热带生物学报2023年14卷05期

发布时间:2023-10-16 | 杂志分类:生物医学
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热带生物学报2023年14卷05期

目  次· 全健康 ·主持人 ………………………………………………… 韩谦、刘萌萌犬肝簇虫病在海南岛的流行病学调查及其遗传关系的研究 ………………………………… 王楷冬,王金花,祖海月,林 洋,王世明(467)抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达及发酵液抑菌活性鉴定…………………… 李飞航,武浩恒,李 宏,李娟娟,马 香,唐燕琼,刘 柱(474)· 生态多样性与生态文化 ·主持人 ………………………………………………………… 任明迅基于残差卷积神经网络模型的勺嘴鹬动作识别 ……………………………………… 杨雪珂,蒙金超,冯悦恒,林婷婷,王兆君,刘 辉(481)海南东寨港红海榄种群结构与数量动态变化特征 …………………………………………… 吕晓波,钟才荣,张孟文,方赞山,程 成,陈 旭,李东海,李剑碧(490)· 植物保护 ·主持人 ………………………………………………………… 缪卫国木薯细菌性萎蔫病菌 2 个候选抗铜基因簇的克隆和分析 ………………… 徐春华,李超萍,时 涛,王国芬,蔡吉苗,李博勋,黄贵修(499)启动子 WY172 和 WY195 在暹罗炭疽菌中的活性研究…... [收起]
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热带生物学报2023年14卷05期
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海南大学学报编辑部
文本内容
第2页

目  次

· 全健康 ·

主持人 ………………………………………………… 韩谦、刘萌萌

犬肝簇虫病在海南岛的流行病学调查及其遗传关系的研究 …………

……………………… 王楷冬,王金花,祖海月,林 洋,王世明(467)

抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达及发酵液抑菌活性鉴定………………

…… 李飞航,武浩恒,李 宏,李娟娟,马 香,唐燕琼,刘 柱(474)

· 生态多样性与生态文化 ·

主持人 ………………………………………………………… 任明迅

基于残差卷积神经网络模型的勺嘴鹬动作识别 ………………………

……………… 杨雪珂,蒙金超,冯悦恒,林婷婷,王兆君,刘 辉(481)

海南东寨港红海榄种群结构与数量动态变化特征 ……………………

……………………… 吕晓波,钟才荣,张孟文,方赞山,程 成,

陈 旭,李东海,李剑碧(490)

· 植物保护 ·

主持人 ………………………………………………………… 缪卫国

木薯细菌性萎蔫病菌 2 个候选抗铜基因簇的克隆和分析 ……………

…… 徐春华,李超萍,时 涛,王国芬,蔡吉苗,李博勋,黄贵修(499)

启动子 WY172 和 WY195 在暹罗炭疽菌中的活性研究………………

…… 董林朋,殷金瑶,赵文渊,林春花,刘文波,缪卫国,李 潇(506)

手性茚虫威对家蚕的急性毒性效应 ……………………………………

……………… 赵文宇,张 洁,郑世祥,汪心雨,苏小婷,范咏梅(514)

· 园艺 ·

主持人 ………………………………………………………… 朱国鹏

葡萄欧亚种与杂交种的营养品质差异研究 ……………………………

……………………… 陈琪玉,李宇飞,徐 航,刘贤青,罗 杰(521)

海南嘉宝果种质资源多样性分析 … 左世友,朱美惠,詹震霖,王华锋(530)

· 热带海洋生物 ·

主持人 ………………………………………………………… 郭志强

不同孔径网格板对小叶鹿角珊瑚的移植效果评估 ……………………

……………………………… 刘相波,朱文涛,夏景全,朱 铭,

任瑜潇,陈柔雯,王爱民,李秀保(536)

南海冷泉区深海沉积物来源放线菌的分离培养及其抑菌活性 ………

………………………………… 陈以秋,韩梅桂,韩 壮,唐 敏(545)

· 研究报告 ·

耐热真菌 HS1-1 的生理特性和抗菌活性………………………………

……………… 黄晓欣,谈嘉莉,杨永星,顾哲铭,李雪珽,雷晓凌(552)

基于 WRF 模式的南海海温梯度对强对流作用的数值试验 …………

………………………………………… 杨 薇,李 勋,石 娟(560)

海南岛水稻需水量与缺水量的时空变化特征 …………………………

……………… 邹海平,张京红,李伟光,陈小敏,白 蕤,吕 润(569)

木薯渣和甘蔗渣基生物炭对砖红壤的改良效果 …… 李昉泽,詹 剑(577)

热带生物学报

JOURNAL OF TROPICAL

BIOLOGY

5

2023

第 14 卷

(2010 年创刊,双月刊)

主办单位: 海南大学

主  编:罗 杰

执行主编:吴少英

编  辑:钟云芳

叶 静

潘学峰

英文编辑:周建南

封面设计:蒋源木

期刊基本参数:CN 46 − 1078/S * 2010 * b * A4 * 118 * zh * P * ¥15.00 * 1000 * 15 * 2023−09

第3页

·One Health·

Convener ………………………………………………………………………… HAN Qian, LIU Mengmeng

Epidemiological investigation and genetic relationship of canine hepatozoonosis in Hainan Island …………

……………………………… WANG Kaidong, WANG Jinhua, ZU Haiyue, LIN Yang, WANG Shiming(467)

Eukaryotic expression of Cathelicidin-1 and validation of its antimicrobial activity in the fermentation

broth ……… LI Feihang, WU Haoheng, LI Hong, LI Juanjuan, MA Xiang, TANG Yanqiong, LIU Zhu(474)

·Biodiversity and Ecological Culture·

Convener ………………………………………………………………………………………… REN Mingxun

Action recognition of spoon-billed sandpipers (Eurynorhynchus pygmeus) based on residual convolutional neural network model………………………………………………………………………………

…………… YANG Xueke, MENG Jinchao, FENG Yueheng, LIN Tingting, WANG Zhaojun, LIU Hui(481)

Population structure and dynamics of Rhizophora stylosa in Dongzhaigang National Mangrove Reserve,

Hainan ………………………… LYU Xiaobo, ZHONG Cairong, ZHANG Mengwen, FANG Zanshan,

CHENG Cheng, CHEN Xu, LI Donghai, LI Jianbi(490)

·Plant Protection·

Convener ………………………………………………………………………………………… MIAO Weiguo

Cloning and analysis of copTAB and XmeRSA gene clusters from Xanthomonas axonopodis pv. manihotis

……… XU Chunhua, LI Chaoping, SHI Tao, WANG Guofen, CAI Jimiao, LI Boxun, HUANG Guixiu(499)

Identification of WY172 and WY195 promoter activity in Colletotrichum siamense…………………………

………………………………………… DONG Linpeng, YIN Jinyao, ZHAO Wenyuan, LIN Chunhua,

LIU Wenbo, MIAO Weiguo, LI Xiao(506)

The acute toxic effects of chiral indoxacarb onBombyx mori……………………………………………………

…………… ZHAO Wenyu, ZHANG Jie, ZHENG Shixiang, WANG Xinyu, SU Xiaoting, FAN Yongmei(514)

·Horticulture·

Convener ………………………………………………………………………………………… ZHU Guopeng

Analysis of difference in nutritional quality between grapes of the Eurasian group and hybrids ……………

……………………………………………… CHEN Qiyu, LI Yufei, XU Hang, LIU Xianqing, LUO Jie(521)

Germplasm diversity of jaboticaba (Plinia cauliflora) in Hainan ………………………………………………

…………………………………………… ZUO Shiyou, ZHU Meihui, ZHAN Zhenlin, WANG Huafeng(530)

·Tropical Marine Biology·

Convener ………………………………………………………………………………………… Guo Zhiqiang

Evaluation of the transplantation effect of artificial substrates with different apertures on Acropora

microphthalma ……………………………… LIU Xiangbo, ZHU Wentao, XIA Jingquan, ZHU Ming,

REN Yuxiao, CHEN Rouwen, WANG Aimin, LI Xiubao(536)

Isolation, cultivation and antibacterial activity of actinomycetes from the sediments in the deep-sea cold

seeps of South China Sea ……………………… CHEN Yiqiu, HAN Meigui, HAN Zhuang, TANG Min(545)

·Research Report·

Physiological properties and antibacterial activity of a thermotolerant fungus HS1-1…………………………

……………… HUANG Xiaoxin, TAN Jiali, YANG Yongxing, GU Zheming, LI Xueting, LEI Xiaoling(552)

Numerical simulation of the effects of sea surface temperature gradients on severe convective weather

over the South China Sea based on WRF model ……………………… YANG Wei, LI Xun, SHI Juan(560)

Spatial and temporal variations of water requirement and water deficit of rice in Hainan Island ……………

………………… ZOU Haiping, ZHANG Jinghong, LI Weiguang, CHEN Xiaomin, BAI Rui, LYU Run(569)

Effect of cassava and bagasse biochar on -physicochemical properties of lateritic soil ………………………

……………………………………………………………………………………… LI Fangze, ZHAN Jian(577)

JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY

(Bimonthly)

Vol. 14 No.5 Sept. 2023

Contents

第4页

·全健康·  DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220114

主持人:韩谦、刘萌萌

犬肝簇虫病在海南岛的流行病学调查

及其遗传关系的研究

王楷冬1,王金花1,2,祖海月1,林 洋1,王世明3

(1. 海南大学 动物科技学院,海口 570228; 2. 海南大学 全健康研究院,海口 570228;

3. 海口市动物疫病预防控制中心,海口 570205)

摘    要: 为了解近几年犬肝簇虫病在海南岛的流行情况,对其防控措施进行评估,便于更好地对海南岛的犬

肝簇虫病进行防治。采用 PCR 方法对 2017 年 10 月至 2022 年 5 月海南岛 18 个市县的 1 039 份犬血样品进

行犬肝簇虫(Hepatozoon canis)的检测。共检测出 135 份犬血样品呈阳性,感染率为 13.0%,其中,海口

(20.7%)、三亚(20.6%)、屯昌(33.3%)等地犬肝簇虫感染率较高;文昌市(8.7%)、定安县(5.6%)、澄迈县

(6.3%)、儋州市(5.0%)、琼中县(15.8%)、乐东县(18.8%)、昌江县(6.7%)等地均发现有犬感染犬肝簇虫。以

三亚(OP699205)、乐东(OP699206)、定安(OP699207)、琼中(OP699208)的阳性样品基于犬肝簇虫 18S

rRNA 基因构建支序图,结果发现海南岛的犬肝簇虫与印度的犬肝簇虫(AF176835)同源性(99.85%)最接近,

并与猫肝簇虫 (Hepatozoon felis),美洲肝簇虫(Hepatozoon americium)的分支分离。说明在海南岛的犬群中犬

肝簇虫的感染率较高,需采用定期驱除犬肝簇虫的传播媒介血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)方式进行

防治。

关键词: 犬肝簇虫;PCR;感染率;流行病学;海南

中图分类号: S851.3            文献标志码: A            文章编号:1674 − 7054(2023)05 − 0467 − 07

王楷冬,王金花,祖海月,等. 犬肝簇虫病在海南岛的流行病学调查及其遗传关系的研究 [J]. 热带生物学报,

2023, 14(5):467−473. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220114

肝簇虫是顶复门(Apicomplexa)真球目(Encoudida)肝簇虫属(Hepatozoon spp.)的原虫,属于血液

寄生虫的 8 个属之一。目前所发现的肝簇虫属已

经达到 300 多种,其中至少有 46 种肝簇虫属能感

染哺乳动物[1]。肝簇虫可以通过不同种类的节肢

动 物 进 行 传 播 , 比 如 蜱 (Ixodida), 虱 (Phthiraptera),蚊(Culicidae),螨(Acariformes and Parasitiformes),白蛉(Phlebotomidae),采采蝇(Glossina),

锥 蝽 (Triatominae), 水 蛭 (Whitmania pigra Whitman)

[1 − 3]。

目前已知能感染犬和其他野生犬科动物的肝

簇虫有 2 种,分别是犬肝簇虫(Hepatozoon canis)

[4] 和美洲肝簇虫(Hepatozoon americium)

[5]。2 种

肝簇虫都是通过犬和其他野生犬科动物吞食含有

成熟卵囊的蜱虫而进行传播的[6 − 7]。也有包括犬

肝簇虫通过胎盘屏障感染胎儿,或新宿主猎食了

作为美洲肝簇虫的原宿主等其他途径感染的报道

[8]。血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus),一种

以犬为主要宿主,以多种哺乳动物血液为食的棕

色犬蜱,在世界范围内广泛分布[9 − 10]

,已被证明是

犬肝簇虫的主要传播媒介[11]。最近,也有实验研究

证实,对犬肝簇虫也有传播作用的还有在意大利

南 部 发 现 的 图 兰 扇 头 蜱 (Rhipicephalus turanicus)

[12]

;其他蜱种如巴西的微小扇头蜱(牛蜱)

[Rhipicephalus (Boophilus) microplus]

[13]、卵圆花

  收稿日期:2022 − 12 − 15    修回日期:2023 − 03 − 09

  基金项目:国家自然科学基金(U22A20363)

  第一作者:王楷冬(1998−),男,海南大学动物科技学院 2020 级硕士研究生. E-mail:534040628@qq.com

  通信作者:王世明(1976−),男 ,高级兽医师. 研究方向 :动物疫病防控. E-mail:shiming05080@163.com;王金花

(1979−),女,副教授. 研究方向:热带动物医学媒介寄生虫病. E-mail:505448533@qq.com

第 14 卷 第 5 期 热 带 生 物 学 报 Vol. 14 No. 5

2023 年 9 月 JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY Sep. 2023

第5页

蜱(Amblyomma ovale)

[14]、日本的长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)和褐黄血蜱(Haemaphysalis

flava)

[15]、意大利的蓖籽硬蜱(Ixodes ricinus)

[16]、匈

牙利的嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)

[17] 等也

可能是犬肝簇虫的潜在载体。

犬肝簇虫可广泛感染世界各地的肉食性宿

主,如狗、豺、狐狸、负鼠和家猫[16, 18 − 22]。家养犬

对犬肝簇虫的感染表现出良好的适应性,大多数

犬在感染后的疾病状态处于亚临床到轻度之间,

而犬被美洲肝簇虫感染后往往是致命的[5, 23]。虽

然美洲肝簇虫和犬肝簇虫在犬科动物感染中都有

报道,但犬肝簇虫的传播更广泛,也是犬肝簇虫病

的主要原因[9]。

犬肝簇虫的诊断常用镜检方法,即在染色的

血涂片中检测出犬肝簇虫的配子体[24]。酶联免疫

吸附试验和间接荧光抗体试验等工具也被用于犬

肝簇虫抗体的血清学诊断[25]。还可以通过 PCR 技

术检测犬体内的犬肝簇虫,这是检测犬感染犬肝

簇虫最准确的诊断方法[7, 26]。

犬肝簇虫广泛分布,欧洲[16, 19]、非洲[27 − 28]、美

洲[29]、亚洲[4, 30]、澳洲[31] 等地都有犬肝簇虫的报

道;在中国的邻国也有发现,如柬埔寨[32]

,印度[33]

日本[34]

,韩国[35]

,巴基斯坦[36]

,泰国[37]

,马来西亚半

岛[38] 等,而美洲肝簇虫只在北美地区有报道[5, 39]。

目前我国犬只数量估计在 1.5 亿到 2 亿[40] 之间。

国内对犬肝簇虫的研究却非常有限,仅有北京、河

南 、 江 苏 、 陕 西 、 新 疆 [41]、 广 西 [42]、 广 东 [43]、

台湾[44] 等地区有关于犬肝簇虫的报道。

在过去的几年里,世界范围内影响家畜和野

生动物的肝簇虫流行率有所增加,因此,对肝簇虫

的研究在兽医领域具有重要意义。本研究旨在通

过 PCR 和测序方法检测出海南岛犬体内携带肝簇

虫的情况,可为海南岛犬蜱传疾病的流行和分布

格局提供信息。

1    材料与方法

1.1    样本来源    2017 年 10 月至 2022 年 5 月,在

海南岛 18 个市县共采集了 1039 份犬血,血液保

存于含有 EDTA 的 EP 管中,放入−80℃ 冻存。并

对每只犬的信息建立档案记录。

1.2    主要试剂    Ezup 柱式血液基因组 DNA 提

取试剂盒、琼脂糖、DL 2000 DNA Marker 均购自

生工生物工程(上海)股份有限公司;Goldview 染

料,购自苏州金唯智生物科技有限公司;2 X Taq

Plus Master Mix II(Dye Plus),购自南京诺维赞生

物科技股份有限公司。

1.3    主 要 仪 器    PCR 仪 , TProfessional, 德 国

Biometra 公司产品 ;小型台式高速冷冻离心机 ,

5415R,Eppendorf 公司产品;琼脂糖水平电泳仪,

Mini-PROTEAN Tetra,北京六一仪器厂产品;凝胶

成像分析系统,GelDoc XR+,美国 Bio-Rad 公司

产品。

1.4    DNA 提取    取出 100 μL 上述采集到的血

液,分别加入到 1.5 mL EP 管中,参照 DNA 提取试

剂盒说明书步骤提取犬血中 DNA,并于−20 ℃

保存。

1.5    PCR 检测    本实验采用的引物序列参照

文献 [45],上游引物为 HEP-F: 5 ′-ATACATGAG

CAAAATCTCAAC-3 ′ ; 下 游 引 物 为 HEP-R: 5 ′-

CTTATTATTCCATGCTGCAG-3′。PCR 具体反应

体系:2 X Taq PLus Master Mix II 12.5 μL,特异性

引物 F 和特异性引物 R(10−8 moL·L−1)各 0.5 μL,

血液基因组 DNA(约 20 ng) 1 μL。PCR 反应程

序:95 ℃,预变性 5 min;95 ℃,变性时间60 s;58

℃,退火时间 60 s;72 ℃,延伸时间 60 s;共 35 个

循环;最后 72 ℃ 延伸 5 min,4 ℃ 保存。反应结束

后,取 5 μL PCR 产物加入 1.5% 琼脂糖凝胶加样

孔中进行电泳,然后在凝胶成像分析系统下观察

结果是否出现目的条带。将出现目的条带所对应

的阳性产物送往生工生物工程(上海)股份有限公

司进行测序。

1.6    序列分析及支序图的构建    使用 NCBI

中 BLAST 在线比对工具将肝簇虫的测序结果进

行比对,选出代表性的犬肝簇虫序列与 GenBank

中已知序列进行比对,利用软件进行同源性分

析 (DNAMAN  8.0), 使 用 Mega  XI 软 件 , 选 择

Neighbor-joining(NJ)算法中的 Kimura-2-parameter

参数模型,Bootstrop 值选择 1000 进行支序图构

建 , 以 刚 地 弓 形 虫 (Toxoplasma gondii)的 18S

rRNA 序列(登录号 L37415)为外群。

2    结果与分析

2.1    犬肝簇虫 18S rRNA 基因的 PCR 检测结果

   对采集到的 1 039 份犬全血 DNA 进行犬肝簇虫

18S rRNA 基因扩增,电泳结果显示扩增产物在

468 热 带 生 物 学 报 2023 年

第6页

666 bp 处出现目的片段(图 1),与犬肝簇虫 18S

rRNA 基因预期片段大小相符。扩增序列测序拼

接后经 BLAST 比对与 GenBank 上已有的犬肝簇

虫序列 AF176835 同源性为 99.85%。

M

2 000 bp

1 000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

100 bp

666 bp

1 2 3 4 N

图 1    犬肝簇虫 18S rRNA 基因的 PCR 扩增

M:DL-2 000 DNA 相对分子质量标准;1~4:检测样

品;N:阴性对照。

2.2    海南犬肝簇虫病的感染率    在海南岛 1 039

份犬血中发现犬肝簇虫阳性血液 135 份,感染率

为 13.0%。海南岛 18 个市县犬肝簇虫感染率见

表 1。海口(20.7%)、三亚(20.6%)、屯昌(33.3%)

