WANGLaixiang, GUODawei, JIANGXichun, ZHOUJinxing(19)

ShortenedexpressionandpolyclonalantibodypreparationofFiber-1proteinoffowladenovirusserotype4

…………………………………… LUOXinyu, ZHAOLei, CHENYuqing, MIAOXinyi,

SHIJiaxin, GUYoufang, LIWenchao, LIUXinchao(25)

IsolationandidentificationofClostridium perfringenstypeGanditsapplicationinthepathogenesis

modelofnecrotizingenteritisinchickens……………… SUNDong, SONGZhongfeng, NIJunli,

FANGSiyun, WANGDingai, SHEN Hanqin, YANZhuanqiang, QINanshan,

SUN Mingfei, GUYoufang(31)

PlantScience·GranariesinJianghuairegion

Effectsofureaformaldehydeandurearatioonnutrientuptakeandnitrogenuseefficiencyof

pottedmaize …………… JIANGXinxin, WUZhongyuan, FANGJunchao, LIXiaoliang(39)

IdentificationofpathogenandisolationandpurificationofphagefromstembaserotofTongling

whiteginger …………………………………… HUAYue, WANGJingsen, ZHOUCheng(46)

BioactivityandefficacyevaluationofdifferenttypesofherbicidesonEragrostisjaponica

indirect-seedingricefields …………………… XIANGJing, WANGHui, XIONGHaojun,

LICheng, CHENGRui, BIYaling(53)

ScienceofFoodandDrug

Optimizationofdevelopmentprocessandanalysisofnutritionaldigestioncharacteristicsofediblerice

branpowder …………………………………………… YANRong, LIUXuhua, SUNQiangqiang,

WANGJunying, YANGLiping, ZHAILigong(59)

OptimizationoffermentationtechnologyofChuzhouchrysanthemumricewine

…………………………………………………………… LINChunyin, LIYali, DUChuanlai(70)

EngineeringandTechnology

DensedynamictargetdetectionmethodbasedonimprovedYOLOv5algorithm

………………… LIUYiping, HEHuan, PENGFeng, ZHUJiawang, JIANGBenchi(79)

IndentificantionanddetectionofstrawberrydiseaseandnutrientbasedonimprovedYOLOv5

…………………… LIUSuhang, ZHANGHua, ZHUTingqian, WUFan, TONGYi(87)

Physicalandmechanicalpropertiesoffreshcornfruitears

………… GAOPengfei, ZHANGXinwei, YIKechuan, YUANFengxia, MAZhanwei(95)

FieldsimulationandexperimentstudyfordoublestatorshydraulictorqueconverterbasedonCFD

……………………………………………… LIShaoling, ZHANGChunyan, LIUDengshui(103)

FiniteelementanalysisofstabilityofmobilestrawpelletlocomotiveframebasedonAnsys

……………………… PENGZheng, JIANGChunxia, ZHANGLiyong, XIAXianming(110)

安徽科技学院学报,2024,38(2):1-12

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-12-23

基金项目:国家自然科学基金(31672502,31502137,31501968);安徽省科技重大专项计划项目(201903a06020002);安徽省高校学科

(专业)拔尖人才学术资助项目(gxbjZD2020080);安徽省高校优秀科研创新团队(2022AH010088);安徽省高校自然科学研

究项目(2022AH030146);安徽省地方鹅种基因库;安徽省滁州市科技计划项目(2022ZN002)。

作者简介:张鑫(1999-),男,山西晋中人,硕士研究生,主要从事动物营养与健康研究,E-mail:3373300763@qq.com。

通信作者:李升和,教授,E-mail:lish@ahstu.edu.cn。

平衡赖氨酸和蛋氨酸的低蛋白日粮对育雏期

皖西白鹅血液生化和胸腺结构的影响

张 鑫1, 张 康1, 史文龙1, 程 露1, 胡倩倩1,2,

李小金1,2, 靳蒙蒙1,2, 任 曼1,2, 李升和1,2*

(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100;

2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100)

摘 要:目的:探究平衡赖氨酸和蛋氨酸的低蛋白日粮对育雏期皖西白鹅血液免疫指标和胸腺结构的影

响。方法:选用180只1日龄皖西白鹅作为研究对象,随机分为6组,每组30只;试验采用3×2因子设计

(不同蛋白水平:20%、18%、16%,分别平衡赖氨酸、蛋氨酸),于14和28日龄分别采集血液和胸腺,研究

不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对育雏期皖西白鹅血液免疫指标以及胸腺结构的影响。结果:14日龄

时,D组 MCV、MCH 显著高于 E、F 组(P<0.05);F 组血清 TP、ALB、AST 含量显著高于 D、E 组

(P<0.05),D组 UA极显著高于F组(P<0.01);A组 TG含量显著高于B、C组(P<0.05);28日龄时

低蛋白组 ALP显著高于高蛋白组。14与28日龄各组胸腺器官指数无显著差异(P>0.05);结构变化不

明显(P>0.05)。结论:低蛋白日粮平衡氨基酸可以提高育雏期皖西白鹅的蛋白质利用率,降低尿酸沉

积,且对胸腺发育没有负面影响。

关键词:蛋氨酸;赖氨酸;低蛋白日粮;血液指标;胸腺;皖西白鹅

中图分类号:S835 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)02-0001-12

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0201

Effectsoflowproteindietwithbalancedlysineandmethionineonblood

biochemistryandthymusstructureofWanxiwhitegeeseatbroodingstage

ZHANGXin1, ZHANGKang

1, SHIWenlong

1, CHENGLu1, HUQianqian1,2,

LIXiaojin1,2, JIN Mengmeng

1,2, REN Man1,2, LIShenghe1,2*

(1.CollegeofAnimalScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofAnimalNutritionRegulationandHealth,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Toexploretheeffectsoflowproteindietwithbalancedlysineandmethionineon

bloodbiochemistryandthymusstructureofWanxiwhitegeeseatbroodingstage.Methods:180one-day-

old Wanxiwhitegeese wererandomlydividedinto6groups with30geeseineach group.The

experimentuseda3×2factorialdesign(differentproteinlevels:20%,18%,16%,balancinglysineand

methionine,respectively).Bloodandthymuswerecollectedat14daysofageand28daysofage

respectivelytostudytheeffectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonblood

indexesandthymusstructureofWanxiwhitegeeseatbroodingstage.Results:MCVand MCHin

14-day-oldGroupDweresignificantlyhigherthanthoseinGroupsEandF(P<0.05).Thecontentsof

serumTP,ALBandASTinGroupFweresignificantlyhigherthanthoseinGroupsDandE(P<0.05),and

theUAinGroupDwassignificantlyhigherthanthatinGroupF(P<0.01).TheTGcontentofGroup

AwassignificantlyhigherthanthatofGroupsBandC(P<0.05).ALPinthelowproteingroupwas

significantlyhigherthanthatinthehighproteingroupat28daysofage.Therewasnosignificant

differenceinthymusindexbetween14and28daysofage(P>0.05).Thestructuralchangeswerenot

significant(P>0.05).Conclusion:Alowproteindietwithbalancedaminoacidcanimproveprotein

availabilityanddecreaseuricaciddepositionofWanxiwhitegeeseinbroodingstage,andhasnonegative

effectonthymusdevelopment.

Keywords:Methionine;Lysine;Lowproteindiet;Bloodindex;Thymus;Wanxiwhitegeese

近年来,中国肉鹅养殖业呈稳健发展的趋势,2021年肉鹅产值为522.6亿元,比2020年上涨6.8%;

2022年中国商品鹅出栏量为4.68亿只,肉鹅产值为526.73亿元,比2021年上涨0.79%

[1-2],肉鹅产业的

发展空间巨大。中国鹅种资源丰富,皖西白鹅是其中肉绒兼用型的优质鹅种之一,具有耐粗饲、抗病力强、

耐寒耐热、适应力强等特点,养殖量逐年增加。但迄今为止尚无统一的关于鹅营养需要量和饲料配制的标

准,这成了影响养殖业发展的关键问题之一。

蛋白质作为动物营养需要的关键元素,是影响动物生长、繁殖、抗病的重要物质基础。目前豆粕是养

殖业和饲粮行业最常用的蛋白原料,每年需要大量从国外进口。动物对蛋白质的需求实际上是对氨基酸

的需求[3-4]。2023年,农业农村部发布了《饲用豆粕减量替代三年行动方案》,提到应用低蛋白日粮技术,

配合使用合成氨基酸,减少饲料中的豆粕占比,提高饲料转化率,做到节粮降耗。目前低蛋白日粮对鹅生

长性能影响的研究较少,因此,研究不同蛋白水平以及配合氨基酸使用的日粮对鹅生产性能的影响具有重

要意义。本研究旨在研究不同蛋白质水平下,平衡氨基酸的日粮对皖西白鹅血液指标以及胸腺结构的影

响,找出合适的日粮蛋白水平,为皖西白鹅的科学饲养提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验设计与饲粮

选取180只体重相近的1日龄健康皖西白鹅,随机分为6组,每组设置5个重复,每个重复6只鹅。

采用双因子试验设计,A、B、C组为平衡赖氨酸组,日粮蛋白水平分别为20%、18%、16%;D、E、F组为平

衡蛋氨酸组,日粮蛋白水平分别为20%、18%、16%,饲粮营养水平参考王宝维[5]的鹅营养需要量,具体试

验方案见表1,基础饲粮组成及营养水平见表2。

表1 试验设计

Table1 Experimentaldesign

分组

营养水平处理/%

蛋白质水平 氨基酸含量

备注

20%CP+Lys(A组) 20 Lys1.00,Met0.30

18%CP+Lys(B组) 18 Lys1.00,Met0.25

16%CP+Lys(C组) 16 Lys1.00,Met0.28

A、B、C组为平衡饲粮中赖氨酸水平

20%CP+Met(D组) 20 Lys1.00,Met0.50

18%CP+Met(E组) 18 Lys0.87,Met0.50

16%CP+Met(F组) 16 Lys0.73,Met0.50

D、E、F组为平衡饲粮中蛋氨酸水平

2 安徽科技学院学报 2024年

表2 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table2 Experimentaldietcompositionandnutrientlevel(air-driedbasis)

项目 A B C D E F

原料/%

玉米 52.11 56.89 61.67 52.31 56.81 61.77

豆粕 30.00 24.00 18.00 29.60 24.00 18.00

麦麸 15.00 16.00 17.00 15.00 16.00 17.00

石粉 0.75 0.80 0.80 0.75 0.80 0.80

磷酸氢钙 1.36 1.38 1.40 1.36 1.38 1.40

食盐 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

矿物元素预混料1 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

维生素预混料2 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03

L-赖氨酸盐酸盐(98.5%) 0.00 0.15 0.35 - - -

DL-蛋氨酸(99%) - - - 0.20 0.23 0.25

氯化胆碱 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20

合计 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00

营养水平3

粗蛋白/% 19.94 17.99 16.02 19.93 18.01 15.95

粗脂肪/% 3.05 3.14 3.21 3.05 3.14 3.25

代谢能/(MJ/kg) 11.79 11.79 11.69 11.77 11.78 11.81

能氮比 0.59 0.66 0.73 0.59 0.65 0.74

粗纤维/% 3.62 3.41 3.19 3.60 3.41 3.21

钙/% 0.80 0.80 0.79 0.79 0.80 0.79

磷/% 0.76 0.77 0.75 0.77 0.77 0.76

赖氨酸/% 1.00 0.99 1.00 1.00 0.87 0.73

蛋氨酸/% 0.30 0.28 0.25 0.50 0.50 0.50

苏氨酸/% 0.74 0.65 0.57 0.73 0.65 0.57

色氨酸/% 0.21 0.20 0.19 0.21 0.20 0.19

(蛋氨酸+胱氨酸)/% 0.56 0.57 0.58 0.75 0.86 0.90

注:1.矿物元素预混料为每千克饲粮提供:90mg锌,80mg锰,80mg铁,20mg铜,0.35mg碘;2.维生素预混料为每千克饲粮提供:

9000IU维生素A,3000IU维生素D3,24IU维生素E,3mg维生素B6,1.8mg维生素K3,5mg维生素B2,0.1mg维生素B12,40mg烟

酸,0.05mg生物素,15mgD-泛酸;3.代谢能和能氮比为计算值,其余为实测值。

1.2 饲养管理

试验期皖西白鹅采用网上平养、自由采食及饮水的方式,保持舍内通风以及圈舍的干净卫生。饲养管

理按照鹅场的常规制度进行,按常规免疫程序进行疫苗免疫,分别在14和28日龄每组每个重复选择1只

鹅,称体质量后进行静脉采血,屠宰取样。

1.3 生长性能的测定

试验第14和28天空腹称量体质量,计算平均周体质量。

1.4 血液指标的测定

试验第14和28天,禁食12h后,翅下静脉采血2管(一管为肝素钠抗凝管,另一管为非抗凝管,每管

4mL)。抗凝管中的血液样品使用BC-200Vet兽用全自动血液细胞分析仪(北京曼程科技有限公司)测量

红细胞数量(RBC)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度

(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、白细胞数量(WBC)、血红蛋白含量(HGB)、血小板数量(PLT)、红细

胞比容(HCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板比容(PCT)指标。非抗凝管血

液样品静置30min后,使用低速冷冻离心机于3000r/min离心10~15min,提取上清,使用血清生化指

标检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)和卓越360全自动血清生化分析仪(上海科华检验医学

产品有限公司)测量血清甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白

(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、球蛋白(GLB)、白蛋白/球蛋白比(A/G)、Ca(钙)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮

(BUN)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆红素(TB)、间接胆

红素(IBIL)、CRE(肌酐)、CK(肌酸激酶)。

第38卷第2期 张 鑫,等:平衡赖氨酸和蛋氨酸的低蛋白日粮对育雏期皖西白鹅血液生化和胸腺结构的影响 3

1.5 胸腺指数和胸腺组织结构的观察测定

试验第14和第28天,待屠宰鹅颈部放血致死,屠宰后取出胸腺,用滤纸吸除残血,称量剔除脂肪和结

缔组织后的质量,计算胸腺指数。

分别将14及28日龄的皖西白鹅胸腺组织置于4%多聚甲醛固定液中固定24h,之后流水冲洗24h,

经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后,用石蜡包埋组织,使用 RM2235石蜡轮转切片机(德国徕卡仪器有限公

司)以4μm的厚度切片。使用BX63正置荧光显微镜(日本 Olympus公司)观察切片,每张切片选择5个

视野,使用Image-ProPlus6.0软件(美国Cybernetics公司)测量皮质和髓质面积,计算皮髓比。

1.6 数据处理与分析

试验数据采用SPSS25.0分析软件进行双因素方差分析,并采用Duncan’s进行多重比较,试验数据

以“平均值±标准差”表示,以P<0.05作为差异显著性判断的标准。

2 结果与分析

2.1 日粮不同蛋白水平对育雏期皖西白鹅生长性能的影响

表3为生长性能结果,赖氨酸和蛋氨酸对0~2周龄皖西白鹅的平均周增质量无显著影响,而3~4周的

平衡赖氨酸组皖西白鹅平均周增质量显著高于平衡蛋氨酸组(P<0.05)。日粮蛋白水平对0~2周龄皖

西白鹅的平均周增质量影响显著,20%CP组平均周增质量极显著高于18%CP和16%CP组(P<0.01)。

氨基酸与蛋白质水平对皖西白鹅仔鹅平均周增质量未显示交互作用(P<0.05)。

表3 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对育雏期皖西白鹅生长性能的影响

Table3 Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonthegrowth

performanceofWanxiwhitegeeseduringthebroodingperiod

项目

平均周增质量/(g/(W·只))

0~2W 3~4W

A组 141.28 379.00

B组 118.52 385.58

C组 117.82 370.66

D组 141.52 344.37

E组 111.20 294.82

F组 113.88 372.94

SEM 4.16 19.01

氨基酸

LYS 125.87 378.41a

MET 122.20 337.38b

SEM 2.40 10.98

蛋白质

20%CP 141.40A 361.69

18%CP 114.86B 340.20

16%CP 115.85B 371.80

SEM 2.94 13.44

P

氨基酸 0.291 0.014

蛋白质 <0.01 0.256

氨基酸*蛋白质 0.666 0.067

注:同列数据上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05);上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01);相同字母或无字母表示差异

不显著(P≥0.05)。下同。

2.2 日粮不同蛋白水平对育雏期皖西白鹅血液指标的影响

由表4~5可知,赖氨酸和蛋氨酸对14日龄皖西白鹅血液生理指标无显著影响,对28日龄皖西白鹅

血液RBC、MCV、MCH、PCT水平有显著影响。与平衡赖氨酸组相比,平衡蛋氨酸组 RBC极显著增高

(P<0.01),PCT极显著降低(P<0.01),MCV 和 MCH 显著降低(P<0.05)。比较日粮不同蛋白水平

可见,14日龄20%CP皖西白鹅RDW 高于18%和16%组(P<0.05)。不同氨基酸组和蛋白水平在14日

4 安徽科技学院学报 2024年

龄皖西白鹅血液 MCV和 MCH 指标上发生交互作用。

表4 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对14日龄皖西白鹅血液生理指标的影响

Table4 Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonbloodphysiologicalindexesof14-day-oldWanxiwhitegeese

项目

WBC/

(109/L)

RBC/

(1012/L)

HGB/

(g/L)

HCT/

%

MCV/

fL

MCH/

pg

MCHC/

(g/L)

RDW/

%

PLT/

(109/L)

