DOI:10.16605/j.cnki.1007-7847.2022.11.0229

斑马鱼 prkd1 基因在心脏早期发育过程中的作用

研究

李韵璇1

, 陈 宇2, 3

, 吴锦秋1

, 游诗琦1

, 李永青1

, 朱 平2, 3

, 吴秀山1, 3

, 江志钢1*

,

王跃群1*

(1. 湖南师范大学 心脏发育研究中心 省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室, 中国湖南 长沙 410081; 2. 广东省

心血管病研究所 广东省人民医院 广东省医学科学院, 中国广东 广州 510100; 3. 广东省心脏病发病机制与精准防治重点

实验室, 中国广东 广州 510100)

摘 要: 为了探究蛋白激酶 D (protein kinase D, PKD; 又名 PRKD)家族典型成员 prkd1 基因对早期心脏发育的

影响, 选用模式动物斑马鱼为研究对象, 设计了吗啉代反义寡核苷酸敲低实验。表型观察结果显示, prkd1 基因

敲低会导致斑马鱼心脏发育异常, 出现心包水肿、环化异常、心管线性化等畸形表型; 斑马鱼心率分析数据显

示, 与野生型斑马鱼相比, prkd1 基因的敲低会导致早期斑马鱼心率降低。利用转录组高通量测序技术对受精

后 3 d (3 days post fertilization, 3 dpf)的斑马鱼对照组和敲低 prkd1 组进行测序, 差异基因富集分析表明, prkd1

的敲低与心脏相关信号通路如心肌细胞的肾上腺素信号通路等显著相关。进一步通过 qRT-PCR 对高通量测

序结果进行验证, 并对早期心脏发育关键因子进行检测, 结果显示, 部分心血管相关基因显著下调, tbx5a、gata4

等心脏调控关键基因同样显著下调。这些表明 prkd1 基因可能通过调控心脏发育相关信号通路以及心脏发育

关键基因来影响早期心脏发育, 在早期心脏发育过程中发挥重要作用。

关键词: 心脏发育; prkd1 基因; 斑马鱼; 吗啉代反义寡核苷酸(MO)

中图分类号: Q756 文献标志码: A 文章编号: 1007-7847(2023)02-0095-09

Role of the prkd1 Gene in Early Cardiac Development in Zebrafish

LI Yunxuan1

, CHEN Yu2, 3

, WU Jinqiu1

, YOU Shiqi1

, LI Yongqing1

, ZHU Ping2, 3

,

WU Xiushan1, 3

, JIANG Zhigang1*

, WANG Yuequn1*

(1. The Center for Heart Development, State Key Laboratory of Freshwater Fish Development Biology, Hunan Normal University,

Changsha 410081, Hunan, China; 2. Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong

Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510100, Guangdong, China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis,

Targeted Prevention and Treatment of Heart Disease, Guangzhou 510100, Guangdong, China)

收稿日期: 2022-11-17; 修回日期: 2022-12-06; 网络首发日期: 2022-12-10

基金项目: 广东省人民医院院内博士后进站启动项目(BY012022004); 国家自然科学基金面上项目(31872315); 国家重点研发计划项目

(2018YFA0108700, 2017YFA0105602); 国家自然科学基金重点国际(地区)合作与交流项目(81720108004)

作者简介: 李韵璇(1998— ), 女, 湖南娄底人, 硕士研究生; 李韵璇和陈宇对本文的贡献相同, 为本文共同第一作者;

* 通信作者: 王跃群

(1964— ), 女, 湖南长沙人, 博士, 教授, 主要从事心脏发育基因调控和心脏疾病发生的分子机制研究, E-mail: yuequnwang@hunnu.edu.cn; 江

志钢(1982— )，男，湖南长沙人，博士，高级实验师，主要从事心脏发育方向的研究，E-mail: 270212729@qq.com。

Abstract: To investigate the role of the prkd1 gene, a typical member of the protein kinase D (PRKD) family,

in early heart development, zebrafish was used as an animal model in this study. Through prkd1 knockdown

with morpholino antisense oligo (MO), it was found that knockdown of prkd1 resulted in abnormal cardiac development, such as pericardial edema, cyclization disorder, cardiac tube linearization. Zebrafish heart rate

analysis indicated that, compared with the wild type, prkd1 knockdown zebrafish exhibited early arrhythmia.