等地犬肝簇虫感染率较高。文昌市(8.7%)、定安

县(5.6%)、澄迈县(6.3%)、儋州市(5.0%)、琼中县

(15.8%)、乐东县(18.8%)、昌江县(6.7%)等地均

发现有犬感染犬肝簇虫。

2.3    犬肝簇虫种系发育分析    BLAST 分析表明,

海南的犬肝簇虫的同源性为 99.4%~100%,用

MEGA-X 软件选择本实验中获得的代表性犬肝簇

虫 18S rRNA 基因序列构建支序图(图 2)(三亚

(OP699205)、乐东(OP699206)、定安(OP699207)、

琼中(OP699208)的阳性样品)。从图 2 中发现海

南的犬肝簇虫 (Hepatozoon canis LD3、Hepatozoon

表 1    海南岛 18 个市县犬肝簇虫感染率

测序方法 市/县

犬肝簇虫

样品数量/阳性数量

(感染率/%)

18S rRNA 海口市 435/90(20.7)

18S rRNA 文昌市 46/4(8.7)

18S rRNA 琼海市 34/0(0)

18S rRNA 定安县 232/13(5.6)

18S rRNA 澄迈县 16/1(6.3)

18S rRNA 临高县 12/0(0)

18S rRNA 儋州市 60/3(5.0)

18S rRNA 琼中黎族苗族自治县 19/3(15.8)

18S rRNA 保亭黎族苗族自治县 24/0(0)

18S rRNA 万宁市 18/0(0)

18S rRNA 五指山市 12/0(0)

18S rRNA 三亚市 34/7(20.6)

18S rRNA 乐东黎族自治县 16/3(18.8)

18S rRNA 陵水黎族自治县 4/0(0)

18S rRNA 白沙黎族自治县 11/0(0)

18S rRNA 昌江黎族自治县 15/1(6.7)

18S rRNA 东方市 21/0(0)

18S rRNA 屯昌县 30/10(33.3)

18S rRNA 总数 1039/135(13.0)

Hepatozoon americanum-Dog-America (EU249992)

Hepatozoon americanum-Dog-America ( JX415175)

Hepatozoon americanum (AF176836)

Hepatozoon felis-Asiatic lion-India (KX017290)

Hepatozoon felis-Wild cat-Spain (MW578995)

Hepatozoon felis-Bengal tiger-lndia (HQ829445)

Hepatozoon felis-Domestic cat-Spain (AY620232)

Hepatozoon canis-Wolf-Germany (MN791089)

Hepatozoon canis-Fox-Czech Republic (KU893125)

Hepatozoon canis-Dog-Czech Republic (KU893127)

Hepatozoon canis-Dog-Venezuela (DQ439540)

Hepatozoon canis-Golden jackal-Rumania (KX712126)

Hepatozoon canis-Tick-India (AF176835)

▲Hepatozoon canis LD 3

▲Hepatozoon canis DA 85

▲Hepatozoon canis SY 1

▲Hepatozoon canis QZ4

Hepatozoon canis-Crab-eating fox-Brazil (AY461375)

Hepatozoon canis-fox (AY150067)

Hepatozoon canis-Golden jackal-Austria (KX712123)

Hepatozoon sp.-Fukuoka (AF418558)

Hepatozoon canis-Tick-apan (LC169075)

Hepatozoon canis-Dog-India (MN628329)

Hepatozoon canis-Red fox-Austria (KM115995)

Toxoplasma gondii ME49(L37415)

90

96

56

56

79

60

97

81

83

52

57

74

100

图 2    基于 18S rRNA 基因构建的支序图

第 5 期 王楷冬等: 犬肝簇虫病在海南岛的流行病学调查及其遗传关系的研究 469

第7页

canis DA85、 Hepatozoon canis SY1、 Hepatozoon

canis QZ4) 与印度的犬肝簇虫(AF176835)均位于

bootstrap 支持度 100 的同一分支中,并在 bootstrap

支持度 90 的情况下与该属其他分支分离 [ 猫肝簇

虫(Hepatozoon felis ),美洲肝簇虫( Hepatozoon

americium )]

3    讨 论

犬肝簇虫是蜱传病原虫中分布最广的一种,

主要由血红扇头蜱[46] 传播。本研究采集的样本来

自于海南岛 18 个市县,海南岛属于热带季风气

候,全年温度和湿度相对较高,年平均温度在 22~

27 ℃。海南岛气候适合热带物种血红扇头蜱的发

展和生存。目前针对犬肝簇虫对不同宿主或宿主

特异性的情况尚未有较多的研究[6, 11]。因此,无法

消除犬肝簇虫通过其他蜱虫物种传播的可能性[19]。

自 1905 年犬肝簇虫首次被提出以来[4]

,犬肝

簇虫已在美洲、欧洲、亚洲、非洲和澳大利亚的几

个国家被报道。大多数的报道通常是通过组织病

理学或显微镜诊断[35] 的方法来确定肝簇虫的感

染,缺乏对其种群的遗传结构和基因变化的理

解。本实验采用 PCR 技术检测犬体内的犬肝簇

虫,并通过测序和建立支序图的方式对该血液寄

生虫的物种进行鉴定[47]

,使调查结果的准确性

更高。

本研究使用了一套肝簇虫属的特异性引物对

海南岛 1039 份犬血样进行检测,琼脂糖凝胶电泳

结果显示,其中 135 份样品(13 .0%)为阳性。通过

对获得的阳性扩增子进行测序分析来确定肝簇虫

的种类。

本研究结果支持并证实了海南犬体内存在

犬肝簇虫,也是海南岛犬肝簇虫的首次分子生物

学报道。据报道,犬肝簇虫在非洲国家流行率如

苏丹 42.3%[48]、尼日利亚 41.4%[49] 和赞比亚 13%[50]。

犬肝簇虫在欧洲国家流行率如法国 1%[51]、西班牙

3%[52] 捷克 50%[53]、意大利南部 50.6%[7]。犬肝簇

虫在北美洲流行率如古巴 47.5%[54]、美国犬肝簇虫

与美洲肝簇虫同时出现,感染率为 2.5%[55]。犬肝

簇虫在南美洲流行率如巴西(53.3%)

[56]

,犬肝簇虫

在亚洲流行率如印度(30%)

[33]、日本(42.9%)

[34]。

文献报道我国犬肝簇虫感染率为河南登封市

4.08%[43]

,河南郑州 4.9%,北京 4.5%,江苏南京

2.3%,陕西杨凌 8.9%,新疆乌鲁木齐 1.2%[41]

,中国

农业大学动物医院有确诊一例犬肝簇虫阳性病

例[57]

,广州也有疑似犬肝簇虫的病例报道[58]。

海南岛犬肝簇虫的感染率为 13.0%,与其他省

市感染率相比偏高,比国外其他国家相比感染率

偏低,这些犬肝簇虫感染率的差异可能是由多种

因素造成的,如目标犬的种群特征、采样季节、社

会因素(犬类饲养、使用药物杀蜱)、地理位置和气

候条件等,这些因素最终会影响病媒蜱物种的数

量和分布[59]。因犬肝簇虫的传播需要通过吞食含

有成熟卵囊的蜱虫进行,使得犬肝簇虫病的感染

率不高。但目前没有可用的犬肝簇虫疫苗,使得

犬肝簇虫病的治疗比较困难。防治这种疾病的最

佳方法是采取适当的蜱虫控制策略来预防感染。

支序图分析结果表明,来自海南岛的犬肝簇

虫与其他地区的犬肝簇虫属于同一支系,与海南

样品同源性最接近的序列是来自印度的犬肝簇虫

(AF176835)。这一发现可能表明,该病原体可能

是由于旅游业、自然灾害和社会因素等,人与宠物

的流动性日益增加的原因而带入海南。

此外,本研究中犬肝簇虫基因型与猫肝簇虫、

美洲肝簇虫分类不同。由于该类群的成员已在全

球广泛分布的犬科动物和家养犬中被报道,因此

可能对进一步研究该类群的新类群划定提供一定

的帮助。

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Epidemiological investigation and genetic relationship of canine

hepatozoonosis in Hainan Island

WANG Kaidong1

,   WANG Jinhua1,2

,   ZU Haiyue1

,   LIN Yang1

,   WANG Shiming3

(1. School of Animal Science and Technology, Hainan University, Haikou, Hainan 570228; 2. One Health Research Institute, Hainan University, Haikou,

Hainan 570228; 3. Haikou Animal Epidemic Disease Prevention and Control Center, Haikou, Hainan 570205, China)

Abstract: In  order  to  understand  the  prevalence  of Hepatozoon canis disease  in  Hainan  in  recent  years,  the

prevention and control measures were evaluated for better control of Canine hepatozoonosis in Hainan. There

were 1039 dog blood samples collected from 18 cities and counties in Hainan Province from October 2017 to

May 2022, and they were detected for H. canis by PCR. Among the dog blood samples collected, 135 samples

were found to be positive for H. canis, with an infection rate of 13.0%. Of the samples higher infection rates of

H. canis were found in Haikou (20.7%), Sanya (20.6%), Tunchang (33.3%), and some infections of H. canis

were  also  found  in  Wenchang  (8.7%),  Dingan  (5.6%),  Chengmai  (6.3%),  Danzhou  (5.0%),  Qiongzhong

(15.8%),  Ledong  (18.8%)  and  Changjiang  (6.7%).  The  positive  samples  from  Sanya  (OP699205),  Ledong

(OP699206), Dingan (OP699207) and Qiongzhong (OP699208) were selected to construct a phylogenetic tree

based on the 18S rRNA of the H. canis. It was found that the homology of H. canis in Hainan was the closest to

that of H. canis (AF176835) in India, which was 99.85%, and was also separated from that of the branches of

H. felis and H. americanum. This shows that the dogs in Hainan Island has a high infection rate of H.canis. The

prevention  and  treatment  of H.canis requires  regular  elimination  of  the  transmission  vector Rhipicephalus

sanguineus .

Keywords:Hepatozoon canis;PCR;infection rate;epidemiology;Hainan

(责任编辑:叶 静)

第 5 期 王楷冬等: 犬肝簇虫病在海南岛的流行病学调查及其遗传关系的研究 473

第11页

·全健康·  DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.20230010

主持人:韩谦、刘萌萌

抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达

及发酵液抑菌活性鉴定

李飞航,武浩恒,李 宏,李娟娟,马 香,唐燕琼,刘 柱

(海南大学 生命科学学院,海口 570228)

摘    要: 为了获得体外表达的高活性抗菌肽,通过分子克隆技术构建了抗菌肽 Cathelicidin-1 重组载体,在毕

赤酵母 (Pichia pastoris) GS115 中表达,并鉴定包含该抗菌肽的发酵液的抑菌活性。通过 DNA 全合成技术合

成编码抗菌肽 Cathelicidin-1 的全长基因,采用 PCR 技术扩增靶标基因并与真核表达载体 pGAPZαA 连接,获

得重组质粒 pGAPZαA- Cathelicidin-1;将重组质粒转化至大肠杆菌 DH5α 中扩增,提取质粒并经单酶切处理

后转化毕赤酵母 GS115;使用 YPD 培养基培养酵母,72 h 后收集发酵液,通过 Tricine-SDS-PAGE 检测抗菌肽

表达,并通过抑菌圈与抑菌曲线测定鉴定发酵液的抑菌活性。结果表明,抗菌肽 Cathelicidin-1 以分泌肽形式

表达于发酵液中,并且该发酵液能够显著抑制大肠杆菌(Escherichia coli)的生长,而对金黄色葡萄球菌

(Staphylococcus aureus)则无明显抑菌效果。

关键词: 抗菌肽;真核表达;发酵液;抑菌效果

中图分类号: Q78;TQ920.1            文献标志码: A            文章编号:1674 − 7054(2023)05 − 0474 − 07

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抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)也称抗

微生物肽和宿主防御肽,是一类具有抗菌活性的

小分子量多肽,一般由 20 ~ 50 个氨基酸组成,具

有净正电荷,广泛存在于各类植物、动物、真菌、

细菌以及人体中[1 − 3]。依据来源的不同,可将抗菌

肽划分为动物抗菌肽、微生物抗菌肽及人造抗菌

肽等[4]。抗菌肽参与多种生物学功能,比如免疫调

节、血管生成、伤口愈合、抗炎活性和抗肿瘤活

性。随着对抗菌肽研究的不断深入,人们发现与

传统抗生素相比,抗菌肽会作用于病原菌细胞膜,

通过物理方式使病原菌死亡,因而不易使病原菌

产生耐药性,其作为抗生素的替代药物具有巨大

发展潜力[5 − 6]。相关研究表明,抗菌肽在临床试

验中已取得成功,但受限于其来源,难以投入实

际应用[7]。Cathelicidin-1 是 2006 年从鸡(Gallus

domesticus)中分离鉴定出来的一种抗菌肽 ,由

26 个 氨 基 酸 组 成 , 一 级 结 构 为 NH2

-RVKR

VWPLVIRTVIAGYNLYRAIKKK-COOH,其具有

广谱抑菌活性,能有效抑制单核细胞增多性李斯

特氏菌(Listeria monocytogenes)、淋球菌(Neisseria

gonorrhoeae)和大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌

的生长[8 − 9]。目前,对于该抗菌肽,获取途径仍局

限于天然提取和化学合成,成本高昂,而通过基因

工程技术构建工程菌株可以高效、低廉、大量生产

抗菌肽。因此,笔者拟通过分子克隆技术构建抗

菌肽 Cathelicidin-1 重组载体,在毕赤酵母(Pichia

pastoris)GS115 中表达,并鉴定包含该抗菌肽的发

酵液的抑菌活性,旨在获得体外表达的高活性抗

菌肽,为纯化抗菌肽 Cathelicidin-1、研究其作用机

制及实际应用奠定基础。

  收稿日期:2023 − 02 − 09    修回日期:2023 − 03 − 20

  基金项目:海南省重点研发计划项目(ZDYF2021XDNY181)

  第一作者:李飞航(1998−),男,海南大学生命科学学院 2020 级研究生.E-mail:2294684896@qq.com

  通信作者:唐燕琼(1968−),女,教授,博士生导师. 研究方向:遗传学及生物防控. E-mail:990804@hainu.cdu.cn

第 14 卷 第 5 期 热 带 生 物 学 报 Vol. 14 No. 5

2023 年 9 月 JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY Sep. 2023

第12页

1    材料与方法

1.1    实验材料    本研究使用的菌株与质粒见表 1。

表 1  实验材料及来源

实验材料 相关属性 来源

菌株

Strains

E. coli DH5α

野生型,

用于质粒克隆 实验室保存

P. pastoris

GS115

野生型,

用于表达外源蛋白实验室保存

E. coli K88

野生型,

用作指示菌 实验室保存

S. aureus

ATCC25923

野生型,

用作指示菌 实验室保存

质粒

Plasmids

pGAPZαA

毕赤酵母蛋白胞

外表达载体 实验室保存

pGAPZαACathelicidin-1 用于表达蛋白 本实验构建

1.2    实验试剂    从美国 NEB 公司选购限制性核

酸内切酶和 T4 DNA 连接酶;2×Phanta Max Master

Mix,DL5000 DNA Marker、质粒提取试剂盒、胶

回收试剂盒、PCR 纯化试剂盒购自中国 Vazyme

公司;双色预染蛋白 Marker、酵母基因组提取试剂

盒和蛋白上样缓冲液购于中国生工公司;其他所

用试剂为国产分析级。

1.3    Cathelicidin-1 的合成、扩增及纯化    抗菌

肽 Cathelicidin-1 的全长核苷酸序列由中国生工公

司合成 ,以该核苷酸序列为模板 ,通过引物对

Cathelicidin-1-F/ Cathelicidin-1-R 扩增 Cathelicidin-1

目 的 基 因 (Cathelicidin-1-F: 5 ′-CCGGAATTCCGAGTAAAGCGAGTTTGGCC-3′   ;  Cathelicidin-1-

R: 5′-TGCTCTAGAGCACCTTGAAAGTACAAGTTTTCCTTC-3′)。 PCR 总反应体系为 12 μL,体

系 包 括 : 0.5  μL 上 游 引 物 , 0.5  μL 下 游 引 物 ,

1 μL 模板 , 6 μL 2×PCR mix,4 μL ddH2O。PCR

产物经由电泳进行检测,依照试剂盒操作,回收目

的条带。

1.4    pGAPZαA-Cathelicidin-1 重组载体构建    首

先用限制性核酸内切酶 Xba Ⅰ与 EcoR Ⅰ消化

pGAPZαA 质粒与目的基因片段,酶切总体系共

100 μL,组分如下:1 μL 内切酶 Xba Ⅰ,1 μL 内切

酶 EcoR Ⅰ,10 μL Cutsmart 缓冲液 ,500 ng 目的基

因和 500 ng 空载质粒 ,60 μL ddH2O 。依照试剂

盒说明书,回收酶切产物,使用酶标仪测定浓度,

并通过 T4 DNA 连接酶 20 ℃ 连接 1 h 。通过热

激法转化 E.coli DH5α 细胞, 37 ℃ 孵育 1 h 后涂

布到含 25 mg·L−1 博莱霉素的 LB 固体培养基上,

37 ℃ 恒温过夜培养 ,随机选取单菌落至 LB 培养

基中 ,恒温过夜培养 12 h ,过夜培养物提取质

粒 , 用 目 的 基 因 扩 增 引 物 对  Cathelicidin-1-F/

Cathelicidin-1-R 进行 PCR,将待测样品送至海南

楠山生物技术有限公司测序。

1.5    pGAPZαA-Cathelicidin-1 重组载体扩增、单

酶切及真核转化    选取测序正确的阳性转化子到

含有 25 mg·L−1 博莱霉素的 LB 培养基中,37 ℃ 恒

温 振 荡 过 夜 。 用 质 粒 萃 取 试 剂 盒 纯 化 回 收

pGAPZαA-Cathelicidin-1 重组载体 ,并用内切酶

BamH I 酶切消化,处理体系为 50 μL,包括:内切

酶 BamH I 1 μL,Cutsmart 缓冲液 5 μL,质粒 600

ng,ddH2O 30 μL。依照试剂盒操作步骤回收单酶

切产物,电转至毕赤酵母 GS115 感受态细胞中。

酵母细胞在 30℃ 孵育 1 h 后涂布到含 50 mg·L−1

博莱霉素的 YPDS 固体培养基上,30 ℃ 恒温培养

48 h,随机选取单克隆菌落转移到 YPD 培养基中

30 ℃ 恒温振荡培养,经蜗牛酶处理 1 h 后,提取酵

母基因组,用验证性引物 pGAP-F/ 3′AOX1 进行

PCR 以验证阳性克隆子(pGAP-F:5′-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3 ′;  3 ′AOX1:5´-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′),将待测阳性克隆子送至

海南楠山生物技术有限公司测序。

1.6    Tricine-SDS-PAGE 凝胶电泳分析    挑经测

序的酵母阳性转化子单菌落至含 50 mg·L−1 博莱

霉素的 5 mL YPD 培养基中,30 ℃ 恒温振荡培养

48 h。将酵母培养物按初始浓度 106 CFU·mL−1 转

接到 200 mL YPD 培养基中, 于 30 ℃ 发酵培养

72 h,然后 5 000 r·min−1 离心 10 min,经滤膜过滤

并收集发酵液。取 20 μL 发酵液与 20 μL 2×蛋白

上样缓冲液混匀,以转入空载质粒的酵母发酵液

为对照,使用试剂盒配置 18% Tricine-SDS-PAGE

凝胶,随后进行电泳分析,使用考马斯亮蓝处理

1 h,经脱色液处理 3 h 后观察结果。

1.7    重组酵母发酵液抑菌活性鉴定    以大肠杆

菌和金黄色葡萄球菌为指示菌,使用牛津杯法与

抑菌曲线法分别测定发酵液抑菌活性。对于牛津

杯法,先将转接培养的 2 种指示菌恒温培育 12 h,

取 5×106 CFU 的初始菌量涂板,待平板晾干后,将

牛津杯竖直放置其上,往其中加入 100 μL 发酵液,

第 5 期 李飞航等: 抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达及发酵液抑菌活性鉴定 475