MPV/

fL

PDW/

%

PCT/

%

A 222.95 1.95 119.50 30.30 155.45a 61.05a 393.00 12.90 14.00 6.80 19.70 0.01

B 212.92 1.85 112.20 28.06 152.76a 61.12a 399.80 12.20 13.00 6.03 19.17 0.01

C 212.46 1.91 107.60 27.76 145.48a 56.24ab 387.20 12.24 18.20 6.18 19.36 0.01

D 219.68 2.04 109.00 28.78 141.53b 53.45b 290.50 14.43 13.75 5.65 19.05 0.01

E 213.58 1.88 112.25 28.45 152.15a 60.23ab 396.00 9.68 10.25 6.60 20.50 0.01

F 214.30 1.84 117.00 28.38 154.20a 63.36a 411.20 10.16 10.40 5.00 18.80 0.01

SEM 13.27 0.18 11.08 2.67 7.99 5.52 73.42 2.40 6.15 0.61 0.73 0.00

氨基酸

LYS 216.11 1.90 113.10 28.71 151.23 59.47 393.33 12.45 15.07 6.34 19.41 0.01

MET 215.85 1.92 112.75 28.54 149.29 59.01 365.90 11.42 11.47 5.75 19.45 0.01

SEM 6.08 0.08 4.91 1.22 2.96 2.02 28.84 0.84 2.57 0.37 0.53 0.00

蛋白质

20%CP 221.31 1.99 114.25 29.54 148.49 57.25 341.75 13.66a 13.88 6.23 19.38 0.01

18%CP 213.25 1.86 112.23 28.26 152.46 60.67 397.90 10.94b 11.63 6.32 19.83 0.01

16%CP 213.38 1.88 112.30 28.07 149.84 59.80 399.20 11.20b 14.30 5.59 19.08 0.01

SEM 4.56 0.06 3.68 0.92 2.22 1.52 21.63 0.63 1.93 0.30 0.43 0.00

P

氨基酸 0.966 0.823 0.944 0.890 0.521 0.823 0.353 0.235 0.178 0.151 0.940 0.820

蛋白质 0.538 0.425 0.941 0.626 0.555 0.436 0.262 0.048 0.620 0.255 0.520 0.659

氨基酸*

蛋白质 0.946 0.715 0.295 0.774 0.024 0.028 0.243 0.170 0.474 0.149 0.289 0.865

表5 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对28日龄皖西白鹅血液生理指标的影响

Table5 Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonbloodphysiologicalindexesof28-day-oldWanxiwhitegeese

项目

WBC/

(109/L)

RBC/

(1012/L)

HGB/

(g/L)

HCT/

%

MCV/

fL

MCH/

pg

MCHC/

(g/L)

RDW/

%

PLT/

(109/L)

MPV/

fL

PDW/

%

PCT/

%

A 223.22 1.77 120.20 28.30 161.42 68.78 425.80 12.50 17.20 5.83 18.88 0.01

B 231.53 1.87 121.67 28.97 155.47 65.13 417.67 12.60 26.33 5.90 19.57 0.02

C 242.35 1.86 120.50 29.33 158.23 64.90 1159.25 11.08 39.00 5.90 18.95 0.04

D 234.60 2.14 122.00 31.40 147.85 57.23 387.50 12.18 17.00 6.25 19.08 0.01

E 227.95 1.99 112.75 29.65 149.38 56.98 379.75 11.50 16.75 5.73 18.65 0.01

F 229.92 2.11 107.40 28.86 137.74 51.18 1051.40 11.94 8.00 5.55 18.95 0.01

SEM 13.83 0.22 14.28 2.78 13.61 9.87 882.12 2.36 23.79 0.46 0.69 0.02

氨基酸

LYS 232.37 1.83B 120.79 28.86 158.37a 66.27A 667.57 12.06 27.51 5.88 19.13 0.02a

MET 230.82 2.08A 114.05 29.97 144.99b 55.13B 606.22 11.87 13.92 5.84 18.89 0.01b

SEM 5.65 0.07 5.96 1.18 4.85 3.39 370.81 1.05 9.85 0.23 0.35 0.01

蛋白质

20%CP 228.91 1.95 121.10 29.85 154.64 63.00 406.65 12.34 17.10 6.04 18.98 0.01

18%CP 229.74 1.93 117.21 29.31 152.42 61.05 398.71 12.05 21.54 5.81 19.11 0.01

16%CP 236.14 1.98 113.95 29.09 147.98 58.04 1105.33 11.51 23.50 5.73 18.95 0.02

SEM 4.67 0.06 4.92 0.98 4.00 2.80 306.36 0.87 8.14 0.17 0.26 0.01

P

氨基酸 0.788 0.003 0.272 0.361 0.012 0.004 0.870 0.861 0.184 0.886 0.509 0.048

蛋白质 0.510 0.858 0.598 0.855 0.503 0.466 0.213 0.793 0.852 0.503 0.920 0.353

氨基酸*

蛋白质 0.217 0.431 0.557 0.438 0.506 0.808 0.996 0.751 0.411 0.338 0.347 0.162

表6~7为血生化蛋白指标结果。比较赖氨酸组和蛋氨酸组可见,14日龄时平衡蛋氨酸组 A/G显著

高于平衡赖氨酸组(P<0.05),28日龄时,与平衡赖氨酸组相比,平衡蛋氨酸组 TP、GLB显著降低(P<

0.05),ALP极显著增高(P<0.01)。比较日粮不同蛋白水平可见,14日龄20%CP皖西白鹅 TP显著低

第38卷第2期 张 鑫,等:平衡赖氨酸和蛋氨酸的低蛋白日粮对育雏期皖西白鹅血液生化和胸腺结构的影响 5

于18%和16%组,18%CP皖西白鹅GLB显著高于20%组(P<0.05),28日龄16%CP皖西白鹅CRE显

著高于18%组。不同氨基酸组和蛋白水平在14日龄皖西白鹅血液TP、ALB、UA指标上发生交互作用。

表6 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对14日龄皖西白鹅血清生化指标的影响

Table6 Effectsofdifferentaminoacidbalancemodesandproteinlevelsonserumproteinindexesof14-day-oldWanxiwhitegeese

项目 TP/

(g/L)

ALB/

(g/L)

GLB/

(g/L)

(A/G)/

%

UA/

(μmol/L)

BUN/

(μmol/L)

CRE/

(μmol/L)

ALT/

(U/L)

AST/

(U/L)

ALP/

(U/L)

A组 31.60AaBbc 9.20AaBbc 22.40 0.41 561.80AaBb 1.85 5.20 26.00 71.20 1258.60

B组 33.40AaBb 9.40AaBbc 24.00 0.39 352.20AaBb 1.90 5.40 28.60 86.00 983.60

C组 30.40ABbc 8.60AaBbc 21.80 0.39 608.60AaBb 2.08 6.80 28.20 75.60 875.20

D组 28.80Bc 8.40Ba 20.40 0.41 685.00A 1.58 9.20 31.80 88.80 884.20

E组 33.00AaBb 9.60b 23.40 0.41 538.60a 2.05 5.20 23.00 57.40 873.40

F组 35.00Aa 10.80Ac 24.20 0.45 208.00Bb 1.08 9.40 27.40 88.80 920.80

SEM 3.20 1.09 2.28 0.03 244.89 0.93 3.67 7.71 12.35 368.12

氨基酸

LYS 31.80 9.07 22.73 0.40a 507.53 1.94 5.80 27.60 77.60 1039.13

MET 32.27 9.60 22.67 0.42b 477.20 1.57 7.93 27.40 78.33 892.80

SEM 0.69 0.21 0.52 0.01 51.34 0.24 0.90 2.05 7.13 96.79

蛋白质

20%CP 30.20b 8.80 21.40b 0.41 623.40 1.71 7.20 28.90 80.00 1071.40

18%CP 33.20a 9.50 23.70a 0.40 445.40 1.98 5.30 25.80 71.70 928.50

16%CP 32.70a 9.70 23.00ab 0.42 408.30 1.58 8.10 27.80 82.20 898.00

SEM 0.85 0.26 0.64 0.01 62.87 0.30 1.11 2.51 8.73 118.54

P

氨基酸 0.638 0.090 0.928 0.021 0.680 0.292 0.108 0.945 0.943 0.296

蛋白质 0.043 0.056 0.049 0.300 0.052 0.641 0.209 0.679 0.673 0.552

氨基酸*蛋白质 0.016 0.002 0.062 0.145 0.005 0.407 0.407 0.290 0.141 0.460

表7 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对28日龄皖西白鹅血清生化指标的影响

Table7 Effectsofdifferentaminoacidbalancemodesandproteinlevelsonserumproteinindexesof28-day-oldWanxiwhitegeese

项目 TP/

(g/L)

ALB/

(g/L)

GLB/

(g/L)

(A/G)/

%

UA/

(μmol/L)

BUN/

(μmol/L)

CRE/

(μmol/L)

ALT/

(U/L)

AST/

(U/L)

ALP/

(U/L)

A组 34.00 9.80 24.20 0.41 191.40 0.89 12.00 18.40 53.80 1004.80

B组 35.40 10.20 25.20 0.40 171.80 0.91 11.00 25.00 62.40 848.00

C组 36.00 10.20 25.80 0.40 238.00 0.97 11.20 30.80 85.20 858.20

D组 33.40 10.00 23.40 0.43 212.60 0.76 11.20 29.40 76.00 1067.80

E组 30.20 8.80 21.40 0.41 225.60 0.87 7.80 21.80 58.00 1302.00

F组 32.60 9.80 22.80 0.43 255.00 1.05 12.80 28.20 80.20 1578.80

SEM 1.41 0.43 1.09 0.02 23.53 0.09 1.07 5.71 18.02 169.88

氨基酸

LYS 35.13a 10.07 25.07A 0.40 200.40 0.92 11.40 24.73 67.13 903.67B

MET 32.07b 9.53 22.53B 0.43 231.07 0.90 10.60 26.47 71.40 1316.20A

SEM 0.81 0.25 0.63 0.01 13.58 0.05 0.62 3.30 10.41 98.08

蛋白质

20%CP 33.70 9.90 23.80 0.42 202.00 0.82 11.60ab 23.90 64.90 1036.30

18%CP 32.80 9.50 23.30 0.41 198.70 0.89 9.40b 23.40 60.20 1075.00

16%CP 34.30 10.00 24.30 0.41 246.50 1.01 12.00a 29.50 82.70 1218.50

SEM 1.00 0.30 0.77 0.01 16.64 0.06 0.76 4.04 12.74 120.12

P

氨基酸 0.014 0.140 0.009 0.075 0.123 0.696 0.369 0.713 0.774 0.007

蛋白质 0.571 0.477 0.659 0.771 0.097 0.104 0.049 0.505 0.433 0.537

氨基酸*蛋白质 0.278 0.190 0.375 0.702 0.697 0.446 0.102 0.387 0.694 0.172

表8~9为血生化能量代谢指标结果。赖氨酸和蛋氨酸对14日龄皖西白鹅血清Ca有显著影响,平衡

蛋氨酸组Ca极显著高于平衡赖氨酸组(P<0.01),对28日龄皖西白鹅血清能量代谢指标无显著影响。

比较日粮不同蛋白水平可见,14日龄20%CP皖西白鹅 TP、IBIL显著高于16%组(P<0.05),28日龄

6 安徽科技学院学报 2024年

18%CP皖西白鹅GLU显著高于16%组。不同氨基酸组和蛋白水平在14日龄皖西白鹅血液 TG指标上

发生交互作用。

表8 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对14日龄皖西白鹅血清能量代谢指标的影响

Table8Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonserumenergymetabolismindexesof14-day-oldWanxiwhitegeese

项目 GLU/

(mmol/L)

TG/

(mmol/L)

TC/

(mmol/L)

HDL/

(mmol/L)

LDL/

(mmol/L)

IBIL/

(μmol/L)

TB/

(μmol/L)

CK/

(U/L)

Ca/

(mmol/L)

A组 10.16 4.53ab 7.84 2.43 2.49 4.70 6.42 1772.60 2.23

B组 10.26 1.71b 7.38 2.27 2.03 5.00 6.14 2346.80 2.26

C组 7.28 3.46a 7.73 1.68 2.67 3.52 4.70 1850.00 2.25

D组 8.06 4.12ab 8.26 2.16 2.33 6.18 7.00 1561.40 2.34

E组 8.86 3.68ab 7.23 1.70 2.24 4.82 5.88 1798.00 2.42

F组 9.12 1.23b 3.90 1.21 1.43 2.94 4.22 2757.00 2.47

SEM 2.06 2.09 3.72 0.82 1.03 1.73 1.87 503.28 0.14

氨基酸

LYS 9.23 3.23 7.65 2.13 2.40 4.41 5.75 1973.13 2.25B

MET 8.68 3.01 6.46 1.69 2.00 4.65 5.70 2038.80 2.41A

SEM 0.50 0.70 0.97 0.20 0.27 0.39 0.45 292.71 0.03

蛋白质

20%CP 9.11 4.33 8.05 2.30 2.41 5.44a 6.71a 1642.00 2.29

18%CP 9.56 2.70 7.31 1.99 2.14 4.91a 6.01ab 2072.40 2.34

16%CP 8.20 2.34 5.81 1.45 2.05 3.23b 4.46b 2303.50 2.36

SEM 0.61 0.58 1.19 0.24 0.33 0.47 0.55 358.50 0.04

P

氨基酸 0.440 0.758 0.396 0.132 0.307 0.665 0.934 0.875 0.001

蛋白质 0.293 0.064 0.412 0.061 0.725 0.018 0.025 0.429 0.363

氨基酸*蛋白质 0.070 0.048 0.403 0.909 0.287 0.284 0.777 0.347 0.616

表9 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对28日龄皖西白鹅血清能量代谢指标的影响

Table9 Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonserumenergymetabolismindexesof28-day-oldWanxiwhitegeese

项目 GLU/

(mmol/L)

TG/

(mmol/L)

TC/

(mmol/L)

HDL/

(mmol/L)

LDL/

(mmol/L)

IBIL/

(μmol/L)

TB/

(μmol/L)

CK/

(U/L)

Ca/

(mmol/L)

A组 8.46 0.95 4.95 1.68 1.81 2.90 3.86 2268.00 2.40

B组 8.40 0.88 4.63 1.92 1.31 3.30 4.42 3073.60 2.50

C组 7.30 0.84 5.63 2.07 1.78 3.16 4.90 3495.60 2.45

D组 7.78 1.03 5.16 2.08 1.34 4.60 6.10 3590.80 2.38

E组 8.52 0.96 4.53 1.47 1.44 1.64 3.74 957.00 2.42

F组 7.18 1.18 4.53 1.81 1.50 1.96 3.74 4254.20 2.39

SEM 0.48 0.18 0.46 0.29 0.18 0.78 0.77 936.98 0.05

氨基酸

LYS 8.05 0.89 5.07 1.89 1.63 3.12 4.39 2945.73 2.45

MET 7.83 1.06 4.74 1.79 1.43 2.73 4.53 2934.00 2.40

SEM 0.28 0.10 0.27 0.16 0.10 0.45 0.44 540.97 0.03

蛋白质

20%CP 8.12ab 0.99 5.06 1.89 1.58 3.75 4.98 2929.40 2.39

18%CP 8.46a 0.92 4.58 1.70 1.37 2.47 4.08 2015.30 2.46

16%CP 7.24b 1.01 5.08 1.94 1.64 2.56 4.32 3874.90 2.42

SEM 0.34 0.12 0.33 0.20 0.13 0.55 0.54 662.55 0.03

P

氨基酸 0.567 0.258 0.387 0.647 0.165 0.551 0.833 0.988 0.170

蛋白质 0.048 0.853 0.485 0.666 0.317 0.210 0.488 0.161 0.312

氨基酸*蛋白质 0.696 0.693 0.354 0.311 0.243 0.087 0.076 0.166 0.862

2.3 日粮不同蛋白水平对皖西白鹅胸腺指数的影响

由表10可知,赖氨酸和蛋氨酸、不同蛋白质水平对 14 和 28 日龄的胸腺指数均无显著差异

(P>0.05),不同氨基酸组和蛋白水平在14和28日龄皖西白鹅胸腺指数上未发生交互作用。14日龄

B组(18%蛋白质平衡LYS)胸腺指数最高,28日龄E组(18%蛋白质平衡 MET组)胸腺指数最高,平衡

第38卷第2期 张 鑫,等:平衡赖氨酸和蛋氨酸的低蛋白日粮对育雏期皖西白鹅血液生化和胸腺结构的影响 7

蛋氨酸组的胸腺指数显著高于平衡蛋氨酸组(P<0.05)。

表10 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对皖西白鹅胸腺指数的影响

Table10 EffectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonthymusindexofWanxiwhitegeese

项目

14日龄

胸腺质量/g 胸腺指数/(g/kg)

28日龄

胸腺质量/g 胸腺指数/(g/kg)

A组 1.73 8.01 3.55 3.68

B组 2.53 11.82 3.08 3.20

C组 1.72 8.47 3.42 3.61

D组 2.00 9.95 3.58 3.89

E组 1.70 8.43 3.91 4.99

F组 1.85 8.91 4.12 4.36

SEM 0.71 3.51 0.94 1.18

氨基酸

LYS 2.00 9.44 3.35 3.50a

MET 1.85 9.10 3.87 4.41b

SEM 0.18 0.93 0.25 0.29

蛋白质

20%CP 1.86 8.98 3.57 3.79

18%CP 2.12 10.13 3.49 4.10

16%CP 1.78 8.69 3.77 3.99

SEM 0.22 1.13 0.30 0.36

P

氨基酸 0.573 0.798 0.151 0.036

蛋白质 0.549 0.642 0.804 0.821

氨基酸*蛋白质 0.183 0.250 0.613 0.295

2.4 日粮不同水平蛋白质对育雏期皖西白鹅胸腺结构的影响

图1~2为14和28日龄皖西白鹅胸腺组织的 HE染色切片图。胸腺小叶分为髓质和皮质,HE染色

后皮质颜色较深,髓质位于胸腺小叶中央,颜色较浅。由表11可知,赖氨酸和蛋氨酸、不同蛋白质水平对

14和28日龄的胸腺皮质面积、髓质面积及皮髓比均无显著差异(P>0.05),不同氨基酸组和蛋白水平在

14和28日龄皖西白鹅胸腺皮质面积、髓质面积及皮髓比上未发生交互作用。

图1 14日龄皖西白鹅胸腺组织结构(HE染色,×100)

Fig.1 Thymustissuestructureof14-day-oldWanxiwhitegeese(HEstaining,×100)

注:A为20%CP+Lys;B为18%CP+Lys;C为16%CP+Lys;D为20%CP+Met;E为18%CP+Met;F为16%CP+Met。下同。

图2 28日龄皖西白鹅胸腺组织结构(HE染色,×100)

Fig.2 Thymustissuestructureof28-day-oldWanxiwhitegeese(HEstaining,×100)

8 安徽科技学院学报 2024年

表11 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平对皖西白鹅胸腺结构的影响

Table11 EffectsofdifferentaminoacidbalancemodesandproteinlevelsonthymusstructureofWanxiwhitegeese