High-throughput transcriptome sequencing was performed for zebrafish embryos at 3 days post fertilization

(dpf) in control and prkd1 knockdown groups. Differential gene enrichment analysis revealed that prkd1

knockdown was significantly associated with heart-related signaling pathways, such as the adrenergic signaling

第 27 卷 第 2 期 生命科学研究 灾燥造援27 晕燥援2

圆园23 年 4 月 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡 Apr. 圆园23

窑遗传与发育窑

生 命 科 学 研 究 圆园23 年

先天性心脏病作为人类心脏发育最常见的畸

形形式, 在世界范围内保持着居高不下的发病率

与死亡率[1]。公认的先天性心脏病包括房室间隔缺

损、法洛四联症、主/肺动脉瓣狭窄、血管错位等病

征[2]。研究表明, 遗传因素是先天性心脏病发生的

主要原因[3]

, 因此, 对控制先天性心脏病发生的基

因展开功能研究十分有必要。

斑马鱼作为模式动物, 有许多利于其用于心

脏疾病研究的特点。胚胎时期, 斑马鱼无色透明,

心脏特征清晰可见, 研究者仅通过普通光学显微

镜就可以直接对心脏和血液进行观察[4]。斑马鱼体

型小, 可通过被动扩散的方式使氧气到达全身各

处组织, 从而保证胚胎发育过程中所需的氧气供

应, 因此在胚胎发育的早期阶段, 有严重心脏畸

形的个体也能存活数天时间[4-5]。斑马鱼后代数量

多, 有利于后续的遗传和统计分析[6]。此外, 有研

究表明, 斑马鱼基因组序列与人类基因组序列具

有高达 70%的同源性[3]。这些独特的天然优势使

得斑马鱼成为心血管研究领域的首选模式生物

之一。

prkd1 基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 D

(protein kinase D, PKD; 又名 PRKD)家族的成员

PRKD1, 该激酶在细胞增殖分化、血管生成、免疫

调节、氧化应激和细胞凋亡等多种生理过程中发

挥作用[7]。前期研究表明, PRKD1 基因与先天性心

脏病具有密切联系[2, 7-10]

, 但其调控机制尚不明确,

有待深入探究。有研究报道, 域类组蛋白脱乙酰

酶(histone deacetylases, HDACs)与心脏肥大的抑

制相关, PRKD1 能通过磷酸化心肌细胞中的HDAC5 刺激核输出, 进而增加心脏肥大相关因子的

转录活性; 此外, HDACs 的磷酸化会导致其与肌

细胞增强因子 2 (myocyte enhancer factor 2, MEF2)

的分离, 从而影响心脏发育[2, 11-12]。在针对人类先

天性心脏病家族病例的研究中, Massadeh 等[2]发现

了一种基于 PRKD1 的新型常染色体隐性突变,

该基因中的双等位基因截断突变可能导致非综合

征型先天性心脏病。心脏特异性 Prkd1 缺失的小

鼠会下调心脏肥大、纤维化等相关基因的激活; 而

且, 在慢性肾上腺素能或血管紧张素域处理的情

况下, 心脏特异性 Prkd1 缺失的小鼠表现出对心

脏肥大的抵抗, 这意味着 Prkd1 在心肌病与病理

性心脏重塑中具有重要作用[9-10]。Prkd1 完全敲除

小鼠纯合致死, 其心脏表型尚无法确认[2]。鉴于斑

马鱼胚胎心脏畸形的个体也能存活数天时间的特

点, 斑马鱼 prkd1 基因的缺失可以用于研究早期

心脏发育过程, 而相关研究尚未见报道。因此, 本

研究旨在以斑马鱼吗啉代反义寡核苷酸(morpholino antisense oligo, MO)敲低为研究模型, 探究

prkd1 对早期心脏发育的影响, 为人类先天性心

脏病发病机制的研究提供新的依据。

1 材料和方法

1.1 斑马鱼品系的养殖

本研究用到的 AB 品系野生型斑马鱼为本实

验室自行饲养、繁殖。根据国家斑马鱼中心养殖方

案, 本实验室将成鱼饲养在 28.5 益循环水系统中,

pH 维持在 6.8~7.6。性成熟斑马鱼交配前一晚, 将

雌鱼与雄鱼以 2︰1 的性别比分别置于杂交缸的

隔板两侧, 第二日一早喂食换水后, 给予光照, 将

隔板去除, 斑马鱼自然交配产卵。

1.2 MO 设计

本实验选用的是翻译抑制型吗啉代反义寡核

苷酸, 由 Gene Tools 公司设计并合成。prkd1 基因

的 MO 序列和对照 MO 序列分别为: CGGATTAC原

CGGAGGTACGCTCAT 和 CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT。

1.3 斑马鱼胚胎显微注射

胚胎受精后, 吸取处于 1 细胞期的胚胎, 均

匀排布在注射板上。用无菌水按照 1︰1 的比例稀

释 prkd1-MO 样品原液, 使 prkd1-MO 样品浓度

pathway in cardiomyocytes. Additionally, the results of high-throughput sequencing were confirmed by qRTPCR, which showed that some genes associated with the cardiovascular system were markedly down-regulated.