第13页

37 ℃ 放置 12 h 后,观察有无抑菌圈,使用游标卡

尺记录其直径。对于抑菌活性测定,先使用 96 孔

板接种 107 CFU 初始指示菌菌量,培养总体积 200

μL,然后加入不同体积的发酵液,使其体积分数分

别达到 25%、50%、75% 和 100%,以转入空载质

粒重组菌株等体积分数的发酵液体为阴性对照,

设置 3 个生物学重复,37 ℃ 恒温培养 24 h,在培

养期间,每 3 h 测定 1 次 OD600 吸光值,绘制抑菌

曲线。

2    结果与分析

2.1    pGAPZαA-Cathelicidin-1 表达载体构建    为

了获得分泌至 P. pastoris 胞外的抗菌肽,以便于后

续检测,选用 pGAPZαA 为载体,将外源片段插入

其中 α−因子分泌信号肽编码序列下游。从图 1 可

知,重组载体在其表达的蛋白 N−端添加酿酒酵母

α−因子分泌信号肽,使得表达的抗菌肽可以分泌

到发酵液中。pGAPZαA 的 GAP 启动子为组成型

启动子,无需诱导物即可表达重组蛋白。

ori ori 1

1

pGAPZα A pGAPZα A-Cathelicidin-1

3 147 bp 3 246 bp

GAP promoter GAP promoter

α-factor

secretion signal

α-factor

secretion signal

EcoR I (760)

Xba I (823)

AOX1 terminator

AOX1 terminator

Cathelicidin-1

BamH I (1 228)

TEF1 promoter TEF1 promoter

BleoR BleoR

CYC1

terminator

CYC1

terminator

图 1    pGAPZαA 空载体与携带外源片段的 pGAPZαA- Cathelicidin-1 重组载体图谱

通过 PCR 扩增 Cathelicidin-1 全长序列(123

bp),并在其 5′及 3′端分别引入相应的酶切位点。

通过电泳分析 PCR 产物 ,由图可知在大约 120

bp 处存在 1 条明亮单一的条带,即为目的条带,表

明获得符合预期的 PCR 产物(图 2)。

250

100

bp M 1

图 2    Cathelicidin-1 编码基因 PCR 扩增产物

M: DL5000 DNA Marker;1:目的基因 PCR 产物。

纯化 PCR 产物,与 pGAPZαA 载体用相同的

内切酶 Xba Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切处理,回收酶切产

物。接着,将酶切产物连接,构建融合表达载体

pGAPZαA-  Cathelicidin-1,通过热激导入 E. coli

DH5α 细胞中,均匀涂布到有 25 mg·L−1 博莱霉素

的抗性平板上。最后,随机挑取抗性平板的单菌

落,通过菌液 PCR 验证是否为阳性。 电泳结果表

明,可以获得 120 bp 左右 的目的条带,PCR 产物

条带单一且浓度丰富(图 3,泳道 3~9)。随后提取

质粒,送至海南楠山生物技术有限公司,测序对比

表明已构建成功重组载体。

2.2    Cathelicidin-1 的 真 核 表 达 及  Tricine-SDSPAGE 凝胶电泳分析    pGAPZαA 载体能够整合到

酵母染色体上,具有较高遗传稳定性。为了防止

环状载体与染色体整合时发生随机断裂,在将重

组载体 pGAPZαA- Cathelicidin-1 转化酵母之前首

先对其进行单酶切,以固定断裂位点。由图 4 可

知,通过内切酶 BamH I 对重组载体进行单酶切

后,酶切后的线性质粒(图 4,泳道 2~4)泳动速度

要低于未酶切的环状质粒(图 4,泳道 1),证明酶切

成功,随后纯化单酶切产物。

将重组载体单酶切产物电转化至 P. pastoris

GS115 感受态细胞中,均匀涂布在有 50 mg·L−1 博

莱霉素抗性平板上,挑选阳性克隆,转接到 5 ml

YPD 培养基中,培养 24 h,经蜗牛酶处理后,提取

基因组,通过 PCR 扩增后,电泳验证。由图可知,

能 够 获 得 与 阳 性 对 照 大 小 一 致 的 目 的 产 物 ,

PCR 产物条带单一且浓度丰富(图 5,泳道 3)。

476 热 带 生 物 学 报 2023 年

第14页

回收 PCR 产物,送至海南楠山生物技术有限

公司分析,结果表明,重组载体已整合到酵母基因

组 中 , 且 开 放 阅 读 框 未 出 现 突 变 , 一 致 性 达

100%(图 6-A 和图 6-B)。最后,将重组酵母转接

到 YPD 培养基中发酵 72 h,离心收集发酵液,进

行 Tricine-SDS-PAGE 分析,结果表明,与转化空

载体的菌株相比,表达抗菌肽的重组菌株发酵液

在 10 kDa 处出现显著目的条带,与预期大小一致,

表明抗菌肽以胞外分泌形式表达(图 7)。

2.3    发酵液抑菌活性测定    以大肠杆菌和金黄

色葡萄球菌分别为革兰氏阴性与阳性指示菌,分

别采用牛津杯法和抑菌曲线测定法鉴定本研究重

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

250

100

图 3    菌液 PCR 鉴定重组载体转化 E. coli DH5α 阳性克隆

M:DL5000 DNA Marker,B. 1:阳性对照;2:阴性对照;3~9:阳性克隆。

5 000

3 000

bp M 1 2 3 4

图 4    重组载体 pGAPZαA- Cathelicidin-1(泳道 1)及重组

载体 pGAPZαA- Cathelicidin-1 酶切产物(泳道 2~4)

电泳结果

M:DL5000 DNA Marker;1:酶切前的质粒;2~4:酶切

后的质粒。

bp M 1 2 3

750

500

图 5    基因组 PCR 鉴定重组载体转化 P. pastoris GS115 阳

性克隆

M:DL5000 DNA Marker;1:阳性对照;2:假阳性克隆;

3:阳性克隆。

A

B

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550

Identity=100%

Identity=100%

图 6    Cathelicidin-1 编码基因开放阅读框起始密码子端测序结果(A)和终止密码子端测序结果(B)

红框分别显示了起始密码子(A)和终止密码子(B)。

16

6.5

kD M 1 2

图 7    Tricine-SDS-PAGE 分析 Cathelicidin-1 的胞外分泌

表达

M:6.5~130kDa 蛋白 Marker;1:表达空载体的重组酵

母发酵液;2:表达抗菌肽 Cathelicidin-1 的重组酵母发酵液。

第 5 期 李飞航等: 抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达及发酵液抑菌活性鉴定 477

第15页

组菌株的发酵液抑菌活性。牛津杯法结果表明,

表达抗菌肽 Cathelicidin-1 的重组酵母发酵液对于

大肠杆菌有明显的抑菌效果,产生抑菌圈直径达

15 mm(图 8-A),而对于金黄色葡萄球菌则观察不

到明显的抑菌圈(图 8-B),几乎没有抑菌效果。

经 SPSS 23 对 24 h 时的 OD 值进行统计分

析 , 结 果 表 明 添 加 50%、 75%、 100% 抗 菌 肽

Cathelicidin-1 发 酵 液 与 其 他 组 存 在 显 著 差 异

(P<0.05),与表达空白载体的重组酵母发酵液相

比,随着表达 Cathelicidin-1 的酵母发酵液所占体

积分数的提高,大肠杆菌的生长速度逐渐减缓,表

明发酵液对于大肠杆菌呈现浓度依赖性的抑菌活

性,在发酵液达到 100% 的情况下,大肠杆菌无法

生长,被完全抑制(图 9-A)。与此不同,对于金黄

色葡萄球菌,各个组别在 24 h 时的 OD 值都无显

著差异,说明表达 Cathelicidin-1 的酵母发酵液对

于金黄色葡萄球菌的生长并未产生显著抑制效

果,甚至 100% 体积分数的发酵液也并未对金黄色

葡萄球菌的生长造成任何显著影响(图 9-B)。

A B

图 8    牛津杯法检测表达 Cathelicidin-1 的重组酵母发酵液对大肠杆菌(A)和金黄色葡萄球菌的抑菌圈(B)1~3:生物学重

复;4~6:生物学重复。

2.0

1.5

1.0

0.5

0

OD600

3 6 9 12 15 18 21 24

t/h

3 6 9 12 15 18 21 24

t/h

25% 空载发酵液

50% 空载发酵液

75% 空载发酵液

100% 空载发酵液

25% Cathelicidin-1 发酵液

50% Cathelicidin-1 发酵液

75% Cathelicidin-1 发酵液

100% Cathelicidin-1 发酵液

25% 空载发酵液

50% 空载发酵液

75% 空载发酵液

100% 空载发酵液

25% Cathelicidin-1 发酵液

50% Cathelicidin-1 发酵液

75% Cathelicidin-1 发酵液

100% Cathelicidin-1 发酵液

A 2.0

1.5

1.0

0.5

0

OD600

B

图 9    表达 Cathelicidin-1 的酵母发酵液对于大肠杆菌(A)和金黄色葡萄球菌(B)的抑菌曲线

3    讨 论

抗菌肽是近年来受到普遍关注,有望替代抗

生素的一类抗菌剂, 与大多数主要通过阻断有限

的细胞内靶点发挥作用的常规抗生素不同,它们

的杀菌活性通常来自于破坏细菌膜完整性的能

力[10]。目前,已有多个模型对抗菌肽的抗菌机制进

行解析,其中多数模型提出抗菌肽主要靶向破坏

细胞膜[11]。膜靶向模型解释抗菌肽对细菌细胞的

选择性依赖于带负电荷的细菌细胞和两性离子真

核细胞之间的表面电荷差异[12]。阳离子抗菌肽被

吸引到阴离子细菌细胞表面并与之结合,从而破

坏生物膜完整性,最终导致细胞死亡[13 − 14]。由于

抗菌肽是对细菌细胞膜造成物理破坏从而抑菌,

细菌不能针对这种作用方式产生耐药性,因此,抗

478 热 带 生 物 学 报 2023 年

第16页

菌肽被认为是前景巨大的抗菌候选药物,有可能

解决迅速增长的抗微生物药物耐药性危机[15]。

有研究表明,抗菌肽 Cathelicidin-1 具有良好

抗菌活性,对多种细菌病原菌都具有较好的抑菌

效果[8]。然而,目前获取 Cathelicidin-1 的方式仍局

限于天然提取和化学合成,成本高昂,相比之下,

通过基因工程表达 Cathelicidin-1 抗菌肽无疑是降

低生产成本、提高产量的有效途径。

近年来,许多报道通过毕赤酵母表达蛋白系

统表达蛋白,并且酵母表达系统也在逐年优化,本

研究采用的 pGAPZαA 表达载体中的 GAP 类启动

子为组成型的启动子,不同于诱导型启动子,无需

添加有毒的诱导物即可高效诱导表达外源蛋白,

且该载体中含有的 α 分泌信号肽编码序列可以与

外源蛋白融合表达,引导外源蛋白一同分泌到胞

外,并且 α 分泌信号肽在分泌过程中会发生自剪

切,从而不对外源蛋白的最终结构产生影响。本

研究采用上述经过优化的毕赤酵母表达系统,旨

在获得高效表达且具有显著抗菌活性的抗菌肽

Cathelicidin-1。 测 序 对 比 结 果 证 明 , Cathelicidin-1 基因已正确整合到毕赤酵母基因组中,而

且,Tricine-SDS-PAGE 分析表明,Cathelicidin-1 抗

菌肽以分泌方式表达于酵母发酵液中。进一步通

过抑菌圈和抑菌曲线测定实验可知 ,含有外泌

Cathelicidin-1 抗菌肽的酵母发酵液对以浓度依赖

的方式对大肠杆菌产生良好抑菌效果,只需少量

即可显著抑制大肠杆菌的生长,在 100% 添加时完

全抑制其生长。本研究构建的 Cathelicidin-1 抗菌

肽酵母表达系统 ,以及获得的外源分泌表达

Cathelicidin-1 抗菌肽,为后续进一步研究 Cathelicidin-1 抗菌肽的抑菌机制及应用奠定了基础。

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第 5 期 李飞航等: 抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达及发酵液抑菌活性鉴定 479

第17页

Eukaryotic expression of Cathelicidin-1 and validation of its

antimicrobial activity in the fermentation broth

LI Feihang,   WU Haoheng,   LI Hong,   LI Juanjuan,   MA Xiang,   TANG Yanqiong,   LIU Zhu

(School of Life Science, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China)

Abstract: In  order  to  obtain  exogenously  expressed  antimicrobial  peptide,  cathelicidin-1  expression

recombinant  vector  was  constructed  using  molecular  cloning  technique,  and  the  secreted  cathelicidin-1  was

expressed in Pichia pastoris. The antimicrobial activity of the fermentation broth containing Cathelicidin-1 was

evaluated. The full-length gene encoding cathelicidin-1 was synthesized by total DNA synthesis and amplified

by PCR. The full-length gene was linked to the eukaryotic expression vector pGAPZαA, and the recombinant

plasmid  pGAPZαA-Cathelicidin-1  was  transformed  into Escherichia coli DH5α  for  multiplication.  The

multiple plasmids were extracted, single digested, and transformed into the yeast Pichia pastoris GS115. The

transformed yeast was cultured in the YPD culture medium, and the fermentation broth was collected after 72

hrs of culture and used to express the antimicrobial peptide Cathelicidin-1 in a secreted form by using TricineSDS-PAGE. The antimicrobial activities of the fermentation broth were evaluated by using inhibition zone of

the antimicrobial peptide and the microbial growth curve. Measurements of inhibition zone and growth curve

showed  that  the  fermentation  broth  from  the  yeast  expressing  Cathelicidin-1  exhibited  significant  inhibitory

activity against E. coli, but did not show any bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus.

Keywords:antimicrobial peptides;eukaryotic expression;fermentation broth;bacteriostatic activity

(责任编辑:潘学峰)

480 热 带 生 物 学 报 2023 年

第18页

·生态多样性与生态文化·  DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220088

主持人:任明迅

基于残差卷积神经网络模型的勺嘴鹬动作识别

杨雪珂1,蒙金超1,冯悦恒1,林婷婷1,2,王兆君2,刘 辉1

(1. 海南大学 林学院,海口 570228; 2. 中国科学院 动物研究所,北京 100101)

摘    要: 为开启海南热带地区鸻鹬类涉禽的动作识别以及其他野生鸟类行为学自动识别的研究,建立了基于

野外采集影像的勺嘴鹬 (Eurynorhynchus pygmeus) 动作图像数据集。该数据集由表达勺嘴鹬主要行为模式

的 9 种动作标签组成;同时利用 ResNet50、ResNet101 和 ResNet152 共 3 种残差卷积神经网络模型尝试对勺

嘴鹬的动作进行自动识别。结果表明 ,ResNet50、ResNet101、ResNet152 测试集准确率分别为 96.90%、

96.94% 和 96.90%,说明 3 种模型都能对勺嘴鹬图像进行快速准确的动作识别。

关键词: 残差卷积神经网络;鸟类图像;动作识别;勺嘴鹬

中图分类号: Q958            文献标志码: A            文章编号:1674 − 7054(2023)05 − 0481 − 09

杨雪珂,蒙金超,冯悦恒,等. 基于残差卷积神经网络模型的勺嘴鹬动作识别 [J]. 热带生物学报,2023, 14(5):

481−489. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220088

随着科技的发展,鸟类图像的大量采集变得

更加便捷,可利用图像采集设备(如红外相机[1]、普

通相机)采集,也可利用智能手机采集。随着鸟类

数据共享平台(eBird[2]、中国爱鸟网等)的建立,来

自世界各地的大量鸟类图像数据被上传至网络数

据库。仅以 eBird 为例,已有超过 2 000 万张鸟类

图像被上传至该平台,并且图像数量依旧在迅速

增长。鸟类图像记录了鸟类形态学特征、生境信

息[3] 及行为学特征,对鸟类学研究有着重要的价

值,但面对如此大量的鸟类图像数据,仅凭人工处

理是无法满足需求的。为了能快速自动化处理大

量的鸟类图像数据,深度学习(Deep Learning)领域

的研究人员已经开展了相关研究。图像识别技术

应用于鸟类物种识别已有一些成功案例,在标准

鸟类图像数据库 CUB200-2011[4] 的技术报告中,

Welinder 等[4] 就使用局部区域和基于传统特征的

词包模型实现分类 ,Berg 等[5] 提出 POOF 特征 ,

Yao[6] 和 Yang[7] 等均尝试使用模板匹配的方法替

换定位算法中的滑动窗口,以降低算法复杂度。

基于图像识别技术的珍稀濒危鸟类的行为识别具

有重大应用价值[8]

,但整体看来,目前的研究主要

涉及计数[9]、密度估计[10]、生境因素识别[11] 等。虽

然目前自动监测获得的影像数据量极大,其中很

大一部分行为表达数据对于无人为干扰下鸟类行

为的研究很有价值,但是目前使用这种方式对野

生鸟类行为学进行的研究少之又少。动物通常以

身体运动和身体姿势来表达行为,动物的行为是

其对环境和生理状况的一种反应,为研究动物健

康水平提供了重要的线索[12]

,所以进行动物行为识

别或动作识别是十分必要的。

卷积神经网络(Convolutional Neural Networks,

CNN)为深度学习的代表算法之一,其在图像识别

领域展现了非常大的潜力和极佳的性能[13 − 15]。经

典的神经网络模型包括 ResNet[16]、VGG  Net[17]、

ALexNet[18]、 GoogLeNet[19] 等 , 其 中 , 残 差 网 络

(Residual Network, ResNet)良好地解决了网络加

深带来的学习退化问题,该模型目前在各领域取

得了广泛应用[20]。目前利用卷积神经网络来实现

野生动物自动识别的研究较多。史春妹等[21] 运用

单次多盒目标检测方法来进行东北虎的个体识

  收稿日期:2022 − 10 − 22    修回日期:2023 − 01 − 24

  第一作者:杨雪珂(1997−),女,海南大学林学院 2020 级硕士研究生. E-mail:15136910537@163.com

  通信作者:刘辉(1988−),男,博士. 讲师. 研究方向:热带野生动物保护. E-mail:liuhui_leen@163.com

第 14 卷 第 5 期 热 带 生 物 学 报 Vol. 14 No. 5

2023 年 9 月 JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY Sep. 2023

第19页

别,达到 97.4% 的准确率。石鑫鑫等[22] 提出了一

种全连接算法与稀疏连接算法相结合的全卷积神

经 网 络 解 决 了 蛙 声 识 别 问 题 , 准 确 率 达 到

99.67%。还有使用基于感兴趣区域与卷积神经网

络的野生动物物种自动识别方法实现了基于野生

动物监测图像的物种识别研究,平均识别率均可

达到 90% 左右[23]。残差网络模型的应用研究成果

对于鸟类图像大数据的有效利用有着重要的辅助

作用 ,但仍不能满足实际需要 ,仍缺乏应用卷

积神经网络进行野生鸟类的动作自动化识别

研究[24]。

勺 嘴 鹬 隶 属 鹬 科 (Scolopacidae)滨 鹬 属

(Calidris), 是一种仅分布于东亚–澳大利西亚候鸟

迁 徙 路 线 上 的 涉 禽 [25]

, 被 世 界 自 然 保 护 联 盟

(IUCN)红色名录列为极度濒危(CR)物种。其在

我国的江苏、浙江、福建、广东、海南等省份均有

被记录到,其中,海南儋州湾是海南岛目前已知的

为数不多的勺嘴鹬的为数不多的越冬地。繁殖期

以外的时期,勺嘴鹬只在滨海滩涂湿地有分布,觅

食地主要为潮间带的滩涂[26]。目前,国内外主要利

用环志等回收数据,开展勺嘴鹬的栖息地保护[27]、

种群数量[28] 和分布区系[29] 等的研究,未涉及其行

为动作的识别。因此,笔者尝试使用卷积神经网

络模型(ResNet50、ResNet101 和 ResNet152)进行

勺嘴鹬动作的自动识别研究,以期开启海南热带

地区鸻鹬类[30] 涉禽的动作识别以及其他野生鸟类

行为学自动识别的研究。

1    材料与方法

1.1    研究区域概况    儋州湾(109°02′~109°36′E,

19°33′~20°01′N)位于海南省儋州市中北部,由北

部湾伸入洋浦半岛进而形成的半封闭内湾, 面积

约为 50 km2。该区域属于季风性气候,冬季干燥、

夏季湿润,年平均降雨量约 1 426 mm,年均气温

23.1 ℃[31]。儋州湾于 1986 年被设立为市级自然保

护区,红树林面积约 133 hm2

,是黑脸琵鹭(Platalea

minor)、小青脚鹬(Tringa guttifer)、勺嘴鹬等珍稀

濒危迁徙涉禽的重要越冬地和停歇地[32]。

1.2    研究方法    

1.2.1   数据的采集与预处理 数据采集于 2020-

11-21—2021-03-20,采集时间段主要集中在 9:00-

17:30,共获得 42 份用相机拍摄的勺嘴鹬视频(佳

能 SX60HS 长焦数码相机、尼康 D500 单反相机和

尼康 Z6 微单相机,视频尺寸为 1920×1080 30p)。

将采集的数据进行预处理:1)通过查找相关文献、

咨询专家和快速浏览现有视频资料确定可以用于

识别勺嘴鹬动作的标签(表 1);2)将 42 份视频数

据解帧(每 5 秒解帧,有重复的图片只保留 1 张,再

进行人工修正),共获得 66 875 张勺嘴鹬图像 ;