项目

14日龄

皮质相对面积/% 髓质相对面积/% 皮髓比

28日龄

皮质相对面积/% 髓质相对面积/% 皮髓比

A组 75.37 24.63 3.34 61.20 38.80 1.95

B组 61.25 38.75 2.50 74.42 25.58 3.53

C组 47.82 52.18 1.61 71.40 28.60 3.33

D组 50.71 49.29 1.17 87.40 12.60 6.94

E组 50.42 49.58 1.99 74.64 25.36 2.94

F组 40.04 59.96 0.69 85.00 15.00 5.79

SEM 0.21 0.21 0.75 0.14 0.14 0.75

氨基酸

LYS 61.42 38.58 2.48 69.06 30.94 2.94

MET 47.17 52.83 1.28 82.37 17.63 5.23

SEM 0.05 0.05 0.44 0.04 0.04 0.43

蛋白质

20%CP 63.01 36.99 2.25 74.33 25.67 4.45

18%CP 55.84 44.16 2.25 74.62 25.38 3.24

16%CP 43.92 56.08 1.15 78.23 21.77 4.56

SEM 0.06 0.06 0.53 0.08 0.08 0.70

P

氨基酸 0.066 0.066 0.069 0.128 0.128 0.057

蛋白质 0.136 0.136 0.291 0.894 0.894 0.507

氨基酸*蛋白质 0.621 0.621 0.235 0.503 0.503 0.087

3 结论与讨论

3.1 日粮不同蛋白水平对皖西白鹅生长性能的影响

饲粮中粗蛋白的适宜添加对动物生长发育、健康状态十分重要,过低的粗蛋白水平会使动物生长性能

下降,过高的粗蛋白水平又会导致动物机体受损以及生产成本的增加。Alagawany等[6]发现不同 CP

(18%和16%)和 ME(3000、2900和2800kcal/kg)水平对生长性状无显著影响。Ashour等[7]发现饲粮

中添加16%的蛋白质或蛋氨酸+胱氨酸(M+C)可提高埃及鹅在饲养期(12~24周龄)的体质量。本试

验中各组的平均周增重并无显著差异,说明平衡赖氨酸和蛋氨酸的低蛋白日粮可以满足育雏期皖西白鹅

的正常生长需要。

3.2 日粮不同蛋白水平对皖西白鹅血液生理生化指标的影响

日粮血液生理指标能够反映动物营养水平、机体代谢以及健康情况。RBC是高等动物体内血液运输

氧气的主要媒介,也是机体的固有免疫细胞[8-9]。红细胞相关参数 HGB、MCV 和 MCH 常作为动物体内

铁营养的评价指标。前人研究发现饲粮中添加氨基酸络合铁可以增加生长育肥猪的 MCV和 MCH

[10-11]。

本试验中各组RBC和 HGB无明显差异,但14日龄D、E、F组(平衡蛋氨酸组)的 MCV 和 MCH 有显著

差异。李曼曼等[12]研究发现,20%和24%蛋白组的14日龄雁鹅盲肠微生物中双歧杆菌数量少于16%蛋

白组,双歧杆菌可以促进铁和维生素D的吸收。铁吸收不良引起的红细胞体积变小可能是D组 MCV和

MCH 显著降低的原因。而赖氨酸可以促进血红蛋白合成,因此赖氨酸平衡组的 MCV和 MCH 并没有显

著差异。免疫细胞在动物机体中担任着重要的角色,本试验中各组 WBC、PLT、MPV、RDW 等指标均无

第38卷第2期 张 鑫,等:平衡赖氨酸和蛋氨酸的低蛋白日粮对育雏期皖西白鹅血液生化和胸腺结构的影响 9

显著差异,说明日粮蛋白水平对皖西白鹅血液免疫细胞的影响不明显。

血清生化指标可以反映动物机体内的代谢过程。蛋白代谢指标可以评价机体对蛋白质的利用情况,

TP和 ALB可以反映肝的健康程度。White等[13]研究发现蛋白质的限制摄入会导致 ALB下降,本试验

平衡赖氨酸组中C组TP和 ALB低于 A、B组,与前人结果一致。而平衡蛋氨酸组中F组 TP、ALB显著

高于D、E组,这可能是因为蛋氨酸在特定的情况下可以转化为合成蛋白质所需的半胱氨酸[14],满足了雏

鹅对蛋白质的营养需要,同时低蛋白饲粮可以提高蛋白质的利用率[15-16]。AST和 ALT可以参与蛋白质

的代谢,反映动物机体合成或代谢蛋白质的情况,本试验中各组 AST和 ALT无显著差异,冯蕾等[17]发现

低蛋白日粮添加赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和异亮氨酸可以维持 ALT和 AST的稳定,与本试验结果一致。

UA是禽类蛋白质代谢的终产物,可以反映对饲粮中蛋白质利用和氨基酸比例平衡情况[18]。14日龄时

D组UA含量显著高于18%、16%蛋白组,陈彬等[19]发现不同能量蛋白水平组皖西白鹅UA无显著差异,

徐茂森等[20]发现15%蛋白组皖西白鹅 UA显著低于16%蛋白组。本试验结果表明高蛋白对14日龄皖

西白鹅的 UA含量影响显著,这与前人研究结果一致[21-24]。

能量代谢指标可以评价机体内葡萄糖、脂肪代谢情况,TG通过机体肝脏合成,其含量高低反映禽类

脂肪组织发育及脂肪沉积程度[25]。TC是指血液中多种脂蛋白所含胆固醇的总和,TG、TC是反映血脂水

平的一个常用指标。李琴等[26]对肉仔鹅的研究发现 TG 水平会随粗蛋白水平的升高而下降。宋琼莉

等[27]研究发现,日粮粗蛋白质水平越低,肉鸡血清中 TC含量越低,TG含量越高。本研究发现,14日龄

高蛋白组皖西白鹅TG显著高于低蛋白组(P<0.05),这可能是雏鹅对脂肪的沉积程度较高而导致的。

而随着日龄的增加,脂肪组织的发育逐渐减慢,因此28日龄各组TG水平无显著差异。

3.3 日粮不同蛋白水平对皖西白鹅胸腺指数的影响

胸腺是机体重要的免疫器官,可以产生T淋巴细胞以及激素类物质[28]。胸腺指数的高低可粗略估计

其免疫功能的强弱[29],胸腺相对质量越小表明其免疫能力越弱[30]。本试验中,平衡赖氨酸和蛋氨酸的低

蛋白日粮对14和28日龄皖西白鹅胸腺指数的影响不显著。刘书锋等[31]研究发现马冈鹅在采食补充氨

基酸的低蛋白饲粮后各组胸腺指数差异不显著。石天虹等[32]研究发现19%、18%以及17%蛋白水平饲

粮对汶上芦花公鸡的免疫器官指数无显著影响。张思轩等[33]研究发现不同类型低蛋白质饲粮对肉鸡免

疫器官指数无显著影响。夏伟光等[34]发现饲喂低蛋白氨基酸平衡饲粮对150日龄清远麻鸡免疫器官指

数无显著影响。曾晓阁等[35]研究发现不同蛋白水平对22~42日龄肉仔鸡免疫器官指数无显著影响。

免疫器官的发育对禽类免疫功能十分重要[36]。家禽的胸腺是一个分叶状的淋巴器官,位于颈的两

侧,与颈静脉平行[37]。它是皖西白鹅重要的中枢免疫器官,有增强细胞免疫功能、调节免疫平衡、抗感染

等作用[38]。胸腺表面的被膜深入到实质将其分为大量不完整的胸腺小叶[39]。胸腺小叶中,皮质主要支

架由上皮网状细胞构成,其体积较大,细胞质的染色较淡,其间由大量的淋巴细胞、巨噬细胞充满,这也是

皮质染色较深的主要原因[40]。髓质相对于皮质中的淋巴细胞较少,所以染色相对于皮质较浅。皮质与髓

质的面积比可以反映胸腺细胞的功能状态。金光明等[41]研究发现,添加1.0g/kg的半胱胺能够促进鸡

胸腺和法氏囊的发育,增强鸡的免疫功能。冉瑞图等[42]研究发现人参皂苷Rg1能显著提高衰老大鼠的胸

腺指数和皮髓比。本研究表明,不同蛋白水平日粮平衡赖氨酸、蛋氨酸并未导致皖西白鹅的胸腺产生实质

性的变化,大体形态的外观变化不是很明显,并未发现出血点和器官肿大等现象,高倍镜下可见淋巴细胞

组成及结构也未发现显著改变,表明低蛋白日粮平衡氨基酸可以维持胸腺的正常生长发育。

综上,14和28日龄的皖西白鹅需要注意蛋白质的供应,饲料中适宜的蛋白质对于鹅的生长发育至关

重要。本试验结果发现,日粮粗蛋白质为16%平衡蛋氨酸时,14和28日龄皖西白鹅的血液指标较好,胸

腺形态无明显变化。本研究可以为育雏期皖西白鹅的营养需要提供一定的参考。

10 安徽科技学院学报 2024年

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(责任编辑:顾文亮)

12 安徽科技学院学报 2024年

安徽科技学院学报,2024,38(2):13-18

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-09-13

基金项目:安徽省自然科学基金面上项目(2008085MC94);安徽省高校自然科学研究项目(KJ2021A0869);安徽省重点研究与开发计

划项目(202204c06020076)。

作者简介:李瑞(1997-),男,安徽合肥人,硕士研究生,主要从事动物繁殖研究,E-mail:765404465@qq.com。

通信作者:王淑娟,副教授,E-mail:wangshujuan2012@hotmail.com。

褪黑素对牛卵巢颗粒细胞发育相关基因表达的作用

李 瑞1, 郑梦浩1, 王佳琪1, 刘彦彦1, 庞训胜1, 刘文举2, 王淑娟1*

(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100;

2.安徽科技学院 生命与健康科学学院,安徽 凤阳 233100)

摘 要:目的:探究褪黑素对卵巢颗粒细胞发育相关基因表达的影响。方法:不同浓度的褪黑素(0、10-3、

10-5、10-7、10-9、10-11 mol/L)分别处理颗粒细胞24、48、72h后提取细胞总 RNA,采用 Real-timePCR

检测抗氧化(GPX4、SOD1)、发育(EGFR、DNMT1a、FSHR)和 TGFβ家族(BMP6)相关基因的表达。

结果:不同浓度褪黑素处理24、48、72h对抗氧化(GPX4、SOD1)、发育(EGFR、DNMT1a、FSHR)和

TGFβ家族(BMP6)相关基因的表达均有促进或抑制作用(P<0.05),高浓度褪黑素(10-3 mol/L)在

48h对GPX4、SOD1 的促进效果最显著(P <0.05);高浓度褪黑素(10-3 mol/L)不影响 EGFR、

DNMT1a的表达,其他浓度褪黑素均促进EGFR、DNMT1a的表达(P<0.05);低浓度褪黑素(10-11 mol/L)

显著抑制FSHR 的表达(P<0.05);褪黑素对于BMP6 的表达在24h为促进作用(P<0.05),48h时抑

制其表达(P<0.05),72h时高浓度褪黑素(10-3 mol/L)和低浓度褪黑素(10-11 mol/L)无显著作用,其

他浓度为促进作用(P<0.05)。结论:褪黑素可以通过促进抗氧化相关基因(GPX4、SOD1)、发育相关基

因(EGFR、DNMT1a)和TGFβ家族(BMP6)相关基因的表达,抑制FSHR 的表达来保护颗粒细胞,抑制

其凋亡。

关键词:褪黑素;牛;卵巢颗粒细胞;发育相关基因

中图分类号:S814 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)02-0013-06

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0202

Roleofmelatoninonexpressionofgenesrelatedto

ovariangranulosacelldevelopment

LIRui1, ZHENG Menghao1, WNAGJiaqi1, LIUYanyan1,

PANGXunsheng

1, LIU Wenju2, WANGShujuan1*

(1.CollegeofAnimalScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.CollegeofLifeandHealthSciences,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Toinvestigatetheeffectofmelatoninontheexpressionofdevelopment-related

genesinovariangranulosacells.Methods:TotalcellularRNA wasextractedaftertreatinggranulosa

cellswithdifferentconcentrationsofmelatonin(0,10-3,10-5,10-7,10-9,and10-11 mol/L)for24,

48,72 h,respectively,andthe expression ofgenesrelatedto antioxidant (GPX4,SOD1),

developmental(EGFR,DNMT1a,andFSHR),andTGFβfamily(BMP6)wasdetectedbyreal-time

PCR.Results:Differentconcentrationsofmelatoninpromotedorinhibitedtheexpressionofantioxidant

(GPX4,SOD1),developmental(EGFR,DNMT1a,FSHR),andTGFβfamily (BMP6)-related

genesat24,48,72h(P<0.05),andahighconcentrationofmelatonin(10-3 mol/L)hadthemost

significant(P<0.05)promotionaleffectonGPX4,SOD1,andSOD1at48h.Thehighconcentration

ofmelatonin(10-3 mol/L)hadthemostsignificant(P<0.05)promotionaleffectonGPX4andSOD1

at48h(P<0.05).SOD1at48h.Highconcentrationmelatonin(10-3 mol/L)hadthemostsignificant

effectonGPX4andSOD1 (P<0.05).Highconcentrationmelatonin(10-3 mol/L)didnotaffectthe

expressionofEGFRandDNMT1a,andallotherconcentrationsofmelatoninpromotedtheexpression

ofEGFR andDNMT1a (P <0.05),andlowconcentration melatonin (10-11 mol/L)significantly

inhibitedtheexpressionofFSHR (P<0.05),andtheeffectofmelatoninonBMP6expressionat24h

waspromotional(P<0.05).ExpressionofBMP6at24h(P<0.05)andinhibiteditsexpressionat

48h(P<0.05).At72h,thehighconcentrationofmelatonin(10-3 mol/L)andthelowconcentration

ofmelatonin (10-11 mol/L)didnothaveanysignificanteffect,andtheotherconcentrationshada

promotionaleffect (P <0.05).Conclusion:Melatonincanprotectgranulosacellsandinhibittheir

apoptosisbypromotingtheexpressionofantioxidant-relatedgenes (GPX4,SOD1),developmentrelatedgenes (EGFR,DNMT1a),and TGFβfamily (BMP6)-relatedgenes,andinhibitingthe

expressionofFSHR.

Keywords:Melatonin;Bovine;Ovariangranulosacells;Development-relatedgenes

刚出生母牛的卵巢中大约有130000个原始卵泡,然而99%原始卵泡最终闭锁,只有不到1%的原始

卵泡能够发育成熟并最终排卵,主要由于卵泡中的颗粒细胞凋亡引起的[1]。褪黑素在抑制颗粒细胞凋亡、

调控颗粒细胞相关基因的表达具有重要的作用,探究不同浓度的褪黑素在不同作用时间对颗粒细胞发育

相关基因的影响,可为褪黑素的应用奠定理论基础。颗粒细胞分泌多种激素和调控因子,可通过旁分泌的

形式调控卵母细胞的发育和成熟。褪黑素除了通过下丘脑-垂体-性腺轴影响动物的繁殖功能外,还可以

通过直接作用于卵巢,影响卵巢的功能,褪黑素调节卵巢内卵母细胞发育和颗粒细胞的功能在牛[2]、猪[3]

和小鼠[4]上均有报道。褪黑素介入牛卵母细胞的成熟、卵泡和胚胎的发育。褪黑素可以清除自由基,减少

内源性ROS来保护颗粒细胞的完整性[5],进而抑制卵泡发育过程中颗粒细胞的凋亡。褪黑素通过抑制促

凋亡基因的表达和促进抑凋亡基因的表达来调控牛颗粒细胞的凋亡,并且可以促进颗粒细胞分泌孕酮,因

此褪黑素通过不同的机制来影响颗粒细胞的功能。颗粒细胞对维持卵巢正常功能和卵泡发育具有重要的

作用,其在发育过程中分泌的激素及一系列生长因子对卵母细胞的发育具有重要的调控作用,颗粒细胞的

增殖、分化和凋亡会决定卵母细胞的发育和成熟,并且颗粒细胞的凋亡会诱导卵泡闭锁的起始和影响卵母

细胞的质量[6]。褪黑素对于颗粒细胞相关基因的调控已有一定的验证,但是对于不同浓度的褪黑素在各

个时间段对于发育相关基因的调控研究较少。本研究探究不同浓度的褪黑素(0、10-3、10-5、10-7、10-9、

10-11 mol/L)在24、48、72h对抗氧化(GPX4、SOD1)、发育(EGFR、DNMT1a、FSHR)和TGFβ(转化生

长因子β)家族相关基因(BMP6)的表达水平的调控。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛卵巢采集于蚌埠市(中国安徽)某屠宰场,总RNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒购于天根生化科技

有限公司;反转录试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;RT-PCR反应试剂盒、相关引物由生工生

14 安徽科技学院学报 2024年

物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 颗粒细胞的分离培养

将从屠宰场收集的60对牛卵巢放入38℃含有青霉素(100IU/mL)、链霉素(100μg/mL)的生理盐水中

保存,并在3h内返回实验室。采用无菌针穿刺的方法从直径3~6mm的卵泡中抽取卵泡液,在1500r/min

下离心5min,收集细胞,用PBS冲洗吹匀沉淀细胞再次离心。将细胞转入至含有10%胎牛血清、青霉素

(50IU/mL)和链霉素(50μg/mL)的DMEM 培养液中,混匀后接种到孔径60mm 的细胞培养皿中。颗

粒细胞最后放在37℃,含5% CO2 的培养箱中培养。

1.3 细胞处理

利用细胞计数板测定细胞浓度,按照1×105 个细胞/孔转至12孔细胞培养板上,然后添加含有不同

浓度褪黑素(0、10-3、10-5、10-7、10-9、10-11 mol/L)的培养液进行培养,每个浓度3组,分别培养24、48、

72h,每组试验重复3次。

1.4 颗粒细胞总RNA的提取及反转录

根据总RNA提取试剂盒的说明书进行颗粒细胞总 RNA的提取,提取后的总 RNA 采用 RevertAid

FirstStrandcDNA试剂盒进行反转录合成cDNA,cDNA 反应体系为1.5μgRNA 模板、1.5μLOligo

(dT)18primer、加RNasefreeddH2O至18μL,然后加6μL5×ReactionBuffer、1.5μL20U/μLRiboLockRNaseInhibitor、3μL10mmol/LdNTPMix、1.5μLRevertAidM-MuLVRT(200U/μL),总体积

为30μL。混合均匀后,在42℃下孵育60min,70℃下孵育5min,25℃孵育30min,获得产物保存于

-20℃备用。

1.5 Real-timePCR

利用Primer6.0设计相关基因的引物(表1),以cDNA 为模板,测定发育(EGFR、DNMT1a、

FSHR)、抗氧化(GPX4、SOD1)、TGF-β家族(BMP6)相关基因的表达,采用10μL反应体系(5.0μL含绿色

荧光的2×MixBuffer,2μLcDNA,0.5μL10mmol/L正、反引物,ddH2O补充),反应程序如表2所示。

表1 试验引物

Table1 Primersusedinpresentstudy

基因 序列 引物长度/bp 退火温度/℃

β-actin 5'-CATCGGCAATGAGCGGTTCC-3' 145 60

5'-CCGTGTTGGCGTAGAGGTCC-3'