Meanwhile, identification of the essential factors in early heart development revealed that key cardiac regulatory genes like tbx5a and gata4 were significantly down-regulated. These findings suggest that the prkd1

gene may affect early cardiac development by regulating cardiac development-related signal pathways and

key genes, and play an important role at the early stage of heart development.

Key words: cardiac development; prkd1; zebrafish; morpholino antisense oligo (MO)

（Life Science Research，2023，27（2）：095-103）

96

第 2 期 李韵璇等：斑马鱼 prkd1 基因在心脏早期发育过程中的作用研究

为 0.5 mmol/L, 随后将其添加至注射针中, 并将注

射针安装至显微注射仪上。根据 Xu 等[13]的方案,

将样品注射进胚胎中, 每个胚胎约注射 1 nL。将注

射后的胚胎收集到加有 E3 养殖水(60 mL 5 mol/L

NaCl, 10 mL 1 mol/L KCl, 20 mL 1 mol/L MgSO4,

2.94 g CaCl2·2H2O,1g 亚甲基蓝粉末, 无菌水补

充至 1 L)的培养皿中, 放至 28.5 益培养箱中培养。

对照组(control-MO 组)处理同上。

1.4 死亡率分析

分别于受精后 12 h (12 hours post fertilization,

12 hpf)、24 h、36 h、48 h、72 h 对存活和死亡的

control-MO 组、prkd1-MO 组胚胎计数。死亡胚胎

数与总胚胎数的比值为死亡率, 利用 GraphPad

Prism 6 进行后续分析与制图。

1.5 显微观察

随机收取注射 control-MO 和 prkd1-MO 的幼

鱼, 在 48 h、72 h 时分别置于显微镜(Carl Zeiss AG

公司, 德国)下观察, 并对典型心脏畸形如心包水

肿、心管线性化等进行拍照记录以及统计分析。

1.6 心率分析

随机收取 48 hpf、72 hpf 时期的 control-MO

组和 prkd1-MO 组幼鱼, 依次置于玻片上, 利用显

微镜的高速摄像头对单条幼鱼的心脏进行拍照和

录像。录像以 16 bit 录制 10 s, 随后将原文件导入

SOHA 心率分析软件进行分析, 以横坐标、纵坐标

为轴, 框选出心脏舒张的最大位置与收缩的最小

位置, 标记心率峰值, 导出数值, 输入 GraphPad

Prism 6 进行后续分析与制图。

1.7 实时荧光定量 PCR

分别随机收集 24 hpf、48 hpf、72 hpf 时期的

control-MO 组与 prkd1-MO 组斑马鱼胚胎, 每管

30 颗。使用 TRIzol 法提取总 RNA, 随后使用逆转

录酶(Takara 公司, 日本)将其反转录成 cDNA。使

用 2伊 SYBR Green qRT-PCR Master Mix 试剂(Selleck 公司, 美国)进行 PCR 实验, 总反应体系为

10 滋L, 其中 2 伊 SYBR Green qRT -PCR Master

Mix 5 滋L, H2O 2.8 滋L, 模板 1 滋L, 正反向引物各

0.5 滋L, ROX 域 0.2 滋L。Quant Studio 6 实时荧光

定量 PCR 系统(Applied Biosystems 公司, 德国)设

置的反应程序为: 95 益预变性 120 s; 95 益变性

15 s、60 益退火 30 s, 循环 40 次; 溶解曲线程序。

Control-MO 组与 prkd1-MO 组靶基因的相对表达

量选用 2

-驻驻Ct 法计算, 并输入 GraphPad Prism 6 进

行后续分析与制图。PCR 引物序列见表 1。

1.8 转录组高通量测序及数据分析

随机收取 72 hpf 时期的 control -MO 组和

prkd1-MO 组幼鱼, 使用 TRIzol 法提取总 RNA 进

行转录组高通量测序。利用 NanoDrop 2000 检测

所提 RNA 的浓度和纯度, 采用琼脂糖凝胶电泳

检测 RNA 的完整性, 采用 Agilent 2100 测定RNA

完整值(RNA integrity number, RIN)。文库采用Illumina TruseqTM RNA Sample Prep Kit 方法构建, 所

有样品(每组 3 个重复)送至上海派森诺生物科技

股份有限公司进行实验。采用 DESeq 工具对基因

进行差异表达分析, 对差异表达分析结果中的显

著差异基因集进行统计, 并对每个比较组的上调

差异基因和下调差异基因计数。使用 R 语言对所

有比较组的差异基因进行双向聚类分析, 根据同

一基因在不同样品中的表达水平和同一样品中不

同基因的表达模式, 采用欧几里得(Euclidean)法计

算距离, 通过层次聚类最长距离法进行聚类。

基因本体论(Gene Ontology, GO; http://www.geneontology.org, 2022-11-16)是将全世界所有与基

因有关的研究结果进行分类汇总的综合数据库。

本研究使用 top GO 进行 GO 富集分析, 利用 GO

术语注释的差异基因计算每个术语的基因列表和

基因数目, 通过超几何分布方法计算 P-value (显

著富集的标准为 P-value<0.05), 找出在整个基因

组背景下差异基因显著富集的 GO 术语, 从而确

定差异基因行使的主要生物学功能。

京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia

of Genes and Genomes, KEGG; http://www.genome.

jp/kegg, 2022-11-16)是基因组破译方面的公共数

据库。本研究通过 KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.