3)删除勺嘴鹬与其他鸟类同框的图像和因拍摄抖

动或对焦失败形成的模糊图像,手动筛选相应标

签的图像(每 1 张图像包含 1 种标签),并在筛选结

束后创建以标签命名的文件夹,最后共获得 9 个

标签文件夹;4)使用 Grad-Cam[33] 对 3 种模型的预

测结果进行可视化处理(图 1)。图 1 中橙色部分

表示模型是基于这些区域判断出图像中的动作

类别。

1.2.2   构建数据集 由于目前没有用于识别勺嘴

鹬动作的公共数据集,因此,笔者建立了1个由猎

食、觅食、休憩、理羽、洗浴、抖羽、振翅和踱步

9 种动作标签构成的共 2 174 张图片的数据集

(表 2),该数据集按照 3∶ 1∶ 1 的比例随机划为

训练集、验证集和测试集[34]。

1.3    残差卷积神经网络和迁移学习    卷积神经

网络包含多个卷积层、池化层和全连接层[35]。卷

积层和池化层是提炼图像特征关键部分的模型,

全连接层能够在高层次特征域内把图像分类作为

主要实现的图像映射[36 − 38]。卷积神经网络也可以

被认为是由特征提取器和分类器 2 个部分组成,

具有端到端特征提取和分类的特性。在卷积神经

网络的结构中,卷积的层次更深,网络学习的能力

也就更强,那么特征图能得到的信息也会更全。

然而,随着网络层次和结构逐渐加深,网络内的计

算量也将随之增多,进而导致网络也变得更为复

杂,同时可能会导致梯度消失和网络退化等问

题[39]

,从而导致识别效果和稳定性都不理想。

残差网络(ResNet)是最近十多年以来相关领

域研究人员提出的最新关于执行计算机领域视觉

任务的一种典型的卷积神经网络,因其加入了残

差模块从而减少了随网络深度的增加而引起的梯

度消失的问题[40]

,一方面减少了参数数量,另一方

面在网络中增加了直连通道,增加了卷积神经网

络对特征的学习能力[41]。鉴于此背景,笔者使用

ResNet101[42]、 ResNet50[43] 和 ResNet152[44]

3 种 不

482 热 带 生 物 学 报 2023 年

第20页

同层数的残差卷积网络模型作为本研究的基本

网络。

因本研究数据集的图像相对较少,所以采用

残 差 网 络 迁 移 学 习 [20] 的 方 法 ,  将 前 人 训 练

ImageNet 图像数据集得到的不同深度残差网络模

型的模型参数当作勺嘴鹬图像训练 3 种网络模型

的初始化值, 然后把预训练网络内的最后一层的

全连接层输出替换为本研究的勺嘴鹬图像数据集

的类别数 9,以此为基础,再将勺嘴鹬图像识别模

型进行下一步训练(图 2)。

1.4    实验环境配置    实验中所有代码均是在

PyTorch[45] 神经网络框架下完成的。本研究选

用 的 是 PyTorch1.3.1, 框 架 环 境 为 GPU:  Tesla

V100Mem:  32  GB, 操 作 系 统 是 Linux  Cento  OS

7.2 服务器。

1.5    实验模型    

1.5.1   模型结构 本研究所用模型是以经典的

ResNet50、ResNet101 和 ResNet152 模型为基础进

行新的改善,网络结构超参数具体设置分别为损

失函数设置为交叉熵函数;优化器设置为自适应

矩估算法;学习率设置为 0.0001;训练轮数为 100;

批量为 64。

1.5.2   模型优化与评价标准 本研究采用自适应

矩估计(Adam)方法[46] 进行模型的优化。图像分

表 1    勺嘴鹬的动作分类及定义

动作标签 描 述 图 像

理羽 用喙部梳理、修饰身体不同部位羽毛的过程

猎食 狩猎食物的一种警戒状态,一般表现为不停转圈、直立伸长

脖颈等观察食物位置的一系列动作

抖羽 使羽毛微微鼓起或竖起,抖动羽毛的过程

进食 吞咽食物的一系列动作

觅食 将喙部贴在水面或深入水下寻觅食物的过程

踱步 脖子或身子略向前倾,脚抬起往前的过程

休憩 头颈后转、喙前端埋于翅下或头颈略为回缩、闭眼静止不动

的行为

洗浴 将身体浸入水中或在水体表面,通过颈部伸缩、翅膀的快速

抖动及身体摆动等动作将水遍布身体,清洗身体的过程

振翅 大幅度拍打翅膀或翅膀完全张开的过程

第 5 期 杨雪珂等: 基于残差卷积神经网络模型的勺嘴鹬动作识别 483

第21页

类评估中常用的评价指标有准确率(精度)、精确

率、召回率和 F1-score[47]

,在此基础上本研究添加

模型训练时长作为模型的评价指标。根据真实标

签和预测结果,将所有测试图像分为 4 类。总共

有 4 个基本数:真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性

(FP)和假阴性(FN)。正确预测的测试图像的数量

由 TP 和 TN 表 示 , 错 误 预 测 的 图 像 的 数 量 由

FN 和 FP 表示。准确率就是正确分类样本所占总

样本的比率,能够衡量分类器对于总样本的判断

能力[33]。精确率又称查准率,值越高说明正确分类

率越高。召回率又称查全率,值越高说明识别得

越全面。F1-score 表示的是算法的综合性能,可以

Qriginal ResNet50 ResNet101 ResNet152

图 1    Grad-CAM 热力图

注:图像中各部分对预测结果的权重,颜色越深红,表示该区域对网络的响应越大,对预测结果的贡献越大,也即该模

型对该区域的关注度越高。

表 2    动作标签数据集

动作标签 数量/张 训练集/张 验证集/张 测试集/张

理羽 463 270 90 90

猎食 229 89 30 30

抖羽 126 74 25 25

进食 69 32 11 11

觅食 407 196 66 66

踱步 191 93 31 32

休憩 171 100 34 34

洗浴 401 240 80 81

振翅 90 52 17 18

总数 2174 1 146 384 387

484 热 带 生 物 学 报 2023 年

第22页

平衡召回率和准确率的影响,其取值范围为 0~1,

值越大表示算法性能越好。以上评价标准形式化

定义如下:

准确率 =

T P+T N

T P+T N + FP+ FN

,

精确率 =

T P

T P+ FP

,

召回率 =

T P

T P+ FN

,

F1− score = 2×

Recall× Precision

Recall+ Precision

,

式中:阳性与阴性是相对的,若阳性代表觅食,阴

性代表踱步;TP 为真阳性(true positive)图像数目,

真阳性则证明这个图像在整个预测分类的结果和

标记标签中属于觅食;FP 为假阳性(false positive)

图像数目,假阳性证明此图像标记标签是觅食,但

是在预测分类结果中为踱步;TN 为真阴性(true

negative)图像数目,真阴性证明该图像标记标签为

踱步,并且对其预测的结果也属于踱步;FN(false

negative)是假阴性图像数目,假阴性是图像标记标

签踱步,但在预测的分类结果里是觅食[26]。

2    结果与分析

2.1    不同模型的损失和验证精度    随着训练轮

数的增加,每个模型的预测值与真实值之间的损

失都呈下降趋势,验证集中的准确性都呈上升趋

势(图 3)。最后,随着训练轮数增多,每个模型的

验证准确率都趋于稳定,仅存在小幅波动,这表明

网络得到了充分的训练。

2.2    不同模型的识别准确率和训练时长    从准

确率来说,3 种网络模型准确率之间的差别较小,

不同模型的验证集准确率和测试集准确率都在

95% 以上,说明模型的泛化能力良好(表 3)。模型

在每轮训练时长上都有较快的速度,时长由短到

长依次为 ResNet50、ResNet101 和 ResNet152,其

中 , ResNet50 和 ResNet152 测 试 集 准 确 率 都 是

96.90%,ResNet101 测试集准确率为 96.64%,低于

其他 2 个模型。ResNet50 训练时长是 89.78 s·轮,

ResNet152 训练时长是 101.87 s·轮,在同样准确率

的情况下 ,ResNet50 训练时长低于 ResNet152。

2.3    3 种模型的精度、召回率及 F1-score    图 4

展示了不同模型在数据集上的评价指标结果。进

食 动 作 标 签 在 ResNet101 和 ResNet152 模 型 的

视频

预处理

训练集 (60%)

+

验证集 (20%)

测试集 (20%)

训练好的模型

模型训练

最优模型

模型评估

-删除模糊、多鸟种同框的图像

-确定动作标签

图 2    残差网络数据分析流程图

0

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

损失/%

20 40 60 80 100

Trainning-ResNet50

Trainning-ResNet101

Trainning-ResNet152

Validation-ResNet50

Validation-ResNet101

Validation-ResNet152

ResNet50

ResNet101

ResNet152

0

70

75

80

85

90

95 验证准确率/%

20 40

训练轮数

60 80 100

图 3    3 种模型的损失和准确率

表 3    ResNet50、ResNet101 和 ResNet152

模型的准确率和训练时长

模型 训练集

准确率/%

验证集

准确率/%

测试集

准确率/%

训练时

长/( s·轮)

ResNet50 92.41 96.61 96.90 89.78

ResNet152 90.49 95.31 96.90 101.87

ResNet101 87.87 97.40 96.64 95.53

第 5 期 杨雪珂等: 基于残差卷积神经网络模型的勺嘴鹬动作识别 485

第23页

F1-score 值偏低于 0.90,除此之外的其他动作标签

在不同的模型的 F1-score 值都高于 0.90,表明本

研究算法的综合性能较好。在模型精度方面,除

踱步和进食 2 种动作标签的精度在 ResNet50 和

ResNet101 上低于 0.90,其余标签的精度都不低于

0.90,说明 3 种模型在识别动作标签时都有较强的

识别能力。在召回率方面,进食标签在 ResNet152

上的召回率在 0.80 以下,其余标签在不同的模型

上召回率都在 0.80 以上,且大部分高于 0.90,说明

进食动作识别得不够全面。

抖羽

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

0.90

0.95

1.00

召回率

踱步进食猎食理羽觅食休憩洗浴振翅

ResNet50 ResNet101

ResNet152

抖羽

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

0.90

0.95

1.00

精度

踱步进食猎食理羽觅食休憩洗浴振翅

ResNet50 ResNet101

ResNet152

抖羽

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

0.90

0.95

1.00 F1-score踱步进食猎食理羽觅食休憩洗浴振翅

ResNet50 ResNet101

ResNet152

图 4    3种模型的精度、召回率及 F1-score

2.4    勺嘴鹬 9 种动作标签的预测分类结果    图 5

对角线上表示在测试集中预测正确的图像数量,

其余为预测错误的数量。模型对一些动作的识别

容易存在误判现象,如 ResNet50 模型在识别猎食

和踱步时错判最多,有 4 张猎食被错判成踱步;

ResNet101 模 型 有 2 张 抖 羽 被 错 判 成 理 羽 ;

ResNet152 模型有 3 张进食被错判成觅食。ResNet50、ResNet101 和 ResNet152 模型识别错误的

图像总数分别是 12、13、20 张。

预测标签

ResNet50

真实标签

0

8

7

6

5

4

3

2

1

0

1 2 3 4 5 6 7 8

预测标签

ResNet101

0 1 2 3 4 5 6 7 8

预测标签

ResNet152

0 1 2 3 4 5 6 7 8

图 5    测试集勺嘴鹬图像识别后统计的混淆矩阵

注:0~8 分别表示抖羽、踱步、进食、猎食、理羽、觅食、休憩、洗浴和振翅 9 种动作标签。

3    讨 论

目前在家禽的动作和行为识别方面已经有了

初步研究。劳凤丹等[48] 基于人工设计的 10 种特

征利用贝叶斯分类法对单只蛋鸡的行为进行了识

别,取得了不错的结果。但文献 [48] 中蛋鸡的行

为识别是在人工设计的特征(如蛋鸡图像的质心点

坐标、轮廓面积、移动距离等)的基础上进行的,人

工设计的特征往往对领域知识依赖度高,还需要

大量的实验测试,可能只在特定的任务上才能获

得不错的效果[49]。相比而言,本研究利用卷积神经

网络实现“端到端”的方式进行勺嘴鹬动作识别,

特征提取和分类过程均由模型自动完成,使用这

种方法的门槛被大大降低。Wang 等[11] 验证了利

用深度卷积神经网络从鸟类图像中识别栖息环境

元素的可行性,最大识别率达到 95.52%,所以笔者

期望未来可以进行勺嘴鹬等稀濒危涉禽栖息地的

因素识别,进一步推进栖息地选择的研究。本研

究的数据集样本相对较少,只实现了 9 种动作识

486 热 带 生 物 学 报 2023 年

第24页

别,未实现勺嘴鹬所有可能动作的识别,期望未来

可以通过补充勺嘴鹬不同动作类别的图像进一步

完善勺嘴鹬的其他动作的识别研究。因鸻鹬类涉

禽可能存在外观、体型或行为相似的情况(勺嘴鹬

与红颈滨鹬),所以模型未来可以推广到鸻鹬类涉

禽的动作识别,进一步推动有关濒危珍稀涉禽的

保护研究。

本研究的不足主要有两个。第一,只进行勺

嘴鹬的动作研究,所以模型在识别与勺嘴鹬体型、

行为等方面差异较大的鸟类时,识别效果可能不

大理想。此外,因一些不可避免的环境因素和人

为因素,采集的视频数据主要集中在光线较好的

9:00-17:30,所以模型可能更适用于在光线良好时

间段拍摄图像的识别。本研究中踱步和进食的识

别精度低于其他动作的主要原因是数据量不够充

足,导致识别某几个标签的时候容易混淆,而且因

为静态图像识别动作的缺陷,导致踱步和进食的

识别较差,笔者会在后续工作中进行数据补充。

第二,使用的是单标签方法来标记勺嘴鹬的动作,

而在实际应用时可能会出现1张图像有多标签、

部分分类照片较少的情况,迁徙候鸟具有显著的

集群行为[50]

,此类研究往往需要识别1张图像中不

同鸟种的不同动作。如果未来通过结合目标检

测、图像分割和物种识别等技术,把一群鸟转换成

单只鸟进行识别,实现从多种鸟同框的图片中识

别出多个不同的动作并用一个框将每个动作分割

出来,进一步再通过采集更多的图像数据进行训

练,可以使训练模型在实际应用时具有更强的适

应性。

致谢:新英湾红树林保护区陈正平同志和中国热带

农业科学院橡胶研究所杨川助理研究员对本研究的野外工

作提供了大力的支持,在此深表感谢!

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488 热 带 生 物 学 报 2023 年

第26页

Action recognition of spoon-billed sandpipers (Eurynorhynchus

pygmeus) based on residual convolutional neural network model

YANG Xueke1

,   MENG Jinchao1

,   FENG Yueheng1

,   LIN Tingting1,2

,   WANG Zhaojun2

,   LIU Hui1

(1. School of Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

Abstract: With  the  widespread  application  of  image  acquisition  equipment  and  data  sharing  platform,  the

amount of bird image data has been increasing at an unprecedented speed. How to effectively deal with such a

large amount of data has become a major challenge. In recent years, convolutional neural network has shown

strong practicability and effectiveness in the application of automatic bird image processing. However, there

has been no research on automatic recognition of movements in wild birds. In view of this, a special action

image dataset of the sandpiper was established based on field images. The dataset was composed of nine action

tags  representing  the  main  behavior  patterns  of  spoon-billed  sandpipers  (Eurynorhynchus pygmeus).  At  the

same time, three residual convolutional neural network models, ResNet50, ResNetT101 and ResNet152, were

used  to  automatically  recognize  the  movements  of  the  spoon-billed  sandpipers.  The  experimental  results

showed that the three models achieved excellent results in action recognition with their accuracy rates of the

test set being 96.90% (ResNet50), 96.94%(ResNet101) and 96.90% (ResNet152), respectively. This indicates

that these three models have a rapid recognition of the movements of the spoon-billed sandpiper.

Keywords:residual convolutional neural network;bird image;movement recognition;spoon-billed sandpiper

(责任编辑:叶 静)

第 5 期 杨雪珂等: 基于残差卷积神经网络模型的勺嘴鹬动作识别 489

第27页

·生态多样性与生态文化·  DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220116

主持人:任明迅

海南东寨港红海榄种群结构

与数量动态变化特征

吕晓波1,钟才荣1,张孟文1,方赞山1,程 成1,

陈 旭1,李东海2,李剑碧2

(1. 海南省林业科学研究院/海南省红树林研究院,海口 571100; 2. 海南大学 生态与环境学院,海口 570228)

摘    要: 为了解东寨港国家级红树林保护区内红海榄(Rhizophora stylosa)种群的动态变化,以保护区内建设

的 1 hm2 的固定样地中的红海榄种群作为研究对象,对其种群的结构与数量动态变化特征进行分析。结果表

明:(1)此区域的红海榄种群径级结构为不规则的金字塔型,I~III 龄级的个体数量之和占种群个体总数的

48.84%,Ⅳ龄级后植株个体数量降低趋势明显。(2)数量动态变化指数反映出该区域的红海榄种群为增长型

的种群,但种群较为不稳定,外界干扰下种群数量增长趋势不显著。(3)红海榄种群的存活曲线属于 Deevey-

Ⅲ类型。(4)红海榄种群的静态生命表、死亡率曲线、消失率曲线以及生存分析反映出该区域的红海榄种群

的在低龄级的阶段种群的动态变化相对较为剧烈 ,发展到高龄级阶段种群的动态变化相对平稳。

(5)红海榄种群数量的时间序列分析也反映出,红海榄种群当前虽然低龄级的个体数量较多,但未来几个龄级

时间后,能发育到较高龄级的个体相对较少,未来的种群将以中高龄级的个体为主体。东寨港国家级红树林

保护区的红海榄种群为增长型种群,但其种群对外界干扰较为敏感,低龄级阶段种群动态变化较为激烈,中、

高龄级阶相对较为平稳。因此,应加强对其种群的长期监测以及灾害的防治,尤其要加强对低龄级阶段个体

的保护和人工辅助修复。

关键词: 红树林;红海榄;种群结构;种群动态变化

中图分类号: S718.5            文献标志码: A            文章编号:1674 − 7054(2023)05 − 0490 − 09

吕晓波,钟才荣,张孟文,等. 海南东寨港红海榄种群结构与数量动态变化特征 [J]. 热带生物学报,2023,

14(5):490−498. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220116

种群是指在一定的时间和空间内同一种物种

的所有个体的集合, 是物种生存、发展和进化的基

本单元, 是群落和生态系统重要的组成部分[1]。物

种种群的结构和数量的动态变化过程是种群学研

究的 2 个主要的方向[2 − 3]

, 种群的结构特征可以反

映出种群内的个体的龄级、径级、高度级的分布情

况[4 − 5]

,种群的数量动态变化过程则可以揭示种群

个体数量在时间和空间上的变化规律[6]。通过种

群的静态生命表、种群的个体存活曲线、种群的数

量动态指数、种群个体的生存函数分析和种群的

时间序列预测分析均是种群研究的常用方法[7 − 10]

,

研究种群目前的生存现状以及与环境的相互作用

程度[11 − 12]

, 还可预测种群的自然更新的能力以及

在受到外界干扰情况下的发展态势, 对物种资源

的保护、修复和利用具有重要的意义[13 − 14]。

红树林湿地是陆地向海洋过渡的区域,主要

分布在热带,并延伸至亚热带部分地区,是生产力

最高的生态系统之一[15]

,也是较早受全球气候变化

影响的生态系统之一[16]

, 尤其是在赤道附近的印度

洋、太平洋和大西洋沿岸分布的红树林。红树林

是海岸带地区的重要的生态屏障[17]