GPX4 5'-TGTGCTCGCTCCATGCACGA-3' 224 60

5'-CCTGGCTCCTGCCTCCCAA-3'

SOD1 5'-GCTGTACCAGTGCAGGTCCTCA-3' 228 61

5'-CATTTCCACCTCTGCCCAAGTC-3'

BMP6 5'-TACGCTGCCAACTACTGTGAC-3' 153 60

5'-GATGGCGTTCAGTTTCGTG-3'

DNMT1a 5'-ACGAATGGTGGATTGCTGGT-3' 197 60

5'-CACGTCTTCGTAGGTGGAGTC-3'

EGFR 5'-CACTCATGCTCTATGACCCTACC-3' 176 60

5'CTCACCGATTCCTATTCCGTTAC-3'

FSHR 5'-GAAGAAAGCAGGTGGATGGA-3' 126 60

5'-GGCAGAGGAAAACTCCGTTA-3'

表2 荧光定量PCR反应程序

Table2 Reactionprogramofreal-timePCR

反应步骤 温度/℃ 时间/s 循环次数 荧光信号

预孵育 95 30 1 无

95 5

扩增 63 20 45 在延伸阶段结束时

72 20

熔解曲线 60 25 1 在温度缓慢升高过程中

冷却 40 10 1 无

第38卷第2期 李 瑞,等:褪黑素对牛卵巢颗粒细胞发育相关基因表达的作用 15

1.6 统计分析

利用LightCycler480软件分析Real-timePCR数据,用2-ΔΔCT 方法计算相对表达量。采用SPSS11.5进

行单因素方差分析,结果以3次测定的“平均值±标准差”表示(P<0.05为差异显著)。

2 结果分析

2.1 褪黑素对抗氧化相关基因表达的影响

与对照组对比,不同浓度褪黑素处理24、48、72h,低浓度(10-11 mol/L)在72h对GPX4 基因的影响

不显著(图1),其他浓度及时间段对GPX4 和SOD1 基因 mRNA表达均有促进作用(P<0.05)。高浓度

褪黑素(10-3 mol/L)在48h对GPX4 和SOD1 表达促进作用最为显著(P<0.05)。

图1 不同浓度褪黑素处理24、48、72h对GPX4、SOD1mRNA 表达的影响

Fig.1 EffectsofdifferentconcentrationsofmelatoninonGPX4,SOD1 mRNAexpressionat24,48,72h

2.2 褪黑素对发育相关基因表达的影响

与对照组相比,除高浓度褪黑素(10-3 mol/L)在48h时对DNMT1a 的表达作用不显著外,其他浓

度的褪黑素在各时间段均促进 DNMT1a 的表达(P<0.05),并且同一时间不同浓度的褪黑素之间

DNMT1a的表达差异不显著(图2)。高浓度褪黑素(10-3 mol/L)在各时间段对EGFR 的表达均没有影

响,在24h时,低浓度褪黑素(10-11 mol/L)对EGFR mRNA的促进作用明显高于其他浓度(P<0.05),

在与72h时比较,差异不显著(图2)。在24h时,较低褪黑素浓度不影响FSHR 的表达,但是随着作用

时间的延续,低浓度褪黑素(10-11 mol/L)显著抑制FSHR 的表达(P<0.05)。试验发现,在48h时,较

低浓度的褪黑素对于DNMT1a、EGFR 的表达促进和FSHR 的表达抑制均优于高浓度的褪黑素水平。

图2 不同浓度褪黑素处理24、48、72h对DNMT1a、EGFR、FSHR mRNA表达的影响

Fig.2 EffectsofdifferentconcentrationsofmelatoninonDNMT1a,EGFR,FSHR mRNAexpressionat24,48,72h

16 安徽科技学院学报 2024年

2.3 褪黑素对TGF-β超家族基因表达的影响

褪黑素处理颗粒细胞后对BMP6 基因的表达存在时间差异性(图3)。添加褪黑素24h后,显著促进

BMP6的表达(P<0.05),促进作用与浓度存在正比关系,浓度越高,BMP6 表达量越高;48h时,颗粒细

胞中BMP6 的表达则不同于24h,褪黑素抑制其表达水平,且褪黑素浓度越高,BMP6 表达水平越低

(P<0.05);褪黑素作用72h时,褪黑素浓度过高(10-3 mol/L)或者浓度过低(10-11 mol/L)对BMP6 的

表达没有显著影响,其他浓度褪黑素组的BMP6 的表达显著升高(P<0.05)。在整个褪黑素的添加过程

中,低浓度褪黑素(10-11 mol/L)对于BMP6 的表达没有影响。

图3 不同浓度褪黑素处理24、48、72h对BMP6 mRNA表达的影响

Fig.3 EffectsofdifferentconcentrationsofmelatoninonBMP6 mRNAexpressionat24,48,72h

3 结论与讨论

卵泡发育、卵母细胞的生长和成熟以及排卵是生殖的重要过程[7]。然而,卵泡发育过程是复杂的,许

多因素都参与了卵巢卵泡生成过程,例如远距内分泌和局部自分泌、旁分泌系统,以及颗粒细胞等[8]。颗

粒细胞在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中发挥着重要作用,颗粒细胞可以产生许多生长因子,并分泌一些

激素例如转化生长因子、雌激素、孕酮、雌二醇等,其均介导卵泡的发育和卵母细胞的成熟。同时,颗粒细

胞的凋亡可引发卵泡闭锁,卵泡闭锁主要是颗粒细胞发生大规模凋亡的一个过程,而从形态学变化来看,

颗粒细胞凋亡的发生远远早于卵泡闭锁的发生,而卵泡闭锁的现象只有在卵泡中的凋亡颗粒细胞达到一

定程度时才能观察到[9]。因此,颗粒细胞凋亡被认为是卵泡闭锁的引发剂,探究颗粒细胞的生长发育对卵

泡的发育具有重要意义。

颗粒细胞的发育首先是受自身的发育相关基因的调控,其次就是受到活性氧(ROS)水平的影响,一

定水平的ROS对于细胞发育具有促进作用,但在高浓度下,会使细胞中的氧化还原状态向氧化应激转变,

会损害线粒体氧化磷酸化,降低线粒体 DNA 拷贝数,导致线粒体产生 ATP的能力下降[10]。SOD1 和

GPX4 的表达是细胞抗氧化功能的一个重要指标,其活性越高意味着抗氧化能力越强,SOD1 和GPX4 的

协同作用可以把细胞中的超氧化物阴离子转化为 H2O 和 O2

[11]。褪黑素可以直接进入细胞与 ROS结

合,清除细胞中的ROS发挥抗氧化的作用,同时,褪黑素可以与其特异性受体相结合,增强抗氧化酶的活

性,上调抗氧化相关基因的表达[12]。褪黑素对颗粒细胞的抗氧化作用已在家禽[13]、牛[14]、鼠[15]中被证

实,其可以通过上调卵巢中GPX3、SOD2、PRDX3 的表达量增强颗粒细胞的抗氧化能力,这与本研究相

一致。本试验中发现,在24h时,不同浓度褪黑素对GPX4、SOD1 的影响差异性不大,但是在48h和

72h时高浓度的褪黑素(10-3 mol/L)极显著的提高了GPX4 和SOD1 的表达。

在卵泡发育过程中DNMT1a、EGFR 和FSHR 对颗粒细胞功能具有重要的调节作用[5],本研究结果

表明,褪黑素可调节颗粒细胞中 DNMT1a、EGFR 和FSHR 的表达,研究发现除了高浓度褪黑素

(10-3 mol/L),其他浓度的褪黑素在24、48、72h时对DNMT1a和EGFR 表达均有促进作用。褪黑素除

了对颗粒细胞中DNMT1a和EGFR 产生作用,还对牛胚胎发育[16]、绵羊卵母细胞成熟中的DNMT1a

表达和绵羊卵丘细胞中的EGFR 产生相同的作用[17]。添加褪黑素会抑制颗粒细胞FSHR 的表达,

FSHR 参与FSH 功能发挥,一定水平的FSH 可通过PINK1-Parkin信号通路来抑制线粒体自噬来保护

颗粒细胞存活,但是 FSH 的增加会激活 Pkahin酶导致 GSK-3β(糖原合成酶激酶-3)活性下调,诱导

NF-κB(核因子κB)通路失活,从而激活细胞凋亡[18]。BMP6 的表达对于颗粒细胞的增殖周期和凋亡没

第38卷第2期 李 瑞,等:褪黑素对牛卵巢颗粒细胞发育相关基因表达的作用 17

有直接的影响,但是可上调颗粒细胞中CYP2A4 和CYP19A1 的表达,进而促进颗粒细胞中E2 和孕酮的

分泌,促进卵巢的发育[19-20]。本试验发现高浓度褪黑素的添加在24h时可以显著增强BMP6 的表达,之

后会呈现抑制的现象可能是存在机体自身的负反馈调节,72h后,高浓度(10-3 mol/L)和低浓度褪黑素

(10-11 mol/L)对BMP6 的表达没有影响,其他浓度均显著促进其表达。

本研究验证了褪黑素对于卵巢颗粒细胞发育相关基因的影响,结果表明,不同浓度的褪黑素可以通过

促进抗氧化相关基因(GPX4、SOD1)、发育相关基因(EGFR、DNMT1a)和TGFβ家族(BMP6)基因的表

达,来减少氧化应激对颗粒细胞功能的影响,刺激颗粒细胞的发育成熟,同时抑制FSHR 的表达,保护颗

粒细胞抑制其凋亡。

参考文献:

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(责任编辑:顾文亮)

18 安徽科技学院学报 2024年

安徽科技学院学报,2024,38(2):19-24

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-07-25

基金项目:安徽省高校自然科学研究项目(KJ2020A086)。

作者简介:汪来香(1997-),女,安徽石台人,硕士研究生,主要从事动物营养生理研究,E-mail:1749609644@qq.com。

通信作者:周金星,教授,E-mail:zhoujx@ahstu.edu.cn。

安徽省部分地区山羊羔瘫软综合征调查与分析

汪来香1, 郭大伟3, 江喜春4, 周金星1,2*

(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100;

2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100;

3.安徽绿墅牧业有限公司,安徽 利辛 236700;

4.安徽省农业科学院 畜牧兽医研究所,安徽 合肥 230031)

摘 要:目的:调查安徽省部分地区山羊羔瘫软综合征的发病情况。方法:通过问卷调查和实地走访,分别

对安徽省9个地级市75家山羊养殖场进行调查。结果:75家山羊养殖场中,有37.33%的养殖场在春季

发病,有29.34%的养殖场在冬季发病,且出生后4~15d羔羊发病率最高,占发病羔羊的66.67%,山羊

羔瘫软综合征的羔羊死亡率可达20%~60%。夏秋季节少发或偶发。结论:根据调查结果,建议加强对

妊娠母羊妊娠期管理,科学配制妊娠期母羊的饲料,提高母羊及羔羊的管理水平,通过对母羊适当放牧、增

加运动、定期免疫和驱虫、加强分娩前后的环境和管理,可减少山羊羔瘫软综合征的发病率。

关键词:羔羊;瘫软综合征;山羊

中图分类号:S852.3 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)02-0019-06

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0203

InvestigationandanalysisofFloppyKidSyndrome

insomeareasofAnhuiProvince

WANGLaixiang

1, GUODawei3, JIANGXichun4, ZHOUJinxing

1,2*

(1.CollegeofAnimalScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofAnimalNutritionRegulationandHealth,Fengyang233100,China;

3.AnhuiLvshuAnimalHusbandryCo.,Ltd.,Lixin236700,China;

4.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,AnhuiAcademyofAgriculturalScience,Hefei230031,China)

Abstract:Objective:ToinvestigatetheincidenceofFloppyKidSyndrome(FKS)insomeareasofAnhui

Province.Methods:75Goatfarmswereinvestigatedthroughquestionnairesandfieldvisitsin9citiesof

AnhuiProvince.Results:TheincidencerateofFKSwas37.33%inspring,and29.34%inwinter,and

theincidenceageswerehighestin4—15d,accountingfor66.67%ofthesicklambs,thedeathrateof

FKSlambsreached20%—60%.Rareoroccasionaloccurrencewasinsummerandautumn.Conclusion:

Accordingtothesurvey,itwaspredictedthattheincidenceofFKScanbereducedbystrengtheningthe

managementofpregnantewesduringpregnancy,scientificallypreparingthefeedforpregnantewes,

improvingthemanagementofewesandlambs,andbyproperlygrazingewes,increasingexercise,regular

immunization,anddeworming,strengtheningenvironmentandmanagementbeforeandafterchildbirth.

Keywords:Lambs;FloppyKidSyndrome(FKS);Goats

中国绵羊、山羊品种资源丰富,分布范围广。随着中国畜牧业集约化水平的日益提升,养羊业也将成

为中国经济增长的新亮点。安徽省养羊业历史悠久,具有丰富的饲草资源和农村劳动力资源,具有发展肉

用山羊产业的明显优势[1-2]。然而近年来山羊羔瘫软综合征(FloppyKidSyndrome,FKS)严重阻碍着养

羊业发展。山羊羔瘫软综合征与代谢性酸中毒有关[3-4],发病特征为软瘫、摇摆无力、腹胀、腹泻、食欲下

降、运动障碍等,发病率较高,不及时治疗的羔羊死亡迅速,给养羊户造成严重的经济损失[5]。欧洲、北美

洲一些国家也相继报道了山羊羔瘫软综合征在本国的一些发病情况[6-10]。对于该发病原因,欧洲、北美洲

一些学者根据临床表现,分别从大肠杆菌、A 型产气荚膜梭菌、隐孢子虫等病原的感染,以及羔羊的饲养

管理方面进行了研究,其结果仍有待进一步证实。根据以上相关文献报道,患有瘫软综合征的羔羊均表现

为厌食、嗜睡、肌肉张力下降、不吮乳、瘫软。目前中国对山羊羔瘫软综合征的相关报道较少,本研究对安

徽省部分地区山羊养殖场山羊羔瘫软综合征进行调查,并对调查信息汇总、统计分析,总结出山羊羔瘫软

综合征发病原因,并制定具有针对性的预防措施,为预防山羊羔瘫软综合征的发生提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 调查对象

调查对象为安徽省安庆市、池州市、宣城市、马鞍山市、六安市、蚌埠市、亳州市、宿州市、阜阳市等9个

地级市75家山羊养殖场,调查其羔羊瘫软综合征发病情况。调查对象分布区域及调查养殖场数量如图1

所示。

图1 安徽省部分地区山羊羔瘫软综合征调查区域及养殖场数分布

Fig.1 SurveyareaanddistributionmapofthenumberofbreedingfarmsforFKSinsomeregionsofAnhuiProvince

注:数字代表该区域内被调查的养殖场数。

20 安徽科技学院学报 2024年

1.2 调查方法

通过对安徽省9个地区75家山羊养殖场进行问卷调查和现场调查,调查养殖场的存栏量、养殖方式、

养殖模式、发病季节、发病症状、发病时间、发病数、死亡数、常用治疗药物以及治疗效果等指标。

1.3 数据统计

对75份问卷调查涉及的养殖方式、养殖模式、发病季节、发病症状、发病时间、发病数、死亡数进行统

计,利用SPSS软件对各地区平均发病率、平均死亡率进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 安徽省部分地区山羊养殖场山羊羔瘫软综合征发病症状、用药情况