cn/home.do)获取 KEGG 通路注释信息, 使用 clusterProfiler 进行 KEGG 富集分析, 利用 KEGG 通路

注释的差异基因计算每个通路的基因列表和基因

数目, 通过超几何分布方法计算 P-value (显著富

集的标准为 P-value<0.05), 找出在整个基因组背

景下差异基因显著富集的 KEGG 通路, 从而确定

差异基因行使的主要生物学功能。

2 结果

2.1 prkd1 基因敲低影响斑马鱼心脏发育

2.1.1 prkd1 敲低导致心脏畸形

分别将 control-MO 和 prkd1-MO 注射至 1 细

胞期的斑马鱼受精卵中, 培养至 24 hpf, 统计数据

显示, 与 control-MO 对照组相比, prkd1-MO 处理

97

生 命 科 学 研 究 圆园23 年

表 1 荧光定量 PCR 引物序列

Table 1 Primers used for real-time fluorescence quantitative PCR analysis

Primer Sequence

actc1a

ryr2

cacng8b

cacna1da

tpm1

adrb1

atf2

akt3a

atp1b2a

myl2b

cacna2d3

cacna1fb

cacnb4a

calml4a

adcy1a

adcy2a

bcl2b

casp8

ctsbb

prkcg

si:ch73-55i23.1

cox8b

tbx5a

gata4

hand2

nkx2.5

茁-actin

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

5忆ACTCCAGTCTTGCGCTACAA3忆

5忆TACCAACCATCACACCCTGG3忆

5忆AAGACGATGCTGTCTTGGGG3忆

5忆CTCTATGGAGCGCTGACTGG3忆

5忆CAACGGGTCACTGAGACCAA3忆

5忆TTCTCACACACCATGCCTGA3忆

5忆GCAACACAAACCCAGTTCGAG3忆

5忆AGCCGTGAAAGCATAGTCAAA3忆

5忆CACTCAGCGTCTCCGGTTTG3忆

5忆CACATCACCTTCAGCTGTTTCT3忆

5忆TACAGAGAAGCCAAACAGCA3忆

5忆TGTTGTAGAACCTTCCCTCAC3忆

5忆CTCTCTGCCTCCGTCCACTA3忆

5忆GTGCCGGACACGGGAACTAT3忆

5忆AGATCCCAACAAGAGACTTGG3忆

5忆GGTTTGAGCTGTGAACTCTTC3忆

5忆CCCTACAACGACACAGTCCA3忆

5忆TCCCAACTTTGTATTTCTTCGC3忆

5忆AGAGAAGCTTAAAGGTGCCGAT3忆

5忆GGTCTTTCTCCTCCCCGTGA3忆

5忆CTACGTCGACAGCGCACTTG3忆

5忆GTCAGGGTGCAACAGGAGAT3忆

5忆CTACTGCTCTACAGGCGGG3忆

5忆GGCTTCTGCTTAAGGGCTCA3忆

5忆CCTCCATATGATGTGGTTCC3忆

5忆CATATCTGTCACCTCGTATCC3忆

5忆GCTCACAGACAAAGAAGTGGATG3忆

5忆CCACTGTAGGAAGTGTGACCA3忆

5忆GTGGAGCCAGGATTTGGTCA3忆

5忆TCGTAACGCTCGTCTCTTGT3忆

5忆CCCTGGGATCAGATTCTGGC3忆

5忆TAACAGACGTTCCTGCTGACG3忆

5忆GCGCTTCAACGCAGTCATAG3忆

5忆CCACAAATGCTTCCCAACCG3忆

5忆AGACCAGGAACAAGGAGGCAG3忆

5忆CTGTAGTAATTGTGCCAGCCG3忆

5忆GTCAATTTCGACAATGTGCC3忆

5忆CGTTTGTGGAGTGTTTCACAG3忆

5忆CACCGATTTCATCTGGGGGA3忆

5忆TAGAGCAGTGAACCGCAGTG3忆

5忆ACATGCTGTACCTGCAAAGTCT3忆

5忆ATCCGTCAGCACCTGAGAAC3忆

5忆TCCGGCTTCAATCGCTCTTT3忆

5忆ATGCAATCACTTGCTCCCCA3忆

5忆AAACCACAAGATCACCCAG3忆

5忆TGCAGCTCCATATCATCAC3忆

5忆CGGGTGGGTTTATCCT3忆

5忆ATCGCCGACTGACCTT3忆

5忆GGACATTCTGGACAAAGATGAA3忆

5忆GCCAACCAGTTCTCCCTTTA3忆