, 同时也是对全

球气候变化最敏感的生态系统之一[18]。全球气候

  收稿日期:2022 − 12 − 19    修回日期:2023 − 03 − 03

  基金项目:海南省林业科学研究院(海南省红树林研究院)基础性科研工作(KYYS-2021-04)

  第一作者:吕晓波,(1980−),男,助理研究员.研究方向:红树林保护与生态修复.E-mail:lvxbo1980@sina.cn

  通信作者:李剑碧,(1964−),男,助理实验师.研究方向:生态学.E-mail:laobi618@qq.com

第 14 卷 第 5 期 热 带 生 物 学 报 Vol. 14 No. 5

2023 年 9 月 JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY Sep. 2023

第28页

变化将显著影响到红树林的生存状况[19 − 21] 及其分

布范围[22]。随着日益增强的人为干扰和全球气候

变化的加剧,红树林正面临严重的威胁如生境破

碎化和丧失、过度开发、环境污染和外来物种入侵

等,多地分布的红树林出现逐步衰退甚至消失的

情况[22 − 26]。

红海榄(Rhizophora stylosa)为常绿灌木或小

乔木,是我国大陆沿海红树林生态恢复的优选树

种[27 − 28]。目前,有关红海榄的研究多侧重于个体

的结构、功能、生理过程、群落的林分结构、种群

的生态位、种分布格局等方面的研究[29 − 35]

,但对于

红海榄种群结构和数量动态变化特征的研究未见

报道东寨港是海南岛红树林分布较为集中的区

域,红树林种类丰富和群落发育较好,其中,红海

榄是东寨港分布较广的树种之一[36]。2022 年,海

南省红树林研究院在东寨港国家级红树林保护区

塔市村附近选择红树林发育较好的区域,建立了

一个 1 hm2 的红树林固定样地,进行红树林湿地的

长期监测。本研究以固定样地内的红海榄种群为

研究对象,利用数量生态学研究方法,开展红海榄

种群的结构与动态变化特征的分析研究,旨在为

东寨港国家级红树林保护区和海南岛红树林湿地

的保护和生态修复工程提供依据。

1    材料与方法

1.1    研究区域概况    样地设在海口市东寨港国

家 级 红 树 林 保 护 区 内 , 该 区 域 内 有 红 海 榄

(Rhizophora stylosa)、角果木(Ceriops tagal)、秋

茄(Kandelia obovata)、白骨壤(Avicennia marina)、

桐花树(Aegiceras corniculatum)、海莲(Bruguiera

sexangula)等红树植物,生长良好,保存较完整。

土壤为泥沙质和淤泥质。研究区域处于热带季风

区海洋性气候区,年平均气温介于 23.3~23.8℃,

出现过的极端高温为 38.9℃,出现过的极端低温

为 2.6℃,年平均日照量大于 2 000 lx,年平均降水

量达到 1  676.4  mm,雨季始于 5 月上旬 ,止于

10 月下旬。潮汐类型为不规律的半日潮,平均的

潮差达到 1.1 m,较适合红树林植物的生长。

1.2    样地设置与调查    2021 年 3 月在东寨港塔

市附近的红树林区域 ,沿着潮水方向设置 1 个

100 m×100   m 的 固 定 样 地 (E110°32 ′13.27861 ″ ,

N20°0′7.05713″)。按照固定样地建设方法,样地

划分为 100 个 10 m×10 m 的样方。以样地的西南

角为原点,对样地进行调查。记录固定样地内的

胸径大于 1 cm 的植株的株高、胸径、冠幅及生长

状况。

1.3    径级划分    采用生态学中径级代替龄级方

法,以胸径级确定龄级,对群落中的红海榄进行种

群年龄结构分析。本研究根据红海榄的生长特点

和 野 外 调 查 数 据 , 以 胸 径 (Diameter  at  breast

height, DBH)2  cm 为标准划分龄级 ,共划分为

10 个龄级,其中,胸径 <2 cm 的个体划分为 I 龄

级,胸径≥18 cm 的个体划分为 X 龄级(表 1)。

表 1  红海榄种群龄级划分

龄级 I II III IV V VI VII VIII IX X

胸径/cm 0<

DBH <2

2≤

DBH <4

4≤

DBH < 6

6 ≤

DBH < 8

8≤

DBH < 10

10 ≤

DBH < 12

12 ≤

DBH < 14

14 ≤

DBH <16

16 ≤

DBH <18

18≤

DBH <∞

V

pi

1.4    种群动态量化方法    通过计算种群内相邻

龄级间个体数量动态变化指数(Vn)和整个种群的

个体数量动态变化指数(Vpi),分析海南东寨港保

护区内红海榄种群各龄级间和整个种群的数量变

化动态特征[37]。由于种群个体数量必然会受到随

机的外环境的干扰,因此对整体数量动态变化指

数(Vpi)进行修正得到修正后的整体数量动态变化

指数( )。个体数量动态变化指数的公式[37]

Vn =

S n −S n+1

max(S n,S n+1)

×100% ,

Vpi =

k−1

n=1

(S n ·Vn) /

k−1

n=1

S n ,

V

pi =

∑k−1

n=1

(S n ·Vn)

k ·min(S 1,S 2,S 3 · ··,S k)·

∑k−1

n=1

S n

,

式中,Vn 为种群从 n 到 n+1 级的个体数量变化动

态指数,反映种群相邻龄级个体数量间 ( 种群整个

年龄结构) 关系,正值表示增长,负值表示衰退,零

表示稳定。Vpi 为整个种群的数量变化动态指数,

第 5 期 吕晓波等: 海南东寨港红海榄种群结构与数量动态变化特征 491

第29页

Sn 为第 n 龄级的个体数量,k 为种群最大龄级。

Pmax 为整个种群承担的随机干扰风险概率极大

值。V´pi 为种群结构动态对随机干扰的敏感性指

数,反映种群数量对未来外部干扰存在着“稀释

效应”。

1.5    静态生命表建立与生存分析的方法    本研

究根据特定时间生命表的编制方法,编制海南东

寨港保护区红海榄种群的静态生命表,通过数据

匀滑解决静态生命表绘制时,出现个体死亡率为

负的问题[37]。采用 Hett 提出的数学模型对种群存

活曲线进行检验[2]。

使用生存率函数 Sx、累计死亡率函数 Fx、死

亡密度函数 fx 和危险率函数 λx,对该区域的红海

榄种群进行生存分析[38]。

S i = S 1S 2S 3…S i

,

Fi = 1−S i

,

f(ti) =

S i−1 −S i

hi

,

λ(ti)

=

2(1−S i)

[hi(1+S i)]

,

式中:Si 为存活率,hi 为龄级宽度。

1.6    种群时间序列分析的方法    使用时间序列

分析中的一次移动平均法,对该区域的红海榄种

群各龄级个体数量的变化进行预测,其计测方法

如下:

M

(1)

t =

1

n

∑t

k=t−n+1

Xk ,

式中:n 表示需要预测的时间 (本研究为龄级时

间),t 代表龄级,Xk 为 k 龄级内的个体数量,Mt

(1) 定

义为经过未来 n 个龄级时间 t 龄级的种群个体

数量[39]。

1.7    数据的处理与分析方法    采用 Microsoft

word 2010 和 Microsoft Excel 2010 软件整理和分

析数据和绘图。

2    结果与分析

2.1    红海榄种群年龄结构分析    笔者在东寨港

固定样地内,调查到红海榄种群个体共 475 株,其

中,个体胸径最大为 15.6 cm。从图 1 可知,该区域

红海榄种群的龄级结构为不规则的金字塔类型,

III 龄级的个体数量相对较多,有 193 株,占种群个

体总数的 40.63%。I~III 龄级的个体数量之和占

种群个体总数的 48.84%,IV~V 龄级个体数量之

和占种群个体总数量的 48.43%,而 VI~X 高龄级

的个体数量之和仅占种群个体总数的 2.73%。说

明低龄级的个体数量较多,III 龄级后个体数量开

始降低,表明红海榄个体受到环境的影响,种內种

间竞争增强,个体数量减少,IV 龄级后个体数量急

剧降低阶段,可能是由于种內、种间竞争急剧或者

受到较强烈外部干扰如病虫害、台风等,引起种群

个体死亡增多。

2

37

193

155

75

7 5 1 0 0 0

50

100

150

200

250

I II III IV V VI VII VIII IX X

个体数量/株

龄级

图 1    红海榄种群龄级结构

2.2    红海榄种群的动态变化    

2.2.1   红海榄种群数量动态 从表 2 可知,红海

榄种群 V1~V2 小于 0,V3~V8 大于 0。表明红海

榄种群整体上表现为“衰退-衰退-增长-增长-增长增长-增长-增长”的变化趋势。当忽略外环境的干

扰时,种群整体的数量变化动态指数 Vpi 和 V'pi 均

大于 0,说明红海榄种群为增长型种群。但修正后

的整个种群的数量变化动态指数 V'pi 值 4.24%,趋

近于 0,对映出该区域的红海榄种群较不稳定,对

外界干扰敏感性较高,受到外界干扰时增长趋势

不明显。

表 2    红海榄种群动态变化指数

种群动态指数级

个体数量动态变化指数V(n)

Vpi V´pi Pmax 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

指数值/% −94.6 −80.8 19.7 51.6 90.7 28.6 80 100 — — 33.9 4.2 0.13

  注:“—”代表空值,由于IX和X龄级的个体数量为0,因此计算后为空值。

492 热 带 生 物 学 报 2023 年

第30页

2.2.2   静态生命表分析 从表 3 可知,红海榄不

同龄级的个体数量差异明显,I~III 龄级的个体数

量总和相对较多,表明种群有一定增长能力,但随

着龄级的增加,种群个体的标准化存活数量不断

降低。生命期望 ex 可以反映出不同龄级阶段个体

的平均生存能力,红海榄种群生命期望值呈现先

降后升再降的趋势,其中 I~III 龄级的生命期望值

逐渐降低,说明从 I 到 III 龄级各龄级的个体逐步

在经历环境的筛选,淘汰个体较多,平均生存能力

有所降低。而从 IV~VI 龄级的生命期望值逐渐

增加,说明各龄级个体经过环境的筛选后,个体的

适应性增强 ,平均生存能力有所提升。然而从

VI 龄级以后,可能是受到生境资源的限制,种內和

种间竞争加剧,以及个体进入生理衰老期等因素

的造成生命期望值随着龄级的增加逐渐下降。

表 3  红海榄种群静态生命表

龄级 径级 Ax ax lx dx qx Lx Tx lnlx ex Kx Sx

Ⅰ 0-2 2 284 1000 225 0.23 887 2 335 6.91 2.63 0.26 0.77

Ⅱ 2-4 37 220 775 225 0.29 662 1 447 6.65 2.19 0.34 0.71

Ⅲ 4-6 193 156 549 225 0.41 437 785 6.31 1.80 0.53 0.59

Ⅳ 6-8 155 92 324 225 0.70 211 349 5.78 1.65 1.19 0.30

Ⅴ 8-10 75 28 99 67 0.68 65 137 4.59 2.11 1.13 0.32

Ⅵ 10-12 7 9 32 7 0.22 28 72 3.46 2.56 0.25 0.78

Ⅶ 12-14 5 7 25 7 0.29 21 44 3.20 2.08 0.34 0.71

Ⅷ 14-16 1 5 18 7 0.40 14 23 2.87 1.63 0.51 0.60

Ⅸ 16-18 0 3 11 7 0.67 7 9 2.36 1.25 1.10 0.33

Ⅹ 18-∞ 0 1 4 - - 2 - 1.26 - - -

  注:Ax :x 龄级存活的个体数量;ax:匀滑后 x 龄级内存活的个体数量; lx: x 龄级的标准化存活个体数量; dx:从 x 到

x+ 1 龄级死亡的个体数量; qx :从 x 到 x+ 1 龄级的种群个体死亡率;Lx :从 x 到 x+1 龄级平均存活的个体数量; Tx :大于

等于 x 龄级的存活个体总数; ex:生命期望;lnlx:标准化存活数对数;Kx : 种群消失率; Sx : 种群存活率。

2.2.3   存活曲线分析 从图 2 可以看出,红海榄

种群存活曲线呈现“凹”的变化趋势。通过线性拟

合 及 验 证 , 其 存 活 曲 线 拟 合 方 程 为 y=2

708.7e−0.648x

,R

2 为 0.97,F 值为 187.965,P<0.001,这

表明该区域的红海榄种群的存活曲线较为符合

Deevey-III 型曲线,体现出红海榄种群的早期阶段

个体死亡率较大,而达到后期阶段个体死亡率趋

于平稳的变化趋势。

2.2.4   死亡率和消失率曲线分析 从图 3 可以看

出,该区域红海榄种群的个体死亡率和消失率的

变化过程比较相似,龄级增加,死亡率和消失率表

现为先增后降的变化趋势。同时结合上述种群数

量动态变化的结果可以发现,该区域的红海榄种

群数量动态变化较为不稳定。此外,死亡率和消

失率均在 IV、V 和 IX 龄级出现峰值,可以看出这

3 个龄级阶段,红海榄种群可能由于外界因素和个

体自身的因素导致的种群数量降低。

0

200

400

600

800

1 000

1 200

标准化存活数/株

I II III IV V VI VII VIII IX X

龄级

图 2    红海榄种群存活曲线

0

20

40

60

80

100

140

120

死亡率和消失率/%

I II III IV V VI VII VIII IX

龄级

死亡率

消失率

图 3    红海榄种群死亡率与消失率曲线

第 5 期 吕晓波等: 海南东寨港红海榄种群结构与数量动态变化特征 493

第31页

2.2.5   生存分析 从图 4 可以看出,随着龄级的

增加,红海榄种群的生存率 S(i)逐渐降低,而累计

死亡率 F(i)呈现逐渐上升。其中,在 II~III 龄级

间,两者有交叉点,意味着种群数量在此期间达到

平衡,之后累计死亡率超过生存率,种群开始逐渐

衰退。在 I~V 龄级阶段两者变化较为明显,这可

能是由于该区域红海榄种群的生存环境条件导致

的种群内和种群间强竞争作用造成的。在 V 龄级

以后,两者变化达到极限平稳状态,这表明种群此

时的存活压力主要是个体的生理衰老。

0

20

40

60

80

100

120

生存率

S(i和)

累计死亡率

F(i)

/%

I II III IV V VI VII VIII IX

龄级

生存率 S(i) 累计死亡率 F(i)

图 4    红海榄种群生存率和累计死亡率曲线

由图 5 可知,红海榄种群的死亡密度曲线 f

(ti )

呈现递减的变化趋势,在 I 和 II 龄级间急剧下降,

说明此期间个体数量锐减。在第 VI 龄级出现最

小值(0.001),说明红海榄种群的个体进入了生理

衰老期。红海榄种群危险率 λ( ti ) 曲线也呈现递减

的变化趋势,在 I~II 龄级间急剧降低,这反映出,

在此阶段红海榄低龄级个体的环境适应性低,面

对环境筛选,个体死亡率高,因此危险率较高,随

着龄级的增加,种群个体环境适应性逐渐增强,死

亡率降低,因此种群的危险率降低。当种群发育

到一定的阶段,个体死亡的主要威胁来源于自身

的生理寿命,因此,高龄级阶段的危险率几乎趋于

平稳的状态。

0

20

40

60

80

100

死亡密度

f

(ti和)

危险率 λ(ti)

/%

I II III IV V VI VII VIII IX

龄级

死亡密度 f

(ti)

危险率 λ(ti)

图 5    红海榄种群的死亡密度和危险率曲线

2.3    种群数量的时间序列分析    根据时间序列

分析中的一次平均推移法,对该区域红海榄种群

在未来 2、3、4、5、6、7、8、9、10 个龄级时间后的

个体数量变化进行预测。从预测的结果(表 4)可

以看出,II 和 III 龄级个体数量在经历 2~3 个龄级

时间后种群个体数量均呈现逐渐减少的趋势,表

明 II 和 III 龄级阶段虽然种群个体数量相对较多,

但可以进入高龄级阶段的个体数量却相对较少。

IV~X 高龄级的个体数量在经历 2~10 个龄级时

间的发育后,种群个体数量均呈现出先增加后减

的变化趋势,这说明 IV~X 龄级的个体具有一定

表 4    红海榄种群数量动态时间序列预测

龄级 各龄级初始个体数量/株

Mt

(1)

M2

(1) M3

(1) M4

(1) M5

(1) M6

(1) M7

(1) M8

(1) M9

(1) M10

(1)

Ⅰ 2

Ⅱ 37 20

Ⅲ 193 115 77

Ⅳ 155 174 128 97

Ⅴ 75 115 141 115 92

Ⅵ 7 41 79 108 93 78

Ⅶ 5 6 29 61 87 79 68

Ⅷ 1 3 4 22 49 73 68 59

Ⅸ 0 1 2 3 18 41 62 59 53

Ⅹ 0 0 0 2 3 15 35 55 53 48

合计 475 474 461 407 342 285 232 173 105 48

  注:Mt

(1)为经过未来n个龄级时间后各龄级的个体数量。

494 热 带 生 物 学 报 2023 年

第32页

的环境适应性,在一定的龄级时间内存活的个体

增多,达到一定的龄级时间后,由于自身原因和外

界干扰造成种群数量降低。同时从种群的总个体

数量来看,种群随着龄级时间的增加,种群数量逐

渐降低。

3    讨 论

3.1    种群年龄结构    种群的龄级结构分析可以

展现个体的发育阶段,同时也可以阐述物种自身

生物学特性与生存环境相互作用情况[40]。本研究

中红海榄种群的龄级结构呈现不规则的金字塔

型,低龄级和高龄级的个体相对较少,中龄级个体

数量则相对较多。这与胡刚等对广西北仑河口红

树林植物种群研究中桐花树种群的年龄结构较为

相似[41]。有研究表明幼龄阶段是种群发育过程中

最敏感、最脆弱的阶段[42]。种内和种间竞争以及

其他外界环境干扰均会影响植物种群的龄级结构

特征[43 − 45]。本研究红海榄种群的龄级结构的成

因,可能是由于本研究区域是以海莲为优势的红

树林群落正处于演替的中后期阶段,而红海榄则

属于演替的中前期种,因此呈现如此的种群龄级

结构特征。此外本研究发现该区域红海榄种群在

第Ⅳ龄级后,个体数量锐减,这可能由于该区域曾

暴发团水虱危害,红树林植物大量死亡造成的[46]。

其他类似的研究均认为种群幼龄阶段个体数量是

影响种群发育和恢复的重要的因素[1,6,10]。

3.2    种群动态变化    该区域红海榄种群的幼龄

阶段个体较多,意味着该种群具有较好的更新基

础,结合种群总体的数量动态变化指数 Vpi >V'pi>

0,可以认为该区域的红海榄种群属于增长型的种

群,但修正后的总体数量动态变化指数 V'pi 趋近

于 0,表明该区域的红海榄种群较为不稳定,易受

到外界干扰,种群个体数量增长趋势不显著。宁

秋云等[47] 在研究广西珍珠湾红树种群结构与动态

时也得出类似的结果。由此可以看出,种群数量

动态变化指数可以量化的反映种群各龄级阶段个

体数量的变化趋势,也能反映种群数量对未来外

部干扰存在着“稀释效应”。

种群的静态生命表、存活率、死亡率和消失率

不仅可以体现种群的发育状况,还能反映物种与

其他物种和生存环境间的相互关系[37,48]。诸多研

究者均认为,种群个体的适应能力、生存资源制约

的种內和种间竞争加剧,以及个体自身的生理衰

老等因素均会导致种群生命期望值降低[49]。本研

究发现,该区域红海榄种群的生命期望值呈现先

降后升再降的趋势,分别在 I 和 VI 龄级出现峰值,

低龄级阶段可能是由于个体环境适应力差造成的

生命期望的降低,而高龄级的阶段可能是由于生

存空间的资源限制引起的种內和种间竞争加剧的

结果,较高龄级也可能是由于个体进入生理衰老

期导致的生命期望值的降低。胡刚等[41] 对广西北

仑河口和宁秋云等[47] 对广西珍珠湾红树种群的研

究均表明,其研究区内不同的红树植物种群的声

明期望也各不相同。由此可以看出,不同物种对

环境的适应能力的差异,在种群发育过程中生命

期望也会有较大的差异。

存活曲线、生存分析函数能够较为直观地反

映种群增长与衰退的动态变化过程[50]。本研究发

现,该区域的红海榄种群存活曲线呈现“凹”的变

化趋势,符合 Deevey-III 型曲线类型,存活曲线为

y=2708.7e−0.648x。早期阶段种群的死亡率较大,

后期个体死亡率趋于平稳的变化趋势。研究区内

不同的红树植物种群的存活曲线类型均有所差

异[41,47]。这就意味着物种及生境条件差异均会影

响种群的发育过程。生存分析函数也反映出,该

区域的红海榄种群在 II 和 III 龄级间,种群个体的

生存率曲线和累计死亡率曲线有交叉,意味着种

群在该阶段达到平衡,在此之后累计死亡率超过

了生存率,种群逐渐衰退。

3.3    种群的时间序列分析    时间序列分析是统

计学中的一个重要的分支,其内容非常丰富,在预

报分析、林业生产的树木生长、病虫害预测等领域

得到广泛应用[51 − 52]。近年来,被应用到种群研究

中进行种群数量的变化预测分析[9,12,37]。本研究通

过对红海榄种群数量的时间序列分析发现 ,第

II 和 III 龄级个体数量在经历 2~3 个龄级时间后

种群数量均呈现逐渐下降的趋势 ,这说明 II 和

III 低龄级阶段虽然个体数量较多,但能进入较高

的龄级阶段的个体很少。第 IV~X 龄级阶段的个

体在历经 2~10 个龄级时间发育,种群个体数量

先增后降,这说明 IV~X 龄级的个体具有一定的

环境适应性,在一定的龄级时间内存活的个体增

多,达到一定的龄级时间后,由于自身原因和外界

干扰造成种群数量降低。

第 5 期 吕晓波等: 海南东寨港红海榄种群结构与数量动态变化特征 495

第33页

从海南东寨港红树林固定样地的红海榄种群

的结构及数量动态变化分析结果来看,此区域的

红海榄种群为增长型种群,但种群相对不稳定,受

到外界干扰后种群个体数量的增长趋势放缓。低

龄级的阶段种群的动态变化相对较为剧烈,发展

到高龄级阶段种群的动态变化相对平稳。时间序

列分析也反映出,虽然低龄级的个体数量较多,经

历几个龄级时间后,能发育到较高龄级的个体相

对较少,未来的种群将以中高龄级的个体为主

体。因此,对于东寨港国家级红树林保护区的红

海榄种群应加强长期监测和灾害防治,尤其是加

强对低龄级个体的保护和修复。

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第 5 期 吕晓波等: 海南东寨港红海榄种群结构与数量动态变化特征 497