由表1可见,调查的9个地区山羊羔瘫软综合征的发病症状基本一致,主要表现为四肢瘫软、无法站

立、食欲下降等。常用的治疗药物主要为维生素类、多糖类及部分抗生素,但治疗效果都不明显。

表1 安徽省部分地区养殖场山羊羔瘫软综合征发病症状、用药情况

Table1 SymptomsandmedicationstatusofFKSinsomeareasofAnhuiProvince

地区 发病症状 常用治疗药 治疗效果

安庆市

四肢瘫软、肌无力、严重的腿瘫、无法站

立、呼吸困难、精神沉郁、心跳迟缓

维生素 D、头孢噻呋钠、土霉素、多酶片、维生素 C、葡萄糖酸钙、青

霉素

不明显

池州市 四肢瘫软、无法站立 葡萄糖酸钙锌口服液、瘫软灵 不明显

宣城市 瘫软、无法站立、食欲下降

葡萄糖多维矿物质混合液、钙中钙口服液、维生素 D胶性钙、维生

素B12

不明显

马鞍山市 四肢瘫软、无法站立 维生素D、青霉素、葡萄糖酸钙 不明显

六安市 瘫软、腹胀、无法站立、软瘫、不食 维生素C、维生素B1、维生素B2、葡萄糖酸钙、钙磷制剂 不明显

蚌埠市 无法站立、四肢瘫软 维生素 A、维生素D、葡萄糖酸钙 不明显

亳州市

瘫软、呼吸急促、摇摆、浑身无力、吃不住

奶、体温偏高、心跳加快

青霉素、头孢、林可霉素、安片西林奈、软瘫灵、葡萄糖酸钙锌口服

液、黄芪多糖、庆大霉素

不明显

宿州市

无法直立行走、体质虚弱、瘫软、四肢无

力、腹泻

维生素D胶性钙、复合维生素B、羔羊犊牛瘫软强壮液、庆大霉素、

钙铁锌片

不明显

阜阳市 四肢瘫软、摇摆无力 葡萄糖酸钙、庆大霉素、恩诺沙星注射液 不明显

2.2 安徽省部分地区山羊养殖场山羊羔瘫软综合征发病及死亡情况

由图2所示,安徽省各地区山羊养殖场都有发病情况,各地区山羊养殖场羔羊平均发病率为0.4%~

6%,亳州市与其他各市之间差异显著(P<0.05),安庆市、宣城市、马鞍山市、蚌埠市、宿州市、阜阳市之间

无显著差异(P>0.05),该病在大规模山羊养殖场羔羊发病率较高,小规模养殖户的羔羊发病率较低。

由图3所示,各地区山羊养殖场羔羊平均死亡率为20%~60%,六安市和池州市、亳州市之间差异显

著(P<0.05),安庆市、宣城市、马鞍山市、蚌埠市、宿州市、阜阳市之间无显著差异(P>0.05),该病在大

规模养殖场死亡率较低。

图2 安徽省部分地区山羊养殖场羔羊平均发病率

Fig.2 Averageincidencerateoflambsingoatfarms

insomeareasofAnhuiProvince

注:肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),肩标字母不

同表示差异显著(P<0.05)。

图3 安徽省部分地区山羊养殖场羔羊平均死亡率

Fig.3 Averagemortalityrateoflambsingoatfarms

insomeregionsofAnhuiProvince

注:无肩标字母或肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),

肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

第38卷第2期 汪来香,等:安徽省部分地区山羊羔瘫软综合征调查与分析 21

2.3 安徽省部分地区山羊养殖场养殖方式

由图4可知,此次调查的安徽省部分地区山羊养殖场主要以圈养、放养和半牧半舍的饲养方式进行饲

养。其中圈养的养殖场66家,占88%;放养的养殖场5家,占6.67%;半牧半舍的养殖场4家,占5.33%。

调查结果显示,圈养是安徽省山羊养殖场主要饲养方式。

2.4 安徽省部分地区山羊养殖场养殖模式

由图5可知,此次调查的安徽省部分地区山羊养殖场饲养模式有2种,分别为自繁自养和专业育肥,

其中自繁自养的养殖场66家,占88%;专业育肥的养殖场9家,占12%。调查结果显示,自繁自养是安徽

省山羊养殖场主要养殖模式。

图4 安徽省部分地区山羊养殖方式统计

Fig.4 Statisticalchartofgoatbreedingmethods

insomeregionsofAnhuiProvince

图5 安徽省部分地区山羊养殖模式统计

Fig.5 Statisticalchartofgoatbreedingpatterns

insomeregionsofAnhuiProvince

2.5 安徽省部分地区山羊养殖场饲料来源

由图6可知,此次调查的安徽省部分地区山羊养殖场饲料来源有3种,自配饲料来源的养殖场49家,

占65.33%;购买饲料来源的养殖场14家,占18.67%;自配+购买饲料来源的养殖场12家,占16%。调

查结果显示,自配饲料是安徽省山羊养殖场主要饲料来源。

2.6 安徽省部分地区山羊养殖场山羊羔瘫软综合征发病阶段

由图7可知,此次调查的安徽省部分地区新生山羊羔瘫软综合征在1~3d发病的养殖场有16家,占

21.33%;4~15d发病的养殖场有50家,占66.67%;16~55d发病的养殖场有9家,占12%。调查结果

显示,出生后4~15d是安徽省山羊羔瘫软综合征发病的主要阶段。

图6 安徽省部分地区山羊养殖场饲料来源统计

Fig.6 Statisticalchartoffeedsourcesforgoatfarms

insomeregionsofAnhuiProvince

图7 安徽省部分地区山羊养殖场山羊羔瘫软综合征发病阶段统计

Fig.7 StatisticalchartoftheincidencestagesofFKSingoatfarms

insomeregionsofAnhuiProvince

2.7 安徽省部分地区山羊养殖场山羊羔瘫软综合征发病季节

由图8可知,此次调查的安徽省部分地区山羊羔瘫软综合征春季发病的养殖场28家,占37.33%;夏季

发病的养殖场9家,占12%;秋季发病的养殖场10家,占比13.33%,冬季发病的养殖场22家,占29.34%,常

年发病的养殖场6家,占8%。调查结果显示,春、冬季节是安徽省山羊羔瘫软综合征发病的主要季节。

图8 安徽省部分地区山羊养殖场山羊羔瘫软综合征发病季节统计

Fig.8 StatisticalchartofseasonalincidenceofFKSingoatfarmsinsomeareasofAnhuiProvince

22 安徽科技学院学报 2024年

3 结论与讨论

3.1 发病因素

3.1.1 养殖规模因素 调查分析得知,亳州市羔羊平均发病率与其他各市之间差异显著(P<0.05),亳州

市羔羊平均死亡率也相对较低。在相对较大规模养殖场羔羊平均发病率较高,但山羊羔羊平均死亡率较

低,其主要原因是大规模养殖场养殖标准和管理制度相对完善,可以保证产品的质量和安全,能更好地控

制养殖过程中的多种因素,如温度、饲料、饮水、疫病等,从而提高养殖效率,减少养殖风险。小规模养殖场

养殖制度和管理制度不完善,存在饲喂不合理、优质草料不足、消毒意识差、防范意识差等现象,导致羔羊

发病后死亡率较高[11]。

3.1.2 饲料因素 调查发现山羊养殖场饲料来源有3种(自配、购买、自配+购买),大部分养殖场都采用

自配饲料,但不同规模、不同羊群对饲料的要求也不同,养殖户在自配饲料时因缺乏专业知识导致饲料出

现质量安全、比例失衡、储存不当等问题,再将饲料长期饲喂给妊娠母羊可能会出现营养缺失或营养不足,

从而在母羊分娩后可能会引起山羊羔瘫软综合征的发生[12]。为提高母羊妊娠率,在妊娠后期要保证饲料

充足,为妊娠母羊提供全价饲料,保持营养均衡。需要补充适量的蛋白质、矿物质、维生素、微量元素等物

质,若维生素、矿物质、蛋白质、微量元素长期缺失或摄入不足,不仅会影响妊娠母羊的健康也会影响胎儿

的健康,从而导致山羊羔瘫软综合征的发生[13]。若母羊采用舍饲管理,长期摄入的青绿多汁饲料和青贮

饲料少,也不利于母羊营养均衡。所以在自配饲料时要根据山羊的生长阶段进行科学配制。在合理科学

配制饲料的同时,加工和储存饲料的设施条件也要达标。大多数养殖场自配饲料的生产条件较差,饲料加

工设备不达标,储存条件简陋,管理粗放,都会导致饲料发生霉变 ,再将霉变的饲料饲喂给羔羊很可能会

导致发病。

3.1.3 季节因素 根据调查,该病主要发生于山羊羔羊,且一年四季都有发生,但山羊羔瘫软综合征在春

季、冬季发病较多,特别是圈养母羊所产羔羊发病率较高。冬季羊群活动量小,阳光照射少,补饲跟不上,

长时间圈养,减少了羊群的户外运动量,造成妊娠母羊体质下降,最终对胎儿的正常发育造成影响,是导致

冬季羔羊发病率高的主要原因。春季发病主要因为妊娠母羊在冬季采用圈养方式,且饲料营养结构单一,

使得出生羔羊营养不良、体质较差,导致山羊羔瘫软综合征高发。母羊妊娠阶段对维生素及微量元素的需

求较高,若在饲养过程这部分营养需求无法得到有效满足,其乳汁营养含量也会随之降低,最终导致山羊

羔瘫软综合征发病概率上升[14]。

3.1.4 环境管理因素 根据调查,羔羊在出生后4~15d发病数最多,大部分为突然发病,发病早期体温

正常或者稍高。在羔羊管理过程中发现,山羊羔瘫软综合征常表现为同一窝多只羔羊同时发生或相继发

生。母羊妊娠期间管理粗放,羊舍饲养密度大,运动量少,母羊体质虚弱,羔羊出生后体温调节能力差,抗

病力低,产房卫生不佳,羊舍温度过低,羊舍环境较差,羔羊没吃好初乳,疫病防治措施没到位,没有做到定

期驱虫等,这些都会导致新生羔羊发病。

3.2 预防措施

3.2.1 母羊妊娠管理 母羊妊娠前期采用放牧饲养与人工饲喂相结合的方法进行饲喂管理,放牧可增加

山羊的太阳光照射量、活动量以及采食种类多样性,可以促进体内钙磷的吸收与转化[15]。因此,科学配制

妊娠期母羊饲料,既要保证饲料原料的质量,混料均匀,又要注意配方的科学性。不同饲养阶段饲料配方

不同,要根据母羊体况适当补充矿物质和维生素等营养成分。在母羊妊娠期适当增加精饲料供给量,粗饲

料可逐渐更换为嫩草优质饲草,严禁饲喂发霉变质的饲料。在合理科学配制饲料的同时,加工和储存饲料

的设施条件要达标,饲料原料存放要合理,防止饲料发酵腐败产生霉菌毒素。同时,养殖户应提高饲料安

全意识,记录好饲料配制时间,一旦饲料出现任何异常可随时查找记录解决问题[16]。

3.2.2 母羊综合管理 调查得知,春冬季节是山羊羔瘫软综合征发病率较高的季节,因此,首先要对圈养

的母羊适当放牧以提高个体的抵抗力,加大太阳光照射量和母羊运动量。其次可在冬季枯草期通过饲喂

人工种植饲草解决青草不足带来的营养摄入不全问题,如饲喂人工种植的黑麦草。再次在春冬季节定期

第38卷第2期 汪来香,等:安徽省部分地区山羊羔瘫软综合征调查与分析 23

对母羊接种疫苗,预防由于气温不稳定带来的各种疾病及并发症。同时,定期给母羊进行驱虫,通过母羊

群体的综合管理,减少山羊羔瘫软综合征的发生。

3.2.3 羔羊管理 首先加强分娩过程管理,分娩前后饲养员必须做好产房的环境消毒,确保地面清洁、干

燥,定时清理羊粪,分娩操作前对相关用具进行消毒,减少病原微生物污染。其次分娩后即刻对母羊乳房

和乳头进行消毒处理,保证羔羊尽快吃到初乳,并对羔羊脐带进行消毒。再次确保羔羊舍保温设施完备避

免吹风 ,如关好羊舍门窗、铺干草增加保温性能等,保证羔羊体质健康来减少山羊羔瘫软综合征的发生。

3.3 结论

山羊羔瘫软综合征发病突然,在较大规模的养殖场发病率较高,但死亡率较低。新生羔羊在4~15d

发病数最多,不及时治疗死亡率较高,死亡率为20%~60%。该病一年四季均可发生,但在春、冬季发病

较多。通过加强对妊娠母羊妊娠期管理、提高母羊及羔羊的管理水平,可减少山羊羔瘫软综合征的发病

比例。

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(责任编辑:顾文亮)

24 安徽科技学院学报 2024年

安徽科技学院学报,2024,38(2):25-30

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-10-12

基金项目:农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室开放课题(YDWS202104);安

徽省高校自然科学研究项目(2022AH051641);安徽省自然科学基金(1908085QC116);安徽科技学院人才引进项目

(DKYJ201902)。

作者简介:罗昕雨(1998-),女,江苏淮安人,硕士研究生,主要从事预防兽医学研究,E-mail:972994329@qq.com。

通信作者:刘欣超,副教授,E-mail:liuxch@ahstu.edu.cn。

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达

及多克隆抗体制备

罗昕雨1,2, 赵 磊1,2, 陈玉晴1,2, 缪欣怡1,2,

石家鑫1,2, 顾有方1,2, 李文超1,2, 刘欣超1,2*

(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100;

2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100)

摘 要:目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1 基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、

检测及致病机制研究奠定基础。方法:对 FAdV-4 的 CH/AHMC/2015 分离株 Fiber-1 基因序列

(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,截取具有较高免疫原性的片段,设计

合成特异性引物,以 CH/AHMC/2015分离株基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增,获得截短Fiber-1

(sFiber-1)基因片段,将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中,诱导表

达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并测定多克隆抗体效价。

用 Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体,获得 FAdV-4 的

sFiber-1重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,重组sFiber-1蛋白大小约为52kDa,主要以包涵体形式表达;间

接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶213;Westernblot结果显示制备的多克隆抗体能特异性

识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白,制备了具有较高免疫

活性的sFiber-1多克隆抗体,可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。

关键词:血清4型禽腺病毒;Fiber-1 基因;重组蛋白;多克隆抗体

中图分类号:S855.3 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)02-0025-06

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0204

Shortenedexpressionandpolyclonalantibodypreparationof

Fiber-1proteinoffowladenovirusserotype4

LUOXinyu1,2, ZHAOLei1,2, CHENYuqing

1,2, MIAOXinyi1,2,

SHIJiaxin1,2, GUYoufang

1,2, LIWenchao1,2, LIUXinchao1,2*

(1.CollegeofAnimalScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofAnimalNutritionRegulationandHealth,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:TopreparethepolyclonalantibodyagainstshortenedFiber-1 (sFiber-1)proteinof

fowladenovirusserotype4(FAdV-4),andtoprovideatoolforthedetectionanddiagnosisofFAdV-4.

Methods:Thesignalpeptide,hydrophobicityandantigendeterminationoftheFibre-1genesequenceof

CH/AHMC/2015isolateofFAdV-4 (MG148335.1:30459-31754)wereanalyzed,andthefragments

withhighimmunogenicitywereinterceptedandthespecificprimersweredesignedandsynthesized.The

DNAofCH/AHMC/2015isolatewasamplifiedtoobtainthesFiber-1fragment,whichwasclonedinto

pET-32a,andtransformedintotheCOMPETENTcellBL21toexpresssFiber-1protein.Thepurified

sFiber-1proteinemulsifiedwithadjuvantwasusedtoimmunizerats.Polyclondantibodywasprepared,

thetiterofpolyclonalantibody wasanalyzedbyELISA,andtheimmunogenicityofsFiber-1 was

analyzedbyWesternblot.Results:ThesFiber-1prokaryoticexpressionvectorwasconstructedtoobtain

recombinantsFiber-1proteinofFAdV-4.SDS-PAGEshowedthatsFiber-1proteinwasmainlyexpressed

ininclusionbodieswithamolecularweightof52kDa.ThetiterofsFiber-1antibodywas1∶213.

Western-blotresultsdisplayedthatrecombinantsFiber-1proteincanberecognizedbytheobtained

antibody.Conclusion:Inthisstudy,recombinantsFiber-1proteinofFAdV-4wassuccessfullyexpressed

andsFiber-1polyclonalantibodywithhighimmuneactivitywasprepared,whichcouldlayafoundation

forthediagnosisanddetectionofFAdV-4.

Keywords:Fowladenovirusserotype4;Fiber-1;Recombinantprotein;Polyclonalantibody

禽腺病毒(Fowladenvirus,FAdV)包括众多血清型[1]。其中,肝炎-心包积液综合征是血清4型禽腺

病毒(FAdV-4)感染的主要症状,且其具有高致病性和高传染性的特点,3~10周龄的鸡、鸭、鹅最为易感,

死亡率可达10%~80%

[2-3]。种禽和产蛋鸡群感染FAdV-4后死亡率一般不超过10%,但可引起产蛋率

下降10%~30%

[4]。

1987年,FAdV-4感染首次报道于巴基斯坦[4]。随后该病迅速蔓延至美国、印度、南非、加拿大、韩国、

新西兰、墨西哥、伊拉克、智利、日本、俄罗斯等国家[5]。2015年之前,我国偶尔有个别FAdV-4病例报道,

当时未引起重视,但自2015年6月以来,山东、安徽、河南、广东等省份家禽密集养殖地区呈现FAdV-4暴

发性流行的趋势,死亡率达到30%~70%,给我国家禽业造成了巨大的经济损失[6-10]。

目前,对FAdV-4病尚无有效治疗方法,因此研制FAdV-4病的诊断方法对于防控该病具有重要意

义。FAdV-4病毒的Fiber-1蛋白位于病毒粒子表面,具有特异性的抗原决定簇,参与病毒增殖、组装、扩

散及宿主特性的选择[11-12]。本研究截取Fiber-1蛋白抗原性较好的第114~424氨基酸(sFiber-1)片段进

行原核表达,并制备sFiber-1多克隆抗体,为FAdV-4检测方法的建立及其致病机制等的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和载体 FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株由家禽疫病防控监测安徽省重点实验室保存,

pET-32a载体由本实验室保存。

1.1.2 主要菌株及试剂 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物(安徽)股份有限公司;BamHI

和HindIII、T4DNA连接酶、胶回收试剂盒、Taq酶、质粒小提试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限

公司;预染180kDa蛋白 Marker、考马斯亮蓝染色液、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG20000、HRP

标记的羊抗鼠IgG均购自北京索莱宝科技有限公司;病毒 DNA 提取试剂盒购自美国奥美嘉生物技术

公司。

1.1.3 试验动物 2只成年雌性SD大鼠,购自白湖博源实验用品公司。

1.2 方法

1.2.1 FAdV-4病毒DNA提取 根据 OMEGAE.Z.N.A.ViralDNAKit说明书,提取FAdV-4安

26 安徽科技学院学报 2024年

徽分离株CH/AHMC/2015的基因组DNA,置于-20℃冰箱备用。

1.2.2 sFiber-1 序列选取及PCR扩增引物设计 根据 GenBank中收录的CH/AHMC/2015分离株的

Fiber-1 基因全序列(MG148335.1:30459-31754),利用在线软件SignalP-5.0分析其是否有信号肽;利用

TMHMM-2.0预测序列的跨膜区;利用在线分析工具(http://www.detaibio.com/tools)预测Fiber-1的

抗原决定簇。根据生物信息分析结果,截取 Fiber-1蛋白抗原性较好的第114~424氨基酸片段,用

PrimerPremier5.0设计引物,引物序列为F:5'-CGCGGATCCATGGCCACTAAGCAAGCCAAC-3',R:

5'-CCCAAGCTTTTAGGGGCCCGGAGCATT-3',其中,下划线处为BamH I和 HindIII酶切位点,由

生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 序列片段扩增 以安徽分离株 CH/AHMC/2015的基因组 DNA 为模板,扩增sFiber-1 序列。

PCR反应的退火温度为60℃,其余反应条件参考说明书。用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,并回收

大小与目的片段一致的片段,置于-20℃保存。

1.2.4 重组质粒的构建 用BamH Ι和HindIII对pET-32a载体和目的片段进行双酶切,双酶切产物

经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,切取与预期大小一致的片段进行胶回收,用T4DNA连接酶连接回收的目的

片段与线性化pET-32a载体,构建pET-32a-sFiber-1重组质粒,并转化至BL21感受态[13]。阳性克隆经

扩大培养后,提取质粒进行双酶切鉴定,验证正确的质粒进一步进行测序验证。

1.2.5 sFiber-1重组蛋白的表达鉴定及纯化 将测序验证过的菌液接入培养基培养,当菌液 OD600 值达

到0.5~0.7时,收集未诱导的菌液后加入IPTG,37℃、170r/min诱导蛋白表达,分别在诱导1.5、3.0、

4.5h后收集菌液,将收集到的菌液离心后留沉淀菌体,加入适量 PBS和5×蛋白上样缓冲液煮沸

10min,进行SDS-PAGE电泳,分析重组蛋白表达情况。以最佳条件诱导1L菌液,离心后用PBS重悬菌

体沉淀,在冰上超声破碎,破碎3s,冷却4s,每次工作5min,超声5~6次后离心,收集上清液和沉淀,沉

淀用包涵体溶解液重悬,上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳以确定重组蛋白在菌体中的分布情