5忆ATGCCATCCGGATCCTCTCT3忆

5忆TCAGATCTTACCCGGGTCT3忆

5忆GACCAGCTAGATCCAGACGC3忆

5忆GCTCCCCTGAATCCCAAAGC3忆

组的斑马鱼胚胎发育迟缓, 死亡率升高(图 1)。随

着胚胎发育至 48 hpf, 注射 prkd1-MO 的斑马鱼

胚胎可见明显心脏畸形, 出现心包水肿、心管线性

化等缺陷表型(图 2A~D); 发育至 72 hpf 时, 相比

98

第 2 期

图 1 敲低 prkd1 导致的斑马鱼胚胎死亡率及不同类型心脏畸形比例(72 hpf)的统计图

(A) 斑马鱼胚胎死亡率; (B) 不同类型心脏畸形比例。PE: 心包水肿; CTL: 心管线性化; LD: 环化异常。n=3, *

: P<0.05, **: P<0.01,

***: P<0.001, ns: 无显著变化。

Fig.1 Statistical chart of the mortality and proportion of different types of cardiac malformations (72 hpf) in zebrafish

embryos caused by prkd1 knockdown

(A) The embryonic mortality of zebrafish; (B) The rate of various types of heart malformations. PE: Pericardial edema; CTL: Cardiac tube linearization; LD: Looping disorder. n=3, *

: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001, ns: No significant change.

control-MO 对照组, prkd1-MO 组斑马鱼胚胎出

现环化异常等心脏畸形(图 2E~H)。在显微镜下观

察 72 hpf 时期 control-MO 组和 prkd1-MO 组斑

马鱼不同类型的心脏畸形并计数, 结果显示, 心

包水肿、心管线性化、环化异常这三类心脏畸形在

control-MO 组中出现的比例依次为 5.40%、1.51%

和 1.45%, 而其在 prkd1-MO 组中出现的比例显

著增加, 依次为 88.50%、32.80%和 42.90% (图1B)。

2.1.2 prkd1 敲低影响斑马鱼心率

为了探究 prkd1 的敲低是否会影响斑马鱼的

心率, 我们对 48 hpf、72 hpf 的 control-MO 组与

prkd1-MO 组幼鱼进行了心率检测分析(图 3)。经

数据统计后发现, 相比 control-MO 组, prkd1-MO

组幼鱼表现出异常降低的心率。研究结果证明,

prkd1 的敲低不仅会导致心脏畸形, 同时也会导致

斑马鱼心率降低。

2.2 prkd1 敲低对斑马鱼基因表达的调控

2.2.1 prkd1-MO 处理后的基因表达差异

为了探究 prkd1 影响早期心脏发育的下游靶

基因, 对 72 hpf 的 control-MO 组与 prkd1-MO 组

图 2 prkd1 敲低导致的斑马鱼胚胎畸形表型

(A) 对照组 48 hpf 时期的心脏表型; (B~D) prkd1-MO 处理组 48 hpf 时期的心脏畸形表型, 依次为轻度、中度、重度; (E) 对

照组 72 hpf 时期的心脏表型; (F~H) prkd1-MO 处理组 72 hpf 时期的心脏畸形表型, 依次为轻度、中度、重度。心脏区域用

红色虚线圈出; V: 心室, A: 心房; 标尺=50 滋m。

Fig.2 Abnormal phenotype of zebrafish embryos caused by prkd1 knockdown

(A) Heart phenotype in control group at 48 hpf; (B~D) Mild, moderate and severe heart malformation phenotypes in prkd1-MO

group at 48 hpf; (E) Heart phenotype in control group at 72 hpf; (F~H) Mild, moderate and severe heart malformation phenotypes

in prkd1-MO group at 72 hpf. The area of the heart is circled with a red dotted line. V: Ventricle; A: Atrium. Scale bar = 50 滋m.