第35页

Population structure and dynamics of Rhizophora stylosa in

Dongzhaigang National Mangrove Reserve, Hainan

LYU Xiaobo1

,   ZHONG Cairong1

,   ZHANG Mengwen1

,   FANG Zanshan1

,  

CHENG Cheng1

,   CHEN Xu1

,   LI Donghai2

,   LI Jianbi2

(1. Hainan Academy of Forestry /Hainan Academy of Mangroves, Haikou, Hainan 571100, China;

2. College of Ecology and Environment, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China)

Abstract:It is of great practical significance to carry out relevant research on mangrove plant population to

understand the population structure and dynamics of mangroves at the present stage for improving mangrove

conservation and ecological restoration. A survey of Rhizophora stylosa population in permanent sample plots

covering 1 hm2

in Dongzhaigan National Mangrove Reserve, Haikou, Hainan Province was made to analyze the

population structure and dynamics of R. stylosa. The analysis showed that the stem diameter structure of the R.

stylosa population in these plots was of irregular pyramid type, with the total number of individuals in age class

I  to  III  accounting  for  48.84%  of  the  total  number  of  individuals  in  the  population,  and  the  number  of

individuals in age class Ⅳ being significantly low. The population dynamic change index suggested that the R.

stylosa population in this mangrove reserve is expanding, but not stable, and not significantly under external

disturbance.  The  population  had  a  Deevey  type  II  survivorship  curve.  The  static  life  table,  mortality  curve,

disappearance  rate  curve  and  survivorship  analysis  of  the R. stylosa population  showed  that  the  population

dynamics in this mangrove reserve was relatively drastic at the younger stage, and relatively stable when the

population  developed  into  the  older  stage.  The  time  series  analysis  of  the R. stylosa population  reveals  that

although there are more individuals at the lower age level in the current population, relatively few individuals

will develop into the older age level after several age levels in the future, and that the future population will

consist of individuals mainly at the middle and older age levels. The population of R. stylosa in Dongzhaigang

National Mangrove Reserve is expanding, but is sensitive to external disturbance. The dynamic changes of the

population are more intense in the lower age stage, and relatively stable in the middle and old stages. Therefore,

the  long-term  monitoring  and  disaster  prevention  of  the  population  should  be  strengthened,  especially  the

protection and assisted restoration of the individuals at the younger stage.

Keywords:mangrove;Rhizophora stylosa;population structure;population dynamics

(责任编辑:潘学峰)

498 热 带 生 物 学 报 2023 年

第36页

·植物保护·  DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220009

主持人:缪卫国

木薯细菌性萎蔫病菌 2 个候选抗铜

基因簇的克隆和分析

徐春华1,2,李超萍1,时 涛1,王国芬1,蔡吉苗1,李博勋1,黄贵修1

(1. 中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所/农业农村部 热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省

热带农业有害生物监测与控制重点实验室,海口 571101; 2. 中国热带农业科学院 热带生物技术研究所,

海口 571101)

摘    要: 为对木薯细菌性萎蔫病菌 2 个候选抗铜基因簇的功能进行验证和对病原菌抗铜机理进行分析,在进

一步评价不同来源菌株抗铜性水平的基础上,开展 2 个基因簇的克隆工作。结果表明,来自国内及密克罗尼

西亚、马来西亚等国家的供试菌株对铜离子同样具有较高水平的抗性,不同国家的代表性菌株均编码有

copTAB 和 XmeRSA 两个抗铜基因簇。不同菌株的 2 个基因簇具有高度同源性,分析其除参与抗铜代谢外,

可能还和致病等其他保守功能相关。

关键词: 木薯细菌性萎蔫病;抗铜基因簇;copTAB;XmeRSA

中图分类号: S435.33            文献标志码: A            文章编号:1674 − 7054(2023)05 − 0499 − 07

徐春华,李超萍,时涛,等. 木薯细菌性萎蔫病菌 2 个候选抗铜基因簇的克隆和分析 [J]. 热带生物学报,2023,

14(5):499−505. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220009

木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科木薯

属灌木状多年生作物,是和马铃薯、甘薯并称的世

界三大薯类作物之一,有近五千年的栽培史[1]

,广

泛栽种于热带和亚热带地区的 100 多个国家和地

区[2]。1820 年前后,木薯首次传入我国广东地区,

目前种植范围已遍及华南地区。木薯在我国主要

用作工业原料,可生产 2 000 多种产品[3]

,相关产业

在当地农业经济中占有重要地位。自 2005 年以

来,我国一直是世界上最大的木薯进口国[4]。由地

毯 草 黄 单 胞 木 薯 萎 蔫 致 病 变 种 (Xanthomonas

axonopodis pv. manihotis,简称 Xam)侵染引起的

细菌性萎蔫病,也称细菌性枯萎病或细菌性疫病,

是世界木薯种植中的重要病害。病原菌从气孔或

伤口侵入并在附近细胞的间隙内增殖,通过维管

束进行系统性扩散。病原菌主要危害叶片和茎

秆,能够产生叶片角斑、萎蔫、枯萎、提前脱落及

幼苗萎蔫、枝条回枯、茎干溃疡、维管束坏死等症

状。植株受害后长势变弱、严重时死亡,重病田块

产量损失可达一半以上。1963 年,该病首次在我

国台湾地区发生[5]

,1980 年在我国海南省发生,随

后扩散到广东、广西等地区[6]。李超萍等[7] 的调查

表明,该病已在国内木薯主栽区普遍发生,是当前

危害我国木薯最严重的病害。

铜基杀菌剂是作物细菌性病害防控中的常用

药剂,也是我国木薯细菌性萎蔫病防控中常见的

推荐药剂[8]。前期研究发现国内外代表性菌株对

铜离子和氢氧化铜、噻菌铜等铜基杀菌剂均具有

较高水平的抗性,而国外部分已测序的菌株中均

编码有 copTAB 和 XmeRSA 两个候选的抗铜基因

簇[9]

,但国内及其他地区的 Xam 菌株是否具有抗铜

  收稿日期:2022 − 03 − 21    修回日期:2023 − 02 − 20

  基金项目:海南省自然科学基金(2019RC274);国家现代木薯产业技术体系病害防控岗项目(CARS-11-HNHGX);中

国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(1630042017003);农作物病虫鼠害疫情综合防控项目

(18210019)

  第一作者:徐春华(1991−),男,硕士. 研究方向:植物保护. E-mail:407391999@qq.com

  通信作者:黄贵修(1968−),男,研究员. 研究方向:植物病理学. E-mail:hgxiu@vip.163.com

第 14 卷 第 5 期 热 带 生 物 学 报 Vol. 14 No. 5

2023 年 9 月 JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY Sep. 2023

第37页

性并携带这 2 个抗铜基因簇尚缺少研究。因此,

本研究在继续收集相关菌株并进行抗铜性评价的

基础上,根据基因序列特征设计引物,通过 PCR 扩

增进行这 2 个基因簇的克隆和序列分析研究,为

进一步开展相关基因的功能验证和病原菌抗铜机

理分析提供依据。

1    材料与方法

1.1    材料    (1)菌株:供试的 39 个 Xam 菌株均由

中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提

供,菌株编号、分离所用样品采集时间和地点见

表 1。(2)培养基和试剂:Xam 菌株的活化和培养

均采用 YGP 培养基;大肠杆菌的培养采用 LB 培

养基(参照方中达[10] 的方法制备)。DNA 片段胶

回收试剂盒和 pMD18-T 载体购买自宝生物工程

(大连)有限公司;Taq 酶和 dNTP 购买自天根生化

科技(北京)有限公司 ;所用引物对(Cop1: GTGCTGCATCGCCTGCTC 和 Cop2:TCAAAACCACACGCGTACAC;Xme1:ATCAGTCGGCCTTGGGC 和 Xme2: TCACGGCTCAAACCGATACC)由

北京六合华大基因科技股份有限公司合成;大肠

杆菌 T1 感受态细胞购自北京全式金生物技术有

限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2    不同来源 Xam 病菌抗铜性评价    采用含毒

介质法中的最低抑制浓度法[11] 进行,参照慕立

义[12] 的方法进行结果的检查及计算。

1.3    候选抗铜基因簇的克隆和分析    各病原菌

菌株活化、培养后收集菌体,用 SDS 法提取基因

组 DNA[13]。PCR 反应体系为:10×PCR 缓冲液 2.5

μL、10 mmol·L−1 dNTP 1 μL、10 μmol·L−1 各引物

溶 液 1  μL、 40% 甘 油 3.75  μL、 20%DMSO  3.75

μL、DNA 模板 50~100 ng、Taq DNA 聚合酶 1.0

U,加无菌水至 25 μL。PCR 循环参数为:94℃ 预变性

3 min;94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 2 min,35 个循

环;最后 72℃ 延伸 10 min。扩增产物用 l.0 % 琼

脂糖凝胶电泳检测。参照 DNA 片段胶回收试剂

盒和 pMD18-T 载体试剂盒说明书进行扩增产物

的回收、连接和克隆,筛选阳性克隆后,各样品随

机挑选 3 个克隆送北京六合华大基因科技股份有

限公司进行序列测定,确认序列后在 http://www.ncbi.

nlm.nih.gov/BLAST 上进行比对。和近源菌株这

2 个 基 因 簇 的 序 列 进 行 聚 类 分 析 , 用 MEGA

version 4.0 中的 NJ(Neighbor-Joining)方法生成系

统树 ,用 Bootstrap 对系统树进行检验 ,1 000 次

重复。

2    结果与分析

2.1    Xam 病菌抗铜性评价    完成了 39 个菌株的

抗铜性评价,结果表明,硫酸铜对各菌株的抑菌最

低有效浓度在 1.25~1.55 mmol·L−1 之间。来自哥

伦比亚的菌株 Xam1197 抗铜能力最强 ,为 1.55

mmol·L−1, 来 自 江 西 的 XamJX08, 广 西 的 XamGX44、XamGX45、XamGX46、XamGX51、XamGX52、XamGX53、XamGX68 和 XamGX70,来自广

东的 XamGD54、XamGD55,来自海南的 XamHN57,来自柬埔寨的 XamKHM05 和马来西亚 XamML1825 的抗铜性较差,均为 1.25 mmol·L−1,其他

菌株的抗铜性在 1.30~1.45 mmol·L−1 之间(表 1)。

2.2    候选抗铜基因簇的克隆和初步分析    根据

2 个候选基因簇的序列特征,分别设计了 Cop1、

Cop2 和 Xme1、Xme2 两对引物。提取各菌株基

因组 DNA 后,分别进行 PCR 扩增,各菌株用 2 个

引物对均能获得大小约 3.4 kb 的扩增产物。随机

选择国内外 17 个代表性菌株(XamJX02、XamJX08、XamGX46、XamGX69、XamGX70、XamGD26、 XamGD54、 XamHN16、 XamHN57、 XamMK1823、 XamKHM04、 XamKHM05、 XamMLXY1825、Xam1197、Xam1198、XamUG1 和 XamUG2)

的扩增产物,纯化回收、克隆后测序并进行同源基

因的比较。

所有菌株均编码有和 XamGX11 完全相同的

CopTAB 基 因 簇 , 该 基 因 簇 由 CopT、 CopA 和

CopB 等编码方向一致的 3 个基因组成,3 个基因

之间的非编码区长度分别为 90 nt 和 454 nt。这些

菌株中,仅有 XamGD26 和其他菌株在 copA 编码

区的第 964 个 nt 为“A”,而其他菌株为“C”,对应

的氨基酸为异亮氨酸,其他菌株为缬氨酸。以其

他菌株共有的基因序列进行了初步分析,CopT 编

码区全长 425 nt,和多个黄单胞菌的预测 CopL 家

族金属结合调节基因(或称铜转运蛋白)仅有 2

个 碱 基 的 差 异 , 同 源 性 最 高 为 99%(登 录 号

CP012063.1、CP012060.1 等),该基因编码 139 个

aa,和番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)菌 株 7882 的 预 测 蛋 白 序 列

500 热 带 生 物 学 报 2023 年

第38页

(WP_017157235.1)完全一致[14]。CopA 全长 1806

nt,和黄单胞菌的预测多铜氧化酶基因同源性最

高,为 99%(CP012063.1、CP012060.1 等),有 21 个

碱基的差异,该基因编码 601 个 aa,和菜豆黄单胞

菌 (Xanthomonas phaseoli)预 测 蛋 白 序 列 (WP_

017157234)一致[15]。CopB 全长 654 nt,和地毯黄

单胞万年青致病变种(Xanthomonas axonopodis

pv.dieffenbachiae)菌株 LMG 695 预测的抗铜相关

基因(CP014347.1)仅有 16 个碱基的差异,同源性

为 99%,编码 369 个 aa,和菜豆黄单胞菌预测蛋白

序列(WP_017157233)一致。

和 CopTAB 基因簇相同,所有菌株同样编码

表 1    供试菌株及其来源

序号 菌株 病样采集时间 病样采集地点 重复次数 抑菌最低有效浓度/(mmol·L−1)

1 XamJX02 2018.10 江西省抚州市东乡区 3 1.45

2 XamJX08 2020.08 江西省抚州东乡区圩上桥镇 3 1.25

3 XamJX10 2020.05 江西省抚州东乡区 4 1.30

4 XamGX09 2019.09 广西壮族自治区桂平市 4 1.30

5 XamGX39 2017.11 广西壮族自治区合浦县 3 1.40

6 XamGX42 2017.10 广西壮族自治区桂平市石龙镇 3 1.35

7 XamGX43 2018.09 广西壮族自治区南宁市 5 1.45

8 XamGX44 2019.07 广西壮族自治区隆安县那桐镇大藤村 4 1.25

9 XamGX45 2019.07 广西壮族自治区北海市合浦县石湾镇 3 1.25

10 XamGX46 2019.07 广西壮族自治区南宁市武鸣区里建镇 3 1.25

11 XamGX47 2017.11 广西壮族自治区合浦县 3 1.40

12 XamGX48 2017.11 广西壮族自治区合浦县 3 1.40

13 XamGX49 2017.11 广西壮族自治区南宁市武鸣区 3 1.40

14 XamGX50 2018.11 广西壮族自治区合浦县 4 1.35

15 XamGX51 2019.09 广西壮族自治区桂平市 3 1.25

16 XamGX52 2019.08 广西壮族自治区隆安县 3 1.25

17 XamGX53 2019.09 广西壮族自治区隆安县 3 1.25

18 XamGX68 2019.10 广西壮族自治区平南县 4 1.25

19 XamGX69 2020.07 广西壮族自治区平南县武林镇安塘村 3 1.30

20 XamGX70 2020.07 广西壮族自治区桂平市石龙镇黄塘村 3 1.25

21 XamGD25 2017.04 广东省云浮市 3 1.35

22 XamGD26 2017.09 广东省遂溪县乐民镇 3 1.30

23 XamGD54 2018.09 广东省广州市花都区 4 1.25

24 XamGD55 2019.09 广东省开平市苍城镇 3 1.25

25 XamHN16 2017.09 海南省澄迈县美亭镇美玉村 3 1.30

26 XamHN17 2017.09 海南省儋州市大成镇 4 1.35

27 XamHN54 2018.07 海南省儋州市新盈农场 3 1.35

28 XamHN56 2018.10 海南省儋州市大成镇 3 1.35

29 XamHN57 2019.07 海南省儋州市 4 1.25

30 XamHN58 2019.07 海南省澄迈县美亭镇 3 1.35

31 XamMK1822 2018.08 密克罗尼西亚 3 1.45

32 XamMK1823 2018.08 密克罗尼西亚 4 1.55

33 XamKHM04 2019.09 柬埔寨桔井省 3 1.35

34 XamKHM05 2019.09 柬埔寨上丁省 3 1.25

35 XamML1825 2018.12 马来西亚沙巴市 3 1.25

36 Xam1197 2013.12 哥伦比亚 3 1.65

37 Xam1198 2013.12 哥伦比亚 3 1.35

38 XamUG1 2014.12 乌干达基里扬东戈区 3 1.35

39 XamUG2 2015.02 乌干达马辛迪区 3 1.45

第 5 期 徐春华等: 木薯细菌性萎蔫病菌 2 个候选抗铜基因簇的克隆和分析 501

第39页

有 XmeRSA 基因簇,其中 XmeR 和 XmeS 位于染色

体负链上 ,两者编码区有 4 个碱基的重叠 ,而

XmeA 位于正链上,和另外 2 个基因编码区方向相

反 并 有 161  nt 的 间 隔 区 。 这 些 菌 株 中 , XamGX69 和 XamGD54 与其他菌株均有 1nt 的序列差

异。XamGX69 在 XmeS 编码区的第 1 015 个 nt 为

“A”,而其他菌株为“C”,对应的氨基酸为苏氨酸,

其他菌株为丙氨酸。XamGD54 在 XmeA 编码区

的第 1 141 个 nt 为“C”,而其他菌株为“G”,对应

的氨基酸为天冬氨酸,其他菌株为组氨酸。以其

他菌株共有的基因序列进行了分析,XmeR 编码区

全长 684 nt,和多个黄单胞菌预测的 DNA 结合转

录调节因子 BaeR 基因(CP012063.1、CP012060.1、

CP012057.1 等)同源性最高 ,为 99%,仅有 6 个

nt 的差异,该基因编码 227 个 aa,和菜豆黄单胞菌

等病原菌预测蛋白序列(WP_046833221、 WP_

017157623)一致[16]。XmeS 编码区全长 1 380 nt,和

黄单胞菌预测的组氨酸激酶感受分泌调节基因

BaeS 同 源 性 为 99%, 有 12 个 nt 的 差 异 , 编 码

459 个 aa,和菜豆黄单胞菌预测蛋白序列(WP_

017157622)完全相同。XmeA 编码区全长 1 224

nt,和多个黄单胞菌预测的外排 RND(resistancenodulation-cell-division,简称 RND,耐药结节细胞

分化)转运蛋白亚基基因(CP012063.1、CP012060.1、

CP012057.1 等 )有 24 个 nt 的 差 异 , 同 源 性 为

99%,编码 407aa,和菜豆黄单胞菌预测基因蛋白序

列(WP_017157621)完全一致。

2.3    候 选 抗 铜 基 因 簇 的 系 统 发 育 分 析    在

NCBI 数据库中检索和下载近源黄单胞病原菌及

其他病原菌中的 copTAB 和 XmeRSA 同源基因簇

(表 2),构建 NJ 系统进化树,分析其进化关系,结

果表明,所获 17 个木薯细菌性萎蔫病菌菌株的

表 2    近源黄单胞病原菌及其他病原菌的抗铜基因簇

病原菌(简写) 菌株名称 序列登录号 基因(基因簇)组成

Agrobacterium(Agr)

CFBP

6623 LT009725.1 1个预测的铜输出P型ATP酶基因

Pseudomonas syringae pv.