况[14]。最后依次用6、4、2、0mol/L尿素对包涵体蛋白进行复性,用PEG20000浓缩复性蛋白后,测定蛋

白浓度,保存于-20℃备用。

1.2.6 sFiber-1多克隆抗体的制备 免疫前从眼眶后静脉丛采集大鼠血液,分离血清作为阴性血清对

照,按1∶1的比例混合乳化弗氏完全佐剂与sFiber-1蛋白(2.3mg/mL),背部皮下多点免疫SD大鼠,每

只免疫500μg蛋白。在一免后的14、21、28d加强免疫,加强免疫时将sFiber-1蛋白与弗氏不完全佐剂

按1∶1比例充分乳化,每只免疫500μg蛋白,第4次免疫7d后对大鼠进行眼眶采血,血液4℃静置过夜

后离心分离血清,作为sFiber-1多克隆抗体,保存于-70℃备用。

1.2.7 抗体效价的测定 ELISA方法测定大鼠抗FAdV-4sFiber-1蛋白多克隆抗体的效价。用包被液

稀释sFiber-1蛋白,包被ELISA板,每孔100ng,4℃过夜。后续试验的孵育温度均为37℃,每次孵育后

用PBST洗涤3次。用含5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭,每孔200μL,封闭1h;将sFiber-1多克隆抗体

按1∶2~1∶218 的梯度进行稀释,作为一抗,孵育1h;加入 HRP标记的山羊抗大鼠IgG(1∶6000稀

释),孵育1h;加入底物显色液TMB避光孵育15min,用20% H2SO4 终止反应,用酶标仪读取OD450 值。

当某孔的 OD450 值为后一孔 OD450 值的2倍及以上时,该孔的稀释倍数则为多克隆抗体的效价[15],同时

设置大鼠阴性血清对照试验。

1.2.8 多克隆抗体的 Westernblot鉴定 将重组sFiber-1蛋白进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF

膜,用5%脱脂奶粉封闭1h后洗涤3次,用sFiber-1多克隆抗体(1∶100)4℃孵育过夜;洗涤后,加入

HRP标记的山羊抗大鼠IgG(1∶3000),37℃孵育1h后洗涤3次,最后加入 DAB显色液显色,观察

结果。

2 结果与分析

2.1 sFiber-1序列扩增及原核表达载体的构建

以FAdV-4安徽分离株CH/AHMC/2015的 DNA 为模版,PCR扩增sFiber-1 序列后,经琼脂糖凝

第38卷第2期 罗昕雨,等:血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备 27

胶电泳检测,获得与目的片段大小933bp一致的条带(图1)。将扩增到的sFiber-1 序列连接至原核表达

载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-sFiber-1,重组质粒经双酶切,获得933bp大小的目标序列和线性

化载体片段(图2)。测序验证sFiber-1 的重组载体构建正确。

图1 sFiber-1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

Fig.1 AgarosegelelectrophoresisiofsFiber-1PCRproducts

注:M 为DNA标准DL2000;1为sFiber-1PCR扩增产物。

图2 重组质粒pET-32a-sFiber-1双酶切(BamHΙ和HindIII)鉴定结果

Fig.2 Resultsofdoubledigestion(BamH ΙandHindIII)

ofrecombinantplasmidpET-32a-sFiber-1

注:M 为DNA标准DL2000;1为pET-32a-sFiber-1双酶切产物。

2.2 重组蛋白的表达及可溶性鉴定

使用IPTG诱导含阳性重组表达质粒的菌液,经诱导后菌体能够表达重组sFiber-1蛋白,大小约为

52kDa,且诱导4.5h后的菌液表达sFiber-1重组蛋白的效果最佳(图3)。将IPTG诱导后的菌液超声破

碎,离心后的沉淀及上清液分别进行SDS-PAGE电泳,如图4所示,重组蛋白sFiber-1主要以包涵体形式

表达。

图3 SDS-PAGE分析pET-32a(+)-sFiber-1的时相表达

Fig.3 SDS-PAGEanalysisoftheexpressionof

pET-32a(+)-sFiber-1indifferenttime

注:M为蛋白分子量标准;1~4分别为pET-32a(+)-sFiber-1

诱导4.5、3、1.5、0h。

图4 SDS-PAGE分析pET-32a(+)-sFiber-1的蛋白分布情况

Fig.4 SDS-PAGEanalysisoftheexpression

ofpET-32a(+)-sFiber-1inE.coli

注:M为蛋白分子量标准;1为pET-32a(+)-sFiber-1诱导后的

超声上清蛋白;2为pET-32a(+)-sFiber-1诱导后的包涵体沉淀。

2.3 多克隆抗体的效价测定

以重组蛋白sFiber-1为包被抗原,利用间接ELISA方法测定sFiber-1多克隆抗体效价,结果表明本

研究制备的sFiber-1多克隆抗体效价为213。

2.4 多克隆抗体的 Western-blot分析

Westernblot分析显示,FAdV-4的sFiber-1重组蛋白能够被制备的sFiber-1多克隆抗体识别,条带

大小为52KDa,与目的条带一致(图5),而阴性血清无法识别sFiber-1重组蛋白。

28 安徽科技学院学报 2024年

图5 抗sFiber-1多克隆抗体的 Westernblot分析

Fig.5 WesternblotanalysisofthepolyclonalantibodyofsFiber-1

注:M 为蛋白分子量标准;1为抗sFiber-1多克隆抗体识别sFiber-1重组蛋白的 Westernblot分析;2为大鼠阴性空白血清识别sFiber-1重组蛋白的 Westernblot分析。

3 结论与讨论

近年来,血清4型禽腺病毒已成为一种危害养禽业发展的重要病毒,其主要危害3~10周龄的禽类,

给养禽业造成了巨大的经济损失,但目前仍缺少有效的防治措施,因而进行快速准确的检测和诊断可为该

病的防控提供参考[16]。目前该病毒的主要诊断方法有ELISA检测、血清中和试验、分子生物学检测、病

毒分离培养等。上述方法中,病毒分离法检测周期相对较长,步骤复杂,对人员要求高,分子生物学检测方

法成本相对较高,而ELISA检测方法具有快速、高效、安全便捷、特异性强、灵敏度高等特点,更适用于临

床检测[17]。

FAdV-4的衣壳蛋白主要包括 Hexon、Penton、Fiber-1和 Fiber-2等4个结构蛋白,其中 Hexon、

Fiber-1和Fiber-2在FAdV-4的感染和致病等方面具有重要的作用,但目前国内外关于FAdV-4的病原

检测及抗体的制备主要针对 Hexon与Fiber-2蛋白[18-19]。谢泉[20]建立了基于 Hexon蛋白的ELISA检测

方法,但检出率不高。Pan等[21]用FAdV-4病毒作为包被抗原,建立了一种 ELISA 方法,但无法特异性

检测FAdV-4。

Mase等[22]对FAdV-4的Fiber-1核苷酸序列进行分析,显示Fiber-1的核苷酸序列可区分不同的禽

腺病毒血清型。因而,本研究以Fiber-1为目标蛋白,通过在线生物信息分析软件预测Fiber-1蛋白的信

号肽、跨膜区和抗原决定簇的分布,截取其具有较好免疫原性的片段进行表达,成功构建了pET-32asFiber-1表达载体,获得了重组sFiber-1蛋白,经免疫大鼠制备了多克隆抗体,效价检测表明本研究制备

的多克隆抗体效价较高,当稀释213 倍后仍能识别抗原。此外,我们进一步通过 Westernblot分析sFiber-1

多克隆抗体的免疫原性,结果显示,sFiber-1多克隆抗体能够特异性的识别重组sFiber-1蛋白,而阴性血

清无法识别sFiber-1蛋白,进一步表明本研究制备的sFiber-1多克隆抗体免疫原性较高。

综上,本研究制备了重组sFiber-1蛋白和具有较高免疫活性的多克隆抗体,研究结果可为建立具有较

好特异性的血清4型禽腺病毒的ELISA检测方法奠定基础,为血清4型禽腺病毒病的防控提供参考。

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(责任编辑:顾文亮)

30 安徽科技学院学报 2024年

安徽科技学院学报,2024,38(2):31-38

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-11-21

基金项目:广东省重点领域研发计划项目(2023B0202150001);广东省基础与应用基础研究基金(2021B1515120006);广东省科技计划

项目(2021B1212050021,2023B1212060040);猪禽种业全国重点实验室开放课题(2023QZ-NK05,2022GZ07);广州市科技计

划项目(2023B04J0137,2023A04J0789);云浮市科技计划项目(2022020202);科技创新战略专项资金(高水平农科院建设)

(202110TD,202122TD,R2020PY-JC001,R2019YJ-YB3010,R2020PY-JG013,R2020QD-048,R2021PY-QY007,R2023PYJG018);广东省现代 农 业 产 业 技 术 体 系 创 新 团 队 建 设 专 项 (2022KJ119);广 东 省 农 业 科 学 院 协 同 创 新 中 心 项 目

(XTXM202202)。

作者简介:孙栋(1999-),男,山东威海人,硕士研究生,主要从事动物寄生虫病研究,E-mail:1453120592@qq.com。

通信作者:顾有方,教授,E-mail:youfanggu@163.com。

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其

在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用

孙 栋1,2, 宋忠锋1,2, 倪君丽1,2, 方肆云3, 王定爱3,

申翰钦3, 严专强3, 戚南山2, 孙铭飞2, 顾有方1*

(1.安徽科技学院 动物科学学院,动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100;

2.广东省农业科学院 动物卫生研究所,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,

农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室,广东 广州 510640;

3.温氏食品集团股份有限公司,广东 新兴 527400)

摘 要:目的:探讨不同诱导因素对鸡坏死性肠炎(Necroticenteritis,NE)的诱发效果,以便建立鸡坏死

性肠炎的发病模型。方法:以安徽省某规模化鸡场采集的病鸡肠道样品中分离出的 G 型产气荚膜梭菌

(Clostridiumperfringens,C.perfringens)(CPG-AH5株)为病原菌,分析单独或联合感染毒害艾美耳

球虫对在饲喂高蛋白饲料(添加鱼粉)和不饲喂高蛋白饲料条件下,诱发鸡坏死性肠炎的影响。结果:无诱

导因素时,1.1×109CFU/mL剂量下CPG-AH5株感染可造成肠道损伤(平均病变评分为1.5±0.85分);单

一诱导因素(鱼粉或球虫)不能有效促进CPG-AH5株的感染,肠道病变与无诱导因素条件下无显著性提

高(2.0±1.15、2.4±1.08,P>0.05);多个诱导因素(鱼粉和球虫)联合诱导可有效促进CPG-AH5株的

感染,与无诱导因素和单一诱导因素相比肠道病变显著性提高(3.6±0.52,P<0.001)。结论:鱼粉和球

虫联合诱导可显著促进G型产气荚膜梭菌的感染,提高肠道病变。本研究建立了一种鸡坏死性肠炎发病

模型,有利于对鸡坏死性肠炎发病机制的研究,为疫苗及药物的后续研发和筛选评价提供了新的技术

支撑。

关键词:坏死性肠炎;G型产气荚膜梭菌;毒害艾美耳球虫;发病模型

中图分类号:S855.1+2 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)02-0031-08

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0205

IsolationandidentificationofClostridiumperfringenstypeGandits

applicationinthepathogenesismodelofnecrotizingenteritisinchickens

SUNDong

1,2, SONGZhongfeng

1,2, NIJunli1,2, FANGSiyun3, WANGDingai3,

SHEN Hanqin3, YANZhuanqiang

3, QINanshan2, SUN Mingfei2, GUYoufang

1*

(1.AnhuiProvincialKeyLaboratoryofAnimalNutritionRegulationandHealth,CollegeofAnimalScience,

AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.KeyLaboratoryofLivestockDiseasePreventionofGuangdongProvince,

KeyLaboratoryofAvianInfluenzaandOtherMajorPoultryDiseasesPreventionandControl,

MinistryofAgricultureandRuralAffairs,InstituteofAnimalHealth,

GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangdong510640,China;

3.WensFoodstuffGroupCo.,Ltd.,Xinxing527400,China)

Abstract:Objective:Thisstudyinvestigatestheinfluenceofvariousinducingfactorsontheinductionof

necroticenteritis(NE)inchickens,aimingtoestablishapathogenesismodelfornecrotizingenteritisin

chickens.Methods:ThisstudyusedClostridiumperfringenstypeG(C.perfringens),specificallythe

CPG-AH5strainisolatedfromtheintestinalsamplesofdiseasedchickenscollectedfromalarge-scale

poultryfarminAnhuiProvince,asthepathogentoanalyzetheeffectsofeithersingleorco-infection

withEimeriaspp.oninducingnecroticenteritisinchickens,underconditionsofbeingfedahighproteindiet(withfishmealadded)andnotbeingfedahigh-proteindiet.Results:Intheabsenceof

inducingfactors,aninoculationwithadoseof1.1×109 CFU/mLoftheCPG-AH5straincancause

intestinaldamage(withanaveragelesionscoreof1.5±0.85).Singleinducingfactors(eitherfishmeal

orcoccidia)donoteffectivelyenhancetheinfectionbytheCPG-AH5strain,andthereisnosignificant

increaseinintestinallesionscomparedtoconditionswithoutinducingfactors(2.0±1.15,2.4±1.08,

P>0.05).However,thecombinationofmultipleinducingfactors(fishmealandcoccidia)effectively

promotestheinfectionbytheCPG-AH5strain,withasignificantincreaseinintestinallesionscompared

toboththeabsenceofinducingfactorsandthepresenceofsingleinducingfactors(3.6±0.52,P<0.001).

Conclusion:Thecombinedinductionoffish mealandcoccidiasignificantlyenhancestheinfectionby

ClostridiumperfringenstypeG,increasingintestinallesions.Thisstudyhasestablishedamodelfor

necroticenteritisinchickens,whichisbeneficialforresearchingthepathogenesisofnecroticenteritisin

chickensandprovidesnewtechnicalsupportforthesubsequentresearchanddevelopment,andselection

evaluationofvaccinesanddrugs.

Keywords:Necroticenteritis;ClostridiumperfringenstypeG;Eimerianecatrix;Diseasemodel

产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌,广泛分布于土壤和腐烂有机物的环境中,是人和多种

动物肠道正常菌群中的一员[1]。产气荚膜梭菌可产生20多种毒素并诱发特征性坏死性肠炎病变[2]。依

据主要毒素α、β、ε、ι、CPE和坏死性肠炎B样(necroticenterocolitisB-like,NetB)编码基因的携带情况将

产气荚膜梭菌分为 A-G7种毒素。其中G型产气荚膜梭菌产生α和 NetB毒素[3]。

鸡坏死性肠炎(NecroticEnteritis,NE)是禽类中高发的肠道疾病,在全球养禽业普遍发生,每年造成

约60亿美元的经济损失[4]。中国在2020年前主要通过在饲料中添加抗生素和抗生素类生长促进剂

(AntimicrobialGrowthPromoter,AGP)的方式来防控坏死性肠炎。但临床抗生素的过度使用导致耐药

菌株大量出现,世界范围内对抗生素生长促进剂的限制使用政策出台,中国已于2020年在食品动物饲料

中推行减抗替抗的策略[5]。G型产气荚膜梭菌是鸡坏死性肠炎的主要致病菌,是近年来发现的新型毒素

型菌株,国外流行较广,但国内对G型产气荚膜梭菌的流行情况以及是否能引发鸡坏死性肠炎的研究报

道较少。因此建立理想的发病模型将有利于鸡坏死性肠炎病理学机制和防控技术的研究。鸡坏死性肠炎

的主要诱导因素包括使用高蛋白饲料,如鱼粉与玉米饲料(1∶1)和球虫共感染等[6]。刘少冰等[7]、Mohiuddin等[8]前期研究了鸡坏死性肠炎发病模型的建立,发现产气荚膜梭菌的接种剂量在每只鸡大于8.0×

108CFU/mL时,可出现典型坏死性肠炎的病变。本研究针对鸡坏死性肠炎发病模型的接种剂量和诱导

32 安徽科技学院学报 2024年

因素进行进一步优化,详细分析1株临床分离的 G型产气荚膜梭菌菌株生化特性及其分泌毒素特点,并

研究分别联合高蛋白饲料或接种毒害艾美耳球虫等不同诱因后对于鸡坏死性肠炎发病模型建立的稳定

性,研究结果将为后续产气荚膜梭菌性肠炎病疫苗和药物的研制和筛选提供新的模型基础,同时为产气荚

膜梭菌的致病机制研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 1日龄未接种疫苗的SPF雏鸡,购自新兴大华农禽蛋有限公司。SPF雏鸡饲养在广

东省农业科学院动物卫生研究所隔离动物舍内,所有试验鸡在饲养前,对环境进行甲醛熏蒸消毒,鸡群自

由采食和饮水。

1.1.2 虫株 毒害艾美耳球虫检验株(Eimeirianecatrix 韶关株,ENSG株)由广东省农业科学院动物

卫生研究所寄生生物学研究室保存。

1.1.3 病料来源 从安徽省某规模化鸡场采集的病鸡肠道样品放在冰盒中运回实验室,置于4℃保存备用。

1.1.4 主要试剂 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(TryptoseSulfiteCycloserineAgarBase,TSC)、

液体硫乙醇酸盐培养基(FluidThiolglycollateMedium,FTG)、革兰氏染色液等均购于广东环凯微生物科

技有限公司;生化鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司;合成的G型产气荚膜梭菌 NetB毒素阳性质粒

(NetB片段与pMD18-Teasy克隆载体连接)参考 Mohiuddin等[8]研究方法,由广东省农业科学院动物卫

生研究所寄生生物学研究室保存。

1.1.5 主要仪器 隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);2.5L厌氧罐(日本三菱瓦斯化学株式

会社);超净工作台(苏州净化设备有限公司);Quantitativereal-timepolymerasechainreaction(BIORAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品处理与增菌 本研究从安徽省某规模化鸡场采集的病鸡肠道样品,经密封塑料袋保存,在低

温条件下运输到实验室。参考PraveenKumar等[9]方法,在超净工作台中无菌操作剪取10cm 肠道样品

于装有已灭菌处理过的液体硫乙醇酸盐培养基的试管中。将试管置于37℃恒温培养箱,加入厌氧袋后,

在厌氧罐中厌氧培养24h。在超净工作台中用接种环蘸取增菌培养后的菌液,采用平板划线法在TSC上

进行三区划线,将培养皿置于37℃恒温培养箱,加入厌氧袋后,在厌氧罐中厌氧培养24h。用接种环挑取

TSC琼脂培养基上的黑色单菌落置于50μL的灭菌ddH2O中制成菌液,革兰氏染色后镜检观察其形态。

1.2.2 分离菌生化特性测定 在超净工作台中,挑取经过纯培养的单菌落接种FTG培养基中37℃厌氧

培养24h后,吸取50μL菌液接种到葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇等不同生化鉴定管中,