Control-MO Control-MO

prkd1-MO 0.3

0.2

0.1

0

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

PE CTL LD

**

*

**

*

ns

***

***

***

(A) (B)

prkd1-MO

Control-MO prkd1-MO

李韵璇等：斑马鱼 prkd1 基因在心脏早期发育过程中的作用研究 99

生 命 科 学 研 究 圆园23 年

胚胎进行了转录组测序, 分析了 prkd1 敲低后的

基因表达差异。样品相关性检测结果表明, 6 个样

品间显示出高度重复性(图 4A)。基因差异表达结

果显示, 本次共检测到了 6 246 个发生显著性变

化的基因, 其中, 3 913 个基因显著下调, 2 333 个

基因显著上调(图 4B)。

2.2.2 差异基因富集分析

为进一步研究 prkd1 的生物学功能, 将发生

显著性变化的 6 246 个基因进行 GO 富集分析

(top 20), 结果显示门控通道活性富集最为显著(图

5A)。此外, 被显著富集的 GO 类别还包括离子通

道活性、离子跨膜转运蛋白活性和电压门控离子

通道活性等。

KEGG (top 30)富集分析显示, 与 control-MO

组相比, prkd1 的敲低对真核生物的核糖体生物

图 3 prkd1 敲低的斑马鱼胚胎心率分析统计图

Fig.3 Statistical chart of heart rate of zebrafish em -

bryos caused by prkd1 knockdown

n=3, *

: P<0.05.

图 4 prkd1-MO 处理组与对照组的差异表达基因

(A) 样品相关性检验; (B) 差异基因聚类分析图。蓝色代表下调, 红色代表上调。

Fig.4 Differentially expressed genes between prkd1-MO group and control group

(A) Sample correlation test; (B) Cluster analysis of differential genes. Blue represents down-regulation and red represents upregulation.

prkd1 1

prkd1 2

prkd1 3

prkd1-MO

Control 1

Control 2

Control 3

Control-MO

Group

1.00

0.96

0.94

1.000 0 0.995 0 0.994 7 0.944 0 0.954 1 0.950 0

0.995 0 1.000 0 0.997 8 0.938 7 0.944 3 0.940 6

0.994 7 0.997 8 1.000 0 0.937 0 0.946 2 0.941 1

0.944 0 0.938 7 0.937 0 1.000 0 0.979 7 0.973 9

0.954 1 0.944 3 0.946 2 0.979 7 1.000 0 0.998 1

0.950 0 0.940 6 0.941 1 0.973 9 0.998 1 1.000 0

prkd1-MO

Control-MO

Group

1.5

1.0

0.5

0

-0.5

-1.0

-1.5

(A)

(B)

prkd1-MO

Control-MO

3

2

1

0

48 hpf 72 hpf

* *

100

第 2 期

发生以及 RNA 运输通路的影响最为显著, 此外

其还影响了心肌细胞的肾上腺素能信号通路、心

肌收缩、血管平滑肌收缩、P53 信号通路和钙离子

信号通路等(图 5B)。

上述研究结果表明, prkd1 可能通过影响心

脏细胞相关的信号通路来影响心脏发育。

2.2.3 KEGG 富集结果中相关信号通路的验证

根据 KEGG 富集分析结果, 选取心脏相关信

号通路如心肌收缩、心肌细胞的肾上腺素能信号

通路中有显著变化的基因进行验证。收取 72 hpf

胚胎进行 qRT-PCR 检测, 结果显示: 与 controlMO 组相比, prkd1-MO 组与心肌收缩有关的基因

如 ryr2、actc1a 和 cacna1fb 等均发生显著变化, 其

中, ryr2 和 cacna1fb 显著下调, actc1a 显著上调,

这些基因同时也在心肌细胞的肾上腺素能信号通

路上; 此外, atp1b2a、cacng8b、cacna1da、cacna2d3、

tpm1、adrb1、atf2、akt3a、myl2b、adcy1a、adcy2a、bcl2b

和 calml4a 等心肌细胞的肾上腺素能信号通路相

关基因在 prkd1-MO 组也显著下调(图 6A)。这些

数据均与高通量测序结果相符。

图 5 prkd1-MO 处理组与对照组的差异表达基因富集分析

Fig.5 Enrichment analysis of differentially expressed genes between prkd1-MO group and control group