Syringae(Pseu)

DC3000 KY362372.1 由copS、copR、copD、copC、copB和copA等基因组成

Xanthomonas citri subsp.

citri(Xcc)

A44 HM362782

由copL、copA、copB、copM、1个转座酶基因、copG、1个预测蛋

白、copC、copD、copF等基因组成[17]

Xanthomonas citri pv.

citri(Xcc)

LH276 NZ_CP018854.1 由copL、copA和copB等基因组成

Xanthomonas campestris pv.

juglandis(Xcj)

C5 L19222.1 由4个预测基因组成[18]

Xanthomonas axonopodis pv.

citri(Xac)

306 AE008923.1 由copL、copA前体和copB等基因组成[19]

Xanthomonas axonopodis pv.

vesicatoria(Xav)

7882 AY536748 由copL、copA、copB、copM、copG、copF等基因组成[14]

Xanthomonas citri pv.

punicae(Xcp)

LMG7504 CP030166.1 由copL、copA和copB等基因组成

Xanthomonas fuscans subsp.

fuscans(Xff)

ISO118C5 CP012051 由copL、copA和copB等基因组成

Xanthomonas phaseoli pv.

phaseoli (Xpp)

PR1 NZ_CP029277.1 由copL、copA和copB等基因组成

Bacillus

methylotrophicus(Baci)

B25 LN999829.1

由BaeM、BaeN、BaeR和BaeS等4个预测的外排RND转运相关基

因组成

Xanthomonas citri pv.

citri(Xcc)

29-1 CP023661.1 由BaeS及另外4个外排RND转运相关基因组成

Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria(Xcv)

85-10 CP017190.1 1个预测的多药运输蛋白基因

Xanthomonas citri pv.

mangiferaeindicae(Xcm)

GXG07 CP073209.1 由BaeR、BaeS、smeA和1个预测的多药运输蛋白基因组成

Erwinia tasmaniensis(Erw t) ET1/99 CU468135.1 由BaeS和BaeR等2个基因组成[19]

Xanthomonas axonopodis pv.

phaseoli(Xap)

ISO98C12 CP012057.1 由预测的1个RND转运蛋白和2个多药运输蛋白基因组成

Xanthomonas perforans(Xp) 91-118 CP019725.1

由预测的1个RND转运蛋白、1个短链脱氢酶和1个预测的多药运

输渗透酶亚基组成[20]

Xanthomonas phaseoli pv.

phaseoli(Xpp)

Xcp25 CP029284.1

由预测的1个运输蛋白、1个多药外排RND转运体渗透酶亚基、

1个外排RND转运蛋白细胞质适应亚基和BaeS组成

502 热 带 生 物 学 报 2023 年

第40页

copTAB 基因簇聚为 1 个分枝,和菜豆黄单胞菜豆

变 种 (Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli)菌 株

PR1 同源基因的亲缘关系最近。柑橘溃疡病菌

(Xanthomonas axonopodis pv. citri)菌株 306、柠檬

黄 单 胞 病 柠 檬 致 病 变 种 (Xanthomonas citri pv.

citri)菌 株 LH276、 柠 檬 黄 单 胞 菌 (Xanthomonas

citri pv. punicae)菌株 LMG7504 和菜豆普通细菌

性疫病病菌(Xanthomonas fuscans subsp. fuscans)

菌株 ISO118C5 等聚成 1 个分枝,和木薯细菌性萎

蔫病菌菌株有很高的同源性。细菌性叶斑病菌

(Xanthomonas axonopodispv. vesicatoria)菌株7882、

柠檬黄单胞病菌(Xanthomonas citri subsp. citri)菌

株 A44 和 野 油 菜 黄 单 胞 菌 胡 桃 致 病 变 种

(Xanthomonas campestris pv. juglandis)菌株 C5 聚

为 1 个分枝 ,同源性也较高。农杆菌(Agrobacterium)菌株 CFBP 6623、丁香假单胞菌丁香致病

变 种 (Pseudomonas syringae pv. syringae)菌 株

DC3000 和木薯细菌性萎蔫病菌菌株的同源性最

低(图 1)。

Agr_CFBP6623

Xac_306

Xcc_LH276

Xcp_LMG7504

Xff_ISO118C5

XamGD26

XamJX08

Xpp_PR1

Xav_7882

Xcc_A44

Xcj_C5

Pseu_DC3000

100%

100%

99%

99%

97%

94%

94%

74%

61%

34%

28%

100% 80% 60% 40% 20%

图 1    供试菌株的 copTAB 基因簇聚类分析

XamJX08 代表相同的 16 个序列。

各木薯细菌性萎蔫病菌菌株的 XmeRSA 基因

簇同样聚为 1 个分枝,菜豆黄单胞菜豆变种菌株

Xcp25 同源基因的相似性最高。地毯草黄单胞菌

菜 豆 致 病 菌 变 种 (Xanthomonas axonopodis pv.

phaseoli)菌株 ISO98C12 和野油菜黄单胞菌辣椒

致病变种(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)

菌株 85-10 聚为 1 个分枝,同源性也较高。柠檬黄

单胞病菌菌株 29-1、柠檬黄单胞病杧果致病变种

(Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae)GXG07

和 塔斯曼尼亚欧文氏菌(Erwinia tasmaniensis)菌

株 ET1/99 亲缘关系较近,聚为 1 个分枝,和木薯

细菌性萎蔫病菌亲缘关系较远。穿孔黄单胞

(Xanthomonas perforans)菌株 91-118 和甲基营养

型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)菌株 B25

与木薯细菌性萎蔫病菌亲缘关系最远(图 2)。

Baci_B25

Erw_t_ET199

Xcc_29-1

Xcm_GXG07

XamGD54

XamJX08

XamGX69

Xpp_Xcp25

Xap_ISO98C12

Xcv_85-10

Xp_91-118

100%

100%

99%

99%

96%

57%

36%

28%

26%

15%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

图 2    供试菌株的 XmeRSA 基因簇聚类分析

XamJX08 代表相同的 15 个序列。

3    讨 论

研究结果表明,来自国内不同种植区以及密

克罗尼西亚、马来西亚、乌干达、哥伦比亚等不同

国家的木薯细菌性萎蔫病菌均对铜离子具有较高

的抗性。分子克隆结果表明,所有供试菌株均携

带有 copTAB 和 XmeRSA 两个高度保守的抗铜基

因簇,其和黄单胞及其他常见病原菌的抗铜相关

基因也有较高的同源性,相关基因在病原菌抗铜

反应及其他方面的作用机制,将是下一步的研究

重点。

不同病原细菌之间的抗铜基因具有保守性,

敏感性菌株常通过结合转移获得相关基因并产生

抗铜性[21]。国外研究结果表明,随着铜基杀菌剂使

第 5 期 徐春华等: 木薯细菌性萎蔫病菌 2 个候选抗铜基因簇的克隆和分析 503

第41页

用,危害番茄和柑橘的黄单胞病菌中,抗铜菌株的

数量和比例也在不断增加[22 − 23]。国内也有研究结

果表明,随着铜基杀菌剂的使用,危害核桃的细菌

性疫病病原菌(Xanthomonas arboricola pv. juglandis)菌株种群中出现抗铜能力不同的抗铜性菌

株[24]

;台湾地区的细菌性疮痂病菌(Xanthomonas

euvesicatoria)和 柑 橘 溃 疡 病 菌 也 都 具 有 抗 铜

性[25]。本研究结果表明,国内外代表性菌株均具备

抗铜性,分析菌株之间可能存在广泛的抗铜相关

基因转移现象。

除抗铜外,copTAB 基因簇还参与黄单胞菌的

其 他 功 能 。 例 如 番 茄 疮 痂 病 菌 (Xanthomonas

gardneri)菌株 Xv10 的 copB 基因同时控制着抗铜

性 和 侵 染 番 茄 的 能 力 [26]

, 而 水 稻 白 叶 枯 病 菌

(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)菌 株 PXO99 的

copAB 上产生 6 个氨基酸突变,导致其对铜离子敏

感而且降低了对水稻的侵染能力[27]。笔者团队在

国内木薯主栽区及柬埔寨、哥伦比亚、乌干达、密

克罗尼西亚、马来西亚等地区收集病原菌,发现所

有菌株均具有较高的抗铜性。除国内广西、广东

等部分重病区之外,其他国家和地区并无使用铜

基杀菌剂的记录,分析这 2 个基因簇可能和病原

菌侵染寄主、适应环境等方面功能相关。

前人研究结果表明,抗铜性黄单胞病菌对铜

离 子 的 抗 性 水 平 通 常 在 0.6~ 1.2  mmol·L−1 之

间[24]

,本研究结果表明木薯细菌性萎蔫病菌的抗性

水平在 1.25~1.55 mmol·L−1,整体上其抗铜能力高

于前人报道的其他菌株。copTAB 基因簇分别编码

铜转运蛋白 、多铜氧化酶和抗铜相关基因 ,而

XmeRSA 基因簇编码 DNA 结合转录调节因子、组

氨酸激酶感受分泌调节因子和外排 RND 转运蛋

白亚基。细菌的抗铜作用包括 RND 等基因家族

的外排作用,阳离子扩散(CDF)基因家族的过滤作

用,P 型 ATP 酶的调控作用等不同层次的作用机

制,包括铜离子的吸附沉积、隔离、修饰及向外转

运等。木薯细菌性萎蔫病菌的抗铜能力相对较

高,可能和该病菌同时具备 copTAB 基因簇的铜离

子转运功能和 XmeRSA 基因簇的外排作用相关。

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Cloning and analysis of copTAB and XmeRSA gene clusters from

Xanthomonas axonopodis pv. manihotis

XU Chunhua1,2

,   LI Chaoping1

,   SHI Tao1

,   WANG Guofen1

,   CAI Jimiao1

,   LI Boxun1

,   HUANG Guixiu1

(1. Environment and Plant Protection Institute, CATAS; Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops, Ministry of Agriculture and Rural

Affairs, P.R.China; Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests, Haikou 571101, China; 2. Institute of Tropical

Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China)

Abstract:Cassava bacterial blight caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis is one of the important

diseases in the world, and it is also the most serious disease in the cassava plantations of China. Some strains in

other  countries  with  their  whole  genomes  being  sequenced  were  found  to  encode  two  candidate  copper

resistance gene clusters, copTAB and XmeRSA, and part of these strains were higher in resistance to copper ion.

An attempt was made to clone copper resistance gene clusters of more strains from different other countries and

analyze  their  copper  resistance  level.  The  results  showed  all  the  tested  strains  from  China,  Micronesia,

Malaysia and other countries were also higher in resistance to copper ion. All the representative strains from

these  countries  also  encoded  the copTAB and XmeRSA gene  clusters.  The  two  gene  clusters  from  these

countries were highly homologous, and they were not only involved in copper-resistance metabolism, but might

also be related to other conservative functions such as pathogenicity.

Keywords:c assava bacterial blight;copper-resistant gene clusters;copTAB;XmeRSA

(责任编辑:钟云芳)

第 5 期 徐春华等: 木薯细菌性萎蔫病菌 2 个候选抗铜基因簇的克隆和分析 505

第43页

·植物保护·  DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220074

主持人:缪卫国

启动子 WY172 和 WY195 在

暹罗炭疽菌中的活性研究

董林朋,殷金瑶,赵文渊,林春花,刘文波,缪卫国,李 潇

(海南大学 植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室,海口 570228)

摘    要: 为了探究来自橡胶树白粉菌(Erysiphe quercicola)的 WY172 与 WY195 启动子在真菌内的功能,以

pJNARG 载体为骨架 ,分别构建 WY172 与 WY195 和绿色荧光蛋白( GFP )基因连接的重组表达载体

(WY172-GFP 和 WY195-GFP 载体)。通过原生质体转化法将重组载体导入侵染橡胶树的暹罗炭疽菌

(Colletotrichum siamense)内。荧光显微检测结果表明 WY172 与 WY195 均可驱动 GFP 基因的表达,具有稳

定的启动子活性。在暹罗炭疽菌侵染橡胶叶片不同进程中均可稳定驱动 GFP 表达;在不同环境条件下测定

GFP 表达量,发现长光照条件下可提高 WY172 启动子驱动 GFP 的活性,并且 23℃ 低温处理和光处理可提

高 WY195 的活性。本研究表明 WY172 与 WY195 在暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)中具有稳定的启

动子活性,并且增加光照和低温处理能诱导启动子活性的提升。

关键词: 启动子;暹罗炭疽菌;原生质体转化

中图分类号: S432.1            文献标志码: A            文章编号:1674 − 7054(2023)05 − 0506 − 08

董林朋,殷金瑶,赵文渊,等. 启动子 WY172 和 WY195 在暹罗炭疽菌中的活性研究 [J]. 热带生物学报,2023,

14(5):506−513. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20220074

启动子 (Promoter) 为 DNA 分子上与 RNA 聚

合酶结合形成转录起始复合物并起始 mRNA 合成

所必需的保守序列。启动子有强、弱之分,其对转

录水平的控制程度差异较大,按转录模式可将启

动子分为组成型、组织特异型、诱导型等多种形

式。强启动子对于基因工程的研究具有促进作

用,为转化体系的建立、互作机制的研究等提供有

效的工具。例如小麦条锈菌效应蛋白 Pst14872 靶

标的鉴定及功能分析[1] 中报道了利用大肠杆菌

Tac 启 动 子 探 究 专 性 寄 生 真 菌 小 麦 条 锈 菌 中

Pst14872 效应蛋白与靶标 TaClpS1 的互作机制;

农杆菌及 PEG 介导向日葵核盘菌遗传转化体系的

研究[2] 中报道了利用大肠杆菌的 Lac 启动子驱动

mgfp5 基因的表达以探究向日葵核盘菌转化体系

的建立;启动子克隆概述[3] 中报道了丝状真菌启动

子可以高效表达内源基因可能得益于其具有强大

的启动子工具。因此,利用从真菌内分离的强启

动子驱动基因的转录表达,有望为丝状真菌转化

体系的建立、侵染机制的研究等提供新的可能。

橡胶树白粉菌是一类专性寄生真菌,目前尚

不能离体培养[4 − 5]

,又因其寄主橡胶树的基因组过

于庞大,因此橡胶树白粉菌遗传转化体系仍是目

前研究中的一个难点问题。本实验室从橡胶树白

粉菌基因组中鉴定得到了 WY172[6] 与 WY195[7]

启动子,但仅在外源寄主双子叶植物内验证过这

两个启动子功能,为进一步探究 WY172 与 WY195

是否有广泛应用于橡胶树白粉菌转化体系建立的

可能性,笔者所在的实验室通过原生质体转化法

在与寄主相同的丝状真菌—暹罗炭疽菌内验证了

这 两 个 启 动 子 功 能 [8]。 笔 者 拟 构 建 以 启 动 子

  收稿日期:2022 − 09 − 20    修回日期:2022 − 12 − 08

  基金项目:国家自然科学基金项目(31960518)

  第一作者:董林朋(1997−),男,海南大学植物保护学院 2020 级硕士研究生. E-mail:donglinoeng@163.com

  通信作者:缪卫国(1969−),男,博士,教授. 研究方向:分子植物病理学研究. E-mail:miao@hainanu.edu.cn;李潇

(1989−),男,博士,讲师. 研究方向:分子植物病理学研究. E-mail:993773@hainanu.edu.cn

第 14 卷 第 5 期 热 带 生 物 学 报 Vol. 14 No. 5

2023 年 9 月 JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY Sep. 2023

第44页

WY172、WY195 驱动绿色荧光蛋白(GFP)表达的

载体,对 GFP 基因在暹罗炭疽菌内的表达情况进

行探究,同时对转化子在不同环境条件下启动子

的活性进行验证,旨在为 WY172、WY195 启动子

的应用提供更多的可能,同时也为橡胶树白粉菌

转化体系的建立提供优良的启动子工具。

1    材料与方法

1.1    菌株与质粒    供试菌株为笔者所在实验室

分离纯化获得并经鉴定的橡胶树暹罗炭疽菌

(Colletotrichum siamense)HN08[9]。pJNARG 质粒

来自西北农林科技大学许金荣课题组 ,依据

pFL2 质粒改造而来[10]。

1.2    培养基    TB3 培养基:酵母提取物 1 g,酸水

解酪蛋白 1 g,蔗糖 5 g,加 ddH2O 定容至 1 L,121℃

高温灭菌 20 min,每 200 mL 加琼脂 1.5 g 制成固

体培养基。CM 培养基:酵母提取物 6 g,酸水解酪

蛋白 1 g,蔗糖 10 g,加 ddH2O 定容至 1 L,121℃

高温灭菌 20 min,每 200 mL 加琼脂 3 g 制成固体

培养基。马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA):马铃薯

200 g,葡萄糖 20 g,琼脂粉 15 g,加 ddH2O 定容至

1 L, 121℃ 高温灭菌 20 min。 马铃薯葡萄糖液

体培养基 (PDB):马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,加

ddH2O 定容至 1 L,121℃ 高温灭菌 20 min。

1.3    试剂    蜗牛酶(Snailase)购自北京索莱宝

(Solarbio)科技有限公司,溶壁酶(lysing enzyme)

购自美国 Sigma Aldrich 公司。1×STC 缓冲液:蔗

糖 20 g,50 mmol·L−1 Tris-HCl 0.785 g,50 mmol·L−1

CaCl2 0.555 g,加 ddH2O 定容至 100 mL,121℃ 高

温灭菌 20 min。PTC 缓冲液:称取 3 g PEG 4000,

溶解于 1×STC 缓冲液,定容至 5mL,利用细菌过

滤器(孔径 0.45 μm)过滤除菌。酶解液配制:细胞

壁溶壁酶 0.2 g,完全溶解于 0.7 mol·L−1 的 NaCl 溶

液,利用细菌过滤器(孔径 0.45 μm)过滤除菌。

1.4    表达载体的构建    利用限制性内切酶 KpnⅠ

和 EcoRⅠ对 pJNARG 载体进行双酶切,切除载体

上的 RP27 启动子基因片段(图 1),并使用 DNA

回收试剂盒(Magen,R6840-01)回收载体片段。提

取橡胶树白粉菌基因组 DNA,以 WY172 F/R 和

WY195 F/R 引物 ,从橡胶树白粉菌基因组中扩

增 出 WY172(GenBank: MK049254.1)与 WY195

(GenBank:MK049253.1)启动子,连接 pJNARG 骨

架片段,并转化 DH5α 感受态细胞,涂布于 Amp+

抗性的 LB 固体培养基上,在 37℃ 的环境中培养

Xcml (307)

