Application Note丨拉曼光谱

关键词：拉曼光谱；定量分析；代谢物

化合物 / 代谢物定量分析

一、前言

拉曼光谱技术作为一种物质化学成分分析工具，在材料鉴定、

食品分析、疾病诊断、法医分析、生物发酵、药物质控等领域

[1–6] 有着广泛的应用。基于拉曼光谱信息，能够快速、无损地获

得目标化合物 / 代谢物的浓度、类型、结构、应力等信息，因此

在反应进程持续、样品珍贵或者有保证样品完整性需求的应用场

景下具有显著技术优势。本文应用 P300 共聚焦拉曼光谱仪，论

证了基于拉曼光谱技术进行化合物定量检测的可行性。

二、研究方法

1. 样品准备

考虑到溶剂对化合物的潜在干扰影响分析，本文选择棕榈酸

（Palmitic acid，cas#57-10-3, cat#P101061-5g，Aladdin）以

及 对 氰 基 苯 甲 醛（4-formylbenzonitrile，cas#105-07-7，

cat#F100751-25g，Aladdin）进行实验。化合物使用 DMSO

（cas#67-68-5，cat#CD4731-100ml，Coolaber）配制至 1 M

浓度1 mL。而后在1.5 mL EP管内，使用DMSO以2倍梯度稀释，

得到 8 个稀释浓度（1 M-7.8125 mM）。

2. 拉曼光谱采集

不同稀释浓度样品以及 DMSO 纯溶液分别，滴加 5-10 μL

至拉曼玻片上，而后上机检测（Hooke P300）。每个样品在随

机位置采集 10-20 个拉曼光谱。采集条件为，激发波长 532

nm，光栅 600 g/mm，镜下激光功率 5 mW，积分时间 1 s。

3. 数据分析

参考文章方法进行线性回归以及检测限计算 [7]。首先原始光

P300 共聚焦拉曼光谱仪

图1 化合物的拉曼光谱定量

化合物母液（1 M）经DMSO的2倍梯度稀释得到8个梯度，分别对应1-8

样品编号。A）不同浓度棕榈酸拉曼光谱。红色箭头表示线性回归所选中

的拉曼光谱相对波数；B）棕榈酸相对波数2850 cm-1处强度的线性回

归。LOD表示检测限；C）不同浓度对氰基苯甲醛拉曼光谱；D）对氰基

苯甲醛相对波数2230 cm-1处强度的线性回归。

谱数据经过 HOOKE IntP 数据分析软件进行去宇宙射线以及去

噪音处理。而后选择稀释液拉曼光谱特定峰位对稀释浓度作线性

回归，求得直线斜率（b）。接着计算纯溶剂 DMSO 在该峰位处

的标准偏差（Sa

）。通过公式 LOD=3*Sa

/b ，计算检测限。此处，

棕榈酸选择拉曼相对波数 2850 cm-1，对氰基苯甲醛选择静默区

2230 cm-1。

三、研究结果

通过比较棕榈酸（图 1a）以及氰基苯甲醛（图 1c）对不同

稀释度的拉曼光谱，我们分别选择相对波数 2850 cm-1 以及

2230 cm-1 进行回归分析以及检测限计算。线性回归显示这些波

数与浓度强相关（r2 分别为 0.993 和 0.997），对应的最小检测

限分别为 26.32 mM 以及 5.55 mM。

参考文献：

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

Shende, C.; Smith, W.; Brouillette, C.; Farquharson, S. Drug

Stability Analysis by Raman Spectroscopy. Pharmaceutics

2014, 6 (4), 651–662.

Ryzhikova, E.; Ralbovsky, N. M.; Sikirzhytski, V.; Kazakov, O.;

Halamkova, L.; Quinn, J.; Zimmerman, E. A.; Lednev, I. K.

Raman Spectroscopy and Machine Learning for Biomedical

Applications: Alzheimer’s Disease Diagnosis Based on the

Analysis of Cerebrospinal Fluid. Spectrochim Acta A Mol

Biomol Spectrosc 2021, 248, 119188.

Amjad, A.; Ullah, R.; Khan, S.; Bilal, M.; Khan, A. Raman

Spectroscopy Based Analysis of Milk Using Random Forest

Classification. Vibrational Spectroscopy 2018, 99, 124–129.

Boonsit, S.; Kalasuwan, P.; Dommelen, P. van; Daengngam, C.

Rapid Material Identification via Low-Resolution Raman

Spectroscopy and Deep Convolutional Neural Network. J.

Phys.: Conf. Ser. 2021, 1719 (1), 012081.

de Oliveira Penido, C. A. F.; Pacheco, M. T. T.; Lednev, I. K.;

Silveira Jr., L. Raman Spectroscopy in Forensic Analysis:

Identification of Cocaine and Other Illegal Drugs of Abuse.

Journal of Raman Spectroscopy 2016, 47 (1), 28–38.

Hirsch, E.; Pataki, H.; Domján, J.; Farkas, A.; Vass, P.; Fehér, C.;

Barta, Z.; Nagy, Z. K.; Marosi, G. J.; Csontos, I. Inline Noninvasive Raman Monitoring and Feedback Control of Glucose

Concentration during Ethanol Fermentation. Biotechnology

Progress 2019, 35 (5), e2848.

[7]

[8]

[9]

[10]

Huang, Y.-H.; Wei, H.; Santiago, P. J.; Thrift, W. J.; Ragan, R.;

Jiang, S. Sensing Antibiotics in Wastewater Using

Surface-Enhanced Raman Scattering. Environ. Sci. Technol.

2023, 57 (12), 4880–4891.

Lima, C.; Muhamadali, H.; Goodacre, R. The Role of Raman

Spectroscopy Within Quantitative Metabolomics. Annual

Review of Analytical Chemistry 2021, 14 (Volume 14, 2021),

323–345.

Orlando, A.; Franceschini, F.; Muscas, C.; Pidkova, S.; Bartoli,

M.; Rovere, M.; Tagliaferro, A. A Comprehensive Review on

Raman Spectroscopy Applications. Chemosensors 2021, 9

(9), 262.

Araujo, C. F.; Nolasco, M. M.; Ribeiro, A. M. P.; Ribeiro-Claro, P.

J. A. Identification of Microplastics Using Raman Spectroscopy: Latest Developments and Future Prospects. Water Res

2018, 142, 426–440.

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四、结论

通过对棕榈酸及氰基苯甲醛拉曼光谱的数据分析，验证了

P300 共聚焦拉曼光谱仪在化合物 / 代谢物定量分析方面的能力。

该方法可以实现 mM 水平化合物的检测，且其线性范围受目标

化合物单位浓度下特征峰峰强的影响，对于氰基苯甲醛（2230

cm-1）最低可以达到 5.55 mM。此方法可拓展到更多物质检测

应用中，例如细胞色素、脂质、药物、染料、微塑料、有机污染物、

机体代谢物等 [7–10]。其中在酵母乙醇发酵监测的研究中 [5]，通过

动态监测调控发酵过程中糖类底物以及终产物乙醇的含量水平，

来达到提高产量的目标。此外，由于不同物质的拉曼特征峰位不

同，使同时实现多种物质的定量检测成为可能。

五、应用优势

拉曼光谱技术为化合物 / 代谢物的快速、动态定量分析提供

了有效手段，P300 共聚焦拉曼光谱仪凭借其高灵敏度与优秀的

共聚焦性能，可针对单个微生物、单细胞、组织、微塑料、材料

等样品实现亚微米精度的检测，描述目标物质在样品中的空间分

布情况，在病理检测、高产菌筛选、生物发酵、微塑料监测等领

域极具应用潜力。