37℃恒温培养箱厌氧培养24~28h,观察并记录发酵情况。

1.2.3 荧光定量PCR鉴定产气荚膜梭菌毒素类型 参考陈祥杰等[10]分型鉴定方法,使用荧光定量PCR

对所分离的产气荚膜梭菌进行毒素分型鉴定[11](扩增引物见表1)。在超净工作台中用接种环挑取 TSC

琼脂培养基上的单菌落于100μLddH2O中,混匀后取1μL作为荧光定量PCR的模板,剩下全部加入至

FTG培养基中。荧光定量 PCR 反应体系为10μL:5μLTBGreenPremix,PrimerF(3μmol/L)和

PrimerR(3μmol/L)各1μL,1μL菌液模板,ddH2O补足至10μL。荧光定量PCR反应程序为:95℃预变性

30s;95℃变性15s;60℃退火和延伸30s,39个循环;熔解曲线程序为95℃10s,65℃5s,95℃5s。

表1 产气荚膜梭菌荧光定量PCR引物序列

Table1 PrimersequenceoffluorescencequantitativePCRofC.perfringens

毒素基因 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 片段大小/bp

plc GATGGAAAAATTGATGGAAC CATGCATGTTCTCTTTTAAAAT 136

cpb TATTCCTAAAAATACAATTTCTC CTGTAAATTTTGTATCCCATGA 212

etx TTAGTTTATCGGATACAGTAAAT ATAATCTTATTTTATTCCTGGTG 242

tpeL GCGATTATGAAACTATTATATGGTA TAACTTCCATTCTTTCTCTATA 168

cpe GATAGCTTAGGAAATATTGATCAAG GTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA 217

netB TGAGACTAAGGACGGTTATAATA TTGATATTCAACTATTATTACAGAT 214

第38卷第2期 孙 栋,等:G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用 33

1.2.4 菌种的保存 在超净工作台中,将鉴定为G型产气荚膜梭菌(命名为CPG-AH5)的菌液与灭菌后

5%甘油按1∶1比例混合后,保存于-80℃备用。

1.2.5 鸡坏死性肠炎发病模型的建立 参照刘少冰等[7]、Mohiuddin等[8]前期关于鸡坏死性肠炎发病模

型的建立方法,产气荚膜梭菌的接种剂量为1.1×109CFU/(mL·只),球虫接种剂量为5.0×103 个/(mL·

只),高蛋白饲料为鱼粉配制成高于40%蛋白含量的小麦基础饲料(以小麦为基础的粗蛋白含量18%的饲料

与含68%蛋白的鱼粉按1∶1的比例混合)。基于本研究前期预试验对产气荚膜梭菌接种剂量的摸索,发现

CPG-AH5株产气荚膜梭菌在接种剂量为1.1×109CFU/(mL·只)时可出现典型坏死性肠炎的病变。鉴于

此,本研究动物发病模型实验详细设计如下:1日龄未接种疫苗的SPF雏鸡80只,随机分为8组,每组

10只。G1~G4 组各试验鸡试验期间全程饲喂以小麦为基础的饲料(粗蛋白含量不低于18%),G5~G8 组

各试验鸡于1~7日龄饲喂以小麦为基础的饲料(粗蛋白含量不低于18%),于8日龄至试验结束饲喂以

小麦为基础的高蛋白饲料(以小麦为基础的粗蛋白含量18%的饲料与含68%蛋白的鱼粉按1∶1的比例

混合),均自由采食和饮水。其中G1 与G5 组为产气荚膜梭菌感染组,各试验鸡分别于14~17日龄每天

灌服1次以1.1×109CFU/mL为剂量的CPG-AH5株产气荚膜梭菌;G2 与G6 组为ENSG株球虫诱导组,各

试验鸡于9日龄灌服1次以5.0×103 个/mL为剂量的ENSG株孢子化卵囊;G3 与G7 组为CP+EN组,各

试验鸡分别于9日龄灌服1次以5.0×103 个/mL为剂量的ENSG株孢子化卵囊,并于14~17日龄每天

灌服1次以1.1×109CFU/mL为剂量的CPG-AH5株产气荚膜梭菌;G4 与 G8 组各试验鸡为空白对照

组,各试验鸡于9日、14~17日龄各灌服1次1mLPBS。G1~G8 试验各组于20日龄各取10只试验鸡

进行剖检取样,均自由采食和饮水。

1.2.6 攻毒菌株的制备 取冻存的CPG-AH5菌株接种到FTG培养基中,37℃恒温厌氧培养过夜后,

按1∶100的比例重新接种到FTG培养基中,37℃恒温厌氧培养12h,分光光度计测其 OD600nm 值,采用

10倍等比稀释法进行计数检测,每个稀释度取100μL用涂布器分别涂布在 TSC琼脂培养基上,每个稀

释度重复3次,待菌液吸收后,置于厌氧罐中,37℃恒温厌氧培养24h进行活菌计数(根据《中国兽药典》

2015版,取40~200个菌落数为准)。按上述步骤培养动物实验所需用量的新鲜菌液,将培养好的菌液经

过富集或稀释制成1.1×109CFU/mL,用于攻菌试验。

1.2.7 剖检病变观察与评分 按照实验室剖检程序,无菌操作采集试验鸡的十二指肠、空肠、盲肠,用已

灭菌消毒后的剪刀、镊子将鸡的十二指肠、空肠和盲肠剪开,观察鸡肠道剖检病变,评分并拍照,病变评

分[8](表2)。

表2 病变评分

Table2 Lesionscore

病变程度 评分

无明显病变 0

肠黏膜充血 1

小灶性坏死或溃疡(1~5个病灶) 2

局灶性坏死或溃疡(6~15个病灶) 3

局灶性坏死或溃疡(16个或更多病灶) 4

注:每只鸡肠道各评分区最大值为肠道总评分。

1.2.8 统计学分析 使用IBMSPSSStatistics23软件,对各个组处理的评分数据进行双因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 疑似产气荚膜梭菌的生长状态及细菌形态学观察

疑似产气荚膜梭菌在TSC培养基上生长为光滑的黑色单菌落,疑似产气荚膜梭菌液体增菌实验中产

生大量气泡(图1)。分离菌株染色镜检呈革兰氏阳性菌,呈现短粗杆状、两端钝圆(图2)。

生化鉴定结果显示疑似产生荚膜梭菌可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖,可液化明胶,硝酸盐还原试

验结果为阳性,不发酵甘露醇,硫化氢试验结果为阴性,与产气荚膜梭菌生化特性相同(表3)。

34 安徽科技学院学报 2024年

图1 疑似产气荚膜梭菌的分离培养

Fig.1 IsolatedculturesuspectedtobeC.perfringens

注:a图为疑似产气荚膜梭菌在TSC培养基上的菌落形态;

b图为FTG培养基上细菌生长状态。

图2 菌株革兰氏染色

Fig.2 StrainGramstain

表3 分离菌株生化鉴定结果

Table3 Biochemicalidentificationresultsoftheisolate

生化鉴定管 结果

葡萄糖 +

蔗糖 +

麦芽糖 +

乳糖 +

明胶 +

硝酸盐还原 +

甘露醇 -

硫化氢还原 -

注:“+”为阳性;“-”为阴性。

2.2 荧光定量PCR鉴定结果

参考陈祥杰等的分型鉴定方法,通过实时荧光定量PCR技术,对plc、cpb、etx、tpeL、cpe和netB 毒

素基因进行鉴定。根据G型产气荚膜梭菌阳性质粒各毒素基因对应的 Tm 值确定产气荚膜梭菌毒素基

因Tm值,进而确定分离菌株类型,结果显示plc毒素基因 Tm 值为77.5℃时峰值与阳性质粒相同,为

CPA阳性(图3);netB 毒素基因Tm值为77.5℃时峰值与阳性质粒相同,为netB 阳性(图4);未检测到

cpb、etx、cpb和tpeL 毒素基因,均为阴性。阳性质粒的netB 和plc毒素基因 Tm 值鉴定结果为77.5℃

(图5~6)。在安徽省某规模化鸡场分离的病鸡肠道样品中,plc和netB 毒素基因Tm值鉴定为77.5℃,

峰值与阳性质粒相同,鉴定为一株G型产气荚膜梭菌。

图3 plc毒素基因荧光定量PCR鉴定结果

Fig.3 Identificationresultsofplctoxingenebyreal-timePCR

注:左图为分离产气荚膜梭菌的plc毒素基因扩增曲线;右图为分离产气荚膜梭菌的plc毒素基因溶解曲线。

图4 netB 毒素基因荧光定量PCR鉴定结果

Fig.4 IdentificationofnetBtoxingenebyreal-timePCR

注:左图为分离产气荚膜梭菌的netB 毒素基因扩增曲线;右图为分离产气荚膜梭菌的netB 毒素基因溶解曲线。

第38卷第2期 孙 栋,等:G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用 35

图5 阳性质粒的netB 毒素基因荧光定量PCR鉴定结果

Fig.5 Identificationofthepositiveplasmid'snetBtoxingenebyreal-timePCR

注:左图为阳性质粒的netB 毒素基因扩增曲线;右图为阳性质粒的netB 毒素基因溶解曲线。

图6 阳性质粒的plc毒素基因荧光定量PCR鉴定结果

Fig.6 Identificationofthepositiveplasmid'splctoxingenebyreal-timePCR

注:左图为阳性质粒的plc毒素基因扩增曲线;右图为阳性质粒的plc毒素基因溶解曲线。

2.3 剖检病变结果

雏鸡在灌喂产气荚膜梭菌后出现羽毛杂乱、活动减少、沉郁萎靡、食欲减退和腹泻等症状。剖检时发

现,相较于对照组,病变鸡肠黏膜明显出现充血肿胀以及肠黏膜坏死病变,鸡肠壁变薄且充满气体,G1 组

各试验鸡的坏死性肠炎病变平均评分为1.5±0.85分,十二指肠病变如图7所示。

图7 十二指肠病变

Fig.7 Duodenallesions

注:A为G1;B为G2;C为G3;D为G4;E为G5;F为G6;G为G7;H为G8。

表4显示,G1 组10只鸡中有8只(80%)出现了坏死性肠炎病变;G3 组10只鸡中有9只鸡(90%)出

现了坏死性肠炎病变;G2 组10只鸡中有2只鸡(20%)肠道出现病变;G4 组未出现坏死性肠炎病变。与

G4 组相比,单独使用CPG-AH5株可以使鸡出现坏死性肠炎病变,攻球虫虽然可以使肠道产生一定的病

变,但未见明显的肠炎病变。此外,利用球虫+G型产气荚膜梭菌的组合可以使肠炎病变率增加。G5 组

10只鸡中有8只80%出现了严重的坏死性肠炎病变;G7 组10只鸡中有10只鸡(100%)出现了严重的坏

死性肠炎病变;G6 组10只鸡中有2只鸡(20%)出现了坏死性肠炎病变;G8 组未出现坏死性肠炎。通过

鱼粉+G型产气荚膜梭菌的组合诱导肠炎,与单独使用 G型产气荚膜梭菌差异不大。但通过添加鱼粉、

球虫、G型产气荚膜梭菌多因素感染可以使鸡坏死性肠炎病变率增加,病变加重。

2.4 肠道病变记分结果评价

使用IBMSPSSStatistics23软件,对20日龄各组病变评分进行双因素方差分析(表4和图8)。结果

显示,在G1~G4 组中,G3 组鸡的坏死性肠炎病变平均分最高,显著高于 G1、G2 和 G4 组(P<0.05、

P <0.001和P<0.001);在G5~G8 组中,G7 组鸡的坏死性肠炎病变平均分最高,均显著高于 G5、G6 和

G8 组(P<0.001)。G7 组较G3 组可显著提高病变程度(0.001<P<0.01)。

36 安徽科技学院学报 2024年

表4 肠道病变评分结果统计表

Table4 Intestinallesionscoringresultsstatisticaltable

组别 内容 数量

评分

0 1 2 3 4

病变评分

平均值±标准差

病变率/%

G1 CPG-AH5 10 2 1 7 0 0 1.5±0.85* 80

G2 E 10 8 0 2 0 0 0.4±0.84*** 20

G3 E+CPG-AH5 10 1 0 4 4 1 2.4±1.08 90

G4 Control 10 10 0 0 0 0 0.0±0.0*** 0

G5 F+CPG-AH5 10 2 0 4 4 0 2.0±1.15*** 80

G6 F+E 10 8 0 2 0 0 0.4±0.84*** 20

G7 F+E+CPG-AH5 10 0 0 0 4 6 3.6±0.52 100

G8 F 10 10 0 0 0 0 0±0*** 0

注:F为鱼粉;E为Eimeirianecatrix;CPG-AH5为G型产气荚膜梭菌;G1~G4 组全程饲喂以小麦为基础的饲料(粗蛋白含量不低于

18%);1~7日龄饲喂以小麦为基础的饲料(粗蛋白含量不低于18%),8日至试验结束饲喂以小麦为基础的高蛋白饲料(小麦为基础的粗蛋

白的含量为18%与68%蛋白的含量的鱼粉,按照1∶1混合);G5~G8 组;G7 组为对照。* 表示差异显著(P<0.05);*** 表示差异极显著

(P<0.001)。

图8 十二指肠病变评分

Fig.8 Duodenallesionsscore

注:Normal为低蛋白饲喂组;protein(H)为高蛋白饲喂组。低蛋白全程饲喂以小麦为基础的饲料(粗蛋白含量不低于18%);高蛋白

1~7日龄饲喂以小麦为基础的饲料(粗蛋白含量不低于18%);8日龄至试验结束饲喂以小麦为基础的高蛋白饲料(以小麦为基础的粗

蛋白含量18%的饲料与含68%蛋白的鱼粉按1∶1的比例混合)。

病变评分分析结果表明,在饲喂鱼粉时,毒害艾美耳球虫与 G型产气荚膜梭菌联合感染引起的坏死

性肠炎试验组较其他试验组差异显著。

3 讨论与结论

坏死性肠炎是鸡的一种重要传染病,会引起鸡炎症性肠道感染,主要是由 A型、C型和 G型产气荚膜

梭菌引起,有极高的死亡率,对我国养鸡行业造成巨大的威胁,对家禽养殖造成巨大经济损失[12]。坏死性

肠炎主要表现为急性或慢性肠毒血症,一年四季均有发生,夏季最盛,呈地方性流行,雏鸡患病率较高。鸡

感染后主要症状有抑郁、羽毛皱褶、饲料消耗减少、腹泻、血便和小肠粘膜出血坏死[13]。因此,通过快速,

有效分离到产气荚膜梭菌,确定其毒素类型,便于进行有效治疗,减少经济损失[14]。

G型产气荚膜梭菌作为坏死性肠炎的主要致病菌,可用于建立坏死性肠炎模型。Cooper等[14]利用A

型产气荚膜梭菌建立模型,评估了模型病例中产气荚膜梭菌的毒力。Keyburn等[15]利用含 NetB毒素的

野生型亲本菌进行动物实验发现能引起典型的坏死性肠炎。To等[16]利用含 NetB毒素基因的产气荚膜

梭菌日本分离株成功建立坏死性肠炎模型,首次在实验模型中证明 NetB阳性的产气荚膜梭菌日本分离

株能够诱发坏死性肠炎的临床症状和病变。本研究证明,使用G型产气荚膜梭菌可引起鸡的典型坏死性

肠炎病例。

球虫和鱼粉是引发坏死性肠炎常见的诱导因素。球虫能造成肠道损伤,破坏肠上皮细胞,引起血浆蛋

白泄漏,黏蛋白分泌,为产气提供丰富的营养环境,从而诱导鸡发生坏死性肠炎[17-18]。龙航宇等[19]使用

4种艾美耳球虫的单一虫种与产气荚膜梭菌共感染来引发坏死性肠炎,结果显示除堆型艾美耳球虫外,巨

型、毒害以及柔嫩艾美耳球虫和产气荚膜梭菌的共感染均促进坏死性肠炎的发生。高蛋白饲料的食用可

以改变肠道营养环境以及肠道微生物菌群,促进产气荚膜梭菌的增殖,从而诱导鸡产生鸡坏死性肠炎[20]。

本次研究中使用毒害艾美耳球虫、鱼粉等诱导因素来引发肠炎病变。结果表明相较于单一诱导因素(球虫

第38卷第2期 孙 栋,等:G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用 37

或鱼粉),多个诱导因素(球虫联合鱼粉)可显著提高肠道病变,且病变评分最高,所有实验组坏死性肠炎病

变均以十二指肠多发。总体来说,鱼粉、毒素艾美耳球虫和 G型产气荚膜梭菌共同联合感染可显著提高

坏死性肠炎病变,能够成功的建立坏死性肠炎动物模型,为后续的坏死性肠炎药物的研发以及致病机理的

研究提供了参考。

本研究成功从鸡肠道样品中分离获得一株G型产气荚膜梭菌(CPG-AH5株)。在无诱导因素的影响

下,CPG-AH5株感染可以造成严重的肠道损伤(平均病变评分1.5±0.85分),为坏死性肠炎的发病机制

提供了理想的动物模型。在该模型中,相较于单一诱导因素(鱼粉或球虫),多个诱导因素(鱼粉和球虫)能够

有效促进CPG-AH5株的感染,与无诱导因素条件和单一诱导因素条件相比肠道病变显著提高(P<0.001)。

该动物模型将为后续产气荚膜梭菌性肠炎病疫苗和药物的研制和筛选提供稳定的模型基础,也为产气荚

膜梭菌的致病机制研究提供技术支撑。

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(责任编辑:顾文亮)

38 安徽科技学院学报 2024年

安徽科技学院学报,2024,38(2):39-45

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-08-12

基金项目:国家重点研发计划(2022YFD2301402-3,2018YFD0300901-2);安徽省科技攻关重大专项(201903a06020001);农业农村部重

点实验室开放课题(BOFA202011)。

作者简介:江鑫鑫(1999-),女,安徽安庆人,硕士研究生,主要从事资源利用与植物保护研究,E-mail:2760179804@qq.com。

通信作者:李孝良,教授,E-mail:lixl@ahstu.edu.cn。

脲甲醛与尿素配比对盆栽玉米养分吸收

及氮肥利用效率的影响

江鑫鑫1, 吴中原1, 方俊超1, 李孝良1,2*

(1.安徽科技学院 资源与环境学院,安徽 凤阳 233100;

2.安徽省农业废弃物肥料化利用与耕地质量提升工程研究中心,安徽 凤阳 233100)