(5 414) EcoRI

6 000

EGFP

5 000

lac promoter

CAP binding site

ori

4 000

AmpR

3 000

AmpR promoter

f1 ori

M13 fwd

T7 promoter

NeoR/KanR

1 000

2 000

RP27 promoter

(4 935) Kpnl

T3 promoter

M13 rev

lac operator

pJNARG

6 904 bp

M13 fwd

T7 promoter

图 1    pJNARG 载体图谱

第 5 期 董林朋等: 启动子 WY172 和 WY195 在暹罗炭疽菌中的活性研究 507

第45页

过夜,挑取单菌落进行 PCR 验证并筛选出阳性克

隆转化子用于后续实验研究。本研究所用的引物

见表 1。

LB 液体培养基中,37℃ 摇床振荡过夜后并提

取质粒进行 PCR 验证,验证正确的质粒送至华大

生物公司测序。测序正确的菌株保存在甘油中并

放置于−80℃ 保存。

表 1  本研究所用引物

编号 引物名称 引物序列(5′-3′) 限制性内切酶

1

pJNARG-WY172-F GGGAACAAAAGCTGGGTACCC

ATTTCATCCATAAGAAATTAAA

KpnⅠ

2 pJNARG-WY172-R

CCACGATTAAATCGAGCCATGAATT

CGATAAATATGCGATTTTTATGCAA

EcoRⅠ

3

pJNARG-WY195-F GGGAACAAAAGCTGGGTACC

AACCAATAATTTTCACGAGGG

KpnⅠ

4

5

6

7

8

pJNARG-WY172-R

GFP-F

GFP-R

RT-GFP-F

RT-GFP-R

CCACGATTAAATCGAGCCATGAATT

CTCTGCATGCTAGTGATTT

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

TCACTTGTACAGCTCGTCCA

TCGTGACCACCCTGACCTA

GTCCTCGCGTGGTAGAAG

EcoRⅠ

1.5    原生质体的制备    将野生型的暹罗炭疽菌

接种至 CM 固体培养基上,5 d 后切取菌落边缘的

菌块,在 250 mL 三角瓶中加入 150 mL CM 液体

培养基,接入切除的菌块,28℃ 160 r·min−1 培养

48 h。收集菌丝 ,使用灭菌过滤纸过滤 ,用 0.7

mol·L−1 NaCl 溶液反复冲洗,用滤纸吸干水分,将

菌丝转移至 50 mL 离心管中(避免手直接触碰菌

丝)。称取菌丝质量,按照质量比为 1 : 1 的比例向

菌丝中加入溶壁酶,置于摇床(28℃, 100 r·min−1)

上,酶解时长约 3.5 h。使用 4 层灭菌过滤纸过滤

酶解液,将酶解后的菌丝溶液进行冰浴后用 0.7

mol·L−1NaCl 溶液洗涤,然后收集原生质体于 50

mL 离心管中,4℃ 4 600 r·min−1 条件下离心 15 min

后弃上清。再用 STC 溶液将原生质体重悬,4℃

4 600 r·min−1 条件下离心 15 min,重复 1 次。最后

利 用 STC 溶 液 将 原 生 质 体 浓 度 调 至 1  ×108

个·mL−1,分装为每管 200 μL,立即进行转化使用。

1.6    原生质体转化    取 60~100 μL 1.4 中构建的

质粒,与 200 μL 制备成功的原生质体混合,冰浴

20~ 30  min, 每 200  μL 原 生 质 体 中 加 入 2  mL

PTC 溶液,在室温下静置 30 min,最后加入 TB3 复

苏液体培养基,每 200 μL 的原生质体加入 3 mL

的 TB3 培养基,轻轻颠倒混匀,室温下振荡培养

2 h;随后将原生质体加入 10 mL 熔化并冷却到约

50℃ 的 TB3 固 体 培 养 基 上 , 并 加 入 Amp+与

G418 抗性药剂,轻轻混匀后倒入培养皿中,静置至

下层板凝固;最后向培养基倒入 10 mL 含 Amp+和

G418 抗性的 TB3 培养基。28℃ 下培养 2~3 d,

待培养基上长出菌落后,将菌丝挑取到新的 CM

固体培养基上培养并进行后期验证。

1.7    暹罗炭疽菌转化子的验证    分别取上述培

养基中转化菌株与野生型的菌株的菌饼进行液体

培养,26℃ 160 r·min−1 条件下培养 2~3 d,并提取

转化子与野生型的 DNA 作为模板 ,利用 GFP

F/R 引物进行 PCR 验证。PCR 反应程序:94℃ 预

变 性 5  min, 94℃ 变 性 5 min   , 56℃ 退 火 35  s,

72℃ 延 伸 25  s, 45 个 循 环 , 72℃ 延 伸 10  min,

4℃ 保存。PCR 扩增产物经过 1% 琼脂糖凝胶电

泳检测。并将转化子以及野生型的菌丝、孢子制

备 成 临 时 玻 片 , 利 用 荧 光 显 微 镜 (奥 林 巴 斯

BX53 显微镜,配备 DP80CCD)观察。

1.8    GFP 基因表达量分析    将暹罗炭疽菌转化

子在 CM 液体培养基中 28℃ 培养 2~3 d。利用

真菌 RNA 提取试剂盒(Omega,R6840-01)提取转

化子的 RNA,同时也提取野生型暹罗炭疽菌的

RNA,利用反转录试剂盒(Vazyme,R333-01)进行

反转录得到 cDNA。以 RP27 启动子驱动 GFP 基

因作为阳性对照,分别测定 WY172 与 WY195 驱

508 热 带 生 物 学 报 2023 年

第46页

动 GFP 基因的表达量。

1.9    启动子在暹罗炭疽菌侵染阶段驱动 GFP 基

因表达    挑取转化成功的暹罗炭疽菌丝放置于

PDA 培养基上培养 4~6 d,再利用打孔器打取

5 mm 直径的暹罗炭疽菌的菌碟,在 PDB 培养基

中 28℃ 培养 3 d,紧接着利用无菌过滤纸过滤,

12 000 r·min−1 离心,加入无菌水制备成分生孢子

悬浮液 ,并利用血球计数板计数 ,制备成 106

个·mL−1 悬浮液备用。

将上述制备好的孢子悬浮液喷洒在经过无菌

水冲洗过的离体橡胶树叶片上。根据暹罗炭疽菌

在橡胶树叶片上的发育进程及侵染结构变化,分

别选择在 0 h (非接种状态)、12 h (附着胞形成侵

染钉)、24 h (分生孢子另一端的芽管产生附着

胞)、48 h (附着胞分化产生次级附着胞)、72 h (菌

丝网状分布)这 5 个时间段,将叶片和菌丝利用锡

箔纸密封[11]

,液氮冷冻,−580℃ 保存。

利用真菌 RNA 试剂盒分别提取这 5 个时间

段的暹罗炭疽菌 RNA,利用反转录试剂盒将

RNA 反转录为 cDNA,以 RP27、WY172、WY195

分别在 0 h 驱动 GPF 基因的表达量作为参考值,

探究不同启动子驱动下 GFP 基因表达含量在暹罗

炭疽菌侵染不同时间的变化。

1.10    启动子 WY172 与 WY195 的诱导类型    将

暹罗炭疽菌转化子接种于普通 CM 固体培养基

上,28℃ 培养 7 d。将上述转化子分别接种于添

加 H2O2(20 mmol·L−1)、葡萄糖(1 mol·L−1)、0.01%

的 SDS、山梨醇(1 mol·L−1)、刚果红 (200 μg·mL−1)

的 CM 固体培养基以及普通 CM 固体培养基在

28℃ 培养 5 d,再取上述转化子接种于普通 CM 固

体培养基,分别放置于长光照、黑暗和 23℃ 低温

条件下培养 5 d。切取上述不同条件下 CM 平板

中培养的转化菌株进行液体培养,28℃ 160 r·min−1

培养 2~3 d。利用真菌 RNA 提取试剂盒(Omega,

R6840-01)提 取 菌 丝 RNA, 用 反 转 录 试 剂 盒

(Vazyme,R333-01)将 RNA 反转录为 cDNA,测定

不同生长条件下 GFP 基因的相对表达量。

2    结果与分析

2.1    表达载体的构建    对阳性菌株提取的质粒

进行 PCR 验证,结果显示出与目的条带大小基本

一致的条带(WY172 大小为 250 bp 左右,WY195

大小为 250 bp 左右),进一步送至华大生物公司测

序以及 NCBI 序列对比,结果显示相似性为 100%,

表明表达载体构建成功。

2.2    WY172 与 WY195 启动子活性的检测    通

过荧光显微镜观察,发现启动子 WY172 与 WY195

驱动 GFP 基因表达出了类似于 RP27 驱动 GFP

基因的荧光强度,而野生菌株未出现荧光表达

(图 2),表明构建的 3 种载体已成功转入,并且初

WT

(a)

(e)

(b)

(f)

(c)

(g)

(d)

(h)

BF

GFP

RP27 WY172 WY195

100 μm

图 2    WY172 与 WY195 启动子驱动 GFP 基因表达菌丝荧光图

BF:白光;GFP:绿色荧光;WT:野生型暹罗炭疽菌菌丝;RP27、WY172、WY195:转入启动子的转化菌株菌丝;a 为白光

通道下野生菌丝,b、c、d 为白光通道下转化子菌丝,c 为 GFP 荧光通道下野生菌丝,f、g、h 为 GFP 荧光通道下的转化子

菌丝。

第 5 期 董林朋等: 启动子 WY172 和 WY195 在暹罗炭疽菌中的活性研究 509

第47页

步证明启动子 WY172 与 WY195 均可在暹罗炭疽

菌内驱动 GFP 基因的表达。

利用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)测定 3 种

启动子(WY172、WY195 和 RP27)驱动 GFP 基因

的表达量是否存在差异 ,结果发现 WY172 和

WY195 驱动 GFP 表达的能力分别约为 RP27 的

87% 和 91%,表现出与 RP27 类似的驱动 GFP 表

达的能力,而野生型未检测到 GFP 基因的表达

(图 3),这再次证明 WY172 与 WY195 启动子均

可在暹罗炭疽菌内驱动 GFP 基因的表达,说明

WY172 与 WY195 在暹罗炭疽菌内具有启动子

活性。

GFP 基因的相对表达量

1.2

0.9

0.6

0.3

0

RP27 WY172 WY195 WT

b b

b

a

图 3    启动子驱动 GFP 基因的表达

a 、b 表示显著性差异(P<0.05),3 个生物学重复。

2.3    WY172 与 WY195 在暹罗炭疽菌侵染寄主

的不同侵染阶段的启动子活性    以 3 种转化子

(WY172、WY195 和 RP27)分别在 0 h 的 GFP 基

因的表达量作为对照, RT-qPCR 结果显示启动子

驱动 GFP 基因在 12 、24 、48 、72 h 这 4 个时间

段表现出的效率相差较小(图 4),如在 RP27 启动

子 驱 动 下 , GFP 基 因 的 表 达 量 在 12、 24、 48、

72 h 分别为 0 h 的 103%、127%、74%、131%,而

在 WY172 启动子驱动下,GFP 基因的表达量在

12、24、48、72 h 分别为 0 h 的 110%、88%、127%、

129%,在 WY195 启动子驱动下,GFP 基因的表达

量在 12、24、48、72 h 分别为 0 h 的 101%、113%、

134%、117%。这证明启动子在暹罗炭疽菌侵染寄

主的不同阶段均可以驱动 GFP 基因的表达。

2.4    环境条件对 WY172 与 WY195 活性的影响

提取不同生长条件处理下的暹罗炭疽菌 RNA,利

用 RT-qPCR 测定发现 WY172 在 24 h 光处理条件

下 GFP 表达量升高,WY195 在低温培养与 24 h

光处理条件下 GFP 表达量升高(图 5)。

GFP 基因的相对表达量

1.8

(a)

1.5

1.2

0.9

0.6

0.3

0

a

a

a

a

a

0 12 24

时间/h

RP27

48 72

GFP 基因的相对表达量

1.8

(b)

1.5

1.2

0.9

0.6

0.3

0

a

a

a

a

a

0 12 24

时间/h

WY172

48 72

GFP 基因的相对表达量

1.8

(c)

1.5

1.2

0.9

0.6

0.3

0

a

a

a

a

a

0 12 24

时间/h

WY195

48 72

图 4    启动子在暹罗炭疽菌侵染寄主阶段驱动 GFP 基因

表达

a 表示显著性差异(P<0.05),3 个生物学重复。

510 热 带 生 物 学 报 2023 年

第48页

3    讨 论

启动子作为转录调控的中心一直是研究热

点,优良启动子的发现是研究基因表达调控的基

础,加深对启动子的研究对基因工程具有很大的

帮助。丝状真菌具有丰富的启动子资源[12]

,目前应

用较多的丝状真菌诱导型启动子含有里氏木霉的

cbhl 启动子[13]、曲霉属的 glaA 启动子[14] 和构巢曲

霉的 alcA 启动子[15]。本研究以实验室前期结果为

基础,进一步加深对 WY172 与 WY195 启动子应

用范围的探索,旨在扩大橡胶树白粉菌启动子应

用,为橡胶树白粉菌转化体系建立和互作机制的

研究提供可靠的启动子工具。

目前已经报道的启动子大多仅能在某种生物

中发挥启动子作用,较少可以在多种不同的生物

内均可高效驱动基因的表达,例如目前使用较为

广泛的 35S 启动子仅适用于双子叶植物[16]

,单子

叶植物经常使用水稻 ACT1 启动子[17] 和玉米

Ubil 启动子[18]。在笔者所在的实验室的前期研究

中,通过 GUS 蛋白染色实验和 GUS 酶活性检测

发现,来源于橡胶树白粉菌的 WY172 与 WY195

启动子在双子叶植物和单子叶植物内均具有较强

的启动子活性。这与来源于花椰菜花叶病毒的

35S 启动子[16] 相类似,虽然来源于病毒却能在植

物中稳定高效表达。但此前研究中对 WY172、

WY195 在丝状真菌中是否具有启动子活性尚未进

行研究。由于橡胶树白粉菌目前尚无有效转化体

系且具有无法离体培养的特点,本研究选择丝状

真菌中的暹罗炭疽菌作为研究对象,对 WY172、

WY195 的启动子功能进行探究,研究结果表明

WY172 与 WY195 均具有可以驱动 GFP 表达的

启动子功能。这证明 WY172 与 WY195 启动子不

仅可以应用于植物,更可以在丝状真菌中发挥启

动子功能。笔者推测,WY172、WY195 启动子可

能具有广泛的启动子功能,在多种生物体内均可

以发挥启动子功能,这可能与其自身具有广泛的

表达调控元件有关。笔者实验室也将在接下来的

实验中对 WY172、WY195 启动子序列中的表达

调控元件进行进一步的鉴定及功能分析,为基因

工程提供更为有效的启动子工具。

本实验室前期的研究结果[7-8] 表明,在植物体

内 WY172 为 IAA 诱导型启动子 ,WY195 为高

温、干旱、盐诱导启动子,经分析发现,这可能与

WY172、WY195 启动子序列具有丰富的植物表达

元件有关,其中,WY172 不仅具有赤霉素响应、生

长素响应等激素作用元件,此外还有低温响应、光

响应元件等非生物因素的作用元件[7]

;WY195 启

动子也具有高等植物常见的创伤应答元件、厌氧

诱导必须元件、干旱诱导元件、光应答元件等[8]。

此外,除这些已报道的植物诱导条件外,还发现

WY172 与 WY195 启动子存在一些未经报道的植

物启动子诱导元件。由于 WY172、WY195 启动

子在植物中的诱导条件会导致真菌的生长发育受

到限制,因此植物体内的启动子诱导条件并不适

用 于 真 菌 体 内 , 为 了 进 一 步 探 究 WY172 与

WY195 启动子在真菌内的表达调控方式,本研究

将转化子置于不同的生长环境条件下,测定启动

子驱动 GFP 基因表达量的变化,发现在光处理的

条件下 WY172 驱动 GFP 基因的高效表达 ,在

23℃ 低温培养和长光照处理下 WY195 启动子高

效驱动 GFP 基因的表达。这些研究结果表明,

WY172 与 WY195 启动子在真菌内也属于诱导型

启动子,但这些诱导条件与植物体内的条件完全 GFP 基因相对表达量1.8

b

a a

a

WY172

a a

b

b

c

(a)

1.5

1.2

0.9

0.6

0.3

0

未处理

H2O2

葡萄糖

SDS

山梨醇

刚果红

低温

光处理

暗处理

处理

GFP 基因相对表达量18

a a

a

a

WY195

a

a

b

c

a

(b)

15

12

9

6

3

0

未处理

H2O2

葡萄糖

SDS

山梨醇

刚果红

低温

光处理

暗处理

处理

图 5    不同环境条件对启动子驱动 GFP 基因表达的影响

a、 b、c 表示显著性差异(P<0.05),3 个生物学重复。

第 5 期 董林朋等: 启动子 WY172 和 WY195 在暹罗炭疽菌中的活性研究 511

第49页

不同。这可能与真菌的生长环境有关,同时也可

能与 WY172 与 WY195 启动子丰富的诱导元件有

关。由于目前专门针对丝状真菌启动子的研究数

据库及分析工具较少,主要依靠其他真核生物的

数据库进行预测,并通过实验对预测结果加以验

证 [12]。 笔 者 实 验 室 将 在 接 下 来 的 实 验 中 对

WY172 与 WY195 启动子在真菌体内的诱导元件

进行鉴定与分析,对以上 2 个启动子是否具有更

多诱导条件的可能性进行进一步鉴定。

目前使用的真菌启动子多为组成型启动子,

虽然组成型启动子不受外界影响,在菌株的不同

生长阶段均可高效表达[19]

,但是组成型启动子的使

用也存在局限性,例如当驱动异源基因表达时,会

导致宿主菌株内产生大量异源蛋白,从而影响菌

株正常生长甚至导致死亡。诱导型启动子在未受

到特定的诱导信号刺激时,驱动目的基因的表达

量往往很低,只有施加可以响应的诱导信号时,目

的基因的转录水平才可以迅速提高,因此,使用诱

导型启动子可以满足对目的基因的实时、定量表

达的研究需求。但实验时还应根据合适的实验条

件选择合适的诱导型启动子,并非每个诱导型启

动子的诱导条件都能给所选的模型生物带来最佳

条件。例如,诱导型启动子 cbh1 的天然诱导剂为

纤维素,而真菌通过纤维素酶将纤维素降解,最后

进入真菌体内对启动子 cbh1 进行直接调控,因此

宿主菌株体内必须有编码纤维素酶的基因[20]。而

WY172 启动子与 WY195 启动子诱导条件为物理

条件,不需要添加化学试剂来进行诱导,不仅避免

化学试剂对寄主菌株正常生长产生影响,而且具

有更广泛的使用范围。此外,WY172 启动子与

WY195 启动子在植物和真菌内均属于诱导型启动

子,在植物和真菌内均可运用。这不仅为功能基

因的研究提供了更多的思路,也为启动子的应用

提供了更多的可能。

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Identification of WY172 and WY195 promoter activity in

Colletotrichum siamense

DONG Linpeng,   YIN Jinyao,   ZHAO Wenyuan,   LIN Chunhua,   LIU Wenbo,   MIAO Weiguo,   LI Xiao

(School of Plant Protection/ Ministry of Education Key Laboratory of Green Prevention and Control of

Tropical Plant Diseases and Pests, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China)

Abstract:Our laboratory preliminarily identified WY172 and WY195 promoter sequences from the rubber tree

powdery  mildew  fungus  (Erysiphe quercicola),  which  could  effectively  drive GUS expression  in  both

monocotyledonous rice and dicotyledonous tobacco. In order to investigate whether WY172 and WY195 have

promoter  activity  in E. quercicola,  the  pJNARG  vector  was  used  as  a  backbone,  linking  WY172-GFP and

WY195-GFP to  construct  recombinant  expression  vectors  (WY172-GFP  and  WY195-GFP  vectors).  The

recombinant  vectors  were  introduced  into Colletotrichum siamense infecting  rubber  trees  by  protoplast

transformation method. Fluorescence microscopy showed that both WY172 and WY195 could stably drive the

expression of GFP gene. And in different stages of C. siamense, WY172 and WY195 could play promoter roles

to stably drive the expression of GFP. In addition, we changed the environmental conditions for the growth of

anthracis and measured the GFP expression under different conditions. The results showed that the long light

condition  enhanced  the  activity  of  WY172  to  drive GFP expression,  and  that  the  activity  of  WY195  was

improved by the long light treatment and the low temperature treatment at 23°C. This indicates that WY172

and WY195 have stable promoter activities in C. siamense, and that their activities can be induced by changing

light or temperature conditions.

Keywords:promoter;Colletotrichum siamense;protoplast transformation

(责任编辑:叶 静)

第 5 期 董林朋等: 启动子 WY172 和 WY195 在暹罗炭疽菌中的活性研究 513

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