-log10(P-value)

KEGG enrichment

Genetic information processing

Organismal systems

Environmental information processing

Metabolism

Cellular processes

Ribosome biogenesis in eukaryotes

RNA transport

RNA polymerase

Spliceosome

Proteasome

Aminoacyl-tRNA biosynthesis

Sulfur relay system

Base excision repair

Neuroactive ligand-receptor interaction

Calcium signaling pathway

Notch signaling pathway

Cell adhesion molecules (CAMs)

Phototransduction

Adrenergic signaling in cardiomyocytes

Cytosolic DNA-sensing pathway

Cardiac muscle contraction

Purine metabolism

Tyrosine metabolism

Arachidonic acid metabolism

Retinol metabolism

Primary bile acid biosynthesis

Fructose and mannose metabolism

Porphyrin and chlorophyll metabolism

Alanine, aspartate and glutamate metabolism

D-glutamine and D-glutamate metabolism

Linoleic acid metabolism

Pyrimidine metabolism

Alpha-Linolenic acid metabolism

P53 signaling pathway

Gap junction

0 1 234 5 678 9 10 1112 1314

(B)

Molecular function

GO enrichment

Biological process

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

(A)

Transmembrane transport

Metal ion transport

ncRNA processing

Ion transmembrane transport

Ion transport

Cation transmembrane transporter activity

Voltage-gated cation channel activity

Voltage-gated channel activity

Inorganic cation transmembrane transporter activity

Voltage-gated ion channel activity

Metal ion transmembrane transporter activity

Cation channel activity

Transporter activity

Transmembrane transporter activity

Inorganic molecular entity transmembrane transporter activity

Ion transmembrane transporter activity

Passive transmembrane transporter activity

Channel activity

Ion channel activity

Gated channel activity

-log10(P-value)

李韵璇等：斑马鱼 prkd1 基因在心脏早期发育过程中的作用研究 101

生 命 科 学 研 究 圆园23 年

图 6 基于 KEGG 信号通路的基因相对表达量验证(72 hpf)

(A) 心肌细胞的肾上腺素能信号通路相关基因的 mRNA 相对表达量; (B) 细胞凋亡信号通路相关基因的 mRNA 相对表达

量; (C) 血管平滑肌收缩信号通路相关基因的 mRNA 相对表达量。n=3, *

: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001。

Fig.6 Verification of relative expression of genes based on KEGG signal pathways (72 hpf)

(A) Relative mRNA expression of adrenergic signaling pathway related genes in cardiomyocytes; (B) Relative mRNA expression of

apoptosis signaling pathway related genes; (C) Relative mRNA expression of vascular smooth muscle contraction signaling pathway related genes. n=3, *

: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001.

我们还对血管平滑肌收缩以及细胞凋亡信号

通路的关键基因进行了检测, 结果显示: 在prkd1-

MO 组中, 细胞凋亡相关基因 casp8 显著上调,

ctsbb 显著下调(图 6B); 血管平滑肌收缩相关基因

prkcg、si:ch73-55i23.1 和 cox8b 均显著下调(图6C),

且它们均与高通量测序结果相符。

以上结果表明, prkd1 可能通过影响心肌收

缩和心肌细胞的肾上腺素能信号通路来影响心脏

发育, prkd1 敲低后其还可能通过抑制血管平滑

肌收缩相关的基因来抑制心脏血液的供给, 同时

细胞凋亡通路上相关基因的表达也受到影响。

2.2.4 早期心脏发育关键基因 mRNA 的相对表

达量变化

由上述结果可知, prkd1 会通过影响心脏相

关信号通路来影响心脏发育。为了进一步探究

prkd1 是否在斑马鱼心脏发育的早期发挥作用,

收取 24 hpf 的 control-MO 组和 prkd1-MO 组斑

马鱼胚胎, 对其进行早期心脏发育关键因子的相

对表达量检测。qRT-PCR 数据显示, 与 controlMO 组相比, 敲低 prkd1 后斑马鱼早期心脏发育

关键因子如 tbx5a、gata4、nkx2.5 和 hand2 均发生

显著下调(图 7), 这表明 prkd1 的敲低会影响早期

心脏发育关键基因的表达。

图 7 早期心脏发育关键基因 mRNA 的相对表达量变化

(24 hpf)

Fig.7 Relative mRNA expression changes of key genes

in early cardiac development (24 hpf)

n=3, ***: P<0.001.