摘 要:目的:基于不同脲甲醛与尿素配比,建立玉米脲甲醛缓释肥施用技术,提高氮肥利用率。方法:通

过盆栽试验,以CK、PK为对照,设置 U(100%尿素)、UF20(80%尿素+20%脲甲醛)、UF40(60%尿素+

40%脲甲醛)、UF60(40%尿素+60%脲甲醛)、UF80(20%尿素+80%脲甲醛)、UF(100%脲甲醛)等6个

尿素与脲甲醛配施比例。结果:玉米脲甲醛缓释肥可显著提高玉米籽粒产量、养分吸收量和氮肥利用率。

盆栽玉米产量以UF20处理最高,较U增产18.75g/株;玉米养分吸收以UF20较高,氮吸收量为1.24g/株,

磷吸收量为0.31g/株,钾吸收量为0.98g/株,分别较U提高17.94%、1.69%、12.02%;氮肥利用率以UF20

较高,肥料总氮利用率为38.49%,肥料总氮农学利用率为26.36g/g,肥料总氮偏生产力为35.49g/g,氮肥

表观利用率为57.11%,氮素生理利用率为46.17g/g,较U处理分别显著提高了18.02%、16.75g/g、16.76g/g、

18.00%、21.61g/g。结论:综合考虑玉米养分吸收和养分利用效率,80%尿素+20%脲甲醛(UF20)处理

可显著提高玉米养分吸收量和肥料利用率,适宜在实际生产中应用。

关键词:脲甲醛;尿素;玉米养分吸收;氮肥利用率

中图分类号:S852.3 文献标志码:A 文章编号:1673-8772(2024)02-0039-07

开放科学(资源服务)标识码(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0206

Effectsofureaformaldehydeandurearatioonnutrient

uptakeandnitrogenuseefficiencyofpottedmaize

JIANGXinxin1, WUZhongyuan1, FANGJunchao1, LIXiaoliang

1,2*

(1.CollegeofResourceandEnvironment,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.AnhuiAgriculturalWasteFertilizerUtilizationandCultivatedLandQualityImprovement

EngineeringResearchCenter,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Basedondifferentratiosofureaformaldehydeandurea,theapplicationtechnology

ofureaformaldehydeslow-releasefertilizerformaizewasestablishedtoimprovetheutilizationrateof

nitrogenfertilizer.Methods:Throughpotexperiment,withCK,PKascontrol,sixdifferentratioswere

set,andtheexperimentswererepatedthreetimes,includingU (100%urea),UF20(80%urea+20%

urea-formaldehyde),UF40 (60% urea+40% urea-formaldehyde),UF60 (40% urea+60% ureaformaldehyde),UF80(20% urea+80% urea-formaldehyde,UF (100% urea-formaldehyde).Results:

Urea-formaldehydeslow-releasefertilizercansignificantlyincreasemaizeyield,nutrientabsorptionand

nitrogenuseefficiency.TheyieldofpottedmaizewasthehighestinUF20treatment,whichwas18.75g/plant

higherthanthatinUtreatment.ThenutrientabsorptionofUF20washigher,thenitrogenabsorption

was1.24g/plant,thephosphorusabsorptionwas0.31g/plant,andthepotassiumabsorptionwas

0.98g/plant,whichwas17.94%,1.69%and12.02%higherthanthatofUrespectively.Thenitrogen

useefficiencyofUF20washigher,thetotalnitrogenutilizationrateoffertilizerwas38.48%,thetotal

nitrogenagronomicutilizationrateoffertilizerwas26.36%,thetotalnitrogenpartialproductivityof

fertilizerwas35.49g/g,theapparentutilizationrateofnitrogenfertilizerwas57.11%,andthe

physiologicalutilizationrateofnitrogenwas46.17g/g,whichwassignificantlyhigherthanthatofU

treatmentby18.02%,16.75g/g,16.76g/g,18.00%,21.61g/g,respectively.Conclusion:

Consideringthenutrientabsorptionandnutrientuseefficiencyof maize,80% urea+20% urea

formaldehyde(UF20)treatmentcouldsignificantlyimprovethenutrientabsorptionandfertilizer

utilizationrateofmaize,whichwassuitableinactualproduction.

Keywords:Ureaformaldehyde;Urea;Maizenutrientabsorption;Nitrogenuseefficiency

作物高产高效是现代农业的必然要求[1],通过氮肥缓释技术实现氮肥的高效利用是人们关注的热

点[2]。脲甲醛在水解与微生物侵袭的双重作用下缓慢释放养分,达到肥料持续供应的目的,是提高氮肥利

用效率的有效途径[3]。目前,已有的研究表明,脲甲醛缓释肥能够有效减少氮肥的损失和浪费,提高氮肥

利用效率[4-6],持续提供养分的供应,满足作物生育期内的氮素需求,进而提高作物产量和品质,同时减少

施肥量和次数,节约劳动力[7-9],并能够被土壤微生物完全分解,降低对土壤和水体的污染风险,对环境友

好[10-12]。但也发现脲甲醛缓释肥制备工艺较为复杂[13],并且脲甲醛缓释存在肥效不稳定、施肥量控制不

当等问题,在不同的土壤和气候条件下的肥效表现还存在差异,需要进一步优化配方和生产工艺,以适应

不同的农业生产环境[14]。因此研究脲甲醛和尿素配比对玉米养分吸收及氮肥利用效率的影响具有重要

意义[15-16]。本研究旨在探究不同脲甲醛和尿素配比对盆栽玉米的养分吸收和氮肥利用效率的影响。通

过设置不同配比的脲甲醛和尿素处理组,结合玉米植株养分含量和氮肥利用效率等指标进行综合评价,以

期为优化肥料配比提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概括

盆栽试验于2022年5—8月在安徽科技学院种植科技园进行。该区域属北亚热带湿润季风气候,年

均气温为14.9℃,年降雨量为904.4mm。盆栽试验土壤为淮河冲积物发育的石灰性潮壤土,采自凤阳县顾

台村,pH8.46,有机质14.59g/kg,全氮0.87g/kg,全磷2.92g/kg,全钾15.52g/kg,硝态氮2.61mg/kg,速

效磷8.57mg/kg,速效钾96.55mg/kg,田间持水量35%。

1.2 供试材料

1.2.1 供试作物 郑单958玉米。

1.2.2 供试肥料 尿素(N,46%)、过磷酸钙(P2O5,12%)、氯化钾(K2O,61%)由安徽科技学院土壤与环

境中心提供,脲甲醛(N,32.2%)由实验室制备。脲甲醛(UF)的制备方法[15]:甲醛和尿素按摩尔比1∶1.25

置于500mL烧杯中,搅拌至尿素全部溶解后,添加5% KOH 调节pH 至9.0,50℃水浴反应2h,得到羟

甲基脲溶液;边搅拌边加入1% HCl调节pH 至5.0,50℃水浴反应2h,形成白色膏状物,后挤压造粒,

40 安徽科技学院学报 2024年

60~70℃下烘干,制备得 UF颗粒。按GB/T34763-2017方法检测,UF中冷水不溶性氮(CWIN)含量

为82.37%,热水不溶性氮(HWIN)含量为39.14%,活性指数(AI)为52.48%

[17-18]。

1.3 试验方案设计

玉米盆栽试验采用单因素随机区组设计,以 CK(不施肥)、PK 为对照,设置 U(100%尿素)、UF20

(80%尿素+20%脲甲醛)、UF40(60%尿素+40%脲甲醛)、UF60(40%尿素+60%脲甲醛)、UF80(20%

尿素+80%脲甲醛)、UF(100%脲甲醛)等6个尿素与脲甲醛配施比例(表1),共8个处理,3次重复。

每盆装11kg干土,氮、磷、钾肥全部作为基肥,与土壤混匀后一次性施入。水分管理按质量法保持田

间持水量为80%。5月16日播种,于苗期、拔节期、大喇叭口期、成熟期采集植株样品,杀青,烘干,粉碎过

直径0.5mm筛,成熟期样品同时考种计产。

表1 试验设计方案

Table1 Testdesignscheme

处理

氮磷钾用量/(g/kg)

U-N UF-N P2O5 K2O

肥料用量/(g/盆)

尿素 脲甲醛 过磷酸钙 氯化钾

CK 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

PK 0.00 0.00 0.10 0.20 0.00 0.00 9.17 3.60

U 0.20 0.00 0.10 0.20 4.79 0.00 9.17 3.60

UF-20 0.16 0.04 0.10 0.20 3.83 1.37 9.17 3.60

UF-40 0.12 0.08 0.10 0.20 2.87 2.74 9.17 3.60

UF-60 0.08 0.12 0.10 0.20 1.92 4.10 9.17 3.60

UF-80 0.04 0.16 0.10 0.20 0.96 5.47 9.17 3.60

UF 0.00 0.20 0.10 0.20 0.00 6.84 9.17 3.60

1.4 分析测定方法

植株全氮的测定采用 H2SO4-H2O2 消煮蒸馏滴定法,全磷测定采用 H2SO4-H2O2 消煮钒钼黄比色

法,全钾测定采用 H2SO4-H2O2 消煮火焰光度法[19]。

单株玉米植株氮(磷、钾)积累量(g)=玉米植株干质量×植株氮(磷、钾)含量[20];

单株玉米生育期氮(磷、钾)吸收量(g)=该生育期玉米氮(磷、钾)积累量-前一生育期玉米氮(磷、

钾)积累量;

肥料总氮利用率=(施氮处理植株氮积累量-CK植株氮积累量)/施氮总量×100%;

肥料总氮农学利用率=(施氮处理籽粒产量-CK籽粒产量)/施氮总量[21];

肥料总氮偏生产力=籽粒产量/施氮总量;

氮肥表观利用率=(施氮处理地上部吸收氮量-CK处理地上部吸收氮量)/施氮量×100%;

氮素生理利用率=(施氮区产量-CK处理产量)/(施氮区吸收氮量-CK处理吸收氮量)。

1.5 数据分析与统计方法

采用 MicrosoftExcel2010和SPSS25进行数据整理和统计分析,采用 Origin2021制图。

2 结果与分析

2.1 脲甲醛与尿素不同配比对玉米产量的影响

脲甲醛缓释肥可显著提高玉米产量(图1)。供试各脲甲醛与尿素配比中,以 UF20产量最高,达

39.04克/株,较CK增产29.00克/株,较 U增产18.43克/株;其次为 UF60,玉米产量为37.45克/株,较

CK增产27.41克/株,较 U增产16.84克/株。脲甲醛缓释肥可通过养分缓慢释放,改善玉米生长后期养

分供应,提高玉米产量。

2.2 脲甲醛与尿素不同配比对玉米氮、磷、钾含量的影响

施肥可显著提高玉米各生育期氮素含量(图2A)。苗期以 U、UF20、UF40相对较高,分别为35.39、

35.56、35.38mg/g;拔节期以 UF20相对较高,达27.44mg/g;大喇叭口期以 UF20相对较高,达22.62mg/g;

成熟期以 UF60相对较高,达17.24mg/g。说明玉米脲甲醛缓释肥通过氮肥的缓慢释放,实现调控玉米

第38卷第2期 江鑫鑫,等:脲甲醛与尿素配比对盆栽玉米养分吸收及氮肥利用效率的影响 41

生育后期氮素营养的效果。

图1 不同脲甲醛与尿素配比对玉米产量的影响

Fig.1 Effectsofdifferentratiosofureaformaldehydeandureaonmaizeyield

图2 不同脲甲醛与尿素配比对玉米地上部氮(A)、磷(B)、钾(C)含量的影响

Fig.2 Effectsofdifferentratiosofureaformaldehydeandureaonthecontentsofnitrogen(A),

phosphorus(B)andpotassium (C)intheabovegroundpartofmaize

注:不同小字母表示在0.05水平上差异显著。下同。

42 安徽科技学院学报 2024年

施肥可显著提高玉米各生育期磷素含量(图2B)。玉米苗期、拔节期、大喇叭口期、成熟期磷含量均以

U处理相对较高,分别为7.53、6.20、5.06、3.90mg/g。说明脲甲醛缓释肥对磷的吸收无促进效果。

施肥可显著提高玉米各生育期钾素含量(图2C)。玉米苗期以PK处理相对较高,达50.97mg/g;拔

节期以 UF40、UF60、UF80相对较高,分别为40.64、40.62、40.34mg/g;大喇叭口期以 UF20相对较高,

为15.78mg/g;成熟期以 UF80、UF相对较高,分别为9.79、9.67mg/g。说明脲甲醛缓释肥对钾的吸收

有促进作用。

2.3 脲甲醛与尿素不同配比对玉米氮、磷、钾积累量的影响

施肥可显著提高玉米氮积累量(图3A)。苗期以 U、UF20、UF40相对较高,分别为0.017、0.016、

0.016g/株;拔节期以 UF80相对较高,为0.22g/株;大喇叭口期、成熟期都以 UF20相对较高,分别为

0.77、1.24g/株。脲甲醛缓释肥对玉米氮积累量有促进作用。

施肥可显著提高玉米磷积累量(图3B)。苗期以 U 相对较高,为0.004g/株;拔节期、大喇叭口期以

UF20相对较高,为0.05、0.16g/株;成熟期以UF20、UF40相对较高,分别为0.31、0.32g/株。成熟期脲

甲醛缓释肥对玉米磷积累量有促进作用,但与尿素处理差异不显著。

施肥可显著提高玉米钾积累量(图3C)。苗期以PK相对较高,为0.02g/株;拔节期以 UF80相对较

高,为0.39g/株;大喇叭口期以 UF20相对较高,为0.54g/株;成熟期以 UF20、UF80相对较高,分别为

0.31g/株、0.31g/株。脲甲醛缓释肥对玉米钾积累量有促进作用。

图3 不同脲甲醛与尿素配比对玉米地上部氮(A)、磷(B)、钾(C)积累量的影响

Fig.3 Effectsofdifferentratiosofureaformaldehydetoureaontheaccumulationofnitrogen(A),

phosphorus(B)andpotassium (C)intheshootofmaize

第38卷第2期 江鑫鑫,等:脲甲醛与尿素配比对盆栽玉米养分吸收及氮肥利用效率的影响 43

2.4 脲甲醛与尿素不同配比对玉米氮肥利用效率的影响

脲甲醛与尿素配施显著提高了玉米氮素养分利用率(表2)。供试处理中,盆栽玉米肥料总氮利用率

以 UF20、UF80相对较高,分别为38.49%、36.82%,较U处理提高了18.02%、16.35%,随脲甲醛替代尿

素比例提高,玉米肥料总氮利用率总体呈先增加后降低趋势;肥料总氮农学利用率以 UF20相对较高,达

26.36g/g,较 U提高了16.75g/g;肥料总氮偏生产力以 UF20相对较高,较 U处理增加了16.76g/g;肥

料表观利用率以 UF20、UF80相对较高,较 U增加了18.00%、16.35%;氮素生理利用率以 UF20、UF60、

UF80相对较高,分别为46.17、45.86、44.16g/g,较U分别提高了21.61、21.30、19.60g/g。采用脲甲醛

与尿素配施的玉米缓控释肥技术,可促进玉米对氮素的吸收与利用,提高氮肥利用率,减少氮素损失[22]。

表2 脲甲醛与尿素不同配比对玉米氮利用效率的影响

Table2 EffectsofdifferentratiosofureaformaldehydeandureaonNutilizationefficiencyofmaize

处理

氮肥用量/

(g/株)

产量/

(g/株)

N吸收总

量/(g/株)

肥料总氮

利用率/%

肥料总氮农学

利用率/(g/g)

肥料总氮偏

生产力/(g/g)

氮肥表观

利用率/%

氮素生理

利用率/(g/g)

CK 0.00 10.04±0.26g 0.61±0.01f - - - - -

PK 0.00 12.17±0.31f 0.81±0.01e - - - - -

U 1.10 20.20±0.92e 1.05±0.01d 20.47±0.34d 9.61±0.51e 18.73±0.51e 39.11±0.34d 24.56±1.17c

UF20 1.10 38.95±0.62a 1.24±0.01a 38.49±1.53a 26.36±0.66a 35.49±0.66a 57.11±1.53a 46.17±1.40a

UF40 1.10 34.02±0.30c 1.21±0.01bc 35.82±1.26bc 21.85±0.30c 30.98±0.30c 54.48±1.26bc 40.13±1.48b

UF60 1.10 37.22±0.94b 1.21±0.02bc 35.70±2.23bc 24.92±0.92b 34.04±0.92b 54.34±2.23bc 45.86±1.05a

UF80 1.10 36.92±0.24b 1.22±0.01ab 36.82±0.31ab 24.49±0.24b 33.61±0.24b 55.46±0.31ab 44.16±0.67a

UF 1.10 32.61±0.47d 1.19±0.041c 33.86±1.16c 20.72±0.18d 29.85±0.24d 52.50±1.16c 39.47±0.90b

3 结论与讨论

本研究表明,脲甲醛与尿素配施可显著提高玉米产量,其中 UF20、UF60、UF80的玉米产量相对较

高,分别较U增产18.75、17.02、16.72g/株。倪露等[4]、李前等[23]研究也表明,不同种类的缓释氮肥和不

同组分的脲甲醛缓释肥可以满足玉米整个生育期的养分需求,从而在不同程度上提高玉米产量。徐峰

等[24]研究发现,脲甲醛肥料可显著提高玉米产量、穗粒数、千粒重。

尿素作为基肥和追肥可以为作物快速提供丰富的氮素,但其供肥效果受到土壤、气候和其他因素的影

响,在中后期,容易导致氮素供应不足,进而影响植株对氮素的积累[25]。脲甲醛缓释肥可以减缓氮素释

放、转化和分解速度,延长氮肥肥效,更有利于作物对氮肥的吸收利用[26]。施用脲甲醛可以改善土壤团聚

体结构、增加其稳定性和提高腐殖酸含量,进而促进玉米对氮素的吸收和利用[22,27],提高氮肥利用率。本

研究还发现,玉米脲甲醛缓释肥可以改善玉米生育后期氮、钾的含量和养分吸收量,提高氮、钾养分积累。

供试处理中 UF20处理玉米成熟期地上部植株 N、P、K 养分积累量较 U 处理提高了17.94%、1.69%、

12.02%;肥料总氮利用率、肥料总氮农学利用率、肥料总氮偏生产力、氮肥表观利用率、氮素生理利用率分

别提高了18.02%、16.75g/g、16.76g/g、18.00%、21.61g/g。

盆栽试验表明,通过脲甲醛与尿素配施的玉米缓释肥技术可以降低氮肥施用量,促进玉米养分的吸

收,改善玉米全生育期氮素营养,提高氮肥利用率。供试各处理中,UF20可显著提高玉米产量,改善玉米

氮、钾营养,提高玉米氮素利用率,适宜在玉米生产中应用。

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(责任编辑:顾文亮)

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