prkd1-MO

Control-MO

tbx5a gata4 nkx2.5 hand2

1.5

1.0

0.5

0

*** *** *** ***

Control-MO

prkd1-MO

Control-MO

prkd1-MO

Control-MO

prkd1-MO

2.0

1.5

1.0

0.5

0

casp8 ctsbb prkcg si:ch73-55i23.1 cox8b

1.5

2.0

1.0

0.5

0

1.5

1.0

0.5

0

*** *** ***

***

***

*** ** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***

*

(A)

(B) (C)

102

第 2 期

3 讨论

PRKD1 最初是蛋白激酶 C (protein kinase C,

PKC)家族的非典型成员, 后因其特殊的结构特征

如不同的跨膜和 PH 结构域以及氨基末端信号肽,

而被分至一个新的家族——PKD 家族[11, 14]。已有

研究表明, PRKD1 通过磷酸化心肌细胞中HDAC5

刺激其核输出, 同时减少对肌细胞增强因子

MEF2 类转录因子及其靶基因的负调节作用, 增

加心脏肥大相关因子的转录活性, 从而降低心脏

特异性 Prkd1 缺失的小鼠抵抗外源性心脏肥大的

能力[9-12, 15-16]。2021 年, 研究人员在人类先天性心

脏病病例中检测到了 PRKD1 的隐性突变, 患者

表现出肺动脉狭窄、动脉干和室间隔缺损的先天

性心脏病病征[2]。PRKD1 会与其他 PKD 家族成员

形成二聚体[17]

, 且有证据表明 PRKD1 定位于多蛋

白复合物[7]

, PRKD1 的缺失可能会破坏这些异构体

从而导致病理性心脏重塑功能受阻。这一系列研

究表明, prkd1 与心脏疾病的发生具有密切关系,

prkd1 的缺失可能通过引起复杂的响应机制来调

控心脏发育。

本文使用 MO 敲低斑马鱼 prkd1, 发现与对

照组相比, prkd1-MO 处理组的斑马鱼早期胚胎

死亡率升高(图 1A), 且出现心包水肿、心管线性化、

环化异常等明显心脏缺陷表型(图 2)。对 72 hpf 时

期出现明显心脏缺陷表型的斑马鱼比例进行统

计, 结果显示, 与 control-MO 组相比, prkd1-MO

组出现心包水肿、心管线性化、环化异常的比例显

著增加(图 1B); 48 hpf、72 hpf 时期斑马鱼的心率

分析结果显示, prkd1-MO 处理组的斑马鱼表现

出心率降低等异常(图 3), 这些结果表明 prkd1 在

早期心脏发育中至关重要。为进一步探究 prkd1

影响早期心脏发育的机制, 本研究选用 72 hpf 时

期的 control-MO 组和 prkd1-MO 组斑马鱼胚胎进

行转录组测序, 测序结果显示, 共检测到 6 246 个

发生显著性变化的基因, 其中 3 913 个基因显著

下调, 2 333 个基因显著上调。差异基因的 GO 和

KEGG 富集分析显示, prkd1 基因的敲低会使心脏

相关的信号通路, 如心肌细胞的肾上腺素能信号

通路、心肌收缩、血管平滑肌收缩、细胞凋亡信号

通路、钙离子信号通路等, 受到不同程度的影响

(图 4~5)。通过 qRT-PCR 对差异基因进行验证, 验

证结果显示, prkd1 敲低后心肌细胞的肾上腺素

能信号通路、心肌收缩等信号通路的部分相关基

因均发生显著变化(图 6A), 这说明 prkd1 可能通过

影响心脏相关的信号通路来影响心脏发育; 同时,

血管平滑肌收缩相关的差异基因显著下调(图 6C),

推测 prkd1 敲低可能会通过抑制血管平滑肌收缩

相关的基因来抑制心脏血液的供给, 从而影响早

期心脏发育。此外, 本研究还对两组斑马鱼胚胎

早期心脏发育关键因子的相对表达量进行了检

测, 发现 prkd1 敲低后早期心脏发育关键因子

tbx5a、gata4、nkx2.5 和 hand2 均发生显著下调(图 7),

这表明 prkd1 的敲低会影响早期心脏发育关键基

因的表达, 并且可能会通过调控这些关键因子的

表达来影响心脏发育。

综上可知, 本文以斑马鱼为模型, 就 prkd1 基

因的敲低对早期心脏发育的影响进行了初步探

究。然而, MO 敲低技术存在不可遗传的局限性,

且 prkd1 影响早期心脏发育的分子机制仍有待进

一步探究, 因此, 后续将在斑马鱼体内敲除 prkd1

基因, 从而对 prkd1 基因在早期心脏发育中的重

要作用展开深入探究